JPH0348697A - 濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法 - Google Patents
濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、濃縮及び/又は精製された上皮細胞成長因子
(以下、EGFという)の製造法に関する。
(以下、EGFという)の製造法に関する。
(従来の技術〕
EGFは、人尿に含まれるヒトEGF、マウス顎下腺に
含まれるマウスEGF等、種々のEGFが知られている
。
含まれるマウスEGF等、種々のEGFが知られている
。
これらは、初期には、人尿、抽出液等かなり大容量の水
溶液に少量含まれるために、有効な精製処理を行おうと
する場合、EGFを捕捉しつつ濃縮する必要があった。
溶液に少量含まれるために、有効な精製処理を行おうと
する場合、EGFを捕捉しつつ濃縮する必要があった。
従来、このような濃縮方法としては、(1)凍結乾燥法
、(2)イオン交換法、(3)EGFを吸着剤に吸着さ
せた後、溶出する方法(吸着法)、(4)沈殿剤を添加
してEGFを沈殿させる方法(沈殿法)、(5)水分を
蒸発させる方法(蒸発法)等が知られている。
、(2)イオン交換法、(3)EGFを吸着剤に吸着さ
せた後、溶出する方法(吸着法)、(4)沈殿剤を添加
してEGFを沈殿させる方法(沈殿法)、(5)水分を
蒸発させる方法(蒸発法)等が知られている。
[発明が解決しようとする課題〕
しかし、上記の方法には、次のような欠・点がある。
(1)凍結乾燥法 :もとの溶液の液量が多いときは、
実用上不可能である し、原料液中の無機塩など もそのまま濃縮される不都 合がある。
実用上不可能である し、原料液中の無機塩など もそのまま濃縮される不都 合がある。
(2)イオン交換法:原料液のイオン強度が高いとイオ
ン交換によりEGF が樹脂に付かないため目的 に合わない。
ン交換によりEGF が樹脂に付かないため目的 に合わない。
(3)吸着法 :選択性が高く、かつ寿命の長い吸
着物がない。
着物がない。
(4)沈殿法 :タンパク質類の沈殿によく使われ
る硫安、硫酸ナトリ ラム等の沈殿剤ではEGF は充分に沈殿しないためロ スが多い。
る硫安、硫酸ナトリ ラム等の沈殿剤ではEGF は充分に沈殿しないためロ スが多い。
(5)蒸発法 :凍乾法と同様、無機塩などがその
まま濃縮される不都 合がある。蒸発効率を上げ るため加熱するとEGFの 失活が避けられない。
まま濃縮される不都 合がある。蒸発効率を上げ るため加熱するとEGFの 失活が避けられない。
本発明は、EGFを含有する溶液から容易に、しかも経
済的にEGFを濃縮及び/又は精製する方法を提供する
ことを目的とする。
済的にEGFを濃縮及び/又は精製する方法を提供する
ことを目的とする。
上記目的を達成するため、沈殿法の条件を種々検討した
結果、EGFを含有する溶液のpHをEGF等電点(約
4.5)付近、すなわちp H4,0〜5.0の範囲で
塩析すると効果的にEGFが濃縮でき、しかもm製度も
上がることを見出し、本発明を完成した。
結果、EGFを含有する溶液のpHをEGF等電点(約
4.5)付近、すなわちp H4,0〜5.0の範囲で
塩析すると効果的にEGFが濃縮でき、しかもm製度も
上がることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、EGFを含有する溶液をpH4,
0〜5.0で塩析することを特徴とする濃縮及び/又は
精製されたEGFの製造法に関する。
0〜5.0で塩析することを特徴とする濃縮及び/又は
精製されたEGFの製造法に関する。
本発明におけるEGFは、ヒトEGF、マウスEGF、
ラットEGF等の晴乳動物のEGF、これらのEGFを
モデルに組換えDNA法で製造したEGF、一部修飾し
たEGF (例えば末端にメチオニンが付加したEGF
、アミノ酸シーケンス中のメチオニンが他のアミノ酸が
N換されたEGFなど)等がある。
ラットEGF等の晴乳動物のEGF、これらのEGFを
モデルに組換えDNA法で製造したEGF、一部修飾し
たEGF (例えば末端にメチオニンが付加したEGF
、アミノ酸シーケンス中のメチオニンが他のアミノ酸が
N換されたEGFなど)等がある。
EGFを含有する溶液としては、尿、血清、顎下腺等の
EGF産生MLyR又は細胞の抽出液又は培養液、EG
Fを産生ずるように遺伝子を組み換えられたtjB菌又
は酵母からの抽出液又は培養液等があり、これらをセラ
イトろ過したもの、吸着樹脂に吸着処理後溶出して得ら
れる溶出液、ゲルろ過して得られる溶出液、限外ろ過で
濃縮したもの等がある。
EGF産生MLyR又は細胞の抽出液又は培養液、EG
Fを産生ずるように遺伝子を組み換えられたtjB菌又
は酵母からの抽出液又は培養液等があり、これらをセラ
イトろ過したもの、吸着樹脂に吸着処理後溶出して得ら
れる溶出液、ゲルろ過して得られる溶出液、限外ろ過で
濃縮したもの等がある。
EGFを含有する溶液(主に水溶液)は、先ずpHをE
GFの等電点から0.5を越えない範囲。
GFの等電点から0.5を越えない範囲。
すなわちPHが4.0〜5.0、好ましくは4.4〜4
.6に調整する。PHが4.0〜5.0の範囲を越える
とEGFの回収率が低下する。pHの調整は酢酸、トリ
フルオロ酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸、必要
ならば水酸化ナトリウム、アンモニア等のアルカリ物質
を用いて行うことができる。
.6に調整する。PHが4.0〜5.0の範囲を越える
とEGFの回収率が低下する。pHの調整は酢酸、トリ
フルオロ酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸、必要
ならば水酸化ナトリウム、アンモニア等のアルカリ物質
を用いて行うことができる。
このようにして、EGFを含有する溶液のPHを調整し
たのち、EGFを沈殿させるのに必要な量の塩を加え、
かき混ぜ、再び液のpHを4.0〜5.0の範囲、好ま
しくは4.4〜4.6に調整したのち静置する。
たのち、EGFを沈殿させるのに必要な量の塩を加え、
かき混ぜ、再び液のpHを4.0〜5.0の範囲、好ま
しくは4.4〜4.6に調整したのち静置する。
塩析に用いられる塩としては、硫酸アンモニウム、硫酸
マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等
が挙げられるが、塩析定数が大きい、すなわちタンパク
質を溶液から析出させる能力が高く、シかも低温でも水
に対する溶解度の大きい硫酸アンモニウムが好ましい。
マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等
が挙げられるが、塩析定数が大きい、すなわちタンパク
質を溶液から析出させる能力が高く、シかも低温でも水
に対する溶解度の大きい硫酸アンモニウムが好ましい。
塩析に用いられる硫酸アンモニウムの量は、溶液中のタ
ンパク質の濃度や不純物の含有量によって多少変動する
が、飽和度0.40 (溶液IQに対し固形の硫酸アン
モニウム243gを加える)から飽和度1.0(溶液I
Qに対し、固形の硫酸アンモニウム767g)の硫酸ア
ンモニウムを用いれば、溶液中のEGFの約60%以上
は沈殿し、回収できる。ここで硫酸アンモニウムの飽和
度とはIQの水に固形の硫酸アンモニウム767gを溶
解させたときを飽和度1.0とみなし、それに対する百
分率を表したもので、固形硫安添加量と濃度(飽和度)
の関係は、例えば日本生化学間[生化学実験口座1jタ
ンパク貿の化学l、第71頁(東京化学同人、1976
年)に表示されている。
ンパク質の濃度や不純物の含有量によって多少変動する
が、飽和度0.40 (溶液IQに対し固形の硫酸アン
モニウム243gを加える)から飽和度1.0(溶液I
Qに対し、固形の硫酸アンモニウム767g)の硫酸ア
ンモニウムを用いれば、溶液中のEGFの約60%以上
は沈殿し、回収できる。ここで硫酸アンモニウムの飽和
度とはIQの水に固形の硫酸アンモニウム767gを溶
解させたときを飽和度1.0とみなし、それに対する百
分率を表したもので、固形硫安添加量と濃度(飽和度)
の関係は、例えば日本生化学間[生化学実験口座1jタ
ンパク貿の化学l、第71頁(東京化学同人、1976
年)に表示されている。
塩析時の液温は0〜50℃、好ましくは0〜10℃とす
る。0℃以下であると溶液中の水や硫酸アンモニウムが
析出し、50”C以上であるとEGFが失活するおそれ
がある。EGFの回収率を上げるため、硫酸アンモニウ
ム添加後、もはや新たに沈殿の発生がみられなくなるま
で適当な時間。
る。0℃以下であると溶液中の水や硫酸アンモニウムが
析出し、50”C以上であるとEGFが失活するおそれ
がある。EGFの回収率を上げるため、硫酸アンモニウ
ム添加後、もはや新たに沈殿の発生がみられなくなるま
で適当な時間。
静置してもよい。
このようにして得られたEGFを含む沈殿は、遠心分離
又はろ過等の方法で分離することができる。これを沈殿
を溶解できる少量の水、生理食塩液又はリン酸緩衝液等
の適当な溶媒に溶解すればよい。
又はろ過等の方法で分離することができる。これを沈殿
を溶解できる少量の水、生理食塩液又はリン酸緩衝液等
の適当な溶媒に溶解すればよい。
なお、本発明においてEGFはラジオレセプターアッセ
イ(RRA法と略す)、すなわちヒトEGFを含む試料
、EGFリセプター及び放射性ヨウ素で標識したマウス
EGFを水溶液中で混合して反応させ、EGFレセプタ
ーとマウスEGFとの結合物を生成させ、これを分離し
て、その放射活性を測定し、検量線に照らし、ヒトEG
F濃度を決定する方法によって測定したものである。
イ(RRA法と略す)、すなわちヒトEGFを含む試料
、EGFリセプター及び放射性ヨウ素で標識したマウス
EGFを水溶液中で混合して反応させ、EGFレセプタ
ーとマウスEGFとの結合物を生成させ、これを分離し
て、その放射活性を測定し、検量線に照らし、ヒトEG
F濃度を決定する方法によって測定したものである。
また、タンパク質は牛血清アルブミンを標準タンパクと
するFo l i n−Lowry法により測定したも
のである。
するFo l i n−Lowry法により測定したも
のである。
水に対するタンパク質等の高分子電解質の溶解度は、塩
類の濃度が高くなると減少する。この減少が塩析と呼ば
れる。塩析の原理は、水を配置する程度がタンパク質よ
りも自由イオンで高いため。
類の濃度が高くなると減少する。この減少が塩析と呼ば
れる。塩析の原理は、水を配置する程度がタンパク質よ
りも自由イオンで高いため。
高い濃度の塩溶液中では大部分の自由水がイオンの配位
水として奪われ、タンパク質問の相互作用が増し、タン
パク質が析出すると考えられる。
水として奪われ、タンパク質問の相互作用が増し、タン
パク質が析出すると考えられる。
一方、等電点においてタンパク質の正負の荷電の総和は
ゼロとなり、ペプチド間の引力が最も大きくなるために
、ペプチドの溶解度が最少となる。
ゼロとなり、ペプチド間の引力が最も大きくなるために
、ペプチドの溶解度が最少となる。
そのため、EGFの等電点付近で、塩析を行うとEGF
が効率よく塩析されると考えられる。
が効率よく塩析されると考えられる。
(実施@1)
(1)新鮮なヒト男子尿2Q (pH6,6、RRAに
よるEGF濃度40ng/mQ)にIN水酸化ナトリウ
ムを加えpH7,0とし、1100OOXで10分間遠
心分離して、清澄な尿を得た。分画分子量5000のホ
ローファイバー型限外ろ過カートリッジrHI5−43
J (アミコン社f#)を用いて約1.5kg/aJ
の加圧下にこの清澄尿を限外ろ過した。約8時間後に尿
は約90mQに濃縮された。この濃縮法のp HをIN
水酸化ナトリウムで7.0に調整し、精製水を加えて液
量を100allとしたのち、EGF及びタンパク質を
分析すると、総量はそれぞれ70gg及び90■で、E
GFの純度は0.078%であった。
よるEGF濃度40ng/mQ)にIN水酸化ナトリウ
ムを加えpH7,0とし、1100OOXで10分間遠
心分離して、清澄な尿を得た。分画分子量5000のホ
ローファイバー型限外ろ過カートリッジrHI5−43
J (アミコン社f#)を用いて約1.5kg/aJ
の加圧下にこの清澄尿を限外ろ過した。約8時間後に尿
は約90mQに濃縮された。この濃縮法のp HをIN
水酸化ナトリウムで7.0に調整し、精製水を加えて液
量を100allとしたのち、EGF及びタンパク質を
分析すると、総量はそれぞれ70gg及び90■で、E
GFの純度は0.078%であった。
(2)上記(1)で得られた前処理液100mQのうち
10IIIQを遠沈管にとり、IN塩酸を加えてpHを
4.5に調整した。よく粉砕した固形の硫酸アンモニウ
ムを少量ずつスタータで撹拌しながら合計2.43g
(飽和度40%)加え、0.IN水酸化ナトリウム又は
O,IN塩酸でpHを4.5に再調整し、2〜10℃の
冷室中で一晩放置した。生じた沈殿を110000Xで
15分間遠心し、上清は除去し、沈殿は生理食塩水1.
0IIIQに溶解した。この沈殿の溶f%液中にはEG
Fが6.2μg、タンパク質が4.5■が含まれており
、E G Fの回収率は89%であった。(第1表)。
10IIIQを遠沈管にとり、IN塩酸を加えてpHを
4.5に調整した。よく粉砕した固形の硫酸アンモニウ
ムを少量ずつスタータで撹拌しながら合計2.43g
(飽和度40%)加え、0.IN水酸化ナトリウム又は
O,IN塩酸でpHを4.5に再調整し、2〜10℃の
冷室中で一晩放置した。生じた沈殿を110000Xで
15分間遠心し、上清は除去し、沈殿は生理食塩水1.
0IIIQに溶解した。この沈殿の溶f%液中にはEG
Fが6.2μg、タンパク質が4.5■が含まれており
、E G Fの回収率は89%であった。(第1表)。
またEGFの純度は前処理液の0.078%から0.1
4%へ向上した。
4%へ向上した。
〔比較例1〕
実施例1の(1)で得た尿の前処理液10mQをとり、
よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを小量ずつスター
タで撹拌しながら合計2.43g(飽和度40%)加え
、0.IN水酸化ナトリウム又は0.IN1!酸t’p
Hを7.1.−再調整し、以下実施例1の(2)と同様
に操作した。この場合、沈殿の溶解液中にはEGFが1
.8μg、タンパク質が4.8rIK含まれており、E
GFの回収率は26%に過ぎなかった(第1表)。
よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを小量ずつスター
タで撹拌しながら合計2.43g(飽和度40%)加え
、0.IN水酸化ナトリウム又は0.IN1!酸t’p
Hを7.1.−再調整し、以下実施例1の(2)と同様
に操作した。この場合、沈殿の溶解液中にはEGFが1
.8μg、タンパク質が4.8rIK含まれており、E
GFの回収率は26%に過ぎなかった(第1表)。
第
液量
(m12)
前処理液 10
(供給液)
実施例11.0
比較例11.0
本前処理液(供給液)
1表
EGF (μg)タンパク質
〔回収率本〕(■)
7、0 9.0
(100%〕
6、2 4.5
〔89%〕
1、8 4.8
〔26%〕
のEGF量を100とした。
(実施例2)
(1)新鮮なヒト男子圧200QにIN塩酸を加え、p
Hを3.5に調整したのち、あらかじめ0、IN酢酸8
M液(p H3、5) テp H3、5に緩衝化したカ
チオン交換樹脂「バイオレックス70」 (バイオラッ
ド社製)2Qを加え、2〜10°Cで24時間撹拌した
。樹脂をろ別し、水洗したのち、樹脂を1M酢酸アンモ
ニウム(アンモニア水でpH8,5に調整)2.58で
4回処理し、EGFを含有する抽出液1012を得た。
Hを3.5に調整したのち、あらかじめ0、IN酢酸8
M液(p H3、5) テp H3、5に緩衝化したカ
チオン交換樹脂「バイオレックス70」 (バイオラッ
ド社製)2Qを加え、2〜10°Cで24時間撹拌した
。樹脂をろ別し、水洗したのち、樹脂を1M酢酸アンモ
ニウム(アンモニア水でpH8,5に調整)2.58で
4回処理し、EGFを含有する抽出液1012を得た。
次いで上記抽出液をスチレン系吸着樹脂rXAD7」
(オルガノ社製)200IIIQを充填したカラムに5
00+nQ/hの速さで負荷し、EGFを吸着させた。
(オルガノ社製)200IIIQを充填したカラムに5
00+nQ/hの速さで負荷し、EGFを吸着させた。
カラ11をFail水500wQで洗浄したのち、II
!fi0.06Mtlむメタ/−ル400IQを流し、
EGFを溶出した。溶出液をIN水酸化ナトリウムでp
H7,0に中和し、約40℃の温浴上、ロータリーエバ
ポレータでメタノールを除去し、EGF@!11製液6
0mD、を得た。このEGF!$1!製液のEGF及び
タンパク質を分析すると、総量はそれぞれ5940 t
t g及び103mgであった。
!fi0.06Mtlむメタ/−ル400IQを流し、
EGFを溶出した。溶出液をIN水酸化ナトリウムでp
H7,0に中和し、約40℃の温浴上、ロータリーエバ
ポレータでメタノールを除去し、EGF@!11製液6
0mD、を得た。このEGF!$1!製液のEGF及び
タンパク質を分析すると、総量はそれぞれ5940 t
t g及び103mgであった。
(2)遠沈管3本にそれぞれ上記(1)で得たEGF粗
精製液10m12ずつをとり、0.IN@酸を加えてp
Hをそれぞれ4,0.4.5及び5.0に調整した。よ
く粉砕した固形の硫酸アンモ・ニウムを少量ずつスター
タで撹拌しながら合計3.13g(飽和度50%)をそ
れぞれに加え、pHをそれぞれ4.0.4.5及び5.
0に再調整したのち、2〜10℃の冷室中で一晩放置し
た。生じた沈殿を110000Xで15分間遠心し、上
清は除去し、沈殿は精製水1.0mQに溶解した。この
沈殿の溶解液中にはEGF/タンパク質がそれぞれ65
3μg/6.2■、812μに/6.7■及び693μ
g76.8■含まれており、EGFの回収率はそれぞれ
66%、82%及び70%(第2表)であった。
精製液10m12ずつをとり、0.IN@酸を加えてp
Hをそれぞれ4,0.4.5及び5.0に調整した。よ
く粉砕した固形の硫酸アンモ・ニウムを少量ずつスター
タで撹拌しながら合計3.13g(飽和度50%)をそ
れぞれに加え、pHをそれぞれ4.0.4.5及び5.
0に再調整したのち、2〜10℃の冷室中で一晩放置し
た。生じた沈殿を110000Xで15分間遠心し、上
清は除去し、沈殿は精製水1.0mQに溶解した。この
沈殿の溶解液中にはEGF/タンパク質がそれぞれ65
3μg/6.2■、812μに/6.7■及び693μ
g76.8■含まれており、EGFの回収率はそれぞれ
66%、82%及び70%(第2表)であった。
(比較例2)
実施例2の(1)で得たEGF粗精製液10mQを遠沈
管にとり、よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを少量
ずつスタータで撹拌しながら合計3.13 g(飽和度
50%)を加え、0.IN水酸化ナトリウム又は0.I
N塩酸でPHを7.0に再調整し、以下、実施例2の(
2)と同様に操作した。この場合沈殿の溶解液中にはE
GFが267μg、タンパク質が6.6■含まれており
、EGFの回収率は27%に過ぎなかった(第2表)。
管にとり、よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを少量
ずつスタータで撹拌しながら合計3.13 g(飽和度
50%)を加え、0.IN水酸化ナトリウム又は0.I
N塩酸でPHを7.0に再調整し、以下、実施例2の(
2)と同様に操作した。この場合沈殿の溶解液中にはE
GFが267μg、タンパク質が6.6■含まれており
、EGFの回収率は27%に過ぎなかった(第2表)。
第 2 表
液 量 EGF (μg) タンパク質〔発明の効果〕
本発明は次のような効果を奏する。
(1)高い濃縮効果が得られる6
(2)EGFの回収率が高い。
(3)大量処理が可能である。
(4)操作が簡単で、所要時間も短い。
(5)不純物を除去する効果もある。
そのため、本発明はEGFの製造に有用な方法である。
Claims (1)
- 1、上皮細胞成長因子を含有する溶液をpH4.0〜5
.0で塩析することを特徴とする濃縮及び/又は精製さ
れた上皮細胞成長因子の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18410389A JPH0348697A (ja) | 1989-07-17 | 1989-07-17 | 濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18410389A JPH0348697A (ja) | 1989-07-17 | 1989-07-17 | 濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0348697A true JPH0348697A (ja) | 1991-03-01 |
Family
ID=16147447
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18410389A Pending JPH0348697A (ja) | 1989-07-17 | 1989-07-17 | 濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0348697A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009526538A (ja) * | 2006-02-13 | 2009-07-23 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ランチビオティックスの製造方法 |
-
1989
- 1989-07-17 JP JP18410389A patent/JPH0348697A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009526538A (ja) * | 2006-02-13 | 2009-07-23 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ランチビオティックスの製造方法 |
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