JPH0348697A

JPH0348697A - 濃縮・精製された上皮細胞成長因子の製造法

Info

Publication number: JPH0348697A
Application number: JP18410389A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Onuki; 哲男大貫; Yoshio Yamazaki; 山崎　良男; Tokuji Hattori; 服部　徳治; Takashi Seki; 関　丘
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1989-07-17
Filing date: 1989-07-17
Publication date: 1991-03-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、濃縮及び／又は精製された上皮細胞成長因子
（以下、ＥＧＦという）の製造法に関する。

（従来の技術〕ＥＧＦは、人尿に含まれるヒトＥＧＦ、マウス顎下腺に
含まれるマウスＥＧＦ等、種々のＥＧＦが知られている
。

これらは、初期には、人尿、抽出液等かなり大容量の水
溶液に少量含まれるために、有効な精製処理を行おうと
する場合、ＥＧＦを捕捉しつつ濃縮する必要があった。

従来、このような濃縮方法としては、（１）凍結乾燥法
、（２）イオン交換法、（３）ＥＧＦを吸着剤に吸着さ
せた後、溶出する方法（吸着法）、（４）沈殿剤を添加
してＥＧＦを沈殿させる方法（沈殿法）、（５）水分を
蒸発させる方法（蒸発法）等が知られている。

［発明が解決しようとする課題〕しかし、上記の方法には、次のような欠・点がある。

（１）凍結乾燥法　：もとの溶液の液量が多いときは、
実用上不可能であるし、原料液中の無機塩などもそのまま濃縮される不都合がある。

（２）イオン交換法：原料液のイオン強度が高いとイオ
ン交換によりＥＧＦが樹脂に付かないため目的に合わない。

（３）吸着法　　　：選択性が高く、かつ寿命の長い吸
着物がない。

（４）沈殿法　　　：タンパク質類の沈殿によく使われ
る硫安、硫酸ナトリラム等の沈殿剤ではＥＧＦは充分に沈殿しないためロスが多い。

（５）蒸発法　　　：凍乾法と同様、無機塩などがその
まま濃縮される不都合がある。蒸発効率を上げるため加熱するとＥＧＦの失活が避けられない。

本発明は、ＥＧＦを含有する溶液から容易に、しかも経
済的にＥＧＦを濃縮及び／又は精製する方法を提供する
ことを目的とする。

〔課Ｈを解決するための手段〕

上記目的を達成するため、沈殿法の条件を種々検討した
結果、ＥＧＦを含有する溶液のｐＨをＥＧＦ等電点（約
４．５）付近、すなわちｐ　Ｈ４，０〜５．０の範囲で
塩析すると効果的にＥＧＦが濃縮でき、しかもｍ製度も
上がることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ＥＧＦを含有する溶液をｐＨ４，
０〜５．０で塩析することを特徴とする濃縮及び／又は
精製されたＥＧＦの製造法に関する。

本発明におけるＥＧＦは、ヒトＥＧＦ、マウスＥＧＦ、
ラットＥＧＦ等の晴乳動物のＥＧＦ、これらのＥＧＦを
モデルに組換えＤＮＡ法で製造したＥＧＦ、一部修飾し
たＥＧＦ　（例えば末端にメチオニンが付加したＥＧＦ
、アミノ酸シーケンス中のメチオニンが他のアミノ酸が
Ｎ換されたＥＧＦなど）等がある。

ＥＧＦを含有する溶液としては、尿、血清、顎下腺等の
ＥＧＦ産生ＭＬｙＲ又は細胞の抽出液又は培養液、ＥＧ
Ｆを産生ずるように遺伝子を組み換えられたｔｊＢ菌又
は酵母からの抽出液又は培養液等があり、これらをセラ
イトろ過したもの、吸着樹脂に吸着処理後溶出して得ら
れる溶出液、ゲルろ過して得られる溶出液、限外ろ過で
濃縮したもの等がある。

ＥＧＦを含有する溶液（主に水溶液）は、先ずｐＨをＥ
ＧＦの等電点から０．５を越えない範囲。

すなわちＰＨが４．０〜５．０、好ましくは４．４〜４
．６に調整する。ＰＨが４．０〜５．０の範囲を越える
とＥＧＦの回収率が低下する。ｐＨの調整は酢酸、トリ
フルオロ酢酸等の有機酸、塩酸、硫酸等の無機酸、必要
ならば水酸化ナトリウム、アンモニア等のアルカリ物質
を用いて行うことができる。

このようにして、ＥＧＦを含有する溶液のＰＨを調整し
たのち、ＥＧＦを沈殿させるのに必要な量の塩を加え、
かき混ぜ、再び液のｐＨを４．０〜５．０の範囲、好ま
しくは４．４〜４．６に調整したのち静置する。

塩析に用いられる塩としては、硫酸アンモニウム、硫酸
マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等
が挙げられるが、塩析定数が大きい、すなわちタンパク
質を溶液から析出させる能力が高く、シかも低温でも水
に対する溶解度の大きい硫酸アンモニウムが好ましい。

塩析に用いられる硫酸アンモニウムの量は、溶液中のタ
ンパク質の濃度や不純物の含有量によって多少変動する
が、飽和度０．４０　（溶液ＩＱに対し固形の硫酸アン
モニウム２４３ｇを加える）から飽和度１．０（溶液Ｉ
Ｑに対し、固形の硫酸アンモニウム７６７ｇ）の硫酸ア
ンモニウムを用いれば、溶液中のＥＧＦの約６０％以上
は沈殿し、回収できる。ここで硫酸アンモニウムの飽和
度とはＩＱの水に固形の硫酸アンモニウム７６７ｇを溶
解させたときを飽和度１．０とみなし、それに対する百
分率を表したもので、固形硫安添加量と濃度（飽和度）
の関係は、例えば日本生化学間［生化学実験口座１ｊタ
ンパク貿の化学ｌ、第７１頁（東京化学同人、１９７６
年）に表示されている。

塩析時の液温は０〜５０℃、好ましくは０〜１０℃とす
る。０℃以下であると溶液中の水や硫酸アンモニウムが
析出し、５０”Ｃ以上であるとＥＧＦが失活するおそれ
がある。ＥＧＦの回収率を上げるため、硫酸アンモニウ
ム添加後、もはや新たに沈殿の発生がみられなくなるま
で適当な時間。

静置してもよい。

このようにして得られたＥＧＦを含む沈殿は、遠心分離
又はろ過等の方法で分離することができる。これを沈殿
を溶解できる少量の水、生理食塩液又はリン酸緩衝液等
の適当な溶媒に溶解すればよい。

なお、本発明においてＥＧＦはラジオレセプターアッセ
イ（ＲＲＡ法と略す）、すなわちヒトＥＧＦを含む試料
、ＥＧＦリセプター及び放射性ヨウ素で標識したマウス
ＥＧＦを水溶液中で混合して反応させ、ＥＧＦレセプタ
ーとマウスＥＧＦとの結合物を生成させ、これを分離し
て、その放射活性を測定し、検量線に照らし、ヒトＥＧ
Ｆ濃度を決定する方法によって測定したものである。

また、タンパク質は牛血清アルブミンを標準タンパクと
するＦｏ　ｌ　ｉ　ｎ−Ｌｏｗｒｙ法により測定したも
のである。

〔作用〕

水に対するタンパク質等の高分子電解質の溶解度は、塩
類の濃度が高くなると減少する。この減少が塩析と呼ば
れる。塩析の原理は、水を配置する程度がタンパク質よ
りも自由イオンで高いため。

高い濃度の塩溶液中では大部分の自由水がイオンの配位
水として奪われ、タンパク質問の相互作用が増し、タン
パク質が析出すると考えられる。

一方、等電点においてタンパク質の正負の荷電の総和は
ゼロとなり、ペプチド間の引力が最も大きくなるために
、ペプチドの溶解度が最少となる。

そのため、ＥＧＦの等電点付近で、塩析を行うとＥＧＦ
が効率よく塩析されると考えられる。

〔実施例〕

（実施＠１）（１）新鮮なヒト男子尿２Ｑ　（ｐＨ６，６、ＲＲＡに
よるＥＧＦ濃度４０ｎｇ／ｍＱ）にＩＮ水酸化ナトリウ
ムを加えｐＨ７，０とし、１１００ＯＯＸで１０分間遠
心分離して、清澄な尿を得た。分画分子量５０００のホ
ローファイバー型限外ろ過カートリッジｒＨＩ５−４３
Ｊ　　（アミコン社ｆ＃）を用いて約１．５ｋｇ／ａＪ
の加圧下にこの清澄尿を限外ろ過した。約８時間後に尿
は約９０ｍＱに濃縮された。この濃縮法のｐ　ＨをＩＮ
水酸化ナトリウムで７．０に調整し、精製水を加えて液
量を１００ａｌｌとしたのち、ＥＧＦ及びタンパク質を
分析すると、総量はそれぞれ７０ｇｇ及び９０■で、Ｅ
ＧＦの純度は０．０７８％であった。

（２）上記（１）で得られた前処理液１００ｍＱのうち
１０ＩＩＩＱを遠沈管にとり、ＩＮ塩酸を加えてｐＨを
４．５に調整した。よく粉砕した固形の硫酸アンモニウ
ムを少量ずつスタータで撹拌しながら合計２．４３ｇ　
（飽和度４０％）加え、０．ＩＮ水酸化ナトリウム又は
Ｏ，ＩＮ塩酸でｐＨを４．５に再調整し、２〜１０℃の
冷室中で一晩放置した。生じた沈殿を１１００００Ｘで
１５分間遠心し、上清は除去し、沈殿は生理食塩水１．
０ＩＩＩＱに溶解した。この沈殿の溶ｆ％液中にはＥＧ
Ｆが６．２μｇ、タンパク質が４．５■が含まれており
、Ｅ　Ｇ　Ｆの回収率は８９％であった。（第１表）。

またＥＧＦの純度は前処理液の０．０７８％から０．１
４％へ向上した。

〔比較例１〕実施例１の（１）で得た尿の前処理液１０ｍＱをとり、
よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを小量ずつスター
タで撹拌しながら合計２．４３ｇ（飽和度４０％）加え
、０．ＩＮ水酸化ナトリウム又は０．ＩＮ１！酸ｔ’ｐ
Ｈを７．１．−再調整し、以下実施例１の（２）と同様
に操作した。この場合、沈殿の溶解液中にはＥＧＦが１
．８μｇ、タンパク質が４．８ｒＩＫ含まれており、Ｅ
ＧＦの回収率は２６％に過ぎなかった（第１表）。

第液量（ｍ１２）前処理液　　１０（供給液）実施例１１．０比較例１１．０本前処理液（供給液）１表ＥＧＦ　（μｇ）タンパク質〔回収率本〕（■）７、０　　　　９．０（１００％〕６、２　　　　４．５〔８９％〕１、８　　　　４．８〔２６％〕のＥＧＦ量を１００とした。

（実施例２）（１）新鮮なヒト男子圧２００ＱにＩＮ塩酸を加え、ｐ
Ｈを３．５に調整したのち、あらかじめ０、ＩＮ酢酸８
Ｍ液（ｐ　Ｈ３、５）　テｐ　Ｈ３、５に緩衝化したカ
チオン交換樹脂「バイオレックス７０」　（バイオラッ
ド社製）２Ｑを加え、２〜１０°Ｃで２４時間撹拌した
。樹脂をろ別し、水洗したのち、樹脂を１Ｍ酢酸アンモ
ニウム（アンモニア水でｐＨ８，５に調整）２．５８で
４回処理し、ＥＧＦを含有する抽出液１０１２を得た。

次いで上記抽出液をスチレン系吸着樹脂ｒＸＡＤ７」　
（オルガノ社製）２００ＩＩＩＱを充填したカラムに５
００＋ｎＱ／ｈの速さで負荷し、ＥＧＦを吸着させた。

カラ１１をＦａｉｌ水５００ｗＱで洗浄したのち、ＩＩ
！ｆｉ０．０６Ｍｔｌむメタ／−ル４００ＩＱを流し、
ＥＧＦを溶出した。溶出液をＩＮ水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７，０に中和し、約４０℃の温浴上、ロータリーエバ
ポレータでメタノールを除去し、ＥＧＦ＠！１１製液６
０ｍＤ、を得た。このＥＧＦ！＄１！製液のＥＧＦ及び
タンパク質を分析すると、総量はそれぞれ５９４０　ｔ
ｔ　ｇ及び１０３ｍｇであった。

（２）遠沈管３本にそれぞれ上記（１）で得たＥＧＦ粗
精製液１０ｍ１２ずつをとり、０．ＩＮ＠酸を加えてｐ
Ｈをそれぞれ４，０．４．５及び５．０に調整した。よ
く粉砕した固形の硫酸アンモ・ニウムを少量ずつスター
タで撹拌しながら合計３．１３ｇ（飽和度５０％）をそ
れぞれに加え、ｐＨをそれぞれ４．０．４．５及び５．
０に再調整したのち、２〜１０℃の冷室中で一晩放置し
た。生じた沈殿を１１００００Ｘで１５分間遠心し、上
清は除去し、沈殿は精製水１．０ｍＱに溶解した。この
沈殿の溶解液中にはＥＧＦ／タンパク質がそれぞれ６５
３μｇ／６．２■、８１２μに／６．７■及び６９３μ
ｇ７６．８■含まれており、ＥＧＦの回収率はそれぞれ
６６％、８２％及び７０％（第２表）であった。

（比較例２）実施例２の（１）で得たＥＧＦ粗精製液１０ｍＱを遠沈
管にとり、よく粉砕した固形の硫酸アンモニウムを少量
ずつスタータで撹拌しながら合計３．１３　ｇ（飽和度
５０％）を加え、０．ＩＮ水酸化ナトリウム又は０．Ｉ
Ｎ塩酸でＰＨを７．０に再調整し、以下、実施例２の（
２）と同様に操作した。この場合沈殿の溶解液中にはＥ
ＧＦが２６７μｇ、タンパク質が６．６■含まれており
、ＥＧＦの回収率は２７％に過ぎなかった（第２表）。

第　　２　　表液　量　ＥＧＦ　（μｇ）　タンパク質〔発明の効果〕本発明は次のような効果を奏する。

（１）高い濃縮効果が得られる６（２）ＥＧＦの回収率が高い。

（３）大量処理が可能である。

（４）操作が簡単で、所要時間も短い。

（５）不純物を除去する効果もある。

そのため、本発明はＥＧＦの製造に有用な方法である。

Claims

【特許請求の範囲】

１、上皮細胞成長因子を含有する溶液をｐＨ４．０〜５
．０で塩析することを特徴とする濃縮及び／又は精製さ
れた上皮細胞成長因子の製造法。