KR100341297B1 - 재조합활성형프로인슐린의분리.정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 극성 메타크릴레이트계 수지와 활성형 프로인슐린과의 흡착 및 탈착을 이용하여 재조합 대장균으로 부터 발현되는 비 활성형 프로인슐린을 활성형 프로인슐린으로 전환하는 단백질 재접힘 반응 후, 반응 혼합물로 부터 활성형 프로인슐린을 분리ㆍ정제하는 방법에 관한 것이다. 활성형 프로인슐린의 정제에 본 발명의 방법을 이용하면 경제적으로 신속ㆍ용이하게 활성형 프로인슐린을 제조할 수 있다.

Description

재조합 활성형 프로 인슐린의 분리ㆍ정제 방법

본 발명은 재조합 프로인슐린의 정제방법에 관한 것이다.

구체적으로 재조합 대장균으로부터 응집체로 대량 발현되는 비활성형 프로인 슐린을 활성형으로 전환시키는 단백질 재접힘 (protein refolding) 반응 후, 공업용 흡착 수지를 이용하여 반응 혼합물로부터 불순물을 분리시켜 정제된 활성형 프로인슐린을 회수하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 제조할 비활성형 프로 인슐린을 활성형으로 전환시키는 재접힘 반응 후 활성형 프로 인슐린을 분리ㆍ정제하기 위하여 세파덱스 G-50과 같은 겔 여과 (Gel filtration) 크로마토그래피 또는 이온교환 (ion exchange) 크로마토그래피 등이 수행되며 이를 위해선 먼저 반응액의 완충 용액이 바뀌고 염들이 제거되어야 하므로 탈염화 과정이 수반된다 (참조: 미합중국 특허 제4,430,266).

탈염화를 위하여 널리 사용되고 있는 방법에는 겔여과법, 투석법 또는 한외 여과법(ultra filtration)이 있다. 겔 여과법은 세파덱스 G-25와 같은 폴리덱스트란 겔을 사용한 크로마토그래피 방법으로 물질의 분자량 또는 구조에 따라 겔의 일정 구멍(pore)을 통과하는데 걸리는 시간의 차이를 이용한다. 투석법은 겔대신 투석막(dialysis membrane)을 이용하며, 한외 여과법은 홀로우 섬유(Hollow fiber)나 카세트(cassette)와 같은 카트리지(cartridge)와 디스크 막 (disc membrane) 을 이용한다.

그러나 위와 같은 방법은 몇가지 문제점을 가지고 있다.

예를들면 겔여과법은 시료처리 용량이 시료의 양 또는 농도보다 칼럼에 충진된 겔의 부피에 의존하므로 시료의 농도가 희석되면 될 수록 칼럼의 크기가 증가된다(처리용량:겔 부피의 10%내지 25%이내). 또한, 용출된 시료의 농도가 희석되므로 부피가 증가되어 후속공정에 문제를 야기시킬 수 있다.

투석법은 투석막에 시료의 비특이적 결합으로 인한 시료손실과 처리용량 제한 등이 문제되며, 한외 여과법은 처리용량의 증가 및 농축의 효과를 갖고 있지만 시설을 갖추어야 되고 비특이적 결합, 파울링 (fouling) 및 프러깅 (plugging)등으로 시료 손실과 유속 감소가 발생한다.

본 발명자는 기존 방법의 원리와 달리 활성형 프로인슐린과 공업용 수지와의 흡착을 이용하여 탈염화를 함으로 상기 열거한 방법들의 문제점 즉, 처리용량의 제한, 용출시료의 희석, 비선택적 결합 및 경제적 부담을 해결할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 극성 메타크릴레이트(methacrylate)계 수지를 이용하여 재조합 프로인슐린을 분리ㆍ정제하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1)활성형 프로인슐린을 포함한 재접힘 반응액을 pH 약 3내지 약 11에서 공업용 흡착수지에 적용시키는 흡착단계와, 2)아세톤 약 15% 내지 약 50%를 함유하는 pH 약 3내지 4의 수성용출제를 사용하여 활성형 프로인슐린을 수지로 부터 용출시키는 탈착단계를 포함하며, 흡착단계와 탈착단계를 통하여 탈염, 농축하여 활성형 프로인슐린이 거의 완전히 회수되도록 한다.

본 발명에서 사용되는 공업용 흡착수지에는 극성 메타크릴레이트계 수지가 포함된다. 실제로는 HP-2MG란 상표로 미쯔비시사가 시판하고 있는 극성 메타크릴레이트계 수지가 바람직하다.

본 발명공정은 흡착 단계 및 탈착단계가 필수적이며 바람직하게는 중간세척단계가 포함될 수 있다. 더욱이 탈염, 농축 및 정제 효율을 위하여 공정을 칼럼조건하에서 수행하는 것이 훨씬 바람직하지만, 뱃치법 또는 칼럼법으로 사용할 수 있다.

본 발명의 흡착단계에서 사용되는 재접힘 반응액은 활성형 프로인린을 포함한다. 활성형 프로인슐린은 재조합 DNA로 부터 발현된 산물로써 일반적인 재조합 인슐린 제조과정인 CNBr 분해, 설포네이션 (sulfonation) 및 재접힘 반응을 거쳐 수득 된다[참조: Chance, et al.,Diabetes care4, 147-154 (1981)]. 재접힘 반응액에는 그리신 (glycine), 환원제 (DTT or β-mercaptoethanol) 및 조건에 따라 요소, 세척액 (detergent), NaCl 등을 함유 할 수 있으며 이들 불순물들은 탈염화 과정에 의하여 제거 되어진다. 상술한 바와 같은 활성형 프로인슐린을 함유한 재접힘 반응 혼합물을 흡착 시킬 때 반응 혼합액의 pH를 약 3 내지 4로 조정하고 HP-2MG에접촉 시키는데, 이때 산성 pH로의 조정은 재접힘 반응을 정지 시킨다.

흡착단계가 완료되면 pH 약 3내지 4인 아세트산 완충용액으로 세척한다.

수지에 흡착이 완료되거나, 세척단계가 포함된 경우 세척이 완료되면, 수성 용출제를 사용하여 탈착시킴으로써 탈염 및 농축된 활성형 프로인슐린을 회수한다. 흡착된 프로인슐린의 용출에 사용된 수성 용출제는 아세톤 약 15% 내지 약 50%를 함유하여야 하며 바람직하게는 30% 내지 50%이어야 한다.

아울러 극성 메타크릴레이트계 수지에 흡착을 위하여 가하는 활성형 프로인슐린을 함유한 혼합 단백질의 양은 수지 1리터당 8그람이고 용적하는 시료의 단백질 농도는 프로인슐린 재접힘 반응조건에 따라 0.1 mg/ml 내지 5mg/ml로 다양하다.

본 발명에 의한 활성형 프로인슐린의 회수는 90% 이상이며 흡착단계에서 용적하는 단백질의 농도에 따라 몇 배에서 몇십배의 농축효과를 갖는다.

전 공정은 약 4℃에서 수행할 수 있으나 편리를 위하여 상온에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법을 이용하면 재조합 인슐린 제조시 생성되는 중간 산물인 활성형 프로인슐린을 경제적으로 탈염, 농축 및 정제 할 수 있고, 용출액 자체를 후속공정에 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 청구범위는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

＜실시예1＞ 재조합 활성형 인체 프로인슐린의 정제

HP-2MG 수지를 상온에서 6시간 동안 수지 1그람당 5밀리리터로 습윤화 시킨다. 그다음 수지를 차례로 0.1N NaOH, 물, 0.1N HCl, 물 및 20mM 아세트산 (pH3.2±0.2)으로 충분히 세척하고 칼럼에 충진한다. 그 다음, 칼럼 부피 3배의 평형완충용액(20mM 아세트산 pH3.2±0.2)을 시간당 칼럼부피 1배의 유속으로 통과시켜 평형에 도달시킨다. 프로인슐린 재접힘 반응이 끝난 반응혼합액 (0.5mg/ml)을 pH를 5.4로 조정하여 원심분리한다. 이때 얻어진 침전물은 비활성형 프로인슐린으로 다시 설포네이션하여 재접힘 반응을 하고, 활성형 프로인슐린을 함유한 상층액(0.14mg/ml)은 pH3.2±0.2로 조정하고 수지 1리터당 단백질 8그람이 되도록 용적한다. 그런다음 pH3.2±0.2의 20mM 아세트산 완충용액을 1칼럼부피 용적하여 세착한 후 활성형 프로인슐린을 30% 아세톤이 함유된 20mM 아세트산 (pH3.2±0.2)으로 용출한다.

활성형 프로인슐린은 1.5 칼럼 부피 이후 부터 3.5칼럼 부피 이내에서 용출된다. 이때 활성형 프로 인슐린이 90% 이상의 수율로 회수되고 불순물이 완전히 제거된다. 또한 약 30배의 농축효과와 약 2배 이상의 단백질 순도증가를 나타낸다. 한편 상기 활성형 프로인슐린을 함유하는 용출액은 진공에 의해 아세톤을 제거하고 동결건조하거나, 용출액의 pH를 1N NaOH로 pH5.4에 맞추고 염화아연을 0.04%되도록 첨가하여 활성형 프로인슐린을 회수한다. 이때 회수율은 95%이다.

＜실시예2＞ 재조합 활성형 인체프로인슐린의 정제를 위한 중요한 파라미터

극성 메타크릴레이트계 수지인 HP-2MG와 활성형 프로인슐린과의 흡착 탈착에 있어서 가장 적절한 반응pH, 반응시간, 완충용액 및 수성 용출용액을 결정하고자뱃치식 정제를 수행한다.

HP-2MG수지와 프로인슐린과의 흡착과 탈착에 있어서 적절한 반응 pH를 확인하기 위하여 실시예 1에서와 같이 제조한 재접힘 반응액의 각 pH를 조정하고 각 완충용액의 pH로 평형된 슬러리 상태의 HP-2MG를 흡착시키기 전에 수지로 부터 완충용액을 원심분리하여 상등액을 분석적 역상크로마토그래피하여 흡착정도를 모니터 한다.

[표 1]

HP-2MG상에서의 활성형 프로인슐린의 흡착율과 탈착율에 대한 pH의 효과

흡착이 완료되면 수지로부터 흡착반응액을 분리한다. 흡착된 수지를 수지 각 1그람당 5밀리리터의 각 세척용액으로 세척한 후 각 용출용액을 수지 1그람당 5밀리릴터를 넣고 교반한다. 그리고 흡착단계에서와 마찬가지로 분석적 역상 크로마토그래피로 탈착정도를 모니터한다.

상기 표 1에서 보듯이 흡착은 pH 약 3내지 약 11구간에서 거의 완전히 이루어지지만 탈착정도는 pH 3.4에서 가장좋다.

[표 2]

시간에 따른 HP-2MG 수지와 활성형 프로인슐린의 흡착정도

표2는 pH 3.4에서 HP-2MG수지와 활성형 프로인슐린의 흡착정도를 시간별로 분석적 역상크로마토그래피하여 나타낸 것이다.

HP-2MG에 흡착된 활성형 프로인슐린의 탈착에 가장 적절한 아세톤 농도를 확인하기 위하여, 각 농도의 아세톤을 함유한 pH3.4의 아세트산을 활성형 프로인슐린이 흡착된 수지 1그람당 50밀리리터 첨가하여 교반하면서 분석적 역상 크로마토그래피로 탈착정도를 모니터 한다.

표 3의 결과에서 알 수 있듯이 아세톤 농도는 활성형 프로인슐린의 수득에 중요한 요소로 30% 이상시 거의 완전히 활성형 프로인슐린을 수득할 수 있다.

[표 3]

HP-2MG에 흡착된 활성형 프로인슐린의 탈착정도 (아세톤%)

본 발명의 활성형 프로인슐린의 분리ㆍ정제방법은 프로인슐린을 공업용 수지에 흡착시킨 후 탈착하여 분리ㆍ정제하는 방법으로서, 선택성이 좋으며 별도의 탈염과정을 필요로 하지 않아 공정이 간단하고, 다량을 처리할 수 있고, 용출시료가 희석되지 않기 때문에 이로 인한 농축과정이 생략될 수 있는 우수한 효과가 있다.

Claims (3)

1. (1)프로인슐린의 재접힘 반응 후의 활성형 프로인슐린을 함유하는 불순 혼합물을 약 pH 3 내지 약 pH 11에서 극성 메타크릴레이트계 수지에 적용시키는 흡착단계; 및 (2) 상기 수지로부터 15%에서 50%의 아세톤을 함유하는 약 pH 3 내지 약 pH 4의 아세트산 용액을 사용하여 활성형 프로인슐인을 용출시키는 탈착단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성형 프로인슐린을 함유하는 불순 혼합물로부터 활성형 프로인슐린을 분리ㆍ정제하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 극성 메타크릴레이트계 수지는 HP-2MG인 것을 특징으로 하는 활성형 프로인슐린을 함유하는 불순 혼합물로부터 활성형 프로인슐린을 분리ㆍ정제하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 활성형 프로인슐린은 인간 프로인슐린의 아미노산 서열에 상응하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성형 프로인슐린을 함유하는 불순 혼합물로부터 활성형 프로인슐린을 분리·정제하는 방법.