KR100195988B1 - 제조합 프로인슐린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지에 금속이온을 결합시켜 제조한 금속 친화성 수지를 사용하여, 재조합 대장균으로 부터 발현된 비활성형 프로인슐린의 활성형으로의 전환과정 중에 형성되는 프로인슐린 S-설포네이트를 선택적으로 분리·회수하는 방법에 관한 것이다. 프로인슐린 S-설포네이트의 정제에 본 발명의 방법을 이용하면, 경제적으로 고순도의 프로인슐린 S-설포네이트를 제조할 수 있다.

Description

제조합 프로인슐린의 제조방법

본 발명은 제조합 프로인슐린의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 유전공학적 방법에 의하여 제조합 대장균으로 부터 응집체 형태로 대량발현되는 비활성형 프로인슐린을 활성형으로 전환시키는 과정 중에 형성된 프로인슐린 S-설포네이트를 공업용 수지를 이용하여 선택적으로 분리·회수하는 방법에 관한 것이다.

고정화 금속 친화성 크로마토그래피(innobilized metal affinity chromatography)는 재조합 단백질의 정제를 위하여 개발되어, 재조합 인간 인슐린 생산을 위하여 응용되기도 하였다. 예를 들면, 미합중국 특허 제 4,569,794호에는 목적 단백질인 프로인슐린과 상응하는 서열을 가진 폴리펩타이드의 N-말단에 금속이온 친화성 표지(tag)를 포함하는 융합단백질을 발현시킨 다음, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 수행함으로써, 친화성 표지와 고정상의 금속이온간의 결합력에 의해 단백질을 분리하는 방법이 개시되어 있다. 이때, 친화성 표지는 금속이온에 대한 친화성을 가진 히스티딘 및 시스테인과 같은 아미노산으로 구성된 펩타이드이며, 고정상의 금속 이온은 고정상 지지체에 IDA(iminodiacetic acid), TED(N, N, N-tri(carboxymethyl)ethylenediamine) 및 NTA(nitrilo-triacetic acid)와 같은 킬레이트제(chelate agent)를 결합시킨 다음, Ni²⁺, Zn²⁺및 Cu²⁺와 같은 금속이온을 결합시킴으로써 형성된다.

그러나, 상기 문헌에서 사용된 금속 친화성 수지는 구입비용에 대한 부담이 지대할 뿐만 아니라, 정제시의 일반적인 압력에서도 쉽게 파괴되므로, 산업적 규모의 인슐린 생산공정에 사용하기에는 부적절하였다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 친화성 표지를 지닌 목적 단백질을 함유하는 혼합단백질의 수용액에 금속이온을 직접 첨가하는 뱃치법을 이용하여, 프로인슐린을 정제하려는 시도가 있었다(참고 : 대한민국 특허공고 제 94-1855호). 그러나, 이러한 정제방법 역시 단백질의 비특이적 응집이 일어나, 목적 단백질의 정제가 용이하지 못하다는 문제점을 노출시켰다.

따라서, 정제시의 일반적인 압력에도 파괴되지 않으면서도 저렴한 금속 친화성 수지를 이용하여 프로인슐린을 정제할 수 있는 새로운 방법이 필요하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 이와 같은 금속 친화성 수지를 개발하고자 연구 노력한 결과, 비교적 강한 압력하에서도 파괴되지 않으면서 적정가격으로 용이하게 입수할 수 있는 Diaion CR11 수지에 금속이온을 결합시켜 제조한 금속 친화성 수지를 사용하여, 재조합 대장균으로 부터 발현된 비활성형 프로인슐린의 활성형으로의 전환과정 중에 형성되는 프로인슐린 S-설포네이트를 선택적으로 분리하고, 이로 부터 프로인슐린을 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지인 Diaion CR11 수지는 폴리스티렌 지지체에 킬레이트제인 IDA가 결합되어 있으므로, 현재 공장폐수처리시 중금속이온 제거의 목적으로 사용되고 있다. 그러나, Diaion CR11수지는 입자크기가 크고(직경 0.4 내지 0.6mm) 소수성 지지체를 가지고 있어, 단백질 분리를 위한 크로마토그래피용 수지로는 아직까지 사용된 적이 없다.

본 발명의 목적은 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지를 사용하는 금속 친화성 크로마토그래피를 통하여 재조합 대장균으로 부터 발현된 프로인슐린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

일반적으로, 재조합 인슐린은 2가지 방법으로 수득할 수 있는데, 한 가지 방법은 인슐린-A-쇄(insulin-A-chain) 및 인슐린-B-쇄(insulin-B-chain)를 각각 발현시켜 분리한 다음, A쇄와 B쇄를 화학적으로 결합시켜 인슐린을 생성시키는 방법이며, 다른 한가지 방법은 직쇄 프로인슐린 전구체(preproinsulin)를 발현시켜 분리하고, 산화시켜 프로인슐린으로 재생시킨 다음, 프로인슐린을 효소처리하여 인슐린으로 전환시키는 방법이다.

이중, 본 발명의 발명자들은 후자의 방법에 의해 재조합 인슐린을 제조하고자 하였는데, 제조과정 중 활성형의 프로인슐린 생산시 생성되는 중간산물인 프로인슐린 S-설포네이트를 수득함으로써, 쉽게 프로인슐린을 제조할 수 있을 것이므로, 본 발명자들은 프로인슐린 S-설포네이트를 정제하는 방법에 관하여 집중연구하였다.

우선, 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합 단백질을 제조하기 위하여, 10개의 히스티딘 잔기로 구성된 폴리히스티딘 표지를 함유하는 융합 펩타이드(약 MW 14,000)가 인간 프로인슐린 서열 (약 MW 9,000)의 N-말단에 위치하도록 선택적 절단부위인 메티오닌 잔기에 의해 연결된 직쇄 프로인슐린 전구체를 발현시킨다. 그런 다음, 시아노겐 브로마이드(CNBr)를 사용하여 인간 프로인슐린 서열을 융합부위와 유리시키고, 프로인슐린 서열내의 시스테이닐 잔기를 아황산화시켜, 프로인슐린 S-설포네이트를 제조한다 (참조 : 대한민국 특허공고 제 94-1855호).

상술한 바와같이 제조된 프로인슐린 S-설포네이트를 시아노겐 브로마이드 처리에 의해 유리·생성된 N-말단 융합 펩타이드 및 절단되지 않은 직쇄 프로인슐린 전구체로 부터 분리시키기 위하여, 중합성 대형 망상조직의 켈레이트 수지를 사용한 금속 친화성 크로마토그래피를 수행한다. 그러면, 고정상의 금속이온에 폴리히스티딘 표지를 가지는 N-말단 융합 부위(약 MW 14,000)와 직쇄 프로인슐린 전구체(약 MW 23,000)는 결합하고, 폴리히스티딘 표지를 가지지 않는 프로인슐린 S-설포네이트는 결합하지 않으므로, 수지 투과액에서 프로인슐린 S-설포네이트를 얻을 수 있다.

전기 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지를 사용한 금속 친화성 크로마토그래피에서, 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합물의 pH를 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 9.0으로 조정하고, 1mM 이미다졸을 포함한 전기 pH의 완충용액으로 평행이 유지되어 있는 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지와 반응시킨다. 이때, 붕산 완충용액(sodium borate)을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지에 결합된 금속이온과 폴리히스티딘 표지와의 결합이 완결되면, 수지를 상기의 평형 완충용액으로 세척한다.

중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지를 사용한 금속 친화성 크로마토그래피는 뱃치법 또는 칼럼법으로 수행할 수 있으며, 40회 이상 재생하여 사용하여도 초기의 금속 친화성 수지와 동일한 정도의 정제도 및 정제수율을 나타낸다.

아울러, 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지와의 반응을 위하여 가하는 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합단백질의 양은 수지 1㎖ 당 2 내지 10㎎, 가장 바람직하게는 5㎎이다. 본 발명의 금속 친화성 크로마토그래피는 약 0°C 내지 약 40°C에서 수행할 수 있으나, 편리를 위하여 상온에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 금속 친화성 크로마토그래피에 의해, 프로인슐린 S-설포네이트를 90% 이상 회수하였으며, 순도는 3배 이상 증가되었다.

본 발명의 방법을 이용하면, 재조합 인슐린 생산시 생성되는 중간산물인 프로인슐린 S-설포네이트를 고순도로서 경제적으로 정제할 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

Cu²⁺가 결합된 Diaion CR11 수지의 제조

금속이온이 결합된 Diaion CR11 수지를 제조하기 위하여, 우선, 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지인 Diaion CR11 수지(Mitsubishi Casei Corp., JAPAN)를 실온에서 증류수로 충분히 세척하고, 칼럼에 충진시켰다. 그런 다음, 칼럼 부피 3배의 평형 완충용액(0.5M NaCl를 함유한 0.1M 아세트산 완충용액(NA acetate), pH 4.5)을 시간당 칼럼 부피 1배의 유속으로 통과시켜 평행에 도달시키고, 수지 1L당 약 100g의 CuSO₄를 상기의 평형 완충용액에 용해시킨 금속이온 함유용액을 시간당 0.5배 칼럼 부피의 유속으로 천천히 주입하였다. Cu²⁺가 Diaion CR11 수지에 결합되고 나면, 상기 평형 완충용액을 주입하여 과량의 Cu²⁺제거한 다음, 증류수로 충분히 세척하였다.

[실시예 2]

뱃치법에 의한 금속 친화성 크로마토그래피의 최적조건 결정

금속 친화성 Diaion CR11 수지와 폴리히스티딘 함유 단백질과의 반응에 가장 적합한 반응 pH 및 반응시간을 결정하고, 또한 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합 단백질에 대한 금속 친화성 Diaion CR11 수지의 결합용량을 결정하고자 하였다.

[실시예 2-1]

금속이온과 폴리히스티딘 함유 단백질과의 반응 pH

금속이온과 폴리히스티딘 함유 단백질과의 결합에 가장 적합한 반응 pH를 결정하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 Cu²⁺가 결합된 Diaion CR11 수지를 1mM 이미다졸을 포함한 수성 완충용액(pH 7.4 내지 10.5)으로 평형을 유지시킨 다음, 이 수지에 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합 단백질을 수지 1ml 당 5mg의 농도로 첨가하여 뱃치법으로 서서히 교반하면서 밤새 반응시켰다. 이때, 프로인슐린 S-설포네이트를 함유하는 혼합단백질 시료는 대한민국 특허공고 제 94-1855호에 기재된 방법에 따라, 10개의 히스티딘 잔기로 구성된 폴리히스티딘 표지를 함유하는 융합 펩타이드가 인간 프로인슐린의 N-말달에 연결되어 발현된 직쇄 프로인슐린 전구체에 시아노겐 브로마이드를 처리하여 프로인슐린 서열을 가진 펩타이드를 N-말단 융합부위로 부터 유리시킨 다음, 아황산화 반응을 거침으로써 제조되었다.

상기에서 금속 친화성 크로마토그래피가 종료되면, 반응상층액을 Zorbax-TMS 칼럼(DuPont, U.S.A.)을 이용한 역상 크로마토그래피로 분석하여 얻은 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보듯이, 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 프로인슐린 S-설포네이트의 정제에 있어서, 프로인슐린 S-설포네이트의 정제도 및 회수율을 고려할 때, 금속이온과 폴리히스티딘 함유 단백질과의 결합반응에 가장 pH는 9.0임을 알 수 있었다.

[실시예 2-2] 금속이온과 폴리히스티딘 함유 단백질과의 반응시간

금속이온과 폴리히스티딘 함유 단백질과의 결합에 가장 적합한 반응 시간을 결정하기 위하여, 반응 pH를 9.0으로 고정하는 점을 제외하고는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 반응시켜, 반응시간에 따라 그 상층액을 수득하여 전기영동하였다. 그런 다음, 폴리히스티딘 표지를 가지는 N-말단 융합 부위와 직쇄 프로인슐린 전구체가 금속 친화성 Diaion CR11 수지에 결합하는 정도를 결정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, 폴리히스티딘 함유 단백질이 금속 친화성 Diaion CR11 수지에 결합하는데 필요한 반응시간은 최대한 3시간이면 충분함을 알 수 있었다.

[실시예 2-3]

단백질의 첨가량 결정

금속 친화성 Diaion CR11 수지와의 반응시 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합단백질의 첨가량을 결정하기 위하여, 반응 pH 및 반응시간을 pH 9.0 및 3시간으로 고정하고, 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합단백질의 첨가량을 수지 1ml당 2.5mg 내지 15mg으로 변화시키면서 반응시키는 점을 제외하고는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 반응시켰다. 그런 다음, 반응상층액에 있는 프로인슐린 S-설포네이트를 분석하였는데, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 보듯이, 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 프로인슐린 S-설포네이트의 정제에 있어서, 프로인슐린 S-설포네이트의 정제도 및 회수율을 고려할 때, 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합단백질의 첨가량은 수지 1ml 당 5mg이 가장 바람직함을 알 수 있었다.

[실시예 3]

금속 친화성 Diaion CR11 수지의 재생조건

금속 친화성 Diaion CR11 수지에 프로인슐린 S-설포네이트를 함유한 혼합단백질을 첨가하여 뱃치법으로 금속 친화성 크로마토그래피를 수행한 다음, 수지 재생을 위해 결합된 단백질을 분리시키는 방법을 조사한 결과, 금속이온 친화성 표지와 경쟁적 리간드 관계인 이미다졸을 1M의 농도로 사용함으로써, 결합된 모든 단백질일 해리됨을 확인하였다.

하기 표4는 전기와 같은 방법으로 재생된 금속 친화성 Diaion CR11 수지를 이용하여 크로마토그래피를 반복시행하여 얻은 결과이다.

상기 표 4에 보듯이, 40회 재생 후에도 초기의 금속 친화성 Diaion CR11 수지와 동일한 정제도와 회수율을 나타냄을 알 수 있었다.

[실시예 4]

칼럼법에 의한 금속 친화성 크로마토그래피

실시예 1에서 제조된 Cu 가 결합된 Diaion CR11 수지를 1mM 이미다졸을 포함한 pH 9.0의 붕산 완충용액으로 평행을 유지시켜, 칼럼에 충진시킨 다음, 수지 1ml 당 5mg이 되는 프로인슐린 S-설포네이트 함유 혼합단백질을 시간당 칼럼부피의 1배 내지 3배의 유속으로 칼럼에 주입하고, 칼럼을 통과한 여액을 다시 각각의 유속으로 재주입하여 총 3시간 동안 주입하였다. 그런 다음, 칼럼을 통과한 여액에 존재하는 프로인슐린 S-설포네이트를 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 보듯이, 뱃치법의 경우와 마찬가지로 폴리히스티딘 함유 단백질이 금속 친화성 Diaion CR11 수지에 결합하는데 필요한 반응시간은 3시간이면 충분하며, 뱃치법에 의한 금속 친화성 크로마토그래피와 동일한 정제도 및 회수율을 나타냄을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 Diaion CR11 수지에 금속이온을 결합시켜 제조한 금속 친화성 수지를 사용하여, 재조합 대장균으로 부터 발현된 비활성형 프로인슐린의 활성형으로의 전환과정 중에 형성되는 프로인슐린 S-설포네이트를 선택적으로 분리·회수하는 방법을 제공한다. 프로인슐린 S-설포네이트의 정제에 본 발명의 방법을 이용하면, 경제적으로 고순도의 프로인슐린 S-설포네이트를 제조할 수 있다.

Claims (2)

1. (ⅰ) 폴리히스티딘 표지를 함유하는 융합펩타디으가 프로인슐린의 N-말단에 연결되어 발현된 직쇄 프로인슐린 전구체에 시아노겐 브로마이드를 처리하여 전기 융합펩타이드를 프로인슐린으로부터 유리시키는 공정 ; (ⅱ) 전기 프로인슐린의 시스테이닐 잔기를 아황산화시켜 프로인슐린 S-설포네이트 함유 단백질 혼합물을 제조하는 공정 ; (ⅲ) 전기 단백질 혼합물의 pH를 8.5 내지 9.5로 조정하고, 이미다졸을 포함하는 전기 pH의 인산완충용액 또는 붕산완충용액으로 평형이 유지된 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지에 수지 1ml 당 2 내지 15mg 단백질의 용량으로 가하고, 3시간 이상 뱃치법 또는 칼럼법으로 반응시켜, 전기 유리된 폴리히스티딘 표지 및 폴리히스티딘 표지가 유리되지 않은 프로인슐린 전구체를 전기 수지에 결합시키는 공정 ; 및, (ⅳ) 반응상층액 또는 칼럼 통과액으로부터 프로인슐린 S-설포네이트를 수득하는 공정을 포함하는 프로인슐린 S-설포네이트의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지는 Diaion CR11 수지인 것을 특징으로 하는 프로인슐린 S-설포네이트의 제조방법.