JP2661790B2 - 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 - Google Patents
入尿トリプシンインヒビターの精製方法Info
- Publication number
- JP2661790B2 JP2661790B2 JP2324103A JP32410390A JP2661790B2 JP 2661790 B2 JP2661790 B2 JP 2661790B2 JP 2324103 A JP2324103 A JP 2324103A JP 32410390 A JP32410390 A JP 32410390A JP 2661790 B2 JP2661790 B2 JP 2661790B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- urine
- concentration
- uti
- trypsin inhibitor
- elute
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、人尿トリプシンインヒビターを工業的規模
で実施することができる精製方法に関する。
で実施することができる精製方法に関する。
人尿中にトリプシンインヒビターが含有されているこ
とは知られている。人尿トリプシンインヒビター（以
下、UTIと略す）は、分子量68000、等電点pH2〜３の糖
タンパク質であり、特にトリプシン、キモトリプシン、
プラスミンなどを阻害する（須見ら、日本生理誌、39、
53（1977））ことから、抗炎症剤として臨床応用されて
いる。
とは知られている。人尿トリプシンインヒビター（以
下、UTIと略す）は、分子量68000、等電点pH2〜３の糖
タンパク質であり、特にトリプシン、キモトリプシン、
プラスミンなどを阻害する（須見ら、日本生理誌、39、
53（1977））ことから、抗炎症剤として臨床応用されて
いる。
例えば、純度99％以上、比活性2500単位/1mg以上、エ
ンドトキシン濃度20pg/トリプシンインヒビター1mg以下
のUTIが抗炎症剤として使用されている。
ンドトキシン濃度20pg/トリプシンインヒビター1mg以下
のUTIが抗炎症剤として使用されている。
ところで、大量の尿から工業的規模でUTIを回収、精
製するには（Ｉ）高純度のUTIを得る、（II）操作が簡
便である、（III）効率がよい、（IV）再現性がよい、
（Ｖ）分解・失活がない等が要求されている。
製するには（Ｉ）高純度のUTIを得る、（II）操作が簡
便である、（III）効率がよい、（IV）再現性がよい、
（Ｖ）分解・失活がない等が要求されている。
UTIの精製方法としては、多くは電気泳動をはじめと
する実験室的手法を精製工程中に組み込んだ方法が知ら
れているのみで、これらは小量規模の精製方法でしかな
い。従来の方法として例えば、メタノール沈澱、固定化
トリプシンアフィニティークロマトグラフィー、調製用
電気泳動を組み合わせた方法（B.J.Bromke et.al.;Bioc
hem.Med.27,56（1982））、過塩素酸処理、固定化トリ
プシンアフィニティークロマトグラフィー、等電点電気
泳動、ゲル濾過を組み合わせた方法（Enzyme;35,225（1
986）等が報告されている。
する実験室的手法を精製工程中に組み込んだ方法が知ら
れているのみで、これらは小量規模の精製方法でしかな
い。従来の方法として例えば、メタノール沈澱、固定化
トリプシンアフィニティークロマトグラフィー、調製用
電気泳動を組み合わせた方法（B.J.Bromke et.al.;Bioc
hem.Med.27,56（1982））、過塩素酸処理、固定化トリ
プシンアフィニティークロマトグラフィー、等電点電気
泳動、ゲル濾過を組み合わせた方法（Enzyme;35,225（1
986）等が報告されている。
本発明者らは、人尿中に存在するUTIを工業的規模で
かつ上記医薬用としての純度を有するまで容易に高純度
化する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
かつ上記医薬用としての純度を有するまで容易に高純度
化する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
すなわち、本発明は以下を要旨とするものである。
1.下記の工程からなることを特徴とする人尿トリプシン
インヒビターの精製方法。
インヒビターの精製方法。
第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に、塩濃度を低くし
てその吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
に吸着させた後、溶離液の極性を低くしてその吸着物質
を溶出させる工程 2.第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、銅、
バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれた少
なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈澱を
除去することを特徴とする１記載の人尿トリプシンイン
ヒビターの精製方法。
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に、塩濃度を低くし
てその吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
に吸着させた後、溶離液の極性を低くしてその吸着物質
を溶出させる工程 2.第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、銅、
バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれた少
なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈澱を
除去することを特徴とする１記載の人尿トリプシンイン
ヒビターの精製方法。
以下、さらに本発明について詳しく説明する。まず、
請求項１の発明について説明すると、この発明は、大量
の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のUTIを得
るための精製方法であって、上記した第１工程から第４
工程までの工程から成るものである。
請求項１の発明について説明すると、この発明は、大量
の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のUTIを得
るための精製方法であって、上記した第１工程から第４
工程までの工程から成るものである。
以下、工程別に説明する。
第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 この工程は、大量の尿からUTIを抽出する際、濃縮ま
たは吸着剤による回収・濃縮を行うものである。その一
般的な手段としては限外濾過濃縮および水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、カオリン、シリカ
ゲル、イオン交換樹脂、キトサン等の吸着剤による方法
が例示される。限外濾過濃縮の場合は、方式等は特に限
定されない。また、吸着剤による回収・濃縮の場合も、
UTIが吸着されるものであればその種類は特に限定され
ないが、それぞれの吸着剤の添加量、添加条件、吸着剤
からの溶出条件などを吟味する必要がある。例えば、水
酸化アルミニウムゲル（キョーワード200B:協和化学工
業（株）製）の場合は、尿を酢酸などによりpHを３〜５
に調整後0.25〜2.0％となるように添加し、数時間撹拌
吸着後、pH10〜12の溶液で溶出する事によりUTIを回収
・濃縮することが可能である。
液を得る工程 この工程は、大量の尿からUTIを抽出する際、濃縮ま
たは吸着剤による回収・濃縮を行うものである。その一
般的な手段としては限外濾過濃縮および水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、カオリン、シリカ
ゲル、イオン交換樹脂、キトサン等の吸着剤による方法
が例示される。限外濾過濃縮の場合は、方式等は特に限
定されない。また、吸着剤による回収・濃縮の場合も、
UTIが吸着されるものであればその種類は特に限定され
ないが、それぞれの吸着剤の添加量、添加条件、吸着剤
からの溶出条件などを吟味する必要がある。例えば、水
酸化アルミニウムゲル（キョーワード200B:協和化学工
業（株）製）の場合は、尿を酢酸などによりpHを３〜５
に調整後0.25〜2.0％となるように添加し、数時間撹拌
吸着後、pH10〜12の溶液で溶出する事によりUTIを回収
・濃縮することが可能である。
さらに、ウィルス除去の目的で尿原液の加熱処理60〜
65℃で10〜15時間を好ましくは実施する。
65℃で10〜15時間を好ましくは実施する。
第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第１工程で得られた尿原液をpH3〜５の
緩衝液に対して透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムに吸着させ、十分な洗浄後、塩濃
度を高めてUTIを溶出させることができる。この場合、
陰イオン交換樹脂はジエチルアミノエチル（DEAE）基、
４級化アミノエチル（QAE）基を官能基として有する物
が一般的であるが、これらに限定されるものではない。
透析用およびカラム平衡化用緩衝液には、0.05〜0.15M
程度の添加ナトリウムを添加しておいてもよく、UTIの
溶出する塩濃度は好ましくは0.25〜0.35M塩化ナトリウ
ムである。
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第１工程で得られた尿原液をpH3〜５の
緩衝液に対して透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムに吸着させ、十分な洗浄後、塩濃
度を高めてUTIを溶出させることができる。この場合、
陰イオン交換樹脂はジエチルアミノエチル（DEAE）基、
４級化アミノエチル（QAE）基を官能基として有する物
が一般的であるが、これらに限定されるものではない。
透析用およびカラム平衡化用緩衝液には、0.05〜0.15M
程度の添加ナトリウムを添加しておいてもよく、UTIの
溶出する塩濃度は好ましくは0.25〜0.35M塩化ナトリウ
ムである。
第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に、塩濃度を低くし
てその吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第２工程で得られた溶出液に、硫酸アンモ
ニウムを1.2〜1.5Mとなるように添加して試料を作製
し、あらかじめ同濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩
衝液で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム、例え
ば、官能基にフェニル基、オクチル基、ブチル基を有す
る担体を充填したカラムに試料を給送しタンパク質を吸
着させ、硫酸アンモニウム濃度を1.0〜0.65Mに低下させ
ることで溶出される画分をUTI活性画分として分取し、
他の夾雑タンパク質と分離した。
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に、塩濃度を低くし
てその吸着物質を溶出させる工程 この工程は、第２工程で得られた溶出液に、硫酸アンモ
ニウムを1.2〜1.5Mとなるように添加して試料を作製
し、あらかじめ同濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩
衝液で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム、例え
ば、官能基にフェニル基、オクチル基、ブチル基を有す
る担体を充填したカラムに試料を給送しタンパク質を吸
着させ、硫酸アンモニウム濃度を1.0〜0.65Mに低下させ
ることで溶出される画分をUTI活性画分として分取し、
他の夾雑タンパク質と分離した。
第２工程と第３工程の実施順序は、逆であっても最終
的な精製結果には何ら影響がなく、任意に選択してもよ
い。
的な精製結果には何ら影響がなく、任意に選択してもよ
い。
第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
に吸着させた後、溶離液の極性を低くしてその吸着物質
を溶出させる工程 この工程は、第３工程で得られた溶液をそのままアル
キル基（C1，C2，C4，C8，C18）やシアノプロピル基、
フェニル基などの疎水性基を化学的に結合させたシリカ
あるいはポリスチレン樹脂を固定相としたカラム（いわ
ゆる逆相系カラム）に給送し、吸着させカラムを十分に
洗浄した後溶離液（移動相）の極性を低くすることでUT
Iを分画回収するものである。逆相系カラムは特に限定
されず、上記のような様々な官能基、様々な粒径（３〜
100μｍ）、様々な孔径（100〜1000Å）の物が適用可能
であるが、一般にタンパク質を扱う場合は、より孔径の
大きい担体でアルキル鎖の比較的短いものが好ましい。
また、粒径は分離能に大きな影響を及ぼすが、粒径の小
さな担体は非常に高価であり工業的規模での使用には不
向きである。本発明に使用する担体の粒径は、15〜60μ
ｍ程度であれば全く問題ない。このような樹脂として、
ベーカーボンドWP−ブチル（C4）（15μｍ、40μm:J.T.
Baker社製）が例示されるがこれに制限されるものでは
ない。極性を低下させる溶離剤としては含水有機溶媒が
移動相として用いられ、アセトニトリル、２−プロパノ
ール、メタノール、エタノール等およびこれらの配合溶
媒が主に使用されているが、医薬品を工業的規模で製造
する目的ではエタノールの使用が好ましい。エタノール
濃度は20〜50％が適用であり、好ましくは30〜40％であ
る。
に吸着させた後、溶離液の極性を低くしてその吸着物質
を溶出させる工程 この工程は、第３工程で得られた溶液をそのままアル
キル基（C1，C2，C4，C8，C18）やシアノプロピル基、
フェニル基などの疎水性基を化学的に結合させたシリカ
あるいはポリスチレン樹脂を固定相としたカラム（いわ
ゆる逆相系カラム）に給送し、吸着させカラムを十分に
洗浄した後溶離液（移動相）の極性を低くすることでUT
Iを分画回収するものである。逆相系カラムは特に限定
されず、上記のような様々な官能基、様々な粒径（３〜
100μｍ）、様々な孔径（100〜1000Å）の物が適用可能
であるが、一般にタンパク質を扱う場合は、より孔径の
大きい担体でアルキル鎖の比較的短いものが好ましい。
また、粒径は分離能に大きな影響を及ぼすが、粒径の小
さな担体は非常に高価であり工業的規模での使用には不
向きである。本発明に使用する担体の粒径は、15〜60μ
ｍ程度であれば全く問題ない。このような樹脂として、
ベーカーボンドWP−ブチル（C4）（15μｍ、40μm:J.T.
Baker社製）が例示されるがこれに制限されるものでは
ない。極性を低下させる溶離剤としては含水有機溶媒が
移動相として用いられ、アセトニトリル、２−プロパノ
ール、メタノール、エタノール等およびこれらの配合溶
媒が主に使用されているが、医薬品を工業的規模で製造
する目的ではエタノールの使用が好ましい。エタノール
濃度は20〜50％が適用であり、好ましくは30〜40％であ
る。
以上、上記した第１工程から第４工程までのUTIの精
製方法を実施することにより大量の尿から工業的規模で
医薬品に適する高純度のUTIを得ることができる。
製方法を実施することにより大量の尿から工業的規模で
医薬品に適する高純度のUTIを得ることができる。
次に、請求項２の発明について説明すると、この発明
は大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のUT
Iを得るための精製方法であって請求項１の改良発明で
ある。
は大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のUT
Iを得るための精製方法であって請求項１の改良発明で
ある。
すなわち、請求項１記載の第１工程の後に、金属塩に
よる処理工程を実施するものである。この工程は、尿原
液中の夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする
粘性物質をUTIの活性損失することなく除去するもので
ある。これにより請求項１記載の第２工程以降において
は、（Ｉ）カラムに対する負荷を軽減し、（II）十分な
分離を行うことができる。
よる処理工程を実施するものである。この工程は、尿原
液中の夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする
粘性物質をUTIの活性損失することなく除去するもので
ある。これにより請求項１記載の第２工程以降において
は、（Ｉ）カラムに対する負荷を軽減し、（II）十分な
分離を行うことができる。
この金属塩処理工程は、第１工程で得られた尿原液に
亜鉛、カルシウム、銅、バリウム、アルミニウムの各金
属塩から選ばれた少なくとも一種以上の金属塩を添加し
た後、生じた沈澱を除去するものである。この沈澱は、
夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘性物
質等である。
亜鉛、カルシウム、銅、バリウム、アルミニウムの各金
属塩から選ばれた少なくとも一種以上の金属塩を添加し
た後、生じた沈澱を除去するものである。この沈澱は、
夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘性物
質等である。
添加する金属塩は、亜鉛、カルシウム、銅、バリウ
ム、アルミニウムの硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物等
が利用可能であり、添加濃度は10mM〜5M程度であり、好
ましくは、0.1〜1.0Mである。添加方法は、特に限定さ
れないが、添加した金属塩が均一に溶解する条件が望ま
しく、４〜80℃の温度範囲の中で撹拌及び／又は振とう
しつつ添加し、0.5〜24時間放置するのが好ましい。
ム、アルミニウムの硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物等
が利用可能であり、添加濃度は10mM〜5M程度であり、好
ましくは、0.1〜1.0Mである。添加方法は、特に限定さ
れないが、添加した金属塩が均一に溶解する条件が望ま
しく、４〜80℃の温度範囲の中で撹拌及び／又は振とう
しつつ添加し、0.5〜24時間放置するのが好ましい。
この工程の後に、請求項１記載の第２工程から第４工
程を同様に引き続き実施するものである。
程を同様に引き続き実施するものである。
以上、上記した第１工程から第５工程までのUTIの精
製方法を実施することにより、大量の尿から工業的規模
でかつ、良好な操作性で、医薬品に適する高純度のUTI
を得ることができる。また本発明の請求項１及び２の精
製方法を実施することにより、医薬品に混入し、体内に
投与されたときに発熱作用を誘発する物質、いわゆるパ
イロジェンの除去も可能である。
製方法を実施することにより、大量の尿から工業的規模
でかつ、良好な操作性で、医薬品に適する高純度のUTI
を得ることができる。また本発明の請求項１及び２の精
製方法を実施することにより、医薬品に混入し、体内に
投与されたときに発熱作用を誘発する物質、いわゆるパ
イロジェンの除去も可能である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例 １ 第１工程 正常人尿1000lに塩酸を添加し、pHを4.0に調整して酸
処理尿を得た。この酸処理尿に5Kgの水酸化アルミニウ
ムゲル（キョーワード200B;協和化学工業（株）製）を
添加し、室温にて３時間撹拌した。１時間の静置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50lで２時間撹拌溶出を行ない、遠心分離（8
000回転、60分）により溶出液を得た。
処理尿を得た。この酸処理尿に5Kgの水酸化アルミニウ
ムゲル（キョーワード200B;協和化学工業（株）製）を
添加し、室温にて３時間撹拌した。１時間の静置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50lで２時間撹拌溶出を行ない、遠心分離（8
000回転、60分）により溶出液を得た。
第２工程 第１工程で得られた尿原液を、65℃の恒温水槽中で撹
拌下、10時間加熱処理した。処理後生じた沈澱は、遠心
分離（8500回転、60分）により除去した。この溶液を、
パイロジェンフリー水で希釈し、電気伝導度を15mmhoに
調整し、さらに酢酸でpHを４に合わせた。50mM NaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）であらかじめ平衡化
しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファイン
A500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に給
送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3M NaClを含
有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画分
を,UTI活性画分として分取した。この画分の活性回収率
は86％であり、比活性は1527U/mgであった。
拌下、10時間加熱処理した。処理後生じた沈澱は、遠心
分離（8500回転、60分）により除去した。この溶液を、
パイロジェンフリー水で希釈し、電気伝導度を15mmhoに
調整し、さらに酢酸でpHを４に合わせた。50mM NaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）であらかじめ平衡化
しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファイン
A500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に給
送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3M NaClを含
有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画分
を,UTI活性画分として分取した。この画分の活性回収率
は86％であり、比活性は1527U/mgであった。
第３工程 第２工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを1.3M
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.85M硫
酸アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.85M硫
酸アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は91％であり、比活性は2388U/
mgであった。
mgであった。
第４工程 第３工程で得られた溶液を、あらかじめ２％エタノー
ル溶液で平衡化したベーカーボンドWP−ブチル（C4）
（40μm:J.T.Baker社製）充填カラム（直径7cm、高さ11
cm）に給送し、吸着させた後カラム容積の10倍量の同エ
タノール溶液で洗浄し、さらに30％エタノール溶液で溶
出される画分をUTI活性画分として分取した。
ル溶液で平衡化したベーカーボンドWP−ブチル（C4）
（40μm:J.T.Baker社製）充填カラム（直径7cm、高さ11
cm）に給送し、吸着させた後カラム容積の10倍量の同エ
タノール溶液で洗浄し、さらに30％エタノール溶液で溶
出される画分をUTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は89％であり、比活性は2641U/
mgであった。また、エンドトキシン濃度は3.1pg/mg・UT
Iであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
mgであった。また、エンドトキシン濃度は3.1pg/mg・UT
Iであった。純度は、電気泳動法およびHPLC法により99
％以上と推定された。
実施例 ２ 第１工程 正常人尿1000lに塩酸を添加し、pHを4.0に調整して酸
処理尿を得た。この酸処理尿に5Kgの水酸化アルミニウ
ムゲル（キョーワード200B;協和化学工業（株）製）を
添加し、室温にて３時間撹拌した。１時間の静置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50lで２時間撹拌溶出を行ない、遠心分離（8
000回転、60分）により溶出液を得た。
処理尿を得た。この酸処理尿に5Kgの水酸化アルミニウ
ムゲル（キョーワード200B;協和化学工業（株）製）を
添加し、室温にて３時間撹拌した。１時間の静置後、上
清と吸着剤をデカンテーションで分離し、さらに吸引濾
過により水で吸着剤を洗浄した。この洗浄吸着剤を１％
アンモニア50lで２時間撹拌溶出を行ない、遠心分離（8
000回転、60分）により溶出液を得た。
第２工程 第１工程で得られた尿原液を塩酸で中和後、0.5Mとな
るように塩化亜鉛を添加し、室温３時間放置後遠心分離
（8500回転、60分）により沈澱を除去した。この塩化亜
鉛処理液をペリコンカセット（ミリポア社製）による限
外濾過で5lまで濃縮し亜鉛処理尿原液とした。
るように塩化亜鉛を添加し、室温３時間放置後遠心分離
（8500回転、60分）により沈澱を除去した。この塩化亜
鉛処理液をペリコンカセット（ミリポア社製）による限
外濾過で5lまで濃縮し亜鉛処理尿原液とした。
第３工程 第２工程で得られた尿原液を、65℃の恒温水槽中で撹
拌下、10時間加熱処理した。処理後再度生じた沈澱は、
遠心分離（8500回転、60分）により除去した。この溶液
を、パイロジェンフリー水で希釈し電気伝導度を15mmho
に調整し、さらに酢酸でpHを４に合わせた。50mM NaCl
を含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）であらかじめ平衡
化しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファイ
ンA500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に
給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3M NaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画
分を、UTI活性画分として分取した。この画分の活性回
収率は88％であり、比活性は1829U/mgであった。
拌下、10時間加熱処理した。処理後再度生じた沈澱は、
遠心分離（8500回転、60分）により除去した。この溶液
を、パイロジェンフリー水で希釈し電気伝導度を15mmho
に調整し、さらに酢酸でpHを４に合わせた。50mM NaCl
を含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）であらかじめ平衡
化しておいた陰イオン交換カラム（DEAE−セルロファイ
ンA500:生化学工業（株）製）（直径5cm、高さ30cm）に
給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.3M NaClを
含有する0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）により溶出される画
分を、UTI活性画分として分取した。この画分の活性回
収率は88％であり、比活性は1829U/mgであった。
第４工程 第３工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを1.3M
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.85M硫
酸アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
となるように添加し、これをあらかじめ1.3M硫酸アンモ
ニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセファロ
ースカラム（ファルマシア社製）（直径2.6cm、高さ30c
m）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。0.85M硫
酸アンモニウムを含有する緩衝液により溶出される画分
を、UTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は93％であり、比活性は2516U/
mgであった。
mgであった。
第５工程 第４工程で得られた溶液を、あらかじめ２％エタノー
ル溶液で平衡化したベーカーボンドWP−ブチル（C4）
（40μm:J.T.Baker社製）充填カラム（直径7cm、高さ11
cm）に給送し、吸着させた後カラム容積の10倍量の同エ
タノール溶液で洗浄し、さらに30％エタノール溶液で溶
出される画分をUTI活性画分として分取した。
ル溶液で平衡化したベーカーボンドWP−ブチル（C4）
（40μm:J.T.Baker社製）充填カラム（直径7cm、高さ11
cm）に給送し、吸着させた後カラム容積の10倍量の同エ
タノール溶液で洗浄し、さらに30％エタノール溶液で溶
出される画分をUTI活性画分として分取した。
この画分の活性回収率は93％であり、比活性は2749U/
mgであった。また、エンドトキシン濃度はタンパク質濃
度5.3mg/mlにおいて注射用蒸留水レベル以下であった。
純度は、電気泳動法およびHPLC法により99％以上と推定
された。
mgであった。また、エンドトキシン濃度はタンパク質濃
度5.3mg/mlにおいて注射用蒸留水レベル以下であった。
純度は、電気泳動法およびHPLC法により99％以上と推定
された。
なお、実施例１、２におけるUTI活性、タンパク質
量、エンドトキシン濃度、および純度は以下の方法によ
り測定した。
量、エンドトキシン濃度、および純度は以下の方法によ
り測定した。
1.UTI活性:Muramatsu等の方法（J.Biochem.,57,402（19
65））に準拠し、カゼイン分解法で測定した。
65））に準拠し、カゼイン分解法で測定した。
2.タンパク質:BCA法タンパク質定量キット（ピアス社
製）を用いた。
製）を用いた。
3.エンドトキシン濃度：トキシカラーシステムLS−１セ
ットおよびEt−１セット（エンドトキシン標準液）（生
化学工業社製）による比色法エンドトキシン測定法を用
いた。
ットおよびEt−１セット（エンドトキシン標準液）（生
化学工業社製）による比色法エンドトキシン測定法を用
いた。
4.純度検定 電気泳動法:SDS−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−P
AGE）により行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（C
BB）染色後、デンシトメーターにて定量分析を実施し
た。
AGE）により行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（C
BB）染色後、デンシトメーターにて定量分析を実施し
た。
HPLC法：シリカ系C4カラム（AP−803−S5:YMC製）を用
い、0.1％TFA存在下アセトニトリル溶出系で分離し、ピ
ーク面積の定量分析を実施した。
い、0.1％TFA存在下アセトニトリル溶出系で分離し、ピ
ーク面積の定量分析を実施した。
本発明による、UTIの精製方法を用いることにより、
大量の尿から工業的規模でUTIを簡便に、効率よく、再
現性をもって回収、精製することができるばかりでな
く、医薬品に適用できる高純度のUTIを得ることが可能
となった。
大量の尿から工業的規模でUTIを簡便に、効率よく、再
現性をもって回収、精製することができるばかりでな
く、医薬品に適用できる高純度のUTIを得ることが可能
となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Claims (2)
- 【請求項１】下記の工程からなることを特徴とする人尿
トリプシンインヒビターの精製方法。 第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に、塩濃度を高くしてその
吸着物質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させた後に、塩濃度を低くし
てその吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
に吸着させた後、溶離液の極性を低くしてその吸着物質
を溶出させる工程 - 【請求項２】第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシ
ウム、銅、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から
選ばれた少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生
じた沈澱を除去することを特徴とする請求項１記載の人
尿トリプシンインヒビターの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2324103A JP2661790B2 (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2324103A JP2661790B2 (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04193894A JPH04193894A (ja) | 1992-07-13 |
| JP2661790B2 true JP2661790B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=18162197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2324103A Expired - Lifetime JP2661790B2 (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2661790B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2722140B2 (ja) * | 1991-07-02 | 1998-03-04 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
| PT904541E (pt) * | 1996-03-20 | 2005-01-31 | Dyax Corp | Purificacao de activador de plasminogenio tecidual (tpa) |
| PT2398817E (pt) * | 2009-02-19 | 2015-08-28 | Xellia Pharmaceuticals Aps | Processo para purificar lipopéptidos |
-
1990
- 1990-11-27 JP JP2324103A patent/JP2661790B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04193894A (ja) | 1992-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2005225889A (ja) | 精製血清アルブミン | |
| SU1523046A3 (ru) | Способ очистки человеческого @ -интерферона | |
| JPS63503352A (ja) | タンパク質の精製 | |
| US5849874A (en) | Process for the purification of serum albumin | |
| JP2661790B2 (ja) | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
| AU594047B2 (en) | Improvements in or relating to a process for purifying growth hormone-like materials | |
| JPS6034916A (ja) | 第１ｘ因子および他のビタミンｋ依存性タンパク質の高純度精製 | |
| JP2882828B2 (ja) | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 | |
| JPH0147997B2 (ja) | ||
| JPS60169427A (ja) | タンパク質の分離方法 | |
| JPS6317899A (ja) | ハプトグロビンの精製方法 | |
| JP4154743B2 (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| JPS5810522A (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 | |
| CA1065305A (en) | PROCESS FOR THE ENRICHMENT OF THE PREGNANCY-SPECIFIC .beta.1-GLYCOPROTEIN | |
| DE4003773A1 (de) | Verfahren zur reinigung von lipocortinen | |
| AU7241294A (en) | High salt binding buffer for immunoglobulin purification with a synthetic affinity ligand | |
| EP0458652A1 (en) | A process for the purification of proteins | |
| JPH0236196A (ja) | 上皮細胞成長因子の精製法 | |
| JPS6391400A (ja) | リンホトキシンの疎水性クロマトグラフイ−による精製法 | |
| JPS61191699A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 | |
| JPH01211496A (ja) | リンホトキシンの精製方法 | |
| JPH0213372A (ja) | スーパーオキサイド・ジスムターゼの精製法 | |
| JPH03244390A (ja) | 大腸菌由来物質の除去方法 | |
| JPS61249397A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 | |
| JPS61234792A (ja) | マウスインタ−フエロンの精製法 |