JPH0236196A

JPH0236196A - 上皮細胞成長因子の精製法

Info

Publication number: JPH0236196A
Application number: JP18575788A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Higuchi; 雅之樋口; Yoshio Yamazaki; 山崎　良男
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1988-07-26
Filing date: 1988-07-26
Publication date: 1990-02-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は消化性潰瘍、皮膚疾患、角膜疾患など種々の疾
患の治療用の医薬品及び細胞培養用培地への添加剤とし
て有用な上皮細胞成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　Ｇ
ｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ、以下ＥＧＦとする）の精
製法に関する。

（従来の技術）ヒトＥＧＦ　（以下ｈ−ＥＧＦとする）はヒト尿に含ま
れる分子量的６，０００のポリペプチドであり１種々の
上皮細胞の増殖の促進作用や胃酸分泌の抑制作用などの
活性があることが知られている。

ｈ−ＥＧＦを含有するヒト尿あるいは部分精製したヒト
尿からｈ−ＥＧＦを精製する方法として従来は。

（１）凍結乾燥法。

（２）イオン交換樹脂を用いる方法（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ　４８．６６７　（
１９７９）　Ｌ（３）安息香酸を用いる方法（特公昭５
９−１９０９１８号公報記載）。

（４）タンニン酸〜セライトを用いる方法（Ｊ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　３５６　１７６５（
１９７５））。

（５）アセトンを用いる方法（特公昭４４−１２７４４
号公報記載）。

（６）硫酸アンモニウムを用いる方法（米国特許第４２
９２，８４１号明細書記載）。

（７）蒸発法。

（８）限外濾過法（％開昭６２−３０７２２号公報記載
）。

（９）重金属沈殿法。

（１０）架橋アクリル、エステル系吸着樹脂及び／又は
架橋メタクリル、エステル系吸着樹脂を用いる方法（特
開昭６２−３０７１８号公報記載）などの方法が知られ
又は考えられるがいずれも工千業的実施において以Ａに示すような欠点がある。

（発明が解決しようとする課題）前記（１）の凍結乾燥法では原料溶液の容量が多い場合
、実際上実行不可能であり、ｔた原料液の無機塩なども
そのまま濃縮される不都合がある。前記（２）のイオン
交換樹脂を用いる方法では９ｗ、料液のイオン強度が充
分低くなっていないとイオン交換樹脂にＥＧＦが吸着さ
れない為、目的に合わず。

また精製効率も低い、前記（３）の安息香酸を用いる方
法では、前もって安息香酸飽和アセトン溶液を用意して
おくことが必要であるが、この安息香酸飽和アセトン溶
液はアセトンが揮発し易く危険なうえ、アセトン揮発や
温度低下に伴い安息香酸が析出し易く、取扱いの面倒な
ものである。またこの方法で処理した尿には多蚤のアセ
トンが溶解する為、尿の再利用が制限され廃棄処理も困
難である等工業的製造法として数多くの問題点がある。

前記（４）のタンニン酸〜セライトを用いる方法では比
較的活性の高いＥＧＦが得られるが、収量は低く、工業
的製造法として使用に耐えない。前記（５）及び前記（
６）の方法は得られるＥＧＦの収量、活性共に工業的製
造法として全く使用に耐えない。前記（７）の蒸発法は
凍結乾燥法と同様、無機塩などがそのまま濃縮される不
都合があるうえ、蒸発効率を上げる為加熱するとＥＧＦ
の失活が避けられない。前記（８）の限外濾過法は細孔
径の小さいものを使用すると濾過速度が遅い為原料液容
量が大きい場合時間がかかる。細孔径を大きくすると処
理時間は短縮できるが、比較的分子量の小さいＥＧＦは
濾過されてしまい全く精製できない。前記（９）の重金
属沈殿法は、処理廃棄物として重金属を含むものが発生
する為その廃棄が非常に困難である。

前記（Ｌ（２）の方法は、ＥＧＦの回収率が高く、良い
方法であるが吸着樹脂に吸着したＥＧＦを選択的に溶出
させることができず、どうしても樹脂に吸着した様々な
不純物もＥＧＦと同時に溶出される為。

ＥＧＦの精製効率は低い。

本発明は２以上のような従来法の問題点を解決するｈ−
ＥＧＦの精製法を提供するものである。

（課題を解決するための手段）本発明は、ヒト尿を疎水性官能基を有する多孔性シリカ
ゲルと接触させてＥＧＦを該多孔性シリカゲルに吸着さ
せ、ついで該多孔性シリカゲルからＥＧＦを溶出させる
ことを特徴とするＥＧＦの精製法に関する。

本発明において、ヒト尿は、予め部分精製し。

それに含まれる不溶物を除去しておくのが好ましい。

ヒト尿を部分精製する方法としては９次の方法等が使用
できる。

（１）尿をセライト等の吸着剤に接触し九後にろ過する
方法。

（２）遠心分離する方法。

（３）尿を発泡処理する方法上記疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルとは、すで
に公知のものであり、多孔性シリカゲルを支持体として
、オクタデシルシリル基、トリメチルシリル基、オクチ
ルシリル基、フェニルシリル基、シアノプロピルシリル
基、ジフェニルシリル基等を単分子層に５ｉ−Ｃ結合さ
せたものである。

これらの疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルとして
は、比表面積が１００〜１，０００ｍ”／ｇのものが好
ましい。

ヒト尿又は部分精製したヒト尿は、前記疎水性官能基を
有する多孔性シリカゲルとｐＨ２〜８の下に接触させら
れる。ここで、ｐＨが２未満ではｈ−ＥＧＦの純度（比
活性）が小さくなり、　　ｐＨが８を超えると疎水性官
能基を有する多孔性シリカゲルが損傷を受ける可能性が
ある。ｐＨの調整は酢酸、トリフルオル酢酸等の有機酸
、塩酸、硫酸等の無機酸を使用して行うことができる。

またヒト尿又は部分精製したヒト尿に塩化ナトリウム。

硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の無機塩を添加す
るとｈ−ＥＧＦへの吸着能が向上するので好ましい。無
機塩は多すぎても吸着能向上効果に影響せず、ｉた精製
する際の不純物の低減を図る上からヒト尿又は部分精製
したヒト尿に対して１０ｉｉ量チ以下が好ましい。

ｈ−ＥＧＦ吸着後の疎水性官能基を有する多孔性シリカ
ゲルはｈ−ＥＧＦの溶出前に水又はｈ−ＥＧＦが溶出さ
れない程度の水溶性有機溶剤水溶液で洗浄することによ
り、ｈ−ＥＧＦ以外の不純物を除去することが望ましい
。この洗浄によって得られるｈ−ＥＧＦの精製度をさら
に高めることができる。

溶出ハメタノール、エタノール、プロパツール。

アセトニトリル等の水溶性有機溶剤又は該水溶性有機溶
剤を好ましくＦｉｌ　５容量チ以上含む水溶液を溶出用
液として用いて行う。溶出液中、水溶性有機溶剤の割合
が小さすぎると溶出が困難になる傾向にある。また溶出
液は、前記ｐＨの調整の説明で例示した有機酸又は無機
酸をｏ、ｏｏｉ〜ＩＮの濃度で含むのが好ましい。溶出
方法としては。

ｈ−ＥＧＦを吸着した疎水性官能基を有する多孔性シリ
カゲルと溶出用液を混合攪拌する方法、ｈ−ＥＧＦを吸
着した疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルをカラム
に充てんし、これに溶出用液を通過させる方法（逆相分
配型液体クロマトグラフィー法）等がある。以上の溶出
は、常圧下で行っても高圧下で行ってもよい。

このようにして得られた溶出液は、そのままでも容積は
小さいが、適宜濃縮することによりさらに容積を小さく
することができる。すなわち、上記溶出液は水溶性有機
溶剤を多量に含むため蒸留等による濃縮が容易である。

特にカラムを使用して溶出する場合はｈ−ＥＧＦを含む
分画のみを捕集することによシかなり容積を小さくする
ことができる。以上のようにして低塩濃度で濃縮された
ｈ−ＥＧＦ溶出液は、そのままゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、凍結乾燥、限外濾過等の処理に供す
ることが可能である。

なお、ｈ−ＥＧＦ分画の確認は、ラジオレセプタアッセ
イ（ＲＲ人）Ｋより行うことができる。

（作用）ｈ−ＥＧＦの疎水性官能基を有する多孔性シリカゲルへ
の吸着は、ｈ−ＥＧＦ分子中の疎水性アミノ酸残基と該
多孔性シリカゲルのリガンドであるアルキル基等の疎水
性基との疎水性相互作用によるものであると考えられる
。この吸着した条件下に疎水塵のよシ高い溶出用液を接
触させることにより、吸着したｈ−ＥＧＦが脱離溶出さ
れる。

ｈ−ＥＧＦは該多孔性シリカゲルと溶出液に対する相互
作用が他の尿中不純物と比べ非常に特異的であるため、
該多孔性シリカゲルをヒト尿又は部分精製したヒト尿に
適用したときに予想外の優れた精製効率及び回収率が得
られたと推察される。

（実施例）次に本発明の実施例を示す。なお、比活性は。

２８０　ｎｍの吸光度と試料の液量（ｍｌ）の積（吸光
度ユニット）あたシのｈ−ＥＧＦｉｔ（μｇ）である。

実施例１新鮮ヒト男子床１（ｌに力性ソーダを加え、ｐＨ＆５と
し１０．０００　ｒｌ）ｍ　で１０分間遠心分離して部
分精製し、清澄な尿を得た。この清澄床にトリフルオル
酢酸を加え、ｐＨ３，０とし、４℃で一夜放置後１０．
００　Ｏｒｐｍ　で１０分間遠心分離し。

そノ上清尿１（１（ｈ−ＥＧＦ濃度１３．６ａｇ／１（
ＲＲＡ法にて分析）、２８０ｎｍの吸光度ユニット２．
．２７Ｘ１０８）にトリメチルシリル・シリカゲル（Ｄ
ｅｖｅｌｏｓｉｌ　　３００　ＴＭ８．野村化学■商品
名）２７５ｍＩ！を加え３０分攪拌し、３０分以上放置
後傾斜法によりトリメチルシリルシリカゲルを採取し、
カラムに充てんした。１２容量チアセトニトリル水溶液
１５００　ｍｌで洗浄後、１２゜１５．２０，２５及び
３０容量チアセトニトリル−０，１容量’４　トＩＪフ
ルオル酢酸水溶液各５００ｄ並びに９０容量チメタノー
ル−０，０１Ｎ　　ＨＣＩ！５００　ｍｌを順次加えて
溶出を行い、フラクションコレクタで分取した。各試験
管の吸光度（２８０ｎｍ）を測定後、上記各濃度の溶出
液ごとに各分画をまとめ、力性ソーダで中和後口−タリ
ーエバポレータで濃縮してｈ−ＥＧＦが含まれていると
思われる水溶液各ｘｏｏｍｌ！を得た。吸光度のクロマ
トグラムを第１図に示した。横軸に保持時間（分画に用
いたフラクションコレクタの試験管史で表現）、縦軸に
２８０　ｎｍの吸光度を示す。また、ｈ−ＥＧＦ濃度を
ＲＲＡ法で分析したところ。

ｈ−ＥＧＦの溶出は吸光度の主ピークより非常に遅れて
おシ、アセトニトリル２５，３０％溶出液の各々のｈ−
ＥＧＦ濃度が６８３μ、；４／ｌ：、４７３μｇ／ｌで
あった。また２５及び３０％溶出液の２８０　ｎｍ吸光
度ユニットはそれぞれ４．０Ｘ１０３゜３．９Ｘ１０”
であった。この２つの分画をまとめたときの収率は８５
％、比活性は１．５Ｘ１０−２μ９／ユニツトであり、
上清銀の比活性６．０Ｘ１０−４μｇ／ユニットよシ約
２５倍向上した。

実施例２実施例１と同様の操作で得た上清銀１０１！にオクタデ
シルシリル・シリカゲル（ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ　
　１５／３０野村化学■商品名）２１０ｍＩ！を加え、
以下実施例１と同じ操作を行った。Ｒ，ＲＡ法でｈ−Ｅ
ＧＦ濃度を分析したところアセトニトリル２５チ及び３
０％溶出液のｈ−ＥＧＦ濃度は。

それぞれ１４２μｇ／１．１２２２μａｌｌであつた。

また２５％及び３０％溶出液の２８０　ｎｍ吸光度ユニ
ットはそれぞれ６．８　Ｘ　１０”、　５．９Ｘ１０”
であった。この２つの分画をまとめたときの収率は７５
チ、比活性は１．ｌＸ１０−２　μｇ／ユニットであり
、上清銀の比活性４．６Ｘ１０−４　　μｇ／ユニット
より約２４倍向上した。

実施例３セライ）濾過して部分精製した新鮮ヒト男子尿１０ｆを
用い実施例１と全く同様の操作を行った。

２５チ及び３０％アセトニトリル溶出液の分画をまとめ
たときの収率は８０チであり、比活性は２０倍向上した
。

（発明の効果）前記の実施例からも明らかなように、ＥＧＦの精製に本
発明を使用することによる効果は次のような点である。

（１）収率が高い（ＥＧＦ回収率７５〜８５チ）。

（２）精製効率が高い（比活性の上昇２０倍以上）。

（３）大量処理が可能である。

（４）脱塩効果が高い。

（５）迅速処理が可能である。

（６）濃縮効果がある（容量を１１５０以下に減少でき
る）。

従って２本発明は従来の方法と比較し、効果の非常に大
きなｈ−ＥＧＦの工業的精製法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１におけるＴ　ＭＳクロマトダラムを
示す。符号の説明１・・・２０％ＣＨ３ＣＮ　−０，１％ＴＦＡ　に対応
する溶出分画のｈ　−ＥＧＦ２・・・２５％ＣＨ３ＣＮ　−０，１％Ｔ］’Ａ　に対
応する溶出分画のｈ−ＥＧＦ３・・・３０％ＣＩ（３ＣＮ−０，１％ＴＦＡに対応す
る溶出分画のｈ　−ＥＧＦ４・・・３５％ＣＨ３ＣＮ　−０，１％ＴＦＡに対応す
る溶出分画のｈ　−ＥＧＦ

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒト尿を疎水性官能基を肩する多孔性シリカゲルと
接触させて、上皮細胞成長因子を該多孔性シリカゲルに
吸着させ、次いで該多孔性シリカゲルから上皮細胞成長
因子を溶出させることを特徴とする上皮細胞成長因子の
精製法。２、ヒト尿を予め部分精製しておく請求項１記載の上皮
細胞成長因子の精製法。