JPS60104052A - フエニルアラニンと桂皮酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つであり、医薬品
、特に医療用アミノ酸輸液等に使用され、又最近はペプ
チド系甘味料であるα−アスパラチルフェニルアラニン
メチルエステルの構成アミノ酸として関心を集めている
。

従来フェニルアラニンは、化学合成法、タンパク質加水
分解法や発酵法等によって生産されていたが、生産効率
が低いので、より効率的な生産方法が種々検討されてい
る。

これらの方法の一つに、桂皮酸を原料としてアンモニア
の存在下、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを
用いて酵素反応により、Ｌ−フェニルアラニンを製造す
る方法か力、す、この方法はフェニルアラニンの生産性
が極めて高く、工業的な製造方法として注摺１されて−
る。

しかし乍ら上記の方法に於ては、生成するＬ−フェニル
アラニンは桂皮酸やアンモニアと共存しており、Ｌ−フ
ェニルアラニンを単品として得るためには、これらの混
合物の中から、Ｌ−フェニルアラニンを分離、採取する
必要がル・るが、特にフェニルアラニンと桂皮酸は化学
構造が類似しており、相互に分離することは非當に困難
である。従って、工業的有利にＬ−フェニルアラニンを
製造するためには、共存する桂皮酸との分離を効率良く
行うことが重要である。

本発明者はこの様な状況を背景に、桂皮酸と共存するフ
ェニルアラニンの効率的な分離、精製方法について鋭意
検討した結果、多孔性の合成吸着剤を用いて、特定の条
件下で処理を行うことにより、極めて効率良くフェニル
アラニンと桂皮酸の分離ができることを見出した。

多孔性合成吸着剤は１種々の有機性の重合性モノマーを
重合、縮重合または共重合することによって得られた架
橋重合体、或は種々の１合性モノマーを重合や縮重合し
た後、架橋して得られた架橋重合体から成り、有為量の
表面積及び細孔容積を有し、各種の物質、特に医薬品や
食品等の分離精製に利用されている。そして、この様な
合成吸着剤としては、多くのものがあり、例えば、「ダ
イヤイオン」ＨＰ１０１２ｏ、ユｌ、３０、ｔｏ−ｓｏ
、ｒダイヤイオン」Ｈｐ２ＭＧ　（三菱化成工業■製；
登録萌標）やアンバーライトＸＡＤ２、ｑ、７１ｇ（米
国ローム＆）・−ス社製）等の商標で既に製造、市販さ
れている。

この様な合成吸着剤が、アミノ酸や有機酸を吸着するこ
とは既に知られており、例えもｆ、、アミノ酸では等電
点付近で最も良く吸着さ牙］２、イイ機醒ではｐＨが低
い、１１機酸の非１１！（Ｐｉｌｌ状態て■遥く吸着さ
れることも知られている。

本発明者らはこれらの知見を基に合成吸ポ斉１１を用い
てフェニルアラニンと桂皮酸を含有する混合物から、フ
ェニルアラニンを分離精製１〜イ）方法について検討し
た結果、驚くべきことに、桂皮酸の解離度やフェニルア
ラニンσ２）等？ｌｉ゛、　、−″入力・ら予測される
領域とは全く独立した溶液σ）ｐ）（によって、合成吸
ｉ　剤のフェニルアラニンと桂皮酸に対する相対吸着能
は大きく変化し、極端な場合、あるｐＨ範囲ではフェニ
ルアラニンと桂皮酸に対する相対吸着能（吸着の選択性
バま逆転する場合があり、これらの現象を巧みに牙ｌ」
用することによって、フェニルアラニンと桂皮酸の分離
が極めて効率的に行えることを見出し、本発明に到達し
た。

ものであり、その要旨は一桂皮酸とフェニルアラニンを
含む混合溶液を５合成吸着剤を用い、ｐＨ１０，０以上
の条件下クロマト展開させることを特徴とするフェニル
アラニンと桂皮酸の分離方法に存する。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明は、桂皮酸とフェニルアラニンを合成吸着剤によ
り分離するものであるが、桂皮酸とフェニルアラニンを
含有する混合溶液を合成吸着剤と接触させると１両者の
合成吸着剤に対する相対的な吸着性は、桂皮酸やフェニ
ルアラニンの濃度、その他の共存物の濃度、溶液のｐＨ
等の溶液の状態、特に溶液のｐＨに太き（依存して変化
する。例えば、第１図は、試薬特級のフェニルアラニン
と桂皮酸を各ｓｇづつ各種の濃度のアンモニア水に溶解
した溶液ｌｌ中に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を
ＳＯｍｅ添加した場合の、桂皮酸とフェニルアラニンの
相対吸着性を、桂皮酸に対する吸着性を／として示した
ものであるが、この図から明らかなように、溶液のｐＨ
によって桂皮酸とフェニルアラニンの相対吸着性は変化
し、１）Ｈ９，＆以上の領域では桂皮酸の方がフェニル
アラニンよりも良く吸着される。

酸と共存するフェニルアラニン溶液から、フェニルアラ
ニンを分離精製する方法である。

本発明方法に従い、分離処理されるフェニルアラニンと
桂皮酸を含む溶液は特に制限されず、通常溶液中のフェ
ニルアラニンと桂皮酸の０．１度は夫々０．０５〜２０
（重量）／（容量）％程度である。また、溶液のｐＨは
、９．ｊ−以上で友・れば、分離可能であるが、分離効
率の面からｐ　Ｈは１０．０以上であることが好ましい
。しかしながら、例えば、合成吸着剤を充填したカラム
に桂皮酸とフェニルアラニンを含む混合物溶液を一定量
供給し、別種の実質的にフェニルアラニンと桂皮酸を含
まない溶液を溶離剤として通して溶離展開クロマトによ
り桂皮酸とフェニルアラニンを分離する手法を採用する
場合には、桂皮酸とフェニルアラニンを含む混合溶液の
ｐＨは必ずしも１０．０以上である必要はなく１合成吸
着剤とフェニルアラニン及び桂皮酸が接触する間の、大
部分の時間の溶媒となる溶離剤のｐＨが１０．０以上で
あれば良い。これらの溶液の’ｐＨを１０．ｏ以上に保
つためのアルカリとしては、アンモニアやアミン、水酸
化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸
化物が好適に使用される。又これらの溶液中には、塩化
アンモニウムや塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等の
塩類やその他の成分が含有されてイテも差しつかエナい
。

本発明に於て使用される合成吸着剤としては。

種々の有機性の重合性モノマーを重合、共重合または縮
重合することによって得られた架橋重合体或は、種々の
重合性モノマーを重合や縮重合した後架橋して得られた
架橋重合体から成り。

有為量の表面積及び細孔容積をもつもめである。

合成吸着剤の吸着量はその表面積及び細孔容積にも大き
く影響され、通常、少くとも１０　ｏ　７ｉ７１以上、
好ましくは３００　ｒｔＶｊｊ以上の表面積を有し、且
つ少くともｏ、ｉ　ｍ１７’ｇ以上、好ましくは０、．
３　ｒｒｔＶ９以上の細孔容積をもつものが望ましい。

一方合成吸着剤の基体を構成する架橋重合体の単位構造
としては、吸着容量の点からスチレンとジビニルベンゼ
ンを主体とする芳香族系の共重合体からなる基体構造を
もつものが好ましい。

このような合成吸着剤としては、市販品として例えば［
ダイヤイオンＪＨＰ１０−　ユ０−　、！／、３０、ダ
０．ｊＯ（三菱化成工業■製；登録商標〕、アンバーラ
イトＸＡＤ２、り（米国−ローム＆ハース社製；商標）
等が挙げられる。

本発明方法を実施する際の具体的な、フェニルアラニン
と桂皮酸の分離操作方法としては、実質的に混合物溶液
のｐＨが７０．０以上の領域で合成吸着剤と接触する以
外特に制限されないが、分離を効率的に行う為には、合
成吸着剤をカラムに充填し、この充填層に桂皮酸とフェ
ニルアラニンを含む溶液を流して、クロマト分離する方
法が好ましい。

この際、ｐＨ１０，０以上である、桂皮酸とフェニルア
ラニンを含む溶液を合成吸着剤の充填層に連続的に供給
すると、吸着性の弱いフェニルアラニンが先にカラムよ
り流出し始め、遅れて桂皮酸が流出し始めるため、カラ
ム流出液の、フェニルアラニンが流出し始めた点から、
桂皮酸の流出し始める迄の分画を採取する、いわゆる先
端クロマト分離により、桂皮酸が分離されたフェニルア
ラニンを得ることができる。伺この原液中にアルカリや
塩化アンモニウムや硫酸ナトＩＪウム等の無機物等が共
存する場合、これらは１通常、桂皮酸やフェニルアラニ
ンの合成吸着剤への吸着性を向上させるが、それ自身は
。

合成吸着剤には殆んど吸着されず、フェニルアラニンの
流出に先立って、流出し始めるため、必要に応じてこれ
らの流出分画を採取することによって、アルカリ及び無
機塩類も併せ回収することが可能である。また、この原
液の充填層への供給を継続すると、合成吸着剤による吸
着は飽和に達し、流入液と流出液の組成は等しくなるが
、通常は桂皮酸が流出し始める前屈の適当な時点で通液
は停止され、その時点で合成吸着剤に吸着されている大
部分の桂皮酸と、既に流出した残りのフェニルアラニン
は、適当な溶離剤、例えばθ、／−５規定、好ましくは
θ、Ｓ〜ユ規定のアンモニアや水酸化すトリウム水溶液
を流ずことによって溶離され、フェニルアラニン含量の
減少した桂皮酸を取得する。他方、溶離剤で処理した後
の合成吸着剤は、勿論再びフェニルアラニンと桂皮酸の
分離に繰返して使用することができる。

合成吸着剤の充填層を用いてクロマト分離する別の方法
として、桂皮酸とフェニルアラニンを含む溶液を一定量
充填層に供給し、合成吸着剤に吸着された桂皮酸とフェ
ニルアラニンをｐＨ／Ｑ、０以上の溶液を溶離液として
流して、クロマト展開溶離して、桂皮酸とフェニルアラ
ニンを分離することも可能である。この際ｐＨ１０，０
以上の条件下では吸着性の弱いフェニルアラニンが先に
流出し、遅れて桂皮酸が流出するため夫々の流出分画を
採取することにより両者の分離が可能である。伺この様
に溶離剤を用いて、クロマト展開溶離により分離する場
合には１分離されるｌ桂皮酸と、フェニルアラニンを含
む溶液のｐＨは必ずしも１０．０以上である必要はなく
、分離工程時の、合成吸着剤の接触する溶液の大部分を
占め、実質的に分離を支配する溶離液のｐＨが７０．０
以上であれば良い。

これらの方法に於て、合成吸着剤の充填層高は装置や操
作上、許容される範囲内で高い方が好ましいが、通常は
０．！；−４ｍ程度が採用される。又通液の流速として
はｂｖ（空筒線速度〕で０．／−ＩＱ＠程度が好ましい
。クロマト展開る分離の程度にもよるが、通常充填層に
、混合溶液を供給して、桂皮酸がカラムより流出し始め
る迄の範囲で、合成吸着剤の充填量の００３〜１００倍
量程度の範囲が好ましい。

本発明の方法によれば、合成吸着剤にはフェニルアラニ
ンより桂皮酸の方が強く吸着さ」ｔろため、例えば先端
クロマト分離の手法を使用すれば、桂皮酸とフェニルア
ラニンを含む溶Ｒｔ中から、桂皮酸を吸着除去して、桂
皮酸の完全に除去されたフェニルアラニンを容易に得る
ことができる。この際、取得されるフェニルアラニンの
溶液中の濃度は、原液と比べて殆ど希釈されることはな
く、逆に一度合成吸着剤に吸着されたフェニルアラニン
が、より吸着性の強い桂皮酸に置換され、放出されるた
め、原液濃度よりも上回って回収できる利点もある。

一方本発明の方法に従って、溶離クロマトの手法を適用
すれば脱塩水等で溶離する場合に比Ｌ　テ桂皮酸トフェ
ニルアラニン、特ニフエニルアラニンの溶出が速くなり
、かつフェニルアラニンが桂皮酸に先立って流出するた
め、小量の溶離液量で高純度の桂皮酸及びフェニルアラ
ニンを得ることが可能であり、かつ回収された桂皮酸及
びフェニルアラニンも比較的高濃度で得られる特徴があ
る。

以下本発明を実施例及び参考例に従って更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を越えない限り、本実施例に
限定されろものではない。

参考例１ 試薬特級のＬ−フェニルアラニンとｔｒａｎｓ　−桂皮
酸を各種濃度のアンモニア水に各ｓｇづつ溶解して、夫
々の溶液の重量を／ｌとする。この溶液に、夫々水中で
５ｏｒｎｌｌづつ秤取し、遠心分離機で水分を除去した
合成吸着剤ダイヤイオンＨｐｘｏＣ三菱化成工業■製；
登録商標９を添加し、３０℃の恒温振盪槽中で１０時間
振盪した。その後溶液中に残留しているフェニルアラニ
ンと桂皮酸の濃度を測定し、原液との差よりダイヤイオ
ンＨＰ２０への吸着量をめた。

これらの結果を、フェニルアラニンの相対吸着性（ダイ
ヤイオンＨＰ２０のフェニルアラニン吸着量／ダイヤイ
オンＨＰ２０の桂皮酸吸着量）と溶液のｐＨの関係とし
て第１図に示した。図から明らかなように−ｐＨ９，，
Ｓ−を境にフェニルアラニンの桂皮酸に対する相対吸着
性は逆転している。

参考例ユ 内径３０朋ダ、高さ／’、３ｍのアクリル樹脂製カラム
に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を７、Ｏｌ充填し
た。

ｔｒ”−桂皮酸（！：Ｌ−フェニルアラニンをアンモニ
ア水に溶解し、ｔｒａｎｓ−桂皮酸ｓ　ＶＩＪ　−Ｌ−
フェニルアラニン３Ｖｌ、及びアンモニアを含むｐＨ１
０，０の混合物溶液を、上記のツノラムの上部より、２
１／ｈｒの流速て１００ｍｅ通液し、続いて溶離液と１
〜で脱塩水（ｐＨｇ、、ｒ）を２１／ｈｒの流速で流し
た。その際のツノラム流出ｆｊ、１ｊｊ（横軸ンと各成
分濃度（縦軸）の関係を第、２１ン」に示した。図中、
（ａＪは桂皮酸を、（ｂ）はフェニルアラニンを表わす
。

実施例ノ 参考例コに於て、溶離液として脱塩水の代りにｌ規定の
アンモニア水（ｐＨ／　／、１．、　）を使用した以外
は参考例コと全（同様に操作した際の結果を第３図に示
した。図中、ｃａ）は、桂皮酸を、（ｂ）はフェニルア
ラニンを表わす。

参考例−ユと比較すると、フェニルアラニンと桂皮酸の
流出順序は逆転し、フェニルアラニンは約３．３倍の濃
度で回収することができた。

実施例−一 実施例−１に於て、ｔｒａｎｓ＝桂皮酸とＬ−フェニル
アラニンを含むｐＨｌ□の混合物溶液を用いた代りに、
ｃｉｓ−桂皮酸、Ｄ　Ｌ　−７エ＝　／Ｌ／アラニン、
塩化アンモニウムをアンモニア水に溶解した、ｃｉｓ−
桂皮酸！；　ｇ／ｌ、Ｄ　Ｌ　−７エ＝ルア　ラ＝　ｙ
　！；　ｇ／１．及び塩化アンモニア水ヮ。

！１／ｌを含むｐＨ７，５の混合物溶液を用いた以外は
実施例−／と全く同様に操作した。

この際カラム流出液には、流出液量。、ｇ　ｏ　１の位
置に塩化アンモニウムの流出ピークがありさらにその後
／、７３１の位置にＤＬ−フェニルアラニンの流出ピー
クがあり、ｘ、ｓｌの位置にｃｉｓ−桂皮酸の流出ピー
クがあった。

実施例３ 内径１５ｍｍ９６、高さ／、３ｍのアクリル樹脂製カラ
ムに、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ、２　／をコタＯｍ
ｇ充填した。

ｔｒａｎｓ　−桂皮酸、ｚｏｇをΩｇ％アンモニア水／
ｌに溶解し、塩酸を適当惜別えてｐＨ調整し、脱塩水を
刃口えて／、９１とした。その時の溶液のｐＨは１０で
あった。この溶液に、ロドトルラ属微生物が産生じたＬ
−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む菌体懸濁
液／　００　ｍｅを加え、３０℃で桂皮酸のＬ−フェニ
ルアラニンへの転換反応を行なった。反応終了後菌体を
Ｅ別し、ｔｒａｎｓ−桂皮酸５　ｇ／ｌ　、　Ｌ−フェ
ニルアラニンｓ、　ｂ　ｇ／ｌと、アンモニア、塩化ア
ンモニウムを含むｐＨ９，９の溶液／、９ｇｌを得た。

この溶液を上記カラムに３０’　Ｏｍｅ／ｈｒの流速で
カラム上部より注入し、カラム下部よりの流出液中の各
成分濃度を測定した結果を第グ図に示す。

流出液＋７）　／　、２３ｒｌｌ−ｇ　７３ｍｌの間に
、桂皮酸、フェニルアラニンを含まぬ、アンモニアと塩
化アンモニウムの溶液が、原液とほぼ同濃度で回収でき
、続いてｇ７３ｒｎｌ〜／Ａ２３ｒｎτの間Ｋ、桂皮酸
を含まないＬ−フェニルアラニンを。

ｓ、ｑｇ得ることができた。この際のフェニルアラニン
濃度は、７．乙ｇ／ｌであり、原液の約／４倍の濃度で
得ることができた。桂皮酸は流出液の１６２３ｍ１以降
の時点から流出し始めたが、／７ｊＴＯｍ□ｌの時点で
原液の通液を停止した。

引続いてｌ規定のアンモニア水、ｂｘｓｒｎｌ！を！；
　００　ｍｅ／　ｈｒの流速で流し、カラムに保持され
ている桂皮酸とフェニルアラニンを溶出し、流出液／６
２！；ｒｕｅ以降の流出液と合せて、フェニルアラニン
ｑ、ノｊｉと桂皮酸ざ、７Ｉとが回収できた。

伺、図中、（ａ）は桂皮酸、（ｂ）ばＬ−フェニルアラ
ニン、ＣＣ）はアンモニア及び塩化アンモニウムを表わ
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例／に従ってフェニルアラニンと桂皮酸の
種々のｐＨの混合物溶液中で、合成吸着剤ダイヤイオン
ＨＰ、２．０と接触させた際のル 桂皮酸に対するフェニルアラニンの相対吸着性をｐＨの
関数として表わしたものであり、縦軸は相対吸着性を、
横軸は溶液のｐＨ値を示す。 第一回は、参考例ユに従ってフェニルアラニンと桂皮酸
の温合物溶液を合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ、２０のカ
ラムを用い、脱塩水で溶離展開した時の流出液中の各成
分濃度を縦軸に、流出液量を横軸に示したものである。 図中（ａ、）は桂皮酸を、（ｂＪはフェニルアラニンを
表わす。 第３図は、実施例／に従って、フェニルアラニンと桂皮
酸の混合物溶液を合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０のカ
ラムで、ｌ規定アンモニア水で溶離展開した時の流出液
の各成分濃度を縦軸に、流出液量を横軸に示したもので
ある。図中（ａ）は桂皮酸を、（ｂ）はフェニルアラニ
ンヲ表わす。 第９図は実施例−３に従って、フェニルアラニンと桂皮
酸の混合物溶液を合成吸着部ダイヤイオンＨＰ、２　／
のカラムで、先端クロマト分離したものである。図中（
ａ）は桂皮酸、（ｂ）はフェニルアラニン、ＣＣ）はア
ンモニア及び塩化アンモニウムを表わす。 出願人　三菱化成工業株式会社 代理人　弁理士　長谷用　− Ｃほか７名） 第　１　図 ン容　液ｐＨ 男　２　刀 シた出液量ｃノ） 第　３図 、７を山液童　（２） 昂　４　図 うｔと）夜ｔ　（ｍｅ） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番“５７／４
４　８３１８−４３

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　フェニルアラニンと桂皮酸を含む混合溶液を、
   合成吸着剤を用い、ＰＨ１０，０以上の条件下クロマト
   展開させることを特徴とするフェニルアラニンと桂皮酸
   の分離方法。
2. （２）合成吸着剤は、少くとも／θ０　〃ｆＪの表面積
   及び少くとも０．　／　ｍＶ！９の細孔容積を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（１）Ｊに記載の分離
   方法。
3. （３）　混合溶液中のフェニルアラニンと桂皮酸の濃度
   ハ夫／ｒ、０．０　！；　〜２０　（重量）　／　（容
   Ｗ　）餐であることを特徴とする特許請求の範囲第（１
   ）項又は第（２）項に記載の分離方法。