JPH058189B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 フエニルアラニンは必須アミノ酸の一つであ
り、医薬品、特に医療用アミノ酸輸液等に使用さ
れ、又最近はペプチド系甘味料であるα−アスパ
ラチルフエニルアラニンメチルエステルの構成ア
ミノ酸として関心を集めている。

従来フエニルアラニンは、化学合成法、タンパ
ク質加水分解法や発酵法等によつて生産されてい
たが、生産効率が低いので、より効率的な生産方
法が種々検討されている。

これらの方法の一つに、桂皮酸を原料としてア
ンモニアの存在下、Ｌ−フエニルアラニンアンモ
ニアリアーゼを用いて酵素反応により、Ｌ−フエ
ニルアラニンを製造する方法があり、この方法は
フエニルアラニンの生産性が極めて高く、工業的
な製造方法として注視されている。

しかし乍ら上記の方法に於ては、生成するＬ−
フエニルアラニンは桂皮酸やアンモニアと共存し
ており、Ｌ−フエニルアラニンを単品として得る
ためには、これらの混合物の中から、Ｌ−フエニ
ルアラニンを分離、採取する必要があるが、特に
フエニルアラニンと桂皮酸は化学構造が類似して
おり、相互に分離することは非常に困難である。
従つて、工業的有利にＬ−フエニルアラニンを製
造するためには、共存する桂皮酸との分離を効率
良く行うことが重要である。

本発明者はこの様な状況を背景に、桂皮酸と共
存するフエニルアラニンの効率的な分離、精製方
法について鋭意検討した結果、多孔性の合成吸着
剤を用いて、特定な条件下で処理を行うことによ
り、極めて効率良くフエニルアラニンと桂皮酸の
分離ができることを見出した。

多孔性合成吸着剤は、種々の有機性の重合性モ
ノマーを重合、縮重合または共重合することによ
つて得られた架橋重合体、或は種々の重合性モノ
マーを重合や縮重合した後、架橋して得られた架
橋重合体から成り、有為量の表面積及び細孔容積
を有し、各種の物質、特に医薬品や食品等の分離
精製に利用されている。そして、この様な合成吸
着剤としては、多くのものがあり、例えば、スチ
レンとジビニルベンゼンの共重合体を基体構造と
する「ダイヤイオン（三菱化成(株)製：登録商標）」
HP１０，HP２０，２１，３０，４０，５０や
アンバーライト（米国ローム＆ハース社製）
XAD２，４等、モノメタクリレートとジメタク
リレートの共重合体を基体構造とする「ダイヤイ
オン」HP２MGやアンバーライトXAD７，８等
が製造、市販されている。

この様な合成吸着剤が、アミノ酸や有機酸を吸
着することは既に知られており、例えば、アミノ
酸では等電点付近で最も良く吸着され、有機酸で
はPHが低い、有機酸の非解離状態で良く吸着され
ることも知られている。

本発明者らはこれらの知見を基に合成吸着剤を
用いてフエニルアラニンと桂皮酸を含有する混合
物から、フエニルアラニンを分離精製する方法に
ついて検討した結果、驚くべきことに、桂皮酸の
解離度やフエニルアラニンの等電点から予測され
る領域とは全く独立した溶液のPHによつて、合成
吸着剤のフエニルアラニンと桂皮酸に対する相対
吸着能は大きく変化し、極端な場合、あるPH範囲
ではフエニルアラニンと桂皮酸に対する相対吸着
能（吸着の選択性）は逆転する場合があり、これ
らの現象を巧みに利用することによつて、フエニ
ルアラニンと桂皮酸の分離が極めて効率的に行え
ることを見出し、本発明に到達した。

即ち、本発明は桂皮酸と共存するフエニルアラ
ニンの工業的有利な分離精製方法を提供するもの
であり、その要旨は、桂皮酸とフエニルアラニン
を含む混合水溶液を、スチレンとジビニルベンゼ
ンを主体とする芳香族系の共重合体またはモノメ
タクリレートとジメタクリレートを主体とするメ
タクリル系共重合体を基体構造とする多孔性合成
吸着剤を用い、PH10.0以下の条件下クロマト展開
させることを特徴とするフエニルアラニンと桂皮
酸の分離方法に存する。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明は、桂皮酸とフエニルアラニンを合成吸
着剤により分離するものであるが、桂皮酸とフエ
ニルアラニンを含有する混合水溶液を合成吸着剤
と接触させると、両者の合成吸着剤に対する相対
的な吸着性は、桂皮酸やフエニルアラニンの濃
度、その他の共存物の濃度、溶液のPH等の溶液の
状態、特に溶液のPHに大きく依存して変化する。
例えば、第１図は、試薬特級のフエニルアラニン
と桂皮酸を各5gづつ各種の濃度のアンモニア水
に溶解した溶液1l中に、合成吸着剤ダイヤイオン
HP２０を50ml添加した場合の、桂皮酸とフエニ
ルアラニンの相対吸着性を、桂皮酸に対する吸着
性を１として示したものであるが、この図から明
らかなように、溶液のpHによつて桂皮酸とフエ
ニルアラニンの相対吸着性は変化し、PH9.5以下
の領域では桂皮酸の方がフエニルアラニンよりも
良く吸着される。

本発明はこのようなPH9.5を境にして相対吸着
性が変化するという新規な知見に基づき、桂皮酸
と共存するフエニルアラニン水溶液から、フエニ
ルアラニンを分離精製する方法である。

本発明方法に従い、分離処理されるフエニルア
ラニンと桂皮酸を含む水溶液は特に制限されず、
通常溶液中のフエニルアラニンと桂皮酸の濃度は
夫々0.05〜20（重量）／（容量）％程度である。
また、水溶液のPHは、9.5以上であれば、分離可
能であるが、分離効率の面からPHは10.0以上であ
ることが好ましい。しかしながら、例えば、合成
吸着剤を充填したカラムに桂皮酸とフエニルアラ
ニンを含む混合水溶液を一定量供給し、別種の実
質的にフエニルアラニンと桂皮酸を含まない溶液
を溶離剤として通して溶離展開クロマトにより桂
皮酸とフエニルアラニンを分離する手法を採用す
る場合には、桂皮酸とフエニルアラニンを含む混
合水溶液のPHは必ずしも10.0以上である必要はな
く、合成吸着剤とフエニルアラニン及び桂皮酸が
接触する間の、大部分の時間の溶媒となる溶離剤
のPHが10.0以上であれば良い。これらの水溶液の
PHを10.0以上に保つためのアルカリとしては、ア
ンモニアやアミン、水酸化ナトリウムや水酸化カ
リウム等のアルカリ金属の水酸化物が好適に使用
される。又これらの水溶液には、塩化アンモニウ
ムや塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等の塩類
やその他の成分が含有されていても差しつかえな
い。

本発明に於て使用される合成吸着剤としては、
多孔性の架橋共重合体であり、有為量の表面積及
び細孔溶液をもつものである。合成吸着剤の吸着
量はその表面積及び細孔容積にも大きく影響さ
れ、通常、少くとも100m²／ｇ以上、好ましくは
300m²／ｇ以上の表面積を有し、且つ少くとも0.1
ml／ｇ以上、好ましくは0.5ml／ｇ以上の細孔容
積をもつものが望ましい。一方合成吸着剤の基体
を構成する架橋重合体の単位構造としては、吸着
容量の点からスチレンとジビニルベンゼンを主体
する芳香族系の共重合体からなる基体構造をもつ
ものが好ましい。このような合成吸着剤として
は、市販品として例えば「ダイヤイオン」HP１
０，２０，２１，３０，４０，５０（三菱化成工
業(株)製；登録商標）、アンバーライトXAD２、４
（米国、ローム＆ハース社製；商標）等が挙げら
れる。

本発明方法を実施する際の具体的な、フエニル
アラニンと桂皮酸の分離操作方法としては、実質
的に混合水溶液のPHが10.0以上の領域で合成吸着
剤と接触する以外特に制限されないが、分離を効
率的に行う為には、合成吸着剤をカラムに充填
し、この充填層に桂皮酸とフエニルアラニンを含
む水溶液を流して、クロマト分離する方法が好ま
しい。

この際、PH10.0以上である、桂皮酸とフエニル
アラニンを含む溶液を合成吸着剤の充填層に連続
的に供給すると、吸着性の弱いフエニルアラニン
が先にカラムより流出し始め、遅れて桂皮酸が流
出し始めるため、カラム流出液の、フエニルアラ
ニンが流出し始めた点から、桂皮酸の流出し始め
る迄の分画を採取する。いわゆる先端クロマト分
離により、桂皮酸が分離されたフエニルアラニン
を得ることができる。尚この原液中にアルカリや
塩化アンモニウムや硫酸ナトリウム等の無機物等
が共存する場合、これらは、通常、桂皮酸やフエ
ニルアラニンの合成吸着剤への吸着性を向上させ
るが、それ自身は、合成吸着剤には殆んど吸着さ
れず、フエニルアラニンの流出に先立つて、流出
し始めるため、必要に応じてこれらの流出分画を
採取することによつて、アリカリ及び無機塩類も
併せ回収することが可能である。また、この原液
の充填層への供給を継続すると、合成吸着剤によ
る吸着は飽和に達し、流入液と流出液の組成は等
しくなるが、通常は桂皮酸が流出し始める前后の
適当な時点で通液は停止され、その時点で合成吸
着剤に吸着されている大部分の桂皮酸と、既に流
出した残りのフエニルアラニンは、適当な溶離
剤、例えば0.1〜５規定、好ましくは0.5〜２規定
のアンモニアや水酸化ナトリウム水溶液を流すこ
とによつて溶離され、フエニルアラニン含量の減
少した桂皮酸を取得する。他方、溶離剤で処理し
た後の合成吸着剤は、勿論再びフエニルアラニン
と桂皮酸の分離に繰返して使用することができ
る。

合成吸着剤の充填層を用いてクロマト分離する
別の方法として、桂皮酸とフエニルアラニンを含
む水溶液を一定量充填層に供給し、合成吸着剤に
吸着された桂皮酸とフエニルアラニンをPH10.0以
上の水溶液を溶離液として流して、クロマト展開
溶離して、桂皮酸とフエニルアラニンを分離する
ことも可能である。この際PH10.0以上の条件下で
は吸着性の弱いフエニルアラニンが先に流出し、
遅れて桂皮酸が流出するため夫々の流出分画を採
取することにより両者の分離が可能である。尚こ
の様に溶離剤を用いて、クロマト展開溶離により
分離する場合には、分離される桂皮酸と、フエニ
ルアラニンを含む水溶液のPHは必ずしも10.0以上
である必要はなく、分離工程時の、合成吸着剤の
接触する溶液の大部分を占め、実質的に分離を支
配する溶離液のPHが10.0以上であれば良い。

これらの方法に於て、合成吸着剤の充填層高は
装置や操作上、許容される範囲内で高い方が好ま
しいが、通常は0.5〜5m程度が採用される。又通
液の流速としてはLV（空筒線速度）で0.1〜10m
程度が好ましい。クロマト展開溶離により分離す
る場合、充填層への混合水溶液の負荷量は、混合
水溶液の各成分濃度や必要とされる分離の程度に
もよるが、通常充填層に、混合溶液を供給して、
桂皮酸がカラムより流出し始める迄の範囲で、合
成吸着剤の充填量の0.05〜100倍量程度の範囲が
好ましい。

本発明の方法によれば、合成吸着剤にはフエニ
ルアラニンより桂皮酸の方が強く吸着されるた
め、例えば先端クロマト分離の手法を使用すれ
ば、桂皮酸とフエニルアラニンを含む水溶液中か
ら、桂皮酸を吸着除去して、桂皮酸の完全に除去
されたフエニルアラニンを容易に得ることができ
る。この際、取得されるフエニルアラニンの水溶
液中の濃度は、原液と比べて殆ど希釈されること
はなく、逆に一度合成吸着剤に吸着されたフエニ
ルアラニンが、より吸着性の強い桂皮酸に置換さ
れ、放出されるため、原液濃度よりも上回つて回
収できる利点もある。

一方本発明の方法に従つて、溶離クロマトの手
法を適用すれば脱塩水等で溶離する場合に比して
桂皮酸とフエニルアラニン、特にフエニルアラニ
ンの溶出が速くなり、かつフエニルアラニンが桂
皮酸に先立つて流出するため、小量の溶離液量で
高純度の桂皮酸及びフエニルアラニンを得ること
が可能であり、かつ回収された桂皮酸及びフエニ
ルアラニンも比較的高濃度で得られる特徴があ
る。

以下本発明を実施例及び参考例に従つて更に詳
細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限
り、本実施例に限定されるものでなはい。

参考例 １ 試薬特級のＬ−フエニルアラニンとtrans−桂
皮酸を各種濃度のアンモニア水に各5gづつ溶解
して、夫々の溶液の液量を1lとする。この溶液
に、夫々水中で50mlづづ秤取し、遠心分離機で水
分を除去した合成吸着剤ダイヤイオンHP２０
（三菱化成工業(株)製；登録商標）を添加し、30℃
の恒温振盪槽中で10時間振盪した。その後溶液中
に残留しているフエニルアラニンと桂皮酸の濃度
を測定し、原液との差よりダイヤイオンHP２０
への吸着量を求めた。これらの結果を、フエニル
アラニンの相対吸着性（ダイヤイオンHP２０の
フエニルアラニン吸着量／ダイヤイオンHP２０
の桂皮酸吸着量）と溶液のPHの関係として第１図
に示した。図から明らかなように、PH9.5を境に
フエニルアラニンの桂皮酸に対する相対吸着性は
逆転している。

参考例 ２ 内径30mmφ、高さ1.5mのアクリル樹脂製カラ
ムに、合成吸着剤ダイヤイオンHP２０を1.0l充
填した。

trans−桂皮酸とＬ−フエニルアラニンをアン
モニア水に溶解し、trans−桂皮酸5g／ｌ、Ｌ−
フエニルアラニン5g／ｌ、及びアンモニアを含
むPH10.0の混合水溶液を、上記のカラムの上部よ
り2l／hrの流速で100ml通液し、続いて溶離液と
して脱塩水（PH6.5）を2l／hrの流速で流した。
その際のカラム流出液量（横軸）と各成分濃度
（縦軸）の関係を第２図に示した。図中、ａは桂
皮酸を、ｂはフエニルアラニンを表わす。

実施例 １ 参考例２に於て、溶離液として脱塩水の代りに
１規定のアンモニア水（PH11.6）を使用した以外
は参考例２と全く同様に操作した際の結果を第３
図に示した。図中、ａは、桂皮酸を、ｂはフエニ
ルアラニンを表わす。

参考例−２と比較すると、フエニルアラニンと
桂皮酸の流出順序は逆転し、フエニルアラニンは
約3.5倍の濃度で回収することができた。

実施例 ２ 実施例−１に於て、trans−桂皮酸とＬ−フエ
ニルアラニンを含むPH10の混合水溶液を用いた代
りに、cis−桂皮酸、DL−フエニルアラニン、塩
化アンモニウムをアンモニア水に溶解した、cis
−桂皮酸5g／ｌ、DL−フエニルアラニン5g／
ｌ、及び塩化アンモニウム90g／ｌを含むPH7.5の
混合水溶液を用いた以外は実施例−１と全く同様
に操作した。

この際カラム流出液には、流出液量0.80lの位
置に塩化アンモニウムの流出ピークがありさらに
その後1.75lの位置にDL−フエニルアラニンの流
出ピークがあり、2.5lの位置にcis−桂皮酸の流出
ピークがあつた。

実施例 ３ 内径15mmφ、高さ1.5mのアクリル樹脂製カラ
ムに、合成吸着剤ダイヤイオンHP２１を250ml
充填した。

trans−桂皮酸20gを28％アンモニア水1lに溶解
し、塩酸を適当量加えてPH調整し、脱塩水を加え
て1.9lとした。その時の溶液のPHは10であつた。
この溶液に、ロドトルラ属微生物が産生したＬ−
フエニルアラニンアンモニアリアーゼを含む菌体
懸濁液100mlを加え、30℃で桂皮酸のＬ−フエニ
ルアラニンへの転換反応を行なつた。反応終了後
菌体を別し、trans−桂皮酸5g／ｌ、Ｌ−フエ
ニルアラニン5.6g／ｌと、アンモニア、塩化アン
モニウムを含むpH9.9の溶液1.98lを得た。この溶
液を上記カラムに500ml／hrの流速でカラム上部
より注入し、カラム下部よりの流出液中の各成分
濃度を測定した結果を第４図に示す。流出液の
125ml〜875mlの間に、桂皮酸、フエニルアラニン
を含まぬ、アンモニアと塩化アンモニウムの溶液
が、原液とほぼ同濃度で回収でき、続いて875ml
〜1625mlの間に、桂皮酸を含まないＬ−フエニル
アラニンを、5.7g得ることができた。この際のフ
エニルアラニン濃度は、7.6g／ｌであり、原液の
約1.4倍の濃度で得ることができた。桂皮酸は流
出液の1625ml以降の時点から流出し始めたが、
1750mlの時点で原液の通液を停止した。

引続いて１規定のアンモニア水、625mlを500
ml／hrの流速で流し、カラムに保持されている桂
皮酸とフエニルアラニンを溶出し、流出液1625ml
以降の流出液と合せて、フエニルアラニン4.1gと
桂皮酸8.7gとが回収できた。

尚、図中、ａは桂皮酸、ｂはＬ−フエニルアラ
ニン、ｃはアンモニア及び塩化アンモニウムを表
わす。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１に従つてフエニルアラニンと
桂皮酸の種々のPHの混合水溶液中で、合成吸着剤
ダイヤイオンHP２０と接触させた際の桂皮酸に
対するフエニルアラニンの相対吸着性をPHの関数
として表わしたものであり、縦軸は相対吸着性
を、横軸は溶液のPH値を示す。第２図は、参考例
２に従つてフエニルアラニンと桂皮酸の混合水溶
液を合成吸着剤ダイヤイオンHP２０のカラムを
用い、脱塩水で溶離展開した時の流出液中の各成
分濃度を縦軸に、流出液量を横軸に示したもので
ある。図中ａは桂皮酸を、ｂはフエニルアラニン
を表わす。第３図は、実施例１に従つて、フエニ
ルアラニンと桂皮酸の混合水溶液を合成吸着剤ダ
イヤイオンHP２０のカラムで、１規定アンモニ
ア水で溶離展開した時の流出液の各成分濃度を縦
軸に、流出液量を横軸に示したものである。図中
ａは桂皮酸を、ｂはフエニルアラニンを表わす。
第４図は実施例−３に従つて、フエニルアラニン
と桂皮酸の混合水溶液を合成吸着剤ダイヤイオン
HP２１のカラムで、先端クロマト分離した時の
カラム流出液（横軸）の各成分濃度ｃを原液
（Co）との濃度の比（縦軸）で表わしたものであ
る。図中ａは桂皮酸、ｂはフエニルアラニン、ｃ
はアンモニア及び塩化アンモニウムを表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フエニルアラニンと桂皮酸を含む混合水溶液
   を、スチレンとジビニルベンゼンを主体とする芳
   香族系の共重合体またはモノメタクリレートとジ
   メタクリレートを主体とするメタクリル系共重合
   体を基体構造とする多孔性合成吸着剤を用い、PH
   10.0以上の条件下クロマト展開させることを特徴
   とするフエニルアラニンと桂皮酸の分離方法。 ２ 合成吸着剤は、少くとも100m²／ｇの表面積
   及び少くとも0.1ml／ｇの細孔容積を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の分離
   方法。 ３ 混合水溶液中のフエニルアラニンと桂皮酸の
   濃度は夫々、0.05〜20（重量）／（容量）％であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第
   ２項に記載の分離方法。