JPS5848159B2 - ウロキナ−ゼの精製方法 - Google Patents
ウロキナ−ゼの精製方法Info
- Publication number
- JPS5848159B2 JPS5848159B2 JP1526676A JP1526676A JPS5848159B2 JP S5848159 B2 JPS5848159 B2 JP S5848159B2 JP 1526676 A JP1526676 A JP 1526676A JP 1526676 A JP1526676 A JP 1526676A JP S5848159 B2 JPS5848159 B2 JP S5848159B2
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- JP
- Japan
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- urokinase
- solution
- crude
- pyrogenic
- sephadex
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はウロキナーゼの精製方法、更に詳し〈は粗ウロ
キナーゼ液から発熱性物質及び不純物例えば色素、にご
り、不純蛋白質等を選択的に除去し、之等を含まず極め
て高い比活性を有するウロキナーゼを容易に効率よくし
かも経済的に収得する方法に関する。
キナーゼ液から発熱性物質及び不純物例えば色素、にご
り、不純蛋白質等を選択的に除去し、之等を含まず極め
て高い比活性を有するウロキナーゼを容易に効率よくし
かも経済的に収得する方法に関する。
ウロキナーゼは人間の尿中に痕跡量存在する酵素で、人
間に静脈注射することにより、血管中に病変として生じ
た繊維素凝固物、又は繊維素様凝固物の溶解促進作用を
有し、各種の血栓に起因する疾患の治療に有用なもので
ある。
間に静脈注射することにより、血管中に病変として生じ
た繊維素凝固物、又は繊維素様凝固物の溶解促進作用を
有し、各種の血栓に起因する疾患の治療に有用なもので
ある。
また該ウロキナーゼは従来より各種の方法で製造乃至精
製されている。
製されている。
しかしながら原料とする人尿中に含有され、人体に適用
した際悪感、発熱等の副作用を惹起させる発熱性物質を
その作用が全く発現されない程度に迄除去し得、しかも
これを効率的に且つ所期のウロキナーゼ自体の特性即ち
高力価、高比活物及び回収率をほとんど低下させること
なく、容易に簡単な操作で行ない得る方法は未だ開発さ
れるに至っていない。
した際悪感、発熱等の副作用を惹起させる発熱性物質を
その作用が全く発現されない程度に迄除去し得、しかも
これを効率的に且つ所期のウロキナーゼ自体の特性即ち
高力価、高比活物及び回収率をほとんど低下させること
なく、容易に簡単な操作で行ない得る方法は未だ開発さ
れるに至っていない。
即ち従来より、発熱性物質、色素、にごり等を含有する
粗ウロキナーゼ液から上記発熱性物質等を除去する方法
としては、例えば米国ローム・アンド・ハース社製「ア
ンバーライ｝ＩＲＣ−５０Ｊ等の弱酸性イオン交換体を
用い、之に選択的にウロキナーゼを吸着させる方法が知
られているが、この方法では、一担吸着されたウロキナ
ーゼを次に溶離せねばならず操作の煩雑さは免かれ得な
へまたジエチルアミノエチルセルロース、トリエチルア
ミノエチルセルロース等のセルロースイオン交換体を用
いる方法も知られているが、これらの方法ではその実施
条件例えば温度、ｐＨ、使用緩衝液濃度をかなり厳密に
調節する必要があり、工業的に不利である。
粗ウロキナーゼ液から上記発熱性物質等を除去する方法
としては、例えば米国ローム・アンド・ハース社製「ア
ンバーライ｝ＩＲＣ−５０Ｊ等の弱酸性イオン交換体を
用い、之に選択的にウロキナーゼを吸着させる方法が知
られているが、この方法では、一担吸着されたウロキナ
ーゼを次に溶離せねばならず操作の煩雑さは免かれ得な
へまたジエチルアミノエチルセルロース、トリエチルア
ミノエチルセルロース等のセルロースイオン交換体を用
いる方法も知られているが、これらの方法ではその実施
条件例えば温度、ｐＨ、使用緩衝液濃度をかなり厳密に
調節する必要があり、工業的に不利である。
更に交叉結合したデキストラン例エばエビクロロヒドリ
ン、エチレングリコールピスーエポキシプロビルエーテ
ル等のゲルを用いる方法も知られている。
ン、エチレングリコールピスーエポキシプロビルエーテ
ル等のゲルを用いる方法も知られている。
しかしながらこの方法はゲル済過法と呼ばれるものであ
り、細菌細胞壁由来の発熱性物質に対して積極的な吸着
除去作用は考えられず、発熱性物質等の充分な除去を行
うためには多量のゲルを要し、操作も煩雑で装置も大規
模となり、工業的に非効率的である。
り、細菌細胞壁由来の発熱性物質に対して積極的な吸着
除去作用は考えられず、発熱性物質等の充分な除去を行
うためには多量のゲルを要し、操作も煩雑で装置も大規
模となり、工業的に非効率的である。
本発明は上記した従来の各種方法に比し更に容易に且つ
効率良く良好な作業性をもって発熱性物質等を除去し、
高純度及び高回収率で目的とするウロキナーゼを収得し
得る改良された方法を提供するものである。
効率良く良好な作業性をもって発熱性物質等を除去し、
高純度及び高回収率で目的とするウロキナーゼを収得し
得る改良された方法を提供するものである。
即ち本発明は発熱性物質を含有する粗ウロキナーゼ液を
ｐＨ７〜１０のリン酸緩衝液とした後、ジエチルー（２
−ヒドロキシプロビル）一アミノプ口ピルセファデツク
ス（以下単にｒ ＱＡＥセファデツクス」という）と接
触させて上記液中に存在する発熱性物質及び不純物を選
択的に吸着除去し非吸着分画を回収することを特徴とす
るウロキナーゼの精製方法に係る。
ｐＨ７〜１０のリン酸緩衝液とした後、ジエチルー（２
−ヒドロキシプロビル）一アミノプ口ピルセファデツク
ス（以下単にｒ ＱＡＥセファデツクス」という）と接
触させて上記液中に存在する発熱性物質及び不純物を選
択的に吸着除去し非吸着分画を回収することを特徴とす
るウロキナーゼの精製方法に係る。
本発明で用いられる発熱性物質を含有する粗ウロキナー
ゼ液とは、発熱性物質の他色素、にごり、不純蛋白質等
の不純物を含有し、発熱性陽性を示し、そのままでは医
薬としての用途に適用し難いウロキナーゼ含有液をいう
。
ゼ液とは、発熱性物質の他色素、にごり、不純蛋白質等
の不純物を含有し、発熱性陽性を示し、そのままでは医
薬としての用途に適用し難いウロキナーゼ含有液をいう
。
また該粗ウロキナーゼ液には、比較的高度に精製された
ものも包含される。
ものも包含される。
之等粗ウロキナーゼ液は、従来より公知の各種方法で製
造乃至精製される。
造乃至精製される。
具体的には例えばアクリロニトリル系合成繊維やカリオ
ン等を用いて濃縮する方法や、重金属、硫酸バリウム、
ケイ酸及びその塩等又は各種イオン交換体を用いる方法
等により収得できる。
ン等を用いて濃縮する方法や、重金属、硫酸バリウム、
ケイ酸及びその塩等又は各種イオン交換体を用いる方法
等により収得できる。
本発明では上記粗ウロ村一ゼ液を、ｐＨ７〜１０のリン
酸緩衝液とした後、ＱＡＥセファデツクスと接触させる
ことを必須とする。
酸緩衝液とした後、ＱＡＥセファデツクスと接触させる
ことを必須とする。
ここでＱＡＥセファデックスは強塩基性陰イオン交換体
として公知のものである。
として公知のものである。
しかるに本発明において処理対象とする粗ウロキナーゼ
液に含有される発熱性物質とは、分子量、物理化学的性
状、生物学的活性等において異なる多種の化合物から或
り、しかも微生物の代謝産物である蛋白質又は多糖類に
脂質が結合したものと考えられるのみでその本体につき
未だ解明されて釦らず、かかる発熱性物質が、上記特定
のｐＨを有するリン酸緩衝液の形態で、ＱＡＥセファデ
ツクスを用いることにより極めて効率よく選択的に吸着
保持できるという事実は本発明者らによりはじめて見い
出されたことである。
液に含有される発熱性物質とは、分子量、物理化学的性
状、生物学的活性等において異なる多種の化合物から或
り、しかも微生物の代謝産物である蛋白質又は多糖類に
脂質が結合したものと考えられるのみでその本体につき
未だ解明されて釦らず、かかる発熱性物質が、上記特定
のｐＨを有するリン酸緩衝液の形態で、ＱＡＥセファデ
ツクスを用いることにより極めて効率よく選択的に吸着
保持できるという事実は本発明者らによりはじめて見い
出されたことである。
しかも上記ＱＡＥセファデツクスは発熱性物質を有効に
吸着保持する特性を有すると共に、粗ウロキナーゼ液中
の色素、にどり等をも良好に吸着保持し、かつウロキナ
ーゼは全くもしくはほとんど吸着しないという特性を有
する。
吸着保持する特性を有すると共に、粗ウロキナーゼ液中
の色素、にどり等をも良好に吸着保持し、かつウロキナ
ーゼは全くもしくはほとんど吸着しないという特性を有
する。
上記の如き特性は、ＱＡＥセファデツクスに特異的に認
められるものであり、他のイオン交換体例えばセルロー
ス系イオン交換体又はゲル炉過剤例えばデキストランゲ
ル、セファデックス等では上記特性は発揮されない。
められるものであり、他のイオン交換体例えばセルロー
ス系イオン交換体又はゲル炉過剤例えばデキストランゲ
ル、セファデックス等では上記特性は発揮されない。
上記ＱＡＥセファデツクスと粗ウロキナーゼ液との接触
は、従来公知の各種方法にて実施できるが、通常ＱＡＥ
セファデツケスを充填したカラム内に粗ウロキナーゼ液
を通じる方法が有利である。
は、従来公知の各種方法にて実施できるが、通常ＱＡＥ
セファデツケスを充填したカラム内に粗ウロキナーゼ液
を通じる方法が有利である。
また上記接触に際して、粗ウロキナーゼ液は、モル濃度
０．０１〜０．１５モル程度及びｐＨ７〜１０、程度の
りん酸緩衝液とするのがよく、接触時の温度はＯ℃〜２
５℃程度の範囲で適宜決定できる。
０．０１〜０．１５モル程度及びｐＨ７〜１０、程度の
りん酸緩衝液とするのがよく、接触時の温度はＯ℃〜２
５℃程度の範囲で適宜決定できる。
殊に上記接触時のｐＨ条件は、上記範囲内にあることが
重要であり、これが上記範囲を外れる場合は、いかにＱ
ＡＥセファデツクスを用いるといえども、本発明所期の
発熱性物質除去効果は顕著に発揮し難くなる。
重要であり、これが上記範囲を外れる場合は、いかにＱ
ＡＥセファデツクスを用いるといえども、本発明所期の
発熱性物質除去効果は顕著に発揮し難くなる。
之等各条件は、例えば従来のセルロース系イオン交換体
を用いる方法が通常Ｏ〜１０℃程度の低温下に、ｐＨを
６〜８に保持し、しかもｏ．ｏｉモル前後のリン酸緩衝
液を用いることによってのみ、発熱性物質の除去が行な
い得るのと対比すると、極めて実用的に有利である。
を用いる方法が通常Ｏ〜１０℃程度の低温下に、ｐＨを
６〜８に保持し、しかもｏ．ｏｉモル前後のリン酸緩衝
液を用いることによってのみ、発熱性物質の除去が行な
い得るのと対比すると、極めて実用的に有利である。
本発明に釦いては、上記接触により、粗ウロキナーゼ液
中に含有される発熱性物質及び不純物がＱＡＥセファデ
ツクスに選択的に吸着保持されるため、接触後の非吸着
分画を回収するのみで、極めて容易に、高収率をもって
高純度のウロキナーゼを収得できる。
中に含有される発熱性物質及び不純物がＱＡＥセファデ
ツクスに選択的に吸着保持されるため、接触後の非吸着
分画を回収するのみで、極めて容易に、高収率をもって
高純度のウロキナーゼを収得できる。
かくして得られた本発明の精製ウロキナーゼは、高い比
活性を保持して釦り且つ発熱性物質を充分に除去きれて
いるため、特に注射用ウロキナーゼ液として有利に用い
得るものである。
活性を保持して釦り且つ発熱性物質を充分に除去きれて
いるため、特に注射用ウロキナーゼ液として有利に用い
得るものである。
以下に本発明を実施例により説明する。
実施例 １
ｐＨ８．０ ， ０．１ リン酸緩衝液で十分乎衝化し
たＱＡＥセファデックス（ ＯＨ一タイプ）を充填した
カラム（カラムの大きさ３．ＯＸ１５Ｃｒ／Ｌ）に最終
０． １ Ｍのリン酸塩を含みｐＨ ８． ０に緩衝化
された発熱性陽性の粗製ウロキナーゼ溶液４，０００単
位／一（ ｐｌｏｕｇ ｕｎｉｔｓ，以下同じ）の１２
０−を流下させた。
たＱＡＥセファデックス（ ＯＨ一タイプ）を充填した
カラム（カラムの大きさ３．ＯＸ１５Ｃｒ／Ｌ）に最終
０． １ Ｍのリン酸塩を含みｐＨ ８． ０に緩衝化
された発熱性陽性の粗製ウロキナーゼ溶液４，０００単
位／一（ ｐｌｏｕｇ ｕｎｉｔｓ，以下同じ）の１２
０−を流下させた。
得られたウロキナーゼ溶液は、３，０２０単位／ｒｎｌ
の１５０７７２７！でこれを日本薬局方第８局の記載に
従い投与量２，０００単位／ｋｇ、４，０００単位／ｋ
ｇ家兎体重をもって、各々発熱性物質試験を行なった。
の１５０７７２７！でこれを日本薬局方第８局の記載に
従い投与量２，０００単位／ｋｇ、４，０００単位／ｋ
ｇ家兎体重をもって、各々発熱性物質試験を行なった。
結果は第１表に示すとおりであり、発熱性陰性と認めら
れた。
れた。
実施温度は２５℃にて行なった。
尚カラムに吸着された発熱性物質及び不純物は０． ４
Ｎ−ＭＣ Ｉ溶液で溶出した。
Ｎ−ＭＣ Ｉ溶液で溶出した。
この時出発ウロキナーゼの比活性は、１０，４００＊＊
単位／■蛋白量でありＱＡＥセファデツクスを通過せし
めた発熱性物質を含まないウロキナーゼ溶液の比活性は
２０，４００単位／ｑ蛋白量であり、その内容液は無色
透明であった。
単位／■蛋白量でありＱＡＥセファデツクスを通過せし
めた発熱性物質を含まないウロキナーゼ溶液の比活性は
２０，４００単位／ｑ蛋白量であり、その内容液は無色
透明であった。
湖上記第１表に示す発熱性物質試験結果にむいて、発熱
性が陽性であるか陰性であるかは、上記日本薬局方の判
定基準に従うものであり、体温上昇値が０．６°Ｃ以上
である供試動物が２匹以上である場合又は、３匹の供試
動物の体温上昇値の合計が１．４℃を越える場合に発熱
性陽性とされる。
性が陽性であるか陰性であるかは、上記日本薬局方の判
定基準に従うものであり、体温上昇値が０．６°Ｃ以上
である供試動物が２匹以上である場合又は、３匹の供試
動物の体温上昇値の合計が１．４℃を越える場合に発熱
性陽性とされる。
＊＊比較例 １
上記実施例１にち−いて被処理液とする発熱性陽性の粗
製ウロキナーゼ液のｐＨを６．０に緩衝化して用いる以
外は同様にした。
製ウロキナーゼ液のｐＨを６．０に緩衝化して用いる以
外は同様にした。
得られたウロキナーゼ溶液の発熱性物質試験結果を下記
第２表に示す。
第２表に示す。
上記第２表よリｐｌ｛ ６． ０に緩衝化した被処理液
を精製する場合、発熱性物質の除去効果は顕著でなく、
精製液は尚発熱性陽性であることが判る。
を精製する場合、発熱性物質の除去効果は顕著でなく、
精製液は尚発熱性陽性であることが判る。
実施例 ２
ｐＨ９．０ ， ０．１ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液で十分平
衝化したＱＡＥセファデツクス（ ＯＨ一タイプ）を充
填したカラム（カラムの大きさ３．ＯＸ１５ｃｒｒＬ）
に最終０．１Ｍのリン酸塩を含みｐｉ−ｉ ９． ０に
緩衝化された発熱性陽性の粗ウロキナーゼ（にごり及び
色素を有する）溶液４，５００単位／ｒｒＩｌの１００
７７２７！を流下させた。
衝化したＱＡＥセファデツクス（ ＯＨ一タイプ）を充
填したカラム（カラムの大きさ３．ＯＸ１５ｃｒｒＬ）
に最終０．１Ｍのリン酸塩を含みｐｉ−ｉ ９． ０に
緩衝化された発熱性陽性の粗ウロキナーゼ（にごり及び
色素を有する）溶液４，５００単位／ｒｒＩｌの１００
７７２７！を流下させた。
得られたウロキナーゼは３，３００単位／７の１２０ｒ
Ｉ１ｌでこれを実施例ｌと同様に投与量２，０００単位
／ｋ！９、４，０００単位／ｋｇをもって各各発熱性物
質試験を行った。
Ｉ１ｌでこれを実施例ｌと同様に投与量２，０００単位
／ｋ！９、４，０００単位／ｋｇをもって各各発熱性物
質試験を行った。
結果は第３表のとおりで精製されたウロキナーゼ溶液は
発熱性陰性と認められた。
発熱性陰性と認められた。
尚カラムに吸着された発熱性物質及び不純物は０．４Ｎ
−ＨＣｌ溶液で溶出した。
−ＨＣｌ溶液で溶出した。
この時出発ウロキナーゼの比活性は１０，４００単位／
ｒｎ９蛋白量でありＱＡＥセファデックスを通過せしめ
た発熱性物質を含まないウロキナーゼ溶液の比活性は２
２，０００単位／■蛋白量であり、その内容液は無色透
明であった。
ｒｎ９蛋白量でありＱＡＥセファデックスを通過せしめ
た発熱性物質を含まないウロキナーゼ溶液の比活性は２
２，０００単位／■蛋白量であり、その内容液は無色透
明であった。
Claims (1)
- １ 発熱性物質を含有する粗ウロキナーゼ液をｐＨ７〜
１０のリン酸緩衝液とした後、ジエチル（２−ヒドロキ
シプロビル）一アミノプロピルセファデックスと接触さ
せて、上記液中に存在する発熱性物質及び不純物を選択
的に吸着除去し、非吸着分画を回収することを特徴とす
るウロキナーゼの精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1526676A JPS5848159B2 (ja) | 1976-02-13 | 1976-02-13 | ウロキナ−ゼの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1526676A JPS5848159B2 (ja) | 1976-02-13 | 1976-02-13 | ウロキナ−ゼの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5299286A JPS5299286A (en) | 1977-08-19 |
| JPS5848159B2 true JPS5848159B2 (ja) | 1983-10-26 |
Family
ID=11884043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1526676A Expired JPS5848159B2 (ja) | 1976-02-13 | 1976-02-13 | ウロキナ−ゼの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5848159B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60111159U (ja) * | 1983-12-28 | 1985-07-27 | 竹花 行雄 | 受話器保持具 |
| JPS60155245U (ja) * | 1984-03-27 | 1985-10-16 | 池田 禮三郎 | 電話機ハンドセツトの保持具 |
-
1976
- 1976-02-13 JP JP1526676A patent/JPS5848159B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60111159U (ja) * | 1983-12-28 | 1985-07-27 | 竹花 行雄 | 受話器保持具 |
| JPS60155245U (ja) * | 1984-03-27 | 1985-10-16 | 池田 禮三郎 | 電話機ハンドセツトの保持具 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5299286A (en) | 1977-08-19 |
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