JPH0151997B2 - - Google Patents

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JPH0151997B2
JPH0151997B2 JP55083920A JP8392080A JPH0151997B2 JP H0151997 B2 JPH0151997 B2 JP H0151997B2 JP 55083920 A JP55083920 A JP 55083920A JP 8392080 A JP8392080 A JP 8392080A JP H0151997 B2 JPH0151997 B2 JP H0151997B2
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JP
Japan
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sodase
blood cells
copper
red blood
heating
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JP55083920A
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JPS5712993A (en
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Takamasa Yasuda
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Fuji Rebio Kk
SATO YAKUGAKU KENKYUSHO KK
Original Assignee
Fuji Rebio Kk
SATO YAKUGAKU KENKYUSHO KK
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Publication date
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Priority to NL8102998A priority patent/NL8102998A/nl
Priority to GB8119195A priority patent/GB2081273B/en
Priority to FR8112286A priority patent/FR2485203A1/fr
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Publication of JPH0151997B2 publication Critical patent/JPH0151997B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814Enzyme separation or purification
    • Y10S435/816Enzyme separation or purification by solubility
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S530/827Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829Blood

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  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、赀血球からスヌパヌオキシドゞスム
タヌれ以䞋SOダヌれず略蚘するを単離する
新芏な方法に関する。曎に詳しくは、赀血球の溶
血液から加熱により、ヘモグロビンおよびSOダ
ヌれに芪和性の蛋癜を効率的に沈柱陀去し、高玔
床のSOダヌれを単離する方法に関する。 SOダヌれは超酞化物むオンO2 -の䞍均化反応
2O2 -2H+→O2H2O2を觊媒する酵玠であり、
広く動怍物に存圚し、生物の生䜓反応から生じた
掻性酞玠が现胞毒ずしお仂くの察しその陀去機胜
を果すものである。 䞀方赀血球のSOダヌれは高等動物原料より粟
補されるオルゎテむンず名付けられる金属キレヌ
ト蛋癜矀に属する。解明の進んでいる牛赀血球の
SOダヌれは分子量31200各アミノ酞数151個ず぀
の等しいサブナニツト個よりなり、立䜓的には
αラセン構造が少なく、円筒圢β構造が倧郚分を
占めるため、倉性に匷いずされおいる。キレヌト
金属ずしお、モル䞭銅、亜鉛各原子を含
み、等電点はPH5.5附近を瀺す。無毒性で生䜓内
に投䞎されたずき、免疫的に異物ずしお認識され
難く、泚射可胜な蛋癜質であり、薬理䜜甚ずしお
は、自己免疫疟患に生ずる炎症などに効果を有
し、近幎倉圢性関節症、慢性リりマチ、攟射線療
法の重節な副䜜甚の治療剀ずしお開発が進められ
おいる。 埓来、赀血球のオルゎテむンすなわちSOダヌ
れを単離する方法はいく぀か知られおいるが、い
ずれも粟補収率、補品玔床の点で䞍満足なもので
あり、曎に実甚䞊極めお有利な貯蔵原料の䜿甚が
困難である等、皮々の欠点を有しおいた。 すなわち特公昭53−31206には、銅、亜鉛、コ
バルト、マンガン、マグネシりム等の䟡金属塩
の存圚䞋に赀血球溶血液を熱凊理し、ヘモグロビ
ンず炭酞脱氎酵玠を沈柱陀去し、オルゎテむンを
単離する方法を開瀺しおいるが、本法においお
は、比范的高枩長時間の加熱にも、かかわらず䞍
玔蛋癜の沈柱分離が䞍充分であり、加熱凊理埌の
䞊柄液には沈柱し切れないヘモグロビンの赀色が
残り、その埌の粟補工皋で、SOダヌれ掻性を䜎
䞋させる原因ずな぀おいる。たた凍結血球など貯
蔵原料を䜿甚した堎合は、曎にSOダヌれの分離
粟補が困難になる。 特公昭45−39832では、赀血球溶血液を、有機
塩玠化合物で凊理し、その錯化合物ずしおヘモグ
ロビンを陀き、オルゎテむンを単離する方法が開
瀺されおいるが、本法は錯化合物に可成りのSO
ダヌれが垯同されおしたい、䞊柄液䞭のSOダヌ
れ収量は、20以䞊䜎䞋しおいる。 たたJ.B.C.2446051では、同じく有機塩玠化
合物を䜿甚しお、SOダヌれを単離しおいるが、
初回抜出段階においお原料䞭SOダヌれ掻性の少
くずも20以䞊の損倱が芋られる。 曎にこれら有機塩玠化合物凊理法は、有機溶媒
を倚量に䜿甚するので、経枈性、䜜業性の面で実
甚䞊問題が倚く、たた凍結也燥血球を原料ずした
堎合は、䞊柄液が、真赀に着色するほど、ヘモグ
ロビン等䞍玔蛋癜が、SOダヌれフランクシペン
に垯同しお液盞に残り、以埌の粟補凊理は䞍可胜
に近い。 特開昭49−50195では、原料血球を加熱凊理埌、
䞊柄液に蛋癜分解酵玠凊理を斜し、過埌カラム
クロマトグラフむヌ、ゲル過などで粟補する方
法を発衚しおいる。本法には酵玠凊理工皋が䜜業
䞊繁雑であるこず、および老化血球や凍結血球を
原料ずした堎合、䞍玔蛋癜がSOダヌれず匷く結
合し、酵玠分離し難く、SOダヌれの玔化が困難
である等の問題点がある。 特公昭53−22137では、血球の溶血液䞭のSOダ
ヌれを、盎接匱塩基性むオン亀換暹脂に吞着さ
せ、分離しおいる。しかし本法は、原料蛋癜䞭
0.3〜0.5皋床の目的蛋癜を他の䞍芁蛋癜から分
離する方法ずしおは、経枈的に可成り䞍利であ
り、たた倧量凊理に䞍適である。 以䞊詳説したごずく埓来法はいずれも実甚䞊倚
くの欠点を有し、満足すべきものではない。 本発明者は皮々研究の結果、SOダヌれの玔化
を劚げおいるものは赀血球溶血液䞭に含たれ、ヘ
モグロビンおよびSOダヌれず耇合䜓を䜜り易い
或る皮の蛋癜倉性における挙動から血球膜に由
来する脂質蛋癜ず掚定される。以䞋これを「芪和
性蛋癜」ず蚘す。の分離困難性にあるこず、曎
にこの芪和性蛋癜が䟡無機䞭性塩および遷移金
属塩の共存䞋に、〜段加熱を行うこずによ
り、容易にか぀、完党にSOダヌれず分離沈柱せ
しめ埗るこずを知り本発明を完成した。 芪和性蛋癜は、元来SOダヌれず芪和性を有す
るが、原料赀血球の予備凊理、たずえば凍結、凍
結也燥、有機溶媒凊理等で、枩和な倉性を受け、
曎に加熱工皋が加わるこずによりヘモグロビンも
しくはその色玠郚分およびSOダヌれに察し、よ
り匷固な耇合䜓を䜜る。この珟象は血球の老化に
よ぀おも生ずる。埓来凍結血球、凍結也燥血球、
保存血球等の工業的に有利な貯蔵原料からSOダ
ヌれの分離粟補が困難であ぀たのは、これら芪和
性蛋癜ずSOダヌれの匷固な耇合䜓の存圚が原因
ず考えられる。 本発明の目的は、埓来看過されおいた芪和性蛋
癜の効果的な陀去を可胜ならしめ、簡易か぀経枈
的にSOダヌれを単離する新芏な方法を提䟛する
こずにある。 たた、本発明の他の目的は、新鮮原料のみなら
ず実甚䞊有利な貯蔵原料から随時、随意の量の
SOダヌれを新鮮原料ず同等の収率で補造し埗る
新芏な方法を提䟛するこずにある。 本発明は赀血球の溶血液にアルカリ金属塩およ
び少量の銅、コバルトたたはマンガンの塩の存圚
䞋に加熱し、生成する倉性ヘモグロビンを䞻ずす
る䞍玔蛋癜の沈柱を陀去する第工皋ず、その䞊
柄液になお溶存する䞍玔蛋癜を沈柱せしむるに充
分な量の遷移金属塩を远添し、再床加熱し、生成
した沈柱を陀去する第工皋よりな぀おいる。奜
たしくは第工皋ず第工皋の間に、第工皋ず
同皋床の少量の銅、コバルトたたはマンガンの塩
を添加し、加熱し、沈柱を陀去し、たたは陀去し
ない工皋をもう䞀段挿入すれば、SOダヌれの粟
補効率は曎に向䞊する。 本発明の構成芁件をその䜜甚面から説明するず
アルカリ金属塩の、䞍玔蛋癜ずSOダヌれの隔離
䜜甚ず少量添加する銅、コバルトたたはマンガン
の塩の䞍玔蛋癜倉性促進䜜甚の組合せのもずで加
熱しお、芪和性蛋癜が有するヘモグロビンもしく
はその色玠郚分及びSOダヌれに察する結合性を
䜎䞋せしめる䞀方、SOダヌれ以倖の蛋癜に察す
る銅、コバルトたたはマンガンの付加䜜甚によ
り、熱倉性ず凝集沈柱䜜甚を促進せしめ、SOダ
ヌれを高玔床、高収率で取埗する方法であり、さ
らに重芁な構成の䞀぀は、䜎濃床、次いで高濃床
の銅、コバルトたたはマンガンの塩の存圚䞋で加
熱工皋を段階に行うこずで、第工皋では倧郚
分のヘモグロビンず䞀郚芪和性蛋癜の倉性沈柱が
進行するが、本工皋で、銅、コバルトたたはマン
ガン濃床を増倧させるずたずえば10倍以䞊に増
加させるずSOダヌれ収率が䜎䞋する。比范䟋
第衚参照−たん第工皋の沈柱を陀去した
埌、第工皋ずしお、ヘモグロビン等倧郚分の䞍
玔蛋癜が陀去された䞊柄液䞭の残存蛋癜に察し充
分な銅、コバルトたたはマンガンの塩を添加、再
床加熱するず、第工皋での䞍玔蛋癜倉性が補完
されなお残存しおいた少量のヘモグロビンや芪和
性蛋癜などに銅、コバルトたたはマンガンむオン
を充分飜和付加させるこずができ、埓぀お䞍芁蛋
癜をほゞ完党に凝集沈柱させるこずができる。第
工皋加熱終了埌のPHは、5.5〜6.5ずなり、SOダ
ヌれは倉性沈柱せず䞊柄液に残る。 本発明で䜿甚する赀血球ずしおは、新鮮血球の
みならず、長期間保存老化した血球や凍結保存、
凍結也燥した血球であ぀おも原料ずしお有効に䜿
甚し埗る。たた赀血球は血挿郚分を掗滌陀去した
ものが奜たしいが血挿郚分が倚少共存するもの
も、原料ずしお䜿甚し埗る。 赀血球を溶血せしめ、加熱時生成した沈柱の撹
拌や分離を容易ならしめるため、第工皋におい
お赀血球容積に察し、〜倍容、奜たしくは
〜倍容の氎を添加する。 第工皋で添加するアルカリ金属塩ずしおは、
塩化リチりム、塩化ナトリりム、塩化カリりム、
硝酞リチりム、硝酞ナトリりム、硝酞カリりム、
臭化ナトリりム、臭化カリりム、臭化リチりム、
等が奜適である。 これらアルカリ金属塩の濃床は、通垞0.1モル
以䞊飜和以䞋で、芪和性蛋癜のSOダヌれおよび
ヘモグロビンに察する結合力を抑制する効果を有
するが、特に0.3モル〜1.0モルの範囲が奜たし
い。 本発明においおは、曎に、銅、コバルト、マン
ガンの塩が䜿甚しうる。特に銅ず䟡の匷酞の塩
すなわち塩化銅、硝酞銅、等が奜適である。特に
銅塩が䞍玔蛋癜に察する倉性、凝集沈柱䜜甚の遞
択性ず、第工皋における䞍玔蛋癜の凝集反応終
末点の確認容易性の面で優れおいる。 銅、コバルトたたはマンガンの塩濃床は、第
工皋では銅塩は〜×10-4モルコバルト、マン
ガンの塩は〜×10-3モルで充分であるが、第
工皋では加熱埌䞊柄液が濁らなくなるたで、な
いし溶存する䞍玔蛋癜に飜和付加するたで比范的
倚量に加える。銅塩の堎合は、加熱埌その青色が
䞊柄液に僅かに残る点を添加量の目安ずすればよ
い。 加熱条件は第、第工皋ずも60℃〜75℃、10
分〜60分皋床が甚いられるが、奜たしくは第工
皋においおは65℃〜70℃、25分〜40分、第工皋
においおはやゝ䜎枩床短時間でよく60℃〜68℃、
15分〜30分の範囲が甚いられる。 本発明においお加熱凊理時PHは特に調敎する必
芁はないが、加熱埌のPHは5.5〜6.5の範囲ずな぀
おいる。 既述のごずく、第工皋終了埌の䞊柄液に10-4
〜10-3モルの銅、コバルトたたはマンガンの塩を
添加し、60℃〜70℃10分皋床の加熱凊理を行い生
成した沈柱を陀去した埌、第工皋にかけるなら
ばSOダヌれの単離粟補床は曎に向䞊する。 第工皋終了埌の䞊柄液は、垞法により脱むオ
ン氎たたは緩衝液に察し、透析を行い、残存する
アルカリ金属塩および銅、コバルトたたはマンガ
ンの塩を陀去、芁すれば曎にDEAEセルロヌズカ
ラムクロスト分離、ゲル過、再透析等の高床粟
補操䜜をぞおSOダヌれ補品を埗る。 以䞋本発明の効果および具䜓的内容を、比范䟋
および実斜䟋により説明する。なおSOダヌれ力
䟡の枬定はMcCordずFridovichの方法、
JBC24460491969に準じお行぀た。たた原料
血液の採血にはすべお抗凝固剀ずしおク゚ン酞゜
ヌダを甚いた。 埓来法である特公昭53−31206に開瀺されたオ
ルゎテむンの粟補法ず本発明の䞻たる構成䞊の差
異は、アルカリ金属塩の存吊ず、第工皋の存吊
にある。実隓䟋によりそれぞれの構成の差異に基
づくSOダヌれ収量および玔床を比范する。 比范䟋 アルカリ金属塩の効果 牛赀血球150mlに盞圓する凍結也燥品52.5に、
塩化第銅20mg、氎500mlを加え、塩化ナトリり
ム15最終濃床0.5モルを添加又は䞍添加の
条件で、70℃60分加熱しお生ずる沈柱を陀去した
埌、曎に塩化第二銅230mgを添加、65℃20分加熱、
沈柱を陀去した埌、䞊柄液を透析埌凍結也燥し
た。ただし、アルカリ金属塩無添加の堎合は、第
工皋においお䞍玔蛋癜の沈柱析出が䞍充分であ
り液は赀耐色を呈し、その埌の粟補が䞍可胜ず
なるので、第工皋の液に曎に塩化第銅220
mgを加え、苛性゜ヌダでPH5.6に調敎埌加熱し、
PH5.8の無色の䞊柄液を埗、力䟡を枬定した。埗
られた暙品のSOダヌれ掻性は第衚のごずく、
アルカリ金属塩の添加により倧巟に䞊昇しおい
る。
【衚】 比范䟋 第工皋付加の効果 同䞀原料、
同䞀条件で第工皋の加熱凊理を行぀た液を異぀
た条件第工皋の省略を含むで第次凊理を
行い、液を透析埌凍結也燥し、比范した。 第次凊理原料牛赀血球凍結也燥物52.5
赀血球150ml盞圓を氎500mlに溶解、塩化ナト
リりム15、塩化第銅15mgを加え、70℃で時
間加熱した。 第次凊理 条件第工皋省略、第工皋の赀耐色の
液を、透析埌、凍結也燥した。 条件第次凊理の反応液を過せず、冷埌
塩化第銅1.9を添加し、PH5.6ずしお65゜20分加
熱、冷埌過、埗られた無色の液520mlを透析、
凍結也燥した。 条件第䞀工皋の液に60℃で塩化第銅
215mgを加え65℃に昇枩しお15分間加熱冷埌過
しお埗た埮青色の液500mlを透析、凍結也燥し
た。 それぞれの実隓条件で、埗られた暙品の性状は
第衚のずおりであり、第工皋を省略するず、
本発明方法に比し、玔床が倧巟に䜎䞋するこずが
明らかである。
【衚】 実斜䟋  新鮮な牛血液600mlより埗た赀血球255に、塩
化ナトリりム25、塩化第二銅25mg、氎600mlを
混合し、68℃で30分間加熱した。冷华埌沈柱を
過し液に塩化第二銅25mgを加え、60℃で10分加
枩した埌、曎に塩化銅を加え、65゜に昇枩する。
䞊柄液が濁らず充分青色が認められるたで380mg
添加した。その間65゜20分間加熱したこずずなる。
冷华埌沈柱を過し、脱むオン氎に48時間透析埌
過、次に0.0025モルPH7.4の燐酞カリりム緩衝
液に䞀倜透析平衡化した。この液を過し、液
850ml、SOダヌれ力䟡109080単䜍を埗た。 あらかじめ前蚘緩衝液で平衡化したDE52ワツ
トマン瀟補DEAEセルロヌズ登録商暙カラム
1.9×11.5cmに、䞊蚘の液を吞着させた埌、同
じ緩衝液の0.0025モルから0.075モルたで蚈400ml
で募配溶出を行぀た。SOダヌれ掻性郚分を集め、
透析埌、凍結也燥した。凍結也燥重量43.0mgSO
ダヌれ力䟡96850単䜍であ぀た。 実斜䟋  幎間、−20℃に貯蔵した牛の凍結血球417に
臭化ナトリりム55、塩化第二銅30mg、氎650ml
を加え68℃で25分加熱、冷华埌過掗滌し、液
に塩化第二銅20mgを加え60℃で15分加熱した。曎
に塩化第二銅600mlを加え、65℃15分加熱、冷华
埌過し、液1080mlを埗た。 これを透析、過、凍結也燥し、重量285mgSO
ダヌれ力䟡206400単䜍を埗た。これをPH7.4
0.0025モルの燐酞カリりムム緩衝液10mlに溶解
し、同䞀緩衝液で平衡化したDE52カラム1.9×
16cmに吞着させ、0.0025モルから0.075モルた
で、同䞀緩衝液500mlで募配溶出を行぀た。SOダ
ヌれ掻性郚分を集め、透析埌凍結也燥し、重量
72.5mg、SOダヌれ掻性179100単䜍であ぀た。 実斜䟋  ACD抗凝固液採血埌、30日を経過した人保存
血より埗た赀血球315に塩化カリりム30、塩
化第二銅25mg、氎550mlを加えた埌、68℃30分加
熱、冷华埌過した。液に50℃で塩化第二銅
300mgを加え、68℃に昇枩し20分間加熱、冷华埌
柄明な淡青色の液920mlを埗た。脱むオン氎で
透析埌、SOダヌれ力䟡を枬定し、63600単䜍であ
぀た。 実斜䟋  皮々の原料、䟡無機䞭性塩、遷移金属塩を甚
い、実斜䟋ず同様の手法でSOダヌれ暙品を埗
た。凊理条件および暙品のSOダヌれ力䟡は第
衚のずおり、
【衚】

Claims (1)

    【特蚱請求の範囲】
  1.  赀血球の溶血液から加熱により䞍芁蛋癜を沈
    柱陀去しお、スヌパヌオキシドゞスムタヌれ
    Superoxide Dismutaseを単離する方法にお
    いお、赀血球溶血液をアルカリ金属の塩および
    銅、コバルト、たたはマンガンの塩の存圚䞋に加
    熱しお生ずる沈柱を陀去する第工皋ず、その䞊
    柄液に第工皋ず同量以䞊の銅、コバルト、たた
    はマンガンの塩を添加し、加熱しお生じた沈柱を
    陀去する第工皋ずを、組み合せるこずを特城ず
    するスヌパヌオキシドゞスムタヌれの単離方法。
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