NL8102998A

NL8102998A - Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloedcellen.

Info

Publication number: NL8102998A
Application number: NL8102998A
Authority: NL
Original assignee: Fujizoki Seiyaku Kk
Priority date: 1980-06-23
Filing date: 1981-06-22
Publication date: 1982-01-18
Also published as: FR2485203B1; JPH0151997B2; US4346174A; DE3124228A1; JPS5712993A; DE3124228C2; FR2485203A1; GB2081273B; GB2081273A

Description

* / / N.0. 30.251 -1-

Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloed-cellen._.____

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloedcellen en meer in het bijzonder op een werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit gehemolyseerde rode bloedcellen door pro-5 teïnen met aantrekking voor hemoglobine 'en superoxide-dismutase en andere niet noodzakelijke proteïnen te doen neerslaan uit1 de gehe-j molyseerde rode bloedcellen bij aanwezigheid van eenwaardige anorganische neutrale zouten en overgangsmetaalzouten onder toepassing van’ warmte daarop.

10i Superoxide-dismutase is een enzym, dat de disproportionering van superoxide 02 ionen als volgt katalyseert: I : 20“ + 2H+ -» . 02 + h2o2 „

Dit enzym is ruim verspreid.in dierlijke en plantaardige orga- ! !nismen en heeft de funktie actieve zuurstof uit deze organismen te :15 elimineren, welke actieve zuurstof tijdens het verloop van biochemische reacties in de organismen wordt ontwikkeld en werkt als een cytotoxine in de organismen.

Superoxide-dismutase verkregen in de zuivere toestand ervan j uit de rode bloedcellen van hogere dieren is een protelnemetaalche- ! i 20 laat, dat "orgotelne" wordt genoemd.

Eundererytrocyt-superoxide-dismutase heeft een molecuulgewicht van 31*200 en bestaat uit twee blijkbaar identieke sub-eenheden van het molecuul, elke sub-eenheid met 151 aminozuren, het grootste deel van de aminozuren heeft een cilindervormige struktuur van het β-^25;type en de rest heeft een spiraalstruktuur van het a-type.

! Tengevolge van de strukturen van de aminozuren is rundererytro-:cyt-superoxide-dismutase zeer resistent ten opzichte van denature- ; | ring. j

Zoals hiervoor vermeld is rundererytrocyt-superoxide-dismutase i 30 een proteïnemetaalchelaat, waarin koper en zink elk aanwezig zijn in een hoeveelheid van 2 gram-atomen in één mol van het superoxide-dismutase.

Het isoëlektrische punt van het superoxide-dismutase is in de buurt van pH 5 >5·, \ 35 Superoxide-dismutase is onschadelijk voor het levende organis me en het kan immunologisch niet beschouwd worden als een vreemd materiaal in levende organismen en derhalve is het een injekteerbaar 81 02 9 9 8 -2- proteïne.

Farmacologisch kan superoxide-dismutase dienst doen als geneesmiddel voor de behandeling van ontsteking veroorzaakt door autoimmune ziekten, en onlangs, zijn door gebruik van superoxide-dismu-5 tase pogingen gedaan geneesmiddelen te ontwikkelen voor de behande- ; i ling van artritis deformans en chronische reumatiek en voor de behandeling van schadelijke neveneffekten veroorzaakt door radiotherapie. 1

Conventioneel zijn verschillende methoden voor het isoleren i i ° ;10|van erytrocyt-superoxide-dismutase, namelijk "orgoteïne" uit rode 'bloedcellen voorgesteld. Echter hebben deze conventionele methoden |verschillende tekortkomingen. Bijvoorbeeld zijn de zuiverheid en de iopbrengst van het verkregen erytrocyt-superoxide-dismutase zeer ge-iring en geconserveerd bloed kan niet worden toegepast voor de berei-15 ding van het erytrocyt-superoxide-dismutase volgens deze conventio- ; nele methoden. In werkelijkheid zou, wanneer geconserveerd bloed zou: kunnen worden toegepast voor de bereiding van erytrocyt-superoxide- ' ;dismutase in de praktijk, dit tbuiten-gewoon nuttig zijn.

Meer in het bijzonder is in het Japanse octrooischrift 53-31206 20een werkwijze beschreven voor het isoleren van orgoteïne uit gehe-|molyseerde rode bloedcellen door de gehemolyseerde rode bloedcellen i ;te onderwerpen aan een warmtebehandeling bij aanwezigheid van zou-iten van tweewaardige metalen, zoals koper, zink, kobalt, mangaan en ; imagnesium, en hemoglobine en koolzuuranhydrase te doen neerslaan en j ; i ; 25 deze te verwijderen.

1 Bij deze werkwijze is, hoewel de gehemolyseerde rode bloedcel- ; ;len behandeld worden bij een vergelijkenderwijze hoge temperatuur 'gedurende een lange tijdsperiode, afscheiding door precipitatie van j niet noodzakelijke proteïnen uit de gehemolyseerde rode bloedcellen I 30'voor het isoleren van superoxide-dismutase onvolledig en rood ge-:kleurd hemoglobine blijft in de bovenstaande oplossing van de met warmte behandelde gehemolyseerde rode bloedcellen achter. De niet :afgescheiden niet noodzakelijke proteïnen veroorzaken afbraak van de activiteit van superoxide-dismutase gedurende het volgende zuive- ; 55 ringsproces van superoxide-dismutase. Voorts worden bij deze werkwijze, wanneer gelyofiliseerde rode bloedcellen worden toegepast voor het isoleren van superoxide-dismutase daaruit, afscheiding en zuivering van superoxide-dismutase moeilijker in vergelijking met het geval dat onbehandelde verse rode bloedcellen worden toegepast. 40 In het Japanse octrooischrift 45-39852 wordt een werkwijze be- 81 02 9 9 8 <* -3- schreven voor het isoleren van orgoteïne door gehemolyseerde rode bloedcellen te behandelen met een organische chloorverbinding voor het vormen van een complexe verbinding van hemoglobine en hemoglobine in complexe verbindingsvorm te verwijderen uit de gehemolyseerde : 5 rode bloedcellen. Bij deze werkwijze wordt echter een aanzienlijke hoeveelheid superoxide-dismutase aangetrokken tot de complexe verbinding en de opbrengst van superoxide-dismutase in de bovenstaande oplossing van de gehemolyseerde rode bloedcellen wordt met meer dan : 20% verminderd.

10; In Journal of Biochemical Chemistry 244» 6051» wordt een andere werkwijze beschreven voor het isoleren van superoxide-dismutase uit gehemolyseerde rode bloedcellen door toepassing van een chloorverbinding. Bij deze werkwijze echter wordt de activiteit van superoxi- de-dismutase met ten minste 20% in de eerste extraktietrap verlaagd ; : | ; :15 i in vergelijking met de activiteit van niet-geïsoleerd superoxide- ; idismutase. j

Deze superoxide isolatiemethoden onder toepassing van organi- j |sche chloorverbindingen vereisen een grote hoeveelheid organisch op-· :losmiddel en zijn daarom niet praktisch uit het oogpunt van kosten 20! en scheidingsdoelmatigheid. Voorts blijven, wanneer gelyofiüseerde ;bloedcellen worden toegepast, niet noodzakelijke proteïnen met inbegrip van hemoglobine, waaraan superoxide-dismutase is aangetrokken, in de bovenstaande oplossing van de gehemolyseerde rode bloed-:cellen. Daarom zijn isolering van superoxide-dismutase uit de boven-:25 staande oplossing en zuivering daarvan uiterst moeilijk.

i In de Japanse ter inzage gelegde octrooiaanvrage 49-50195» ;wordt een verdere werkwijze beschreven voor het isoleren van super- j :oxide-dismutase uit gehemolyseerde rode bloedcellen, welke werkwij- j ze de trappen omvat van onderwerping van de gehemolyseerde rode j30 bloedcellen aan warmtebehandeling; verwerking van de bovenstaande oplossing van de met warmte behandelde gehemolyseerde rode bloedcellen met een proteolytisch enzym en filtratie van de verwerkte boven-!staande oplossing en scheiding en zuivering van superoxide-dismutase uit de oplossing door kolomchromatografie en gelfiltratie. De te-i35 kortkomingen van deze werkwijze zijn, dat de bij de werkwijze betrokken trappen onder toepassing van het pro.teolytische enzym gecompliceerd zijn en, wanneer oude bloedcellen of gelyofiliseerde bloedcellen gebruikt worden voor het voortbrengen van superoxide-dismutase, superoxide-dismutase stevig gebonden wordt aan niet noodzake-i40 lijke proteïnen aanwezig in de bloedcellen en' derhalve is de zuive- 81 02 9 98 s -4- ring van superoxide-dismutase uiterst moeilijk. Tenslotte wordt in het Japanse octrooischrift 53-22137 een werkwijze beschreven voor het isoleren van superoxide-dismutase uit gehemolyseerde rode bloedcellen door superoxide-dismutase aanwezig in gehemolyseerde rode 5 bloedcellen direkt te laten aantrekken op een zwak-basische ionen-luitwisselingshars. In termen van kosten en doelmatigheid is deze werkwijze echter niet geschikt :voor de scheiding van een dergelijk proteïne als superoxide-dismutase aanwezig in een hoeveelheid die ;varieert van 0,3 - 0,5 gew.% van andere proteïnen. In werkelijkheid : i10;kan deze werkwijze niet worden toegepast voor de bereiding van een ;grote hoeveelheid superoxide-dismutase uit gehemolyseerde bloedcel- j | len. j

Zoals hiervoor beschreven hebben deze conventionele superoxide-1 I Idismutase-isolatiemethoden een verscheidenheid van tekortkomingen Il5:en kunnen in de praktijk niet worden gebruikt.

; Het is derhalve een oogmerk van de onderhavige uitvinding een nieuwe werkwijze te verschaffen voor het isoleren van superoxide-jdismutase uit rode bloedcellen door verwijdering van niet noodaake- ; lijke proteïnen, met inbegrip van hemoglobine, en een-proteïne met 20 aantrekkingskracht voor superoxide-dismutase daaruit welke werkwijze: eenvoudig en doelmatig is voor het isoleren van superoxide-dismu-tase.

Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaf-fen van een werkwijze, die in staat is niet alleen superoxide-dismu-; 25 tase te isoleren uit verse rode bloedcellen, maar ook uit geconserveerde rode bloedcellen, met in hoofdzaak dezelfde hoge opbrengst aan superoxide-dismutase.

Gevonden werd, dat het meest belangrijke obstakel voor de af-:scheiding en zuivering van superoxide-dismutase uit gehemolyseerde jO'xode bloedcellen een bepaald proteïne is, dat gemakkelijk een complexe verbinding kan vormen in combinatie met hemoglobine en/of su-; ; ' ! peroxide-dismutase, en welk proteïne moeilijk af te scheiden is uit superoxide-dismutase. Dit proteïne wordt uit zijn gedrag gedurende de denaturering ervan, geacht lypoproteïne te zijn afkomstig van :55 bloedcelmembranen en wordt hierna aangeduid als het "affiniteits-proteïne".

Aanvraagsters hebben verder gevonden, dat het affiniteitspro-teïne gemakkelijk en volledig kan worden gescheiden van superoxide-dismutase door twee of drie trapsgewijze warmtebehandelingen van de 40 gehemolyseerde rode bloedcellen bij aanwezigheid van eenwaardige an- 8102998 -5- organische neutrale zouten en overgangsmetaalzouten.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de hiervoor vermelde beide ontdekkingen.

Wanneer het affiniteitsproteïne aanwezig in rode bloedcellen en 5 met een sterke affiniteit voor superoxide-dismutase bijvoorbeeld i iwordt verwerkt door vriezen, lyofiliseren en behandeling met organi-| :sche oplosmiddelen, gevolgd door warmtebehandeling, wordt het affiniteitsproteïne enigszins gedenatureerd tijdens die verwerking en ;vormt een complexe verbinding in dichte combinatie met hemoglobine 10;en/of superoxide-dismutase. Yorming van een dergelijke complexe ver-;binding heeft ook plaats tijdens veroudering van rode bloedcellen.

| De gebruikelijk ontmoette moeilijkheid bij het isoleren van |superoxide-dismutase in de zuivere toestand ervan uit bevroren bloedy icellen, gelyofiliseerde bloedcellen en geconserveerd bloed is waar- j i 15ischijnlijk toe te schrijven aan de aanwezigheid van een dergelijk complex van het affiniteitsproteïne en superoxide-dismutase, niette-; igenstaande het feit dat bevroren bloedcellen, gelyfoliseerde bloedcellen en geconserveerd bloed beschouwd zijn als de meest prakti-! :sche superoxide-dismutasebronnen, wanneer superoxide-dismutase ge- ' i 20;makkelijk daaruit kan worden afgescheiden in de zuivere toestand er-; van en met een hoge opbrengst.

Bij de onderhavige uitvinding zijn rode bloedcellen, die kunnen worden toegepast voor het isoleren van superoxide-dismutase daaruit, niet beperkt tot onbehandelde verse rode bloedcellen, maar verouder-1 : 25 de rode bloedcellen, die geconserveerd zijn gedurende een lange tijdsperiode, bevroren rode bloedcellen en gelyofiliseerde rode ; ‘bloedcellen kunnen eveneens worden toegepast. Yoorts kunnen voor gebruik bij de onderhavige uitvinding terwijl het de voorkeur ver-; dient rode bloedcellen vrij van bloedplasma te gebruiken, rode bloed-I 30:cellen waaruit bloedplasma niet volledig is verwijderd, eveneens zonder enig wezenlijk probleem worden toegepast.

Een werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit :rode bloedcellen volgens de onderhavige uitvinding zal nu worden !toegelicht. Deze werkwijze omvat in hoofdzaak twee trappen.

' ; | i 35 Bij de eerste trap wordt water toegevoegd aan rode bloedcellen i teneinde rode bloedcellen te hemolyseren en het roeren van de ge-hemolyseerde rode bloedcellen tijdens de superoxide-dismutase-iso-latiewerkwijze te vergemakkelijken. De hoeveelheid aan de rode bloedcellen toe te voegen water is 1 tot 4 maal, bij voorkeur 2 tot 3 40 maal, het volume van de rode bloedcellen.

8102998 -6-

De aldus gevormde gehemolyseerde rode bloedceloplossing wordt verwarmd bij temperaturen die variëren van 60°C - 75°C gedurende 10 - 60 minuten, "bij voorkeur 65°C - 70°C gedurende 25 - 40 minuten, bij aanwezigheid van een eenwaardig anorganisch neutraal zout, zo-| 5 als lithiumchloride, natriumchloride, kaliumchloride, lithiumni-ïtraat, natriumnitraat, kaliumnitraat, natriumbromide, kaliumbromide, i ! i lithiumbromide en ammoniumbromide, en een vergelijkenderwijze klei- j : | ne hoeveelheid van een overgangsmetaalzout, zoals in water oplosbare J zouten van koper, kobalt en mangaan, bijvoorbeeld CuiNO^^·3^0, j10' CuC^ · 21^0, CuB^, CuCl, MhClg^^O en CoClg.SE^O, koper(l)chloride ! ;en koper(II)nitraat, aangezien deze koperzouten in staat zijn selec- \ |tief de niet noodzakelijke proteïnen te denatureren en coagulatie I 1 en precipitatie daarvan te bevorderen.

De eenwaardige anorganische neutrale zouten hebben de funktie I 15:superoxide-dismutase te scheiden van het affiniteitsprotelne en niet; i inoodzakelijke proteïnen, die in hoofdzaak gedenatureerde hemoglobine; 'omvatten, door verzwakking van de binding tussen superoxide-dismuta-i |se en het affiniteitsprotelne en de niet noodzakelijke proteïnen. j I De overgangsmetaalzouten hebben de funktie denaturering van de 20 niet noodzakelijke proteïnen te bevorderen, precipitatie van de jniet noodzakelijke proteïnen en isolatie van superoxide-dismutase |van de niet noodzakelijke proteïnen met een grote zuiverheid en een 'hoge opbrengst te vergemakkelijken.

Yoor het verzwakken van de binding tussen superoxide-dismutase 25'en het affiniteitsprotelne en aadere niet noodzakelijke proteïnen, |is de concentratie van het eenwaardige anorganische neutrale zout |in de gehemolyseerde rode bloedceloplossing in het trajekt van 0,2 |mol tot de verzadiging ervan, bij voorkeur in het traj'ekt van 0,3 :mol -1,0 mol.

20 Betreffende het overgangsmetaalzout is de geschikte concentra- :tie van het koperzout in het trajekt van 1 x 10-^ mol tot 2 x 10~^ jmol, terwijl de geschikte concentratie van het mangaanzout in het

TT

Itrajekt van 1 x 10 ? mol tot 2 x 10 mol is.

Gedurende de eerste trap worden de niet noodzakelijke prote-25 inen, met inbegrip van het affiniteitsprotelne en hemoglobine voor het grootste deel tot precipitatie gebracht. De geprecipiteerde proteïnen worden door filtratie verwijderd. Bij deze trap blijft een zeer geringe hoeveelheid van de niet noodzakelijke proteïnen in de bovenstaande laag van de gehemolyseerde rode bloedceloplossing ach- 40 ter‘ 81 0 2 9 9 8 -7-

Bij de tweede trap wordt, teneinde de niet noodzakelijke proteïnen, die nog in de Bovenstaande oplossing van de gehemolyseerde rode Bloedceloplossing achterblijven, te verwijderen het bij de eerste trap toegepaste overgangsmetaalzout verder toegevoegd aan de 5:gehemolyseerde rode bloedceloplossing en wordt de gehemolyseerde rolde bloedceloplossing verwarmd bij temperaturen die variëren van 60°C - 75°C gedurende 10-60 minuten, bij voorkeur bij temperaturen die ; i variëren van 60°C - 68°C gedurende 15-30 minuten. Het overgangsmetaalzout wordt toegevoegd tot de bovenstaande oplossing doorzich- 10Jtig wordt, terwijl de gehemolyseerde rode bloedceloplossing verwarmd [wordt. In het bijzondere geval van het koperzout wordt dit in klei- ' [ne hoeveelheden op een zodanige wijze toegevoegd, dat de bovenstaan-i ide oplossing enigszins blauw kleurt na voltooiing van de verwarming.

Na koeling van de gehemolyseerde rode bloedceloplossing worden ........ i 15ide neergeslagen niet noodzakelijke proteïnen door filtratie verwij- j ! j iderd. Als gevolg worden vrijwel alle niet noodzakelijke proteïnen jverwijderd, terwijl superoxide-dismutase in het filtraat achter- jblijft zonder geneutraliseerd te zijn. j

Het filtraat wordt gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water en/ofi 20 een gebruikelijke bufferoplossing ter verwijdering van het eenwaar- j [dige neutrale zout en het overgangsmetaalzout daaruit. i

Uit de aldus verkregen oplossing wordt superoxide-dismutase i · verkregen in de zuivere toestand ervan door een sterk zuiveringsproces met inbegrip van scheiding door gebruik van dialyse, BEAE- j 251cellulosekolomchromatografie en gelfiltratie.

Een andere werkwijze voor het 'isoleren van superoxide-dismuta-; se uit gehemolyseerde rode bloedcellen volgens de onderhavige uit-! vinding omvat de hiervoor beschreven twee trappen en een extra tus- j sentrap.

jjo' Bij de extra tussentrap, na voltooiing van de eerste trap, wordt het overgangsmetaalzout verder toegevoegd aan de bovenstaande : oplossing verkregen bij de eerste trap in een hoeveelheid die vari- . -4 -3 eert van 1 x 10 mol tot‘1 x 10 mol, en de bovenstaande oplossing wordt opnieuw verwarmd tot temperaturen die variëren van 60°C 35 - 70°C gedurende ongeveer 10 minuten. Be bij deze tussentrap neergeslagen niet noodzakelijke proteïnen kunnen verwijderd worden na voltooiing van deze trap of later. Be andere trappen bij deze werkwijze zijn precies dezelfde als die bij de eerst vermelde werkwijze volgens de onderhavige uitvinding. Beze tweede werkwijze is in staat 40 de opbrengst van superoxide-dismutase te vergroten in vergelijking 81 02 9 9 8 -8- met de eerst vermelde werkwijze.

In verband met deze tussentrap wordt, wanneer de hoeveelheid van het overgangsmetaalzout toe te voegen bij de eerste trap vergroot wordt buiten de hiervoor vermelde hoeveelheid, met de tussen-5 trap weggelaten, de eindopbrengst van superoxide-dismutase verlaagd. Specifieke voorbeelden van de werkwijze voor het isoleren van isuperoxide-dismutase uit rode bloedcellen volgens de onderhavige : uitvinding zullen nu beschreven worden. In de volgende voorbeelden | werd natriumcitraat toegepast als anticoagulatiemiddel voor het 10 bloed. Yoorts werd de meting van de activiteit van superoxide-dis-jmutase uitgevoerd volgens de methode van McCord en Eridovich, voor- ; !gesteld in Journal of Biochemistry,244. (19^9)> 6049· ! (Voorbeeld I.

Aan 255 g rode bloedcellen verkregen uit 600 ml vers runder-;15 bloed werden 25 g natriumchloride, 25 mg koper(II)chloride en 600 ml! i ; water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 30 ; ! |minuten tot 68°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neer-! ;slag door filtratie verwijderd.

| 25 mg Koper(II)chloride werden aan het filtraat toegevoegd en 20 het mengsel werd 10 minuten tot 60°C verwarmd.

Terwijl de temperatuur van het mengsel tot 65°C werd verhoogd :en deze temperatuur werd gehandhaafd, werd verder koper(II)chloride : (in kleine hoeveelheden aan het mengsel toegevoegd tot de bovenstaande laag van het mengsel gekleurd was tot maximaal blauw zonder troebel 25 te worden. Als resultaat werden 380 mg koper(II)chloride in totaal aan het mengsel toegevoegd, hetgeen 20 minuten duurde, en gedurende ; die tijdsperiode werd het mengsel continu tot 65°C verwarmd.

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd !en werd het filtraat gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water geduren-: !30 de 48 uren en werd daarna gefiltreerd.

Het filtraat werd één nacht gedialyseerd tegen 0,0025 M kalium-fosfaatbuffer (pH 7»4) en met dezelfde buffer in evenwicht gebracht. Deze oplossing werd gefiltreerd, zodat 850 ml filtraat, dat 109*080 ! eenheden superoxide-dismutase bevatte, werden verkregen.

:35 De superoxide-dismutase-oplossing werd vervolgens aangebracht ;op een DE 52 kolom (1,9 x 11,5 cm) (bereid door Whatman Ltd. onder :de handelsnaam DEAE cellulose), vooraf in evenwicht gebracht met de ! hiervoor vermelde zelfde kaliumfosfaatbuffer, zodat de superoxide-dismutase-oplossing op de kolom werd geadsorbeerd. Gradiëntelutie ; 40 werd uitgevoerd onder toepassing van 400 ml van dezelfde buffer in 81 02 9 9 8 -9- totaal, met de kaliumfosfaatconcentratie daarvan variërend van :0,0025 M - 0,075 M. De actieve frakties van superoxide-dismutase werden verzameld en verenigd en gedialyseerd en werden vervolgens gelyofiliseerd. De opbrengst aan superoxide-dismutase in de gelyo-; 5:filiseerde toestand ervan was 43»0 mg met 96-850 eenheden.

Voorbeeld II.

; : Aan 417 g rode bloedcellen van runderen, die 2 jaren bij een temperatuur van -20°C waren geconserveerd, werden 55 g natriumbro-mide, 30 mg koper(II)chloride en 65Ο ml water toegevoegd en er werd : ;10 gemengd. Het mengsel werd 25 minuten tot 68°C verwarmd. Na koeling !van het mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

! 20 mg Koper(il)chloride werden aan het filtraat toegevoegd en | Ihet mengsel werd 15 minuten tot 60°C verwarmd.

De temperatuur van het mengsel werd tot 65°C verhoogd en 600 mg '15 koper(ll)chloride werden verder toegevoegd, terwijl die temperatuur 15 minuten werd gehandhaafd.

; Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd, ; ;zodat 1080 ml van het filtraat werden verkregen. Het filtraat werd ;tegen gedeïoniseerd water 48 uren gedialyseerd en werd vervolgens 20!gefiltreerd. i

Het filtraat werd één nacht gedialyseerd tegen 0,0025 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7*4) en niet dé buffer in evenwicht gebracht. Deze ; oplossing werd gefiltreerd en werd vervolgens gelyofiliseerd, waarbij ;285 mg superoxide-dismutase met 206.400 eenheden werden verkregen.

i j 25 Het aldus verkregen superoxide-dismutase werd opgelost in 10 ml :0,0025 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7>4) en de superoxide-dismutase-:oplossing werd vervolgens aangebracht op een DE 52 kolom (1,9 x [11,5 cm) (vervaardigd door Whatman Ltd. onder de handelsnaam DEAE-;cellulose) vooraf in evenwicht gebracht met dezelfde hiervoor ver-30:melde kaliumfosfaatbuffer, zodat de superoxide-dismutase-oplossing op de kolom werd geadsorbeerd. Gradiëntelutie werd uitgevoerd onder toepassing van 500 ml van dezelfde buffer in totaal, met de ka- : liumfosfaatconcentratie daarvan variërend van 0,0025 M - 0,075 M.

De actieve frakties van superoxide-dismutase werden verzameld en 35!verenigd en gedialyseerd en werden vervolgens gelyofiliseerd. De opbrengst van superoxide-dismutase in de gelyofiliseerde toestand ervan was 72,5 mg met 179-100 eenheden.

Voorbeeld III.

Aan 73,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund (over-40 eenkomend met 210 ml verse rode bloedcellen van het rund), werden 81 02 9 9 8 -10- 30 g natriumbromide, 20 mg koper(il)chloride en éOO ml water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd 30 minuten tot 65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

: 5, 320 mg Koper(il)chloride werden aan het filtraat toegevoegd en | het mengsel werd 15 minuten tot 60°C verwarmd.

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd. .

| Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water gedurende ! ;48 uren en werd vervolgens gefiltreerd.

|10' Het filtraat werd gedialyseerd tegen 0,0025 M kaliumfosfaat-| buffer (pH 7,4) en in evenwicht gebracht met de buffer. Deze oplos-ising werd gefiltreerd en werd vervolgens aangebracht op een DE 52 | ;kolom (1,9 x 11,5 cm) (vervaardigd door Whatman Ltd. onder de handelsnaam DEAE-cellulose) vooraf in evenwicht gebracht mét de hier-15 voor vermelde zelfde kaliumfosfaatbuffer, zodat de superoxide-dis- ! |mutase-oplossing op de kolom werd geadsorbeerd. Gradiëntelutie werd ! ί 1 !

| ;uitgevoerd onder toepassing van 500 ml van dezelfde buffer in ιοί :taal, met de kaliumfosfaatconcentratie daarvan variërend van 0,0025M

j ; i ;- 0,075 M. De actieve frakties van superoxide-dismutase werden ver- j

20 zameld en verenigd en gedialyseerd en werden vervolgens gelyofili-! jSeerd. De opbrengst van superoxide-dismutase in de gelyofiliseerde I

toestand ervan was 34,5 mg met 76.000 eenheden. j I Voorbeeld IV.

ί Aan 315 g rode bloedcellen verkregen van 30 dagen oud geconser-l I . : ;25'v@©:rd· menselijk bloed (waarin zuur-citraat-dextrose (Ach) werd toe- ί |gepast als anticoagulatiemiddel) werden 30 g kaliumchloride, 25 mg ; ;koper(il)chloride en 550 ml water toegevoegd en er werd gemengd. Het ;mengsel werd 30 minuten tot 68°C verwarmd. Na koeling van het meng- I : sel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

300 mg Koper(II)chloride werden aan het filtraat toegevoegd en het mengsel werd 20 minuten tot 68°C verwarmd.

ί Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd, waarbij 920 ml van een doorzichtig, lichtblauw filtraat werden verkregen en het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water ^gedurende 48 uren en werd vervolgens gefiltreerd.

De activiteit van superoxide-dismutase verkregen uit het filtraat bedroeg 63*600 eenheden.

Voorbeeld V.

Aan 105 g rode bloedcellen van het schaap, die gedurende 15 dagen bij een temperatuur van 4°C waren geconserveerd, werden 10 g 81 02 9 9 8 -11- natriumchloride, 6 mg koper(II)chloride, CuClg^HgO en 250 ml water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 50 minuten tot 65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

5 150 mg Koper(ll)chloride, CuClg^HgO, werden aan het filtraat toegevoegd en het mengsel werd 20 minuten tot 65°C verwarmd.

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd. : Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water en werd 1 vervolgens gefiltreerd.

10 De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het fil- ! , : ;traat bedroeg 19*860 eenheden.

Voorbeeld YI.

Aan 73>5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund werden I 50 g natriumnitraat, 20 mg koper (II )nitraat, C^NO-Jp* 3H„0 en 600 ml: 15:water toegevoegd en-werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 25 mi- ; inuten tot é5°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neer- I 1 i slag door filtratie verwijderd.

280 mg Koper(ll)nitraat, Cu(N0^)2*3H20, werden aan het filtraat; ;toegevoegd en het mengsel werd gedurende 20 minuten tot 65°C ver- | I ; 20 warmd. i

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd, j Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water en werd j vervolgens gefiltreerd. i

De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het filtraat 25 bedroeg 94*300 eenheden.

1''Voorbeeld VII.

i .......— ........................

; Aan 73>5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund werden ; 35 g kaliumnitraat, 20 mg koper(ll)nitraat, CuiNO^g· 3^0 en 600 ml Iwater toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 30 2o:minuten tot 65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

300 mg Koper(ll)nitraat, CuiNO^g^HgO, werden aan het filtraat toegevoegd en het mengsel werd gedurende 20 minuten tot 65°C verwarmd .

22 Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd.

Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water en werd vervolgens gefiltreerd.

De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het filtraat bedroeg 83-600 eenheden.

8102998 40 -12-

Voorbeeld VIII,

Aan 210 g "bevroren rode bloedcellen van het rund werden 35 g kaliumbromide, 30 mg koper(ll)bromide, CuBr^j en 520 ml water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 30 uren tot 5 i65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag door ;filtratie verwijderd.

400 mg Koper(ll)bromide, CuBr^, werden aan het filtraat toege- ! |voegd en het mengsel werd 20 minuten tot 65°C verwarmd.

i Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd. ; 10 Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeïoniseerd water en werd | vervolgens gefiltreerd.

De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het fil-itraat bedroeg 87*500 eenheden. iVoorbeeld IX.

j15| Aan 250 g verse rode bloedcellen van het rund werden 15 δ li-;thiumchloride, 20 mg koper(i)chloride, CuCl, en 620 ml water toege- ; : i ; | ;voegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten tot '· |67°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag door I 'filtratie verwijderd :20 320 mg Koper(l)chloride werden aan het filtraat toegevoegd en ; het mengsel werd gedurende 20 minuten tot 67°C verwarmd.

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd.

| iHet filtraat werden tegen gedeïoniseerd water gedialyseerd en werd vervolgens gefiltreerd*.

; 25 De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het fil- traat bedroeg 104.200 eenheden.

i Het volgende zijn voorbeelden van de tweede werkwijze met in begrip van de hiervoor vermelde tussentrap volgens de onderhavige uitvinding. j,n Voorbeeld X.

Aan 52,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund werden' 15 § lithiumnitraat, 20 mg koper(II)nitraat, Cu(N0^)2·33^0 en 500 ml' water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 30 minuten tot 65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neer-; yj slag door filtratie verwijderd.

Na voltooiing van deze eerste trap werden voorts 20 mg koper-(il)nitraat, Gu(N0^)2· 3^0 aan het filtraat toegevoegd en het mengsel werd gedurende 15 minuten tot 68°C verwarmd. Na koeling van het; mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

1,25 g Kobalt(II)chloride, CoClg^H^O, werden aan het filtraat 8102998 -13- :toegevoegd en het mengsel werd gedurende 30 minuten tot 70°C ver-:warmd.

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd. Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeioniseerd water en werd 5ivervolgens gefiltreerd.

| De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het fil- traat bedroeg 69.800 eenheden, i Voorbeeld XI.

I ' " " i i ii i ; Aan 60 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund werden 10:12 g lithiumchloride, 150 mg mangaan(II)chloride, MnCl2.4H20 en ]600 ml water toegevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedu-I rende 30 minuten tot 70°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd ; ihet neerslag door filtratie verwijderd.

i Na voltooiing van deze eerste trap werden voorts 15 mg k'oper-15 (II)chloride, CuC12.2H20, aan het filtraat toegevoegd en het mengsel werd gedurende 20 minuten tot 70°C verwarmd. Nakoeling van het j :mengsel werd het neerslag door filtratie verwijderd.

2,0 g mangaan(II)chloride, Mn012<4H20, werden aan het filtraat j :toegevoegd en het mengsel werd gedurende 30 minuten tot 70°C ver-20 warmd. j

Nadat het mengsel was gekoeld werd het neerslag afgefiltreerd. ; :Het filtraat werd gedialyseerd tegen gedeioniseerd water en werd :vervolgens gefiltreerd.

De activiteit van superoxide-dismutase aanwezig in het fil-25 traat bedroeg 69-750 eenheden.

Teneinde het effekt van het eenwaardige anorganische neutrale |zout op de doelmatigheid van de scheiding van superoxide-dismutase : |op de activiteit van het verkregen superoxide-dismutase te bevesti- : gen, werden de volgende vergelijkende proeven uitgevoerd onder toe-: 50'passing van natriumchloride als het eenwaardige anorganische neutra-: |le zout.

i Vergelijkingsproef 1-1.

Aan 52,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund (overeenkomend met 150 ml verse rode bloedcellen van het rund) werden ^15 g natriumchloride (θ,5 M)» 20 mg koper(ll)chloride en 500 ml water toegevoegd. Het mengsel werd 60 minuten tot 70°C verwarmd en het gevormde neerslag werd door filtratie verwijderd.

Aan het filtraat werden verder 230 mg koper(II)chloride toegevoegd en het mengsel werd 20 minuten tot 65°C verwarmd. Het gevormde : 40'neerslag werd door filtratie verwijderd.

81 0 2 9 9 8 -14-

De bovenstaande laag van het filtraat werd gedialyseerd en werd daarna gelyofiliseerd, zodat superoxide-dismutase werd verkregen.

De activiteit van het aldus verkregen superoxide-dismutase be- i |droeg 63.000 eenheden.

5 ;Vergelijkingsproef 1-2.

Aan 52,5 S gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund (over-: j eenkomend met 150 ml verse rode bloedcellen van het mind) werden j 20 mg koper(II)chloride en 500 ml water toegevoegd. Het mengsel werd; I ;gedurende 60 minuten tot 70°C verwarmd en het gevormde neerslag werd: 10'door filtratie verwijderd.

Aan het filtraat werden voorts 230 mg koper(ll)chloride toege- i

Ivoegd en het mengsel werd 20 minuten tot 65°C verwarmd. In het ί · : mengsel was de vorming van precipitaat onvolledig, maar het gevorm- de neerslag werd door filtratie verwijderd. Het filtraat was rood- 15;bruin gekleurd en het bleek dat een volledige zuivering door deze :filtratie onmogelijk was. Daarom werden verder 220 mg koper(II)chlo-; ί : iride aan het filtraat toegevoegd, werd de pH van het filtraat op ί i l ί 5»6 ingesteld door toevoeging van natriumhydroxide, werd het meng- :sel 20 minuten tot 65°C verwarmd en werd het neerslag door filtra- 20|tie verwijderd. Uit het filtraat werd een kleurloze bovenstaande laag (pH 5>8) verkregen.

\ De bovenstaande laag werd gedialyseerd en werd vervolgens ge-

Ilyofiliseerd, zodat superoxide-dismutase werd verkregen.

De activiteit van het aldus verkregen superoxide-dismutase 25 bedroeg 11.700 eenheden.

Bij de vergelijkingsproef 1-1 werd als eenwaardig anorganisch neutraal zout natriumchloride aan het reactiemengsel bij de eerste 'trap toegevoegd, terwijl bij vergelijkingsproef 1-2 geen eenwaardig ; | ! anorganisch zout bij de eerste trap werd toegevoegd.

; 30; Ue resultaten van deze twee vergelijkende proeven waren als ivolgt:

Activiteit van Verbinding superoxide-dismutase 35 vergelijkingsproef 1-1 63.000 eenheden 100,0 vergelijkingsproef 1-2 11.700 eenheden 18,6.

Deze resultaten laten zien, dat toevoeging van het eenwaardige anorganische neutrale zout aanzienlijk de activiteit van superoxide-dismutase vergroot.

40 Voorts werden, teneinde het effekt van de tweede trap te beves- 81 02 9 9 8 -15- itigen, waarbij het overgangsmetaalzout wordt toegevoegd aan het redact iemengsel, op de doelmatigheid van de scheiding van superoxide-'dismutase en op de activiteit van verkregen superoxide-dismutase, de volgende vergelijkende proeven uitgevoerd.

| 5Vergelijkingsproef 2-1.

| Bij deze vergelijkende proef werd de tweede trap als volgt weg- ! :gelaten: I Aan 52,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund (over eenkomend met 150 ml verse rode bloedcellen van het rund) werden 10 15 g natriumchloride, 15 mg koper(ll)chloride en 500 ml water toe-;gevoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 60 minuten j tot 70°C verwarmd en het gevormde neerslag werd door filtratie ver- j ! ; j wijderd. Het filtraat was roodbruin gekleurd. Bit filtraat werd ge- ; dialyseerd en werd vervolgens gelyofiliseerd. j 15 (1) Het verkregen superoxide-dismutase was roodbruin gekleurd. ; (2) Het totale gewicht van de verkregen proteïne was 870 mg. i (5) Be enzymactiviteit van superoxide-dismutase was 74*400 een-: |heden.

(4) Be specifieke enzymactiviteit van superoxide-dismutase was 20 86 eenheden/proteïne (mg).

;Vergelijkingsproef 2-2.

Bij deze vergelijkingsproef werd de filtratie van het gevormde |neerslag bij de eerste trap weggelaten.

Aan 52,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen vah het rund (over-f ! I

25 eenkomend met 150 ml verse rode bloedcellen van het rund) werden I5g

natriumchloride, 15 mg koper(ll)chloride en 500 ml water toegevoegd I

en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 60 minuten tot 70°C i verwarmd.

Na koeling van het mengsel werden 1,9 g koper(ll)chloride aan mengsel toegevoegd zonder verwijdering van het bij de eerste trap gevormde precipitaat. Met de pH van het mengsel ingesteld op 5,6 werd het mengsel gedurende 20 minuten tot 65°C verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het neerslag afgefiltreerd, zodat 520 ml van een kleurloos filtraat werden verkregen.

^ Het filtraat werd gedialyseerd en werd vervolgens gelyofili seerd.

(1) Het verkregen superoxide-dismutase was licht grijsgroen gekleurd.

(2) Het totale gewicht van de verkregen proteïnen was 185 mg.

(5) Be enzymactiviteit van superoxide-dismutase was 45*200 een- 81 0 2 9 9 8 > -16- heden.

(4) De specifieke enzymactiviteit van superoxide-dismutase was 238 eenheden/proteïne(mg). iYergelijkingsproef 2-3.

I 5! Bij deze vergelijkingsproef werden zowel de eerste trap als de ; ;tweede trap uitgevoerd-

Aan 52,5 g gelyofiliseerde rode bloedcellen van het rund (overeenkomend met 150 ml verse rode bloedcellen van het rund) werden 15 g natriumchloride, 15 mg koper(ll)chloride en 500 ml water toege-Molvoegd en er werd gemengd. Het mengsel werd gedurende 60 minuten bij ;70°C verwarmd en het gevormde neerslag werd door filtratie verwij- | | ; derd. i

Aan het filtraat werden voorts 215 mg koper(ïï)chloride bij !.60°C toegevoegd en het mengsel werd gedurende 15 minuten tot 65°C :j5:verwarmd. Na koeling van het mengsel werd het gevormde neerslag door filtratie verwijderd, zodat 500 ml lichtblauw filtraat werden ver-kregen.

! i

Het filtraat werd gedialyseerd en werd vervolgens gelyofili-seerd.

20' (1) Het verkregen superoxide-dismutase was wit. j i (2) Het totale gewicht van de verkregen proteïnen was 98 mg.

(3) De enzymactiviteit van superoxide-dismutase was 73*250 eenheden.

; (4) De specifieke enzymactiviteit van het superoxide-dismutase i25;was 747 eenheden/proteïne(mg).

j De resultaten van de vergelijkingsproeven 2-1, 2-2 en 2-3 kun- ; ren als volgt worden samengevat:

Yergelij- Kleur van Totale Enzym- Specifieke enzym- kings- S.O.D. proteïne- activi- activiteit [eenhe- ;20' proef gewicht teit den/proteïne(mg)] (eenheden) 2-1 roodbruin 870 mg 74.400 85 2-2 licht grijs- 185 mg 43*200 238 groen 35 2-3 wit 98 mg 73250 747 S.O.D. = superoxide-dismutase.

Deze vergelijkende proeven geven aan, dat weglating van de tweede trap aanzienlijk de zuiverheid van het superoxide-dismutase vermindert.

81 02 9 9 8 -17-

De beschreven uitvoeringsvormen zijn alleen als voorbeeld gegeven en de deskundigen zullen in staat zijn variaties en modificaties ;aan te brengen zonder buiten het kader van de uitvinding te treden.

:Bijvoorbeeld worden in de beschreven uitvoeringsvormen precipitaten | 5 gevormd tijdens de werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismu-| , tase uit rode bloedcellen door filtratie verwijderd. Echter kan ver-; | wijdering van dergelijke precipitaten worden uitgevoerd door centri-: | fugeren of andere methoden, die als equivalent worden beschouwd aan ; | ;dergelijke scheidingsmethoden volgens deskundigen. Al dergelijke mo- !10;dificaties en variaties vallen binnen het kader van de uitvinding.

! ! ! ; | ; : i l ; j : j ; - : i ! : i i I : ' i ! : j | ; ! i : j j : ' | 81 02 9 9 8

Claims

1. Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit |rode bloedcellen, met het kenmerk, dat men gehemolyseerde rode bloedcellen bij aanwezigheid van ten minste ; 5iéén eenwaardig anorganisch neutraal zout en ten minste één over-:gangsmetaalzout verwarmt, neerslag uit de gehemolyseerde rode bloedcellen verwijdert door !filtratie of door centrifugeren voor het verkrijgen van een oplossing, 110: voorts ten minste één overgangsmetaalzout aan deze oplossing !toevoegt in een hoeveelheid gelijk aan of groter dan die van de j ieerste toevoeging van overgangsmetaalzouten onder toepassing van warmte daarop en neerslag uit deze oplossing verwijdert. 15' 2. Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit :rode bloedcellen, met het kenmerk, dat men gehemolyseerde rode bloedcellen bij aanwezigheid van ten minste: ;één eenwaardig anorganisch zout en ten minste één overgangsmetaal-zout verwarmt, ;20 neerslag uit de gehemolyseerde rode bloedcellen door filtratie of door centrifugeren verwijdert voor het verkrijgen van een op-, lossing, ten minste één overgangsmetaalzout aan de oplossing toevoegt in een hoeveelheid gelijk aan of kleiner dan die van de eerste toe- :25 voeging van overgangsmetaalzouten onder toepassing van warmte daar-:°p» voorts een overgangsmetaalzout toevoegt aan de oplossing onder | toepassing van warmte daarop in een hoeveelheid gelijk aan of groter dan die van de eerste toevoeging van een overgangsmetaalzout en 30 neerslag uit de oplossing verwijdert.

5· Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloedcellen volgens conclusie 1 en 2, met het kenmerk, dat men als eenwaardige anorganische neutrale zouten na-triumchloride, kaliumchloride, lithiumchloride, natriumnitraat, ka- : ^ liumnitraat, lithiumnitraat, natriumbromide, kaliumbromide, lithium-: 'bromide en/of ammoniumbromide toepast. ; 4· Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloedcellen volgens conclusie 1 en 2, met het kenmerk, dat men als overgangsmetaalzouten zouten van koper, kobalt en/of mangaan toepast. 81 0 2 9 9 8 * , -19- «

5· Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode bloedcellen, met het kenmerk, dat men rode bloedcellen hemolyseert door deze rode bloedcellen met water te mengen, 5 ten minste één eenwaardig anorganisch neutraal zout en ten I minste één overgangsmetaalzout aan het mengsel van gehemolyseerde rode bloedcellen toevoegt, het mengsel van gehemólyseerde rode bloedcellen verwarmt, neerslag gevormd tijdens de verwarming van het mengsel van ge- j 10'hemolyseerde rode bloedcellen daaruit elimineert door filtratie of !door centrifugeren voor het verkrijgen van een oplossing, ! voorts ten minste één overgangsmetaalzout aan de oplossing toe-: ; i j voegt in een hoeveelheid gelijk aan of groter dan die van de eerste ; itoevoeging van overgangsmetaalzouten onder toepassing van warmte ; 15 daarop, ; | | neerslag gevormd tijdens de verwarming van de oplossing elimi- i I Jneert, j ; de oplossing dialyseert en ; superoxide-dismutase isoleert uit de gedialyseerde oplossing 20 door chromatografie.

6. Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit j rode bloedcellen, met het kenmerk, dat men rode bloedcellen hemolyseert door de rode bloedcellen met waiter te. mengen, ! 25 ten minste één eenwaardig anorganisch neutraal zout en ten :minste één overgangsmetaalzout aan het mengsel van gehemolyseerde rode bloedcellen toevoegt, | het mengsel van gehemolyseerde rode bloedcellen verwarmt, neerslag gevormd tijdens de verwarming van het mengsel van ge- j : 30!hemolyseerde rode bloedcellen daaruit elimineert door filtratie of door centrifugeren voor het verkrijgen van een oplossing, voorts ten minste één overgangsmetaalzout aan de oplossing toevoegt in een hoeveelheid gelijk aan of kleiner dan die van de eerste toevoeging van overgangsmetaalzouten onder toepassing van warmte 35 daarop, uit de oplossing neerslag gevormd tijdens de verwarming van de oplossing elimineert, voorts ten minste één overgangsmetaalzout aan de oplossing toevoegt in een hoeveelheid gelijk aan of groter dan die van de eerste 40 toevoeging van een overgangsmetaalzout onder toepassing van warmte 81 0 2 9 9 8 .? * . -20- % daarop, uit de oplossing neerslag gevormd tijdens de verwarming van de oplossing elimineert, | de oplossing dialyseert, en 5! superoxide-dismutase uit de gedialyseerde oplossing door chro- i imatografie isoleert.

7· Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit rode . "bloedcellen volgens conclusie 5 en 6, met het ken-'merk, dat men als eenwaardige anorganische neutrale zouten na-10Itriumchloride, kaliumchloride, lithiumohloride, natriumnitraat, ka-;liumnitraat, lithiumnitraat, natriumbromide, kaliumbromide, lithium-] j ;bromide en/of ammoniumbromide toepast.

8. Werkwijze voor het isoleren van superoxide-dismutase uit ro- < ! i ide bloedcellen volgens conclusie 5 en 6, met het ken-1^m e r k , dat men als overgangsmetaalzouten zouten van koper, kobalt : en/of. mangaan toepast. : i ' ; : i , ; : i : j ; ! 8102998