FR2485203A1 - Procede pour isoler la dismutase peroxydee des hematies - Google Patents
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Abstract
PROCEDE POUR ISOLER DE LA DISMUTASE PEROXYDEE D'HEMATIES. IL CONSISTE A CHAUFFER DES HEMATIES HEMOLYSEES EN LA PRESENCE D'AU MOINS UN SEL NEUTRE MINERAL MONOVALENT ET D'AU MOINS UN SEL DE METAUX DE TRANSITION, A ELIMINER LE PRECIPITE DES HEMATIES HEMOLYSEES PAR FILTRATION OU PAR CENTRIFUGATION POUR OBTENIR UNE SOLUTION, A AJOUTER ENCORE AU MOINS UN SEL DE METAUX DE TRANSITION AU MOINS UNE FOIS A LA SOLUTION, TOUT EN CHAUFFANT, ET A ELIMINER LE PRECIPITE DE LA SOLUTION. MEDECINE.
Description
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La présente invention est relative à un nouveau procédé
pour isoler la dismutase peroxydée des hématies et, plus parti-
culièrement, à un procédé pour isoler la dismutase peroxydée d'hématies hémolysées en faisant précipiter des protéines ayant de l'avidité pour l'hémoglobine et pour la dismutase peroxydée et d'autres protéines qui ne sont pas nécessaires dans les hématies hémolysées, en la présence de sels neutres minéraux monovalents et de sels de métaux de transition en y appliquant
de la chaleur.
La dismutase peroxydée est un enzyme qui catalyse la dismutation des ions 02 peroxydes de la manière suivante
+ 2H+ 02 + 1202
Cet enzyme est très répandu dans les organismes animaux et végétaux et a pour fonction d'éliminer l'oxygène actif de ces organismes, cet oxygène actif étant engendré au cours des réactions biochimiques dans les organismes et agissant comme
cytotoxine des organismes.
La dismutase peroxydée obtenue à l'état pur, à partir des hématies d'animaux supérieurs, est un chélate métallique
protéiné qui est dénommé "orgotéine".
La dismutase peroxydée d'érythrocyte de boeuf a une masse moléculaire de 31.200 et consiste en deux sous-unités moléculaires apparemment identiques, chaque sous-unité ayant 151 amino acides, la plus grande partie des amino acides ayant une structure cylindrique de type B, tandis que le reste a une
structure en spirale de type ".
En raison des structures des amino acides, la dismutase
peroxydée d'érythrocyte de boeuf est très résistante à la déna-
turation.
Comme on l'a mentionné ci-dessus, la dismutase peroxy-
dée d'érythrocyte de boeuf est un chélate métallique protéiné dans lequel le cuivre et le zinc sont contenus chacun à raison
de 2 atomes gramme pour une mole de dismutase peroxydée.
Le point isoélectrique de la dismutase peroxydée est
proche du pH 5,5. La dismutase peroxydée est inoffensive vis-à-
vis des organismes vivants et, du point de vue immunologique, elle ne peut pas être considérée comme une matière étrangère
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dans les organismes vivants et c'est donc une protéine injec-
table.
Pharmacologiquement, la dismutase peroxydée peut servir de médicament pour traiter des inflammations provoquées par des maladies autoimmunologiques et, récemment, en utilisant la
dismutase peroxydée, on a essayé de mettre au point des médica-
ments destinés à traiter l'arthrite déformante et le rhumatisme
chronique, et à traiter des effets secondaires nuisibles provo-
qués par la radiothérapie.
On a proposé plusieurs procédés pour isoler la dismuta-
se peroxydée d'érythrocyte, à savoir "l'orgotéine", des hématies.
Mais ces procédés classiques ont un certain nombre d'inconvé-
nients. C'est ainsi, par exemple, que la pureté et le rendement de la dismutase peroxydée d'érythrocyte obtenue sont faibles et que l'on ne peut utiliser du sang conservé pour préparer la
dismutase peroxydée d'érythrocyte par ces procédés classiques.
En fait, si l'on pouvait utiliser du sang conservé pour prépa-
rer de la dismutase peroxydée d'érythrocyte en pratique, ce
serait très utile.
Plus particulièrement, à la demande de brevet au Japon publiée sous le No. 53-31.206, on décrit un procédé pour isoler l'orgotéine d'hématies hémolysées en soumettant les hématies hémolysées à un traitement thermique en la présence de sels de métaux divalents, tels que le cuivre, le zinc, le cobalt, le
manganèse, et le magnésium, et en faisant précipiter l'hémo-
globine et l'anhydrase carbonique et en les enlevant.
Dans ce procédé, bien que les hématies hémolysées
soient traitées à une température comparativement élevée pen-
dant une longue période, la séparation par précipitation des protéines qui ne sont pas nécessaires des hématies hémolysées en vue d'isoler la dismutase peroxydée est incomplète, et de
l'hémoglobine colorée en rouge reste dans la solution surna-
geante des hématies hémolysées traitées par la chaleur. Les
protéines qui ne sont pas nécessaires et qui n'ont pas été sé-
parées,provoquent une dégradation de l'activité de la dismutase
peroxydée pendant le stade de purification ultérieur de celle-
ci. En outre, dans ce procédé, quand on utilise des hématies lyophilisées pour en isoler de la dismutase peroxydée, la
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séparation et la purification de la dismutase peroxydée sont plus difficiles en comparaison de ce qu'elles sont lorsque l'on
utilise des hématies fraîches non traitées.
A la demande de brevet publiée au Japon sous le numéro 45-39.832, on décrit un procédé pour isoler de l'orgotéine en traitant des hématies hémolysées par un composé organique chloré, afin de former un complexe d'hémoglobine et en enlevant
l'hémoglobine sous la forme du complexe des hématies hémolysées.
Mais, dans ce procédé, une quantité importante de dismutase
peroxydée est attirée sur le complexe et le rendement en dismu-
tase peroxydée dans la solution surnageante des hématies hémo-
lysées est diminué de plus de 20 %.
Au Journal of Biochemical Chemistry, vol. 244, 6051,
on décrit un autre procédé pour isoler de la dismutase peroxy-
dée d'hématies hémolysées en utilisant un composé chloré. Mais
dans ce procédé l'activité de la dismutase peroxydée est dimi-
nuée d'au moins 20 % au premier stade d'extraction, en comparai-
son de l'activité de la dismutase peroxyde non isolée.
Ces procédés d'isolement de peroxydes en utilisant des composés organiques chlorés nécessitent une grande quantité de solvants organiques et ne sont donc pas pratiques en termes de
coût et d'efficacité de la séparation. En outre, quand on uti-
lise des hématies lyophilisées, des protéines qui ne sont pas nécessaires incluant l'hémoglobine auxquelles la dismutase peroxydée est attirée, restent dans la solution surnageante des hématies hémolysées. C'est pourquoi l'isolement de dismutase peroxydée de la solution surnageante et sa purification sont
extrêmement difficiles.
A la demande de brevet publiée au Japon sous le numéro 49-50.195, on a décrit un autre procédé pour isoler de la
dismutase peroxydée d'hématies hémolysées, ce procédé consis-
tant à soumettre les hématies hémolysées à un traitement par
la chaleur, à traiter la solution surnageante des hématies hémo-
lysées traitées par la chaleur par un enzyme protéolytique et à filtrer la solution surnageante traitée et à séparer et à
purifier la dismutase peroxydée de la solution par chromato-
graphie sur colonne et par filtration sur gel. Les inconvé-
nients de ce procédé sont que les stades mis en oeuvre dans le processus utilisant l'enzyme protéolytique sont compliqués
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et que, quand on utilise des hématiesvilUJMOUdes hématies lyophilisées pour préparer de la dismutase peroxydée, celle-ci est fortement liée à des protéines qui ne sont pas nécessaires contenues dans les hématies, si bien que la purification de la dismutase peroxydée est extrêmement difficile. Enfin, dans la demande de brevet publiée au Japon sous
le No. 53-22.137, on décrit un procédé pour isoler de la dismu-
tase peroxydée d'hématies hémolysées en faisant en sorte que de la dismutase peroxydée contenue dans des hématies hémolysées
soit attirée directement sur une résine d'échange d'ions faible-
ment basique. Mais, en termes de coût et d'efficacité, ce pro-
cédé ne convient pas pour séparer d'autres protéines, une pro-
téine telle que la dismutase peroxydée représentant de 0,3 à 0,5 % en poids. En fait, on ne peut pas utiliser ce procédé
pour préparer une grande quantité de dismutase peroxydée à par-
tir d'hématies hémolysées.
Comme on l'a décrit ci-dessus, ces procédés d'isolation classiques de dismutase peroxydée ont divers inconvénients et
ne peuvent pas être utilisés en pratique.
L'invention vise: - un nouveau procédé pour isoler la dismutase peroxydée
d'hématies en enlevant des protéines qui ne sont pas nécessai-
res, y compris l'hémoglobine et une protéine ayant de l'avidité
pour la dismutase peroxydée, ce procédé étant simple et effica-
ce pour isoler de la dismutase peroxydée; - un procédé capable d'isoler la dismutase peroxydée
non seulement d'hématies fraîches, mais aussi d'hématies con-
servées avec sensiblement le même rendement élevé en dismu-
tase peroxydée.
On a en effet trouvé que l'obstacle le plus important à la séparation et à la purification de la dismutase peroxydée d'hématies hémolysées est une certaine protéine qui peut former facilement un complexe en combinaison à l'hémoglobine et/ou à
la dismutase peroxydée, cette protéine étant difficile à sépa-
rer de la dismutase peroxydée. Cette protéine, compte tenu de son comportement à la dénaturation, est considérée comme étant une lipoprotéine dérivée des membranes des hématies et est
désignée ci-après comme la protéine d'avidité.
On a trouvé en outre que l'on peut séparer complètement
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et facilement la protéine d'avidité de la dismutase peroxydée par des traitements à la chaleur en deux ou trois stades des hématies hémolysées en la présence de sels minéraux neutres
monovalents et de sels de métaux de transition.
L'invention repose sur les deux phénomènes mentionnés ci-dessus. Quand la protéine d'avidité contenue dans les hématies et ayant une forte affinité pour la dismutase peroxydée est traitée, par exemple par congélation, par lyophilisation et par
des traitements par des solvants organiques suivis d'un traite-
ment à la chaleur, la protéine d'avidité est légèrement déna-
turée au cours du traitement et forme un complexe associé étroitement à l'hémoglobine et/ou à la dismutase peroxydée. La
formation d'un tel complexe a lieu aussi au cours du vieillis-
sement des hématies.
La difficulté à laquelle on se heurte habituellement pour isoler la dismutase peroxydée à l'état pur d'hématies congelées, d'hématies lyophilisées et de sang conservé est due probablement à la présence d'un tel complexe de la protéine d'avidité et de dismutase peroxydée, en dépit du fait que des
hématies congelées, des hématies lyophilisées et du sang con-
servé ont été considérés jusqu'ici comme étant les sources de
dismutase peroxydée les plus pratiques, si la dismutase peroxy-
dée pouvait en être séparée facilement à l'état pur et en un
rendement élevé.
Suivant l'invention, les hématies qui peuvent être utilisées pour en isoler de la dismutase peroxydée ne sont pas limitées à des hématies fraîches non traitées, mais on peut utiliser tout aussi bien des hématies vieillies qui ont été conservées pendant longtemps, des hématies congelées et des
hématies lyophilisées.
En outre, aux fins de l'invention, bien qu'il soit pré-
férable d'utiliser des hématies exemptes de plasma sanguin, on peut utiliser aussi sans problème important des hématies
dont le plasma sanguin n'a pas été enlevé complètement.
On explicite ci-dessous un procédé pour isoler, suivant l'invention, de la dismutase peroxydée d'hématies. Ce procédé
comprend essentiellement deux stades.
Au premier stade, on ajoute de l'eau à des hématies afin de les hémolyser et de faciliter le brassage des hématies hémolysées pendant le processus d'isolation de la dismutase peroxydée. La quantité d'eau à ajouter par rapport aux hématies représente de 1 à 4 fois et, de préférence, de 2 à 3 fois le volume des hématies. On chauffe la solution d'hématies hémolysées ainsi formée à des températures allant de 60C à 750C pendant 10 à minutes et, de préférence, de 650C à 70C pendant 25 à 40 minutes, en la présence d'un sel minéral neutre monovalent, tel que le chlorure de lithium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le nitrate de lithium, le nitrate de
sodium, le nitrate de potassium, le bromure de sodium, le bro-
mure de potassium, le bromurede lithium et le bromure d'ammo-
nium, et d'une quantité comparativement petite d'un sel d'un métal de transition, tel qu'un sel hydrosoluble de cuivre, un sel hydrosoluble de cobalt et un sel hydrosoluble de manganèse par exemple Cu(No3)2, 3H20, CuC12, 2H20, CuBr2, CuCl, MnCl2, 4H20, et CoCl2, 2H20, et de préférence du chlorure de cuivre (I) et du nitrate de cuivre (II), puisque ces sels de cuivre sont capables de dénaturer sélectivement les protéines qui ne sont pas nécessaires et d'en favoriser la coagulation et la précipitation.
Les sels minéraux neutres monovalents ont pour fonc-
tion de séparer la dismutase peroxydée de la protéine d'avidité et des protéines qui ne sont pas nécessaires, qui comprennent principalement de l'hémoglobine dénaturée, en affaiblissant la liaison entre la dismutase peroxydée et la protéine d'avidité
et les protéines qui ne sont pas nécessaires.
Les sels des métaux de transition ont pour fonction de
favoriser la dénaturation des protéines qui ne sont pas néces-
saires, de faciliter la précipitation des protéines qui ne sont pas nécessaires et l'isolation de la dismutase peroxydée des protéines qui ne sont pas nécessaires en donnant une pureté
élevée et un rendement élevé.
Pour affaiblir la liaison entre la dismutase peroxydée et la protéine d'avidité et d'autres protéines qui ne sont pas nécessaires, la concentration du sel neutre minéral monovalent de la solution d'hématies hémolysées est comprise entre 0,2 mole et la saturation et, de préférence, entre 0,3 mole et
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1,0 mole.
Comme sels de métal de transition, les concentrations de sels de cuivre qui conviennent vont de 1 x 10 4 moles à 2 Ax 10-4 moles, alors que la concentration qui convient pour le sel de manganèse est comprise entre 1 x 10 3 moles et 2 x 10O3 moles. Pendant le premier stade, les protéines qui ne sont pas nécessaires, y compris la protéine d'avidité et l'hémoglobine, précipitent pour la plus grande partie. On enlève les protéines précipitées par filtration. A ce stade, il reste une très petite quantité de protéines qui ne sont pas nécessaires dans
ce qui surnage au-dessus de la solution d'hématies hémolysées.
Au second stade, en vue d'enlever les protéines qui ne.
sont pas nécessaires et qui restent encore dans la-solution surnageante d'hématies hémolysées, on ajoute encore à cette solution le sel de métal de transition utilisé au premier stade et on chauffe la solution d'hématies hémolysées à des
températures comprises entre 600C et 750C pendant 10 et 60 mi-
nutes et, de préférence, à des températures comprises entre 60C et 680C pendant 15 à 30 minutes. On ajoute le sel de métal de transition jusqu'à ce que la solution surnageante devienne
limpide, tout en chauffant la solution d'hématies hémolysées.
Dans le cas particulier du sel de cuivreOn lajoute peu à peu de manière à ce que la solution surnageante soit légèrement
colorée en bleu après achèvement du chauffage.
Après avoir refroidi la solution d'hématies hémolysées, on enlève les protéines précipitées qui ne sont pas nécessaires
par filtration. Il en résulte que pratiquement toutes les pro-
téines qui ne sont pas nécessaires sont éliminées, tandis que
la dismutase peroxydée reste dans le filtrat-sans être déna-
turée. On dialyse le filtrat contre de l'eau désionisée et/ou une solution tampon classique, pour en enlever le sel neutre
monovalent et le sel du métal de transition.
De la solution ainsi obtenue, on obtient de la dismu-
tase peroxydée à l'état pur, par un processus de purification
mettant en oeuvre une séparation par dialyse, une chromatogra-
phie sur colonne de cellulose DEAE et une filtration sur gel.
Un autre procédé pour isoler la dismutase peroxydée
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des hématies hémolysées suivant l'invention comprend les deux
stades mentionnés ci-dessus et un stade intermédiaire supplémen-
taire. Dans le stade intermédiaire supplémentaire, après avoir achevé le premier stade, on ajoute encore le sel du métal de transition à la solution surnageante obtenue au premier stade en une quantité comprise entre 1 x 10 moles à 1 x 10 moles
et on chauffe à nouveau la solution-surnageante à des températu-
res comprises entre 600C et 700C pendant 10 minutes environ.
On peut enlever les protéines qui ne sont pas nécessaires et qui ont précipité dans ce stade intermédiaire après achèvement de ce stade ou ultérieurement. Les autres stades de ce mode opératoire sont-exactement les mêmes que ceux du premier mode
opératoire mentionné. Ce second mode opératoire permet d'augmen-
ter le rendement en dismutase peroxydée par rapport au premier.
En relation avec ce stade intermédiaire, si la quantité de sel de métal de transition à ajouter au premier stade est augmentée au-delà de la quantité mentionnée préalablement, alors que le stade intermédiaire est omis, le rendement final en
dismutase peroxydée diminue.
Les exemples suivants, dans lesquels on a utilisé du citrate de sodium comme anticoagulant pour le sang et dans lesquels la mesure de l'activité de la dismutase peroxydée est effectuée suivant la méthode McCord et Fridovich proposée au Journal of Biochemistry, vol. 244, 6049 (1969), illustrent l'invention.
EXEMPLE 1
A 255 grammes d'hématies obtenus de 600 ml de sang de boeuf frais, on ajoute 25 grammes de chlorure de sodium, 25 mg de chlorure cuivrique et 600 ml d'eau-et on mélange. On chauffe le mélange à 680C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le
mélange, on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 25 mg de chlorure cuivrique et
on chauffe le mélange à 600C pendant 10 minutes.
Tout en élevant la température du mélange à 65'C et en maintenant cette température, on ajoute encore du chlorure cuivrique peu à peu au mélange, jusqu'à ce que le surnageant du mélange soit coloré en bleu au maximum sans devenir trouble. Il en ressort que l'on ajoute 380 mg de chlorure cuivrique au
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total au mélange en 20 minutes et que, pendant cette période,
on chauffe continuellement le mélange à 650C.
Après avoir refroidi le mélange, on filtre le précipité et on dialyse le filtrat contre dé l'eau désionisée pendant 48 heures, puis on filtre. On dialyse le filtrat pendant une nuit contre un tampon au phosphate de potassium 0,0025 M (pH 7,4) et on équilibre à l'aide du même tampon. On filtre la solution en obtenant 850 ml
de filtrat contenant 109.080 unités de dismutase peroxydée.
On applique ensuite la solution de dismutase peroxydée sur une colonne DE 52 (1,9 x 11,5 cm) (fournie par la Société Whatman Ltd. sous la marque de DEAE cellulose) préalablement équilibrée par le même tampon au phosphate de potassium que mentionné ci-dessus de sorte que la solution de dismutase peroxydée s'adsorbe sur la colonne. On effectue une élution avec gradient en utilisant 400 ml du même tampon au total, la concentration du phosphate de potassium allant de 0,0025 M à
0,075 M. On recueille les fractions actives de bismutase per-
oxydée et on les réunit et on les dialyse puis on les lyophi-
lise. Le rendement en dismutase peroxydée à l'état lyophilisé
est de 43,0 mg avec 96.850 unités.
EXEMPLE 2
A 417 grammes d'hématies de boeuf qui ont été conser-
vées pendant 2 ans à une température de -200C, on ajoute 55 grammes de bromure de sodium, 30 mg de chlorure cuivrique et
650 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 680C pen-
dant 25 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le
précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 20 mg de chlorure cuivrique et
on chauffe le mélange à 60C pendant 15 minutes.
On élève la température du mélange à 650C et on y ajoute encore 600 mg de chlorure cuivrique, tout en maintenant
cette température pendant 15 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité par filtration en obtenant 1080 ml du filtrat. On dialyse le filtrat contre de l'eau désionisée pendant 48 heures, puis on
le filtre.
On dialyse le filtrat pendant une nuit contre un tampon au phosphate de sodium 0,0025 M (pH 7,4) et on l'équilibre par
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le tampon. On filtre cette solution et on la lyophilise ensuite
en obtenant 285 mg de dismutase peroxydée ayant 206.400 unités.
On dissout la dismutase peroxydée ainsi obtenue dans 10 ml d'un
tampon au phosphate de potassium 0,0025 M (pH 7,4) et on appli-
que la solution de dismutase peroxydée sur une colonne DE 52 (1,9 x 11,5 cm) (fournie par la Société Whatman Ltd. Sous la
marque DEAE cellulose) équilibrée au préalable par le même tam-
pon au phosphate de potassium que celui mentionné ci-dessus, de sorte que la solution de dismutase peroxydée est adsorbée sur la colonne. On effectue une élution avec gradient en utilisant 500 ml du même tampon au total, la concentration en phosphate de potassium allant de 0,0025 M à 0, 075 M. On recueille les fractions actives de la dismutase peroxydée et on les réunit, puis on dialyse et on lyophilise. Le rendement en dismutase
peroxydée à l'état lyophilisé est de 72,5 mg avecl79.100 unités.
EXEMPLE 3
A 73,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (corres-
pondant à 210 ml d'hématies de boeuf fraîches), on ajoute 30 grammes de bromure de sodium, 20 mg de chlorure cuivrique et
600 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 650C pen-
dant 30 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le
précipité par filtration.
On ajoute 320 mg de chlorure cuivrique au filtrat et on
chauffe le mélange à 60C pendant 15 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée pendant 48 heures puis on le filtre.
On dialyse le filtrat pendant une nuit contre un tampon au phosphate de potassium 0,0025 M (pH 7,4) et on l'équilibre par le même tampon. On filtre la solution, puis on l'applique sur une colonne DE 52 (1,9 x 11,5 cm) (fournie par la Société
Whatman Ltd. sous la marque DEAE cellulose) équilibrée au préa-
lable par le même tampon au phosphate de potassium que celui mentionné cidessus, de sorte que la solution de dismutase peroxydée s'adsorbe sur la colonne. On effectue une élution avec gradient en utilisant 500 ml du même tampon au total, la concentration du phosphate de potassium de ce tampon allant de 0,0025 M à 0,075 M. On recueille les fractions actives de dismutase peroxydée et on les réunit, puis on les dialyse et
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on les lyophilise. Le rendement en dismutase peroxydée à l'état
lyophilisé est de 34,5 mg avec 76.000 unités.
EXEMPLE 4
A 315 grammes d'hématies provenant de sang humain con-
servé pendant 30 jours (dans lequel on ajouté comme anticoagu- lant un mélange d'acide de citrate et de dextrose (ACD)), on ajoute 30 grammes de chlorure de potassium, 25 mg de chlorure cuivrique et 550 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 680C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on
enlève le précipité par filtration.
On ajoute 300 mg de chlorure cuivrique au filtrat et
on chauffe le mélange à 680C pendant 20 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité par filtration, ce qui donne 900 ml d'un filtrat limpide bleu
clair et on dialyse le filtrat contre de l'eau désionisée pen-
dant 48 heures, puis on le filtre.
L'activité de la dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 63.600 unités.
EXEMPLE 5
A 105 grammes d'hématies de mouton qui ont été conser-
vées à une température de 40C pendant 15 jours, on ajoute grammes de chlorure de sodium, 6 mg de chlorure cuivrique,
CuCl2, 2H20 et 250 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélan-
ge à 650C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le mélange,
on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 150 mg de chlorure cuivrique,
CuCl2, 2H20 et on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
*sée, puis on le filtre.
L'activité de la dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 19.860 unités.
EXEMPLE 6
A 73,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées, on
ajoute 30 grammes de nitrate de sodium, 20 mg de nitrate cui-
vrique, Cu(N03)2, 3H20 et 600 ml d'eau et on mélange. On
chauffe le mélange à 650C pendant 25 minutes. Après avoir re-
froidi le mélange, on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 280 mg de nitrate cuivrique,
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Cu<N092, 3H20, eton chauffe le mélange à 650C pendant 20 minu-
tes. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée, puis on le filtre. L'activité de la dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 94.300 unités.
EXEMPLE 7
A 73,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées, on ajoute 35 grammes de nitrate de potassium, 20 mg de nitrate cuivrique, Cu(N03)2, 3H20 et 600 ml d'eau et on mélange. On
chauffe le mélange à 650C pendant 30 minutes. Après avoir re-
froidi le mélange, on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat on ajoute 300 mg de nitrate cuivrique, Cu(N03)2, 3H20 et on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée, puis on le filtre.
L'activité de dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 83.600 unités.
EXEMPLE 8
A 210 grammes d'hématies de boeuf congelées, on ajoute grammes de bromure de potassium, 30 mg de bromure de cuivre
(II), CuBr2 et 520 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélan-
ge à 650C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le mélange,
on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 400 mg de bromure de cuivre (II)
CuBr2, et on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée, puis on le filtre.
L'activité en dismutase peroxyde contenue dans le fil-
trat s'élève à 87.500 unités.
EXEMPLE 9
A 250 grammes d'hématies de boeuf fraîches, on ajoute grammes de chlorure de lithium, 20 mg de chlorure de cuivre (I), CuCl et 620 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à.670C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on
13 2485203
enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 320 mg de chlorure de cuivre (I) et on chauffe le mélange à 670C pendant 20 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée, puis on le filtre.
L'activité de dismutase peroxydée contenue dans le fil-
trat s'élève à 104.200 unités.
Les exemples suivants illustrent le second mode opéra-
toire incorporant le stade intermédiaire mentionné auparavant,
suivant l'invention.
EXEMPLE 10
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées, on
ajoute 15 grammes de nitrate de lithium, 20 mg de nitrate cui-
vrique, Cu(NO3)2, 3H20r et 500 ml d'eau et on mélange. On
chauffe le mélange à 650C pendant 30 minutes. Après avoir re-
froidi le mélange, on enlève le précipité par filtration.
Après avoir achevé ce premier stade, on ajoute encore au filtrat 20 mg de nitrate cuivrique, Cu(N03)2, 3H20, et on
chauffe le mélange à 680C pendant 15 minutes. Après avoir re-
froidi le mélange, on enlève le précipité par filtration.
Au filtrat, on ajoute 1,25 gramme de chlorure de
cobalt (II), CoCl2 2H20, et on chauffe le mélange à 700C pen-
dant 30 minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité
par filtration. On dialyse le filtrat contre de l'eau désioni-
sée, puis on le filtre.
L'activité de la dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 69.800 unités.
EXEMPLE 11
A 60 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées, on ajoute
12 grammes de chlorure de lithium, 150 mg de chlorure de manga-
nèse (II), MnC12, 4H20 et 600 ml d'eau et on mélange. On chauf-
fe le mélange à 70C pendant 30 minutes. Après avoir refroidi
le mélange, on enlève le précipité par filtration.
Après avoir achevé ce premier stade, on ajoute encore au filtrat 15 mg de chlorure de cuivre (II), CuCl2, 2H20 et on
chauffe le mélange à 70C pendant 20 minutes. Après avoir re-
froidi le mélange on enlève le précipité par filtration.
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Au filtrat, on ajoute 2,0 grammes de chlorure de manga-
nèse (II), MnCl2, 4H20, et on chauffe le mélange à 70C pendant
minutes.
Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité par filtration. L'on dialyse le filtrat contre de l'eau désio-
nisée, puis on le filtre.
L'activité de la dismutase peroxydée contenue dans le
filtrat s'élève à 69.750 unités.
Pour confirmer l'effet du sel neutre minéral monovalent sur l'efficacité de la séparation de la dismutase peroxydée, et sur l'activité de la dismutase peroxydée obtenue, on effectue les essais comparatifs suivants en utilisant du chlorure de
sodium comme sel neutre ou minéral monovalent.
ESSAI COMPARATIF 1-1.
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (cor-
respondant à 150 ml d'hématies de boeuf fraîches), on ajoute grammes de chlorure de sodium (0,5 M), 20 mg de chlorure cuivrique et 500 ml d'eau. On chauffe le mélange à 700C pendant
minutes et on enlève le précipité formé par filtration.
Au filtrat, on ajoute encore 230 mg de chlorure cuivri-
que et on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes. On
enlève le précipité formé par filtration.
On dialyse ce qui surnage au-dessus du filtrat, puis on
le lyophilise de manière à obtenir de la dismutase peroxydée.
L'activité de la dismutase peroxydée ainsi obtenue
s'élève à 63.000 unités.
ESSAI COMPARATIF 1-2.
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (corres-
pondant à 150 ml d'hématies de boeuf fraîches) on ajoute 20 mg de chlorure cuivrique et 500 ml d'eau. On chauffe le mélange à 700C pendant 60 minutes et on enlève le précipité formé par filtration.
Au filtrat, on ajoute encore 230 mg de chlorure cuivri-
que et on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes. Dans le mélange, la formation du précipité est incomplète, mais on enlève le précipité formé par filtration. Le filtrat est coloré en brun rouge et il apparaît qu'une purification complète par
cette filtration est impossible. C'est pourquoi on ajoute en-
core au filtrat 220 mg de chlorure cuivrique, on ajuste le pH
2485203
du filtrat à 5,6 par addition d'hydroxyde de sodium, on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes et on enlève le précipité par filtration. Du filtrat, on obtient un surnageant incolore
(pH 5,8).
On dialyse le surnageant puis on le lyophilise, de ma-
nière à obtenir de la dismutase peroxydée.
L'activité de la dismutase peroxydée ainsi obtenue
s'élève à 11.700 unités.
Dans l'essai 1-1 comparatif, du chlorure de sodium servant de sel neutre minéral monovalent est ajouté au mélange
réactionnel au premier stade, tandis que dans l'essai compara-
tif 1-2, on n'ajoute pas de sel minéral monovalent au premier stade.
Les résultats de ces deux essais comparatifs sont les-
suivants.
Ces résultats montrent que l'addition du sel neutre
minéral monovalent augmente nettement l'activité de la dismu-
tase peroxydée.
En outre, afin de confirmer l'effet du second stade, dans lequel on ajoute le sel du métal de transition au mélange réactionnel, sur l'efficacité de la séparation de la dismutase peroxydée et sur l'activité de la dismutase peroxydée obtenue,
on effectue les essais comparatifs suivants.
ESSAI COMPARATIF 2-1.
Dans cet essai comparatif, on omet le second stade de
la manière suivante.
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (corres-
pondant à 150 ml d'hématies de boeuf fraîches), on ajoute 15 grammes de chlorure de sodium, 15 mg de chlorure cuivrique et 500 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 70C pendant Activité de la Rapport dismutase peroxydée Essai comparatif 63.000 unités 100,0 1-1 Essai comparatif 11.700 unités 18,6 1-2
16 2485203
minutes et on enlève le précipité formé par filtration. Le filtrat est coloré en brun rouge. On dialyse le filtrat et on
le lyophilise ensuite.
(1) La dismutase peroxydée obtenue a une coloration brune rouge. (2) Le poids total des protéines obtenues est de
870 mg.
(3) L'activité enzymatique de la dismutase peroxydée
est de 74.400 unités.
(4) L'activité enzymatique spécifique de la dismutase
peroxydée est de 86 unités/protéines (mg).
ESSAI COMPARATIF 2-2.
Dans cet essai comparatif, on omet de filtrer le préci-
pité formé au premier stade.
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (corres-
pondant à 150 ml d'hématies de boeuf fraîches), on ajoute 15 grammes de chlorure de sodium, 15 mg de chlorure cuivrique et
500 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 700C pen-
dant 60 minutes.
* Après avoir refroidi le mélange, on ajoute 1,9 gramme de chlorure cuivrique au mélange, sans éliminer le précipité formé au premier stade. Alors que le pH du mélange est ajusté à 5,6, on chauffe le mélange à 650C pendant 20 minutes. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité par filtration
en obtenant 520 ml d'un filtrat incolore.
On dialyse le filtrat puis on le lyophilise.
(1) La dismutase peroxydée obtenue a une coloration
vert gris clair.
(2) Le poids total des protéines obtenues est de
185 mg.
(3) L'activité enzymatique de la dismutase peroxydée
est de 43.200 unités.
(4) L'activité enzymatique spécifique de la dismutase
peroxydée est de 238 unités/protéines (mg).
ESSAI COMPARATIF 2-3.
Dans cet essai comparatif, on effectue à la fois le pre-
mier stade et le second stade.
A 52,5 grammes d'hématies de boeuf lyophilisées (corres-
pondant à 150 ml d'hématies de boeuf fraîches), on ajoute 15
17 2485203
grammes de chlorure de sodium, 15 mg de chlorure cuivrique et
500 ml d'eau et on mélange. On chauffe le mélange à 70'C pen-
dant 60 minutes et on enlève le précipité formé par filtration.
Au filtrat, on ajoute encore 215 mg de chlorure cuivreux à 60C, et on chauffe le mélange à 650C pendant 15 minutés. Après avoir refroidi le mélange, on enlève le précipité formé
par filtration en obtenant 500 ml d'un filtrat bleu clair.
On dialyse le filtrat, puis on le lyophilise.
(1) La dismutase peroxydée obtenue est blanche.
(2) Le poids total des protéines obtenues est de
98 mg.
(3) L'activité enzymatique de la dismutase peroxydée
est de 73.250 unités.
(4) L'activité enzymatique spécifique de la dismutase
peroxydée est de 747 unités/protéines (mg).
Les résultats des essais comparatifs 2-1, 2-2 et 2-3
peuvent être résumés de la manière suivante.
Ces essais comparatifs montrent que l'omission du se-
cond stade diminue nettement la pureté de la dismutase peroxy-
dée.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits, qui n!ont été donnés qu'à titre
d'exemple. En particulier, dans les modes de réalisation dé-
crits, les précipités formés au cours du processus d'isolement I Activité Essai Couleur Poids Activité enzymatique comparatif de la D.P.0. total des enzymatique spécifique protéines (unités) [unités/protéine (mg)] 2-1 Brun-rougeâtre 870 mg 74.400 85 2-2 Vert gris- 185 mg 43.200 238 léger 23 Blanc 98 mg 73.250 747
D.P.0. = dismutase peroxydée.
18 2485203
de la dismutase peroxydée des hématies sont enlevés par filtra-
tion. Mais l'enlèvement de ces précipités peut être effectué
par centrifugation ou par n'importe quelle autre technique con-
sidérée comme équivalente.
19 2485203
Claims (8)
1. Procédé pour isoler de la dismutase peroxydée d'héma-
ties, caractérisé en ce qu'il consiste - à chauffer des hématies hémolysées en la présence d'au moins un sel neutre minéral monovalent et d'au moins un sel d'un métal de transition; - à éliminer le précipité de ces hématies hémolysées par filtration ou par centrifugation pour obtenir une solution; - à ajouter encore au moins un sel d'un métal de transition à la solution en une quantité égale à celle de la première addition des sels de métaux de transition, ou en une quantité supérieure à celle-ci tout en chauffant; et
- à éliminer le précipité de la solution.
2. Procédé pour isoler de la dismutase peroxydée dUhéma-
ties, caractérisé en ce qu'il consiste: - à chauffer des hématies hémolysées en la présence d'au moins un sel neutre minéral monovalent et d'au moins un sel de métal de transition; - à éliminer le précipité de ces hématies hémolysées par filtration ou par centrifugation pour obtenir une solution;
- à ajouter au moins un sel d'un métal de transi-
tion à la solution en une quantité égale à celle de la première addition des sels des métaux de transition, ou en une quantité inférieure à celleci, tout en chauffant; - à ajouter encore un sel d'un métal de transition à la solution
tout en la chauffant en une quantité égale à celle de la pre-
mière addition du sel de métal de transition, ou en une quanti-
té supérieure à celle-ci; et
- à éliminer le précipité de la solution.
3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que chacun des sels neutres minéraux monovalents est choisi parmi le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de lithium, le nitrate de sodium, le nitrate de potassium, le nitrate de lithium, le bromure de sodium, le bromure de potassium, le bromure de lithium et le bromure d'ammonium.
4. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractéri-
sé en ce que chacun des sels des métaux de transition est choisi parmi les sels de cuivre, les sels de cobalt, et les
sels de manganèse.
5. Procédé pour isoler de la bismutase peroxydée d'héma-
ties, caractérisé en ce qu'il consiste: - à hémolyser des hématies en les mélangeant à de l'eau; -
- à ajouter au moins un sel neutre minéral monova-
lent et au moins un sel des métaux de transition au mélange d'hématies hémolysées; - à chauffer ce mélange d'hématies hémolysées; - à éliminer le précipité formé pendant le chauffage du mélange d'hématies hémolysées de celles-ci par filtration ou par centrifugation pour obtenir une solution; - à ajouter en outre au moins un sel d'un métal de transition à cette solution en une quantité égale à celle de la première addition des sels de métaux de transition ou en une quantité supérieure à celle-ci tout en chauffant; - à éliminer le précipité formé pendant le chauffage de la solution; - à dialyser cette solution; et - à isoler la dismutase peroxydée de la solution
dialysée par chromatographie.
6. Procédé pour isoler de la dismutase peroxyde d'héma-
ties, caractérisé en ce qu'il consiste: - à hémolyser des hématies en les mélangeant à de l'eau;
- à ajouter au moins un sel neutre minéral monova-
lent et au moins un sel de métaux de transition au mélange d'hématies hémolysées; - à chauffer le mélange d'hématies hémolysées;
- à éliminer le précipité formé pendant le chauffa-
ge du mélange d'hématies hémolysées decelles-ci par filtration ou par centrifugation pour obtenir une solution;
- à ajouter au moins un sel d'un métal de transi-
tion à la solution en une quantité égale à celle de la première addition des sels de métaux de transition, ou en une quantité inférieure à celleci, tout en chauffant; - à éliminer la solution et le précipité formé pendant le chauffage de la solution; - à ajouter en outre au moins un sel de métaux de
21 2485203
transition à la solution en une quantité égale à celle de la
première addition d'un sel de métaux de transitions ou supé-
rieure à celle-ci, tout en chauffant;
- à éliminer de la solution le précipité formé pen-
dant le chauffage de la solution; - à dialyser la solution; et - à isoler la dismutase peroxydée de la solution
dialysée par chromatographie.
7. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que chacun des sels neutres minéraux monovalents est choisi parmi le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de lithium, le nitrate de sodium, le nitrate de
potassium, le nitrate de lithium, le bromure de sodium, le bro-
mure de potassium, le bromure de lithium et le bromure d'ammo-
nium.
8. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que chacun des sels de métaux de transition est choisi parmi les sels de cuivre, les sels de cobalt, les sels de manganèse.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8392080A JPS5712993A (en) | 1980-06-23 | 1980-06-23 | Isolation of superoxide dismutase |
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| FR2485203B1 FR2485203B1 (fr) | 1984-04-06 |
Family
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