DE3124228C2

DE3124228C2 - Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen

Info

Publication number: DE3124228C2
Application number: DE3124228A
Authority: DE
Inventors: Takamasa Tokio/Tokyo Yasuda
Original assignee: FUJIREBIO K K TOKIO/TOKYO; Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1980-06-23
Filing date: 1981-06-20
Publication date: 1986-09-25
Also published as: GB2081273B; JPH0151997B2; DE3124228A1; US4346174A; GB2081273A; NL8102998A; FR2485203B1; JPS5712993A; FR2485203A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen, wobei in erster Verfahrensstufe hämolysierte rote Blutzellen in Gegenwart von mindestens einem anorganischen neutralen Salz und mindestens einem Übergangsmetallsalz erhitzt und der gebildete Niederschlag von den hämolysierten roten Blutzellen durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt wird und in zweiter Verfahrensstufe der in der ersten Verfahrensstufe erhaltenen Lösung erneut mindestens ein Übergangsmetallsalz mindestens einmal unter Erhitzen zugesetzt und der gebildete Niederschlag entfernt wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen unter Verwendung von Salzen 2wertiger Metalle.

SuperDxid-dismutase ist ein Enzym, das die Disproportionierung von Superoxid-O~2-lonen in der folgenden Weise katalysiert:

20-2+ 2 H* ^O₂ + H₂O₂.

Dieses Enzym ist in tierischen und pflanzlichen Organismen weit verbreitet. Es hat die Funktion, aus diesen Organismen aktiven Sauerstoff, der im Verlauf von biochemischen Reaktionen in den Organismen gebildet wird und als ein Cytotoxin in den Organismen wirkt, zu entfernen.

Superoxid-dimutase, die in reinem Zustand aus roten Blutzellen höherer Tiere gewonnen wird, ist ein Protein-Metallchelat, das »Orgotein« genannt wird.

Rindererythrocyten-Superoxid-dismutase hat ein Molekulargewicht von 31 200 und besteht aus zwei anscheinend identischen Untereinheiten des Moleküls, von denen eine jede Untereinheit des Moleküls, von denen eine jede Untereinheit 151 Aminosäuren aufweist, wobei der größere Teil der Aminosäuren eine zylindrische Slruktür vom/-Typ und der Rest eine Spiralstruktur vom «-Typ hat.

Infolge der Strukturen des Aminosäuren ist Rindererythrocyten-Superoxid-dismutase gegenüber Denaturicrung sehr widerstandsfähig.

Wie weiter oben angegeben ist, ist Rindererythrocyten-Superoxid-dismutase ein Protein-Metallchelat, in dem Kupfer und Zink jeweils in der Menge von 2 g-Atomen pro Mol Superoxid-dismutase enthalten sind.
Der isoelektrische Punkt der Superoxid-dismutase liegt nahe bei pH 5,5.

Superoxid-dismutase ist lebenden Organismen gegenüber unschädlich, immunologisch kann es nicht als Fremdmaterial in lebenden Organismen angesehen werden, es stellt daher ein injizierbares Protein dar.

Pharmakologisch kann Superoxid-dismutase als ein Mittel zur Behandlung von Entzündungen, die durch Autoimmun-Erkrankungen verursacht worden sind, dienen. Kürzlich sind mit der Anwendung von Superoxiddismutase Versuche unternommen worden, Mittel zur Behandlung von Arthritis deformans, chronischem Rheumatismus sowie zur Behandlung von schädlichen Nebenwirkungen, die auf Radiotherapie zurückgehen, zu entwickeln.

Es sind bereits einige konventionelle Methoden zur Isolierung von Erythrocyten-Superoxid-dismutase und insbesondere von Orgotein aus roten Blutzellen vorgeschlagen worden. Diese konventionellen Methoden weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf. So sind z. B. Reinheitsgrad und Ausbeute der erhaltenen Erythrocyten-Superoxid-dismutase niedrig, und außerdem kann bei diesen konventionellen Methoden konserviertes Blut nicht für die Produktion von Erythrocyten-Superoxid-dismutase verwendet werden. Wenn es gelingen würde, konserviertes Blut zur Herstellung von Erythrocyten-Superoxid-dismutasc in der Praxis zu benutzen, würde dies einen außerordentlichen Vorteil darstellen.

Aus der JP-AS (Japanese Patent Publication) Serial No. 53-31 206 ist bereits eine Methode zur Isolierung von Orgotein aus hämolysierten roten Blutzellen bekannt, wonach die hämolysierten roten Blutzellen der Hit/.ebehandlung in Gegenwart von Salzen zweiwertiger Metalle, wie Kupfer, Zink, Cobalt, Mangan und Magnesium, unterworfen werden und ausgefallenes Hämoglubin und Carbonatdehydratase entfernt wird.

|ί Obgleich bei diesem Verfahren die hämolysierten roten Blutzellen eine lange Zeit bei verhältnismäßig hohen

Ü Temperaturen behandelt werden, ist die Abtrennung durch Fällung der nutzlosen Proteine aus den hämolysier-

|fe" ten roten Blutzellen zur Isolation von Superoxid-dismutase unvollständig, und rotgefärbtes Hämoglubin bleibt in

S, der überstehenden Lösung der Hitze-behandelten hämolysierten roten Blutzellen zurück. Die nicht abgetrenn-

ten nutzlosen Proteine sind Ursache für den Aktivitätsabbau der Superoxid-dismutase während der nächsten

fe Reinigungsstufe der Superoxid-dismutase. Außerdem werden in diesem Verfahren lyophilisierte rote Blutzellen

Il als Ausgangsmaterial für die Isolierung von Superoxid-dismutase benutzt; darum sind Abtrennung und Reini-

|| gung von Superoxid-dismutase sehr viel schwieriger als bei Verwendung vn unbehandelten frischen roten

§p Blutzellen.

j|· Aus der JP-AS Serial No.45-39 832 ist bekannt, zur Isolierung von Orgotein hämolysierte rote Biutzellen

j|j durch Behandlung mit einer organischen Chlorverbindung in einen Hämoglubinkomplex überzuführen und das

iH Hämoglubin als Komplexverbindung von den hämolysierten roten Blutzellen abzutrennen. Bei diesem Verfah-

p ren wird jedoch eine bedeutende Menge Superoxid-dismutase von der Komplexverbindung gebunden, wodurch

'^l die Ausbeute an Superoxid-dismutase in der überstehenden Lösung der hämolysierten roten Blutzellen um mehr

H als 20% erniedrigt wird.

P Aus Journal of Biochemical Chemistry, Bd. 244, 6051, ist eine weitere Methode zur Isolierung von Superoxides dismutase aus hämolysierten roten Blutzellen mittels einer Chlorverbindung bekannt. Bei diesem Verfahren

!p nimmt jedoch die Aktivität von Superoxid-dismutase in der ersten Extraktionsstufe, verglichen mit der Aktivität

m der nicht isolierten Superoxid-dismutase, um mindestens 20% ab.

£; Diese Superoxid-Isolationsmethoden unter Verwendung von organischen Chlorverbindungen erfordern eine

f|™ große Menge an organischem Lösungsmittel, sie sind daher im Hinblick auf die Kosten und die Trennleistung

nicht zweckmäßig. Außerdem bleiben bei Verwendung von lyophilisierten Blutzellen nutzlose Proteine, einschließlich Hämoglubin, an das Superoxid-dismutase gebunden ist, in der überstehenden Flüssigkeit der hämolysierten roten Blutzellen zurück. Daher ist die Isolierung von Superoxid-dismutase aus der überstehenden Lösung sowie deren Reinigung außerordentlich schwierig.

Aus der JP-OS Serial No.49-50 195 ist eine weitere Methode zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus hämolysierten roten Blutzellen bekannt, wonach die hämolysierten Blutzellen einer Hitzebehandlung unterworfen, die überstehende Flüssigkeit der Hitze-behandelten hämolysierten roten Blutzellen mit einem proteolytischen Enzym behandelt, die erhaltene überstehende Flüssigkeit nitriert und die Superoxid-dismutase aus der Lösung abgetrennt und durch Kolonnenchromatographie und Gelfiltration gereinigt wird. Die Nachteile dieser Methoden bestehen darin, daß die Verfahrensstufen, die die Verwendung von proteolytischem Enzym umfassen, kompliziert sind und daß bei Verwendung von alten Blutzellen oder lyophilisierten Blutzellen die Superoxid-dismutase fest an den nutzlosen Pi oteine gebunden ist, die in den Blutzellen enthalten sind, so daß die Reinigung der Superoxid-dismutase außerordentlich schwierig ist.

Schließlich ist aus der JP-AS Serial No. 53-22 137 ein Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus hämolysierten roten Blutzellen bekannt, wonach die in hämolysierten roten Blutzellen enthaltene Superoxid-dismutase direkt von einem schwach basischen lonenaustauscherharz gebunden wird. Im Hinblick auf die Kosten und die Leistungsfähigkeit ist diese Methode jedoch nicht zur Abtrennung von einem Protein, wie Superoxiddismutase, das in einer Menge von 0,3 bis 0,5 Gew.-% enthalten ist, von den anderen Proteinen geeignet. Infolgedessen kann diese Methode nicht zur Produktion von großen Mengen Superoxid-dismutase aus hämolysierten Blutzellen benutzt werden.

Die Erfindung betrifft ein leistungsfähiges und für die Anwendung in der Praxis geeignetes Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen — durch Abtrennung der nutzlosen Proteine, einschließlich Hämoglubin, sowie eines Proteins mit starker Affinität zu Superoxid-dismutase unter Verwendung von Salzen 2wertiger Metalle —, womit die Nachteile der konventionellen Verfahren in überraschend einfacher Weise umgangen werden.

Das Verfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man

in einer ersten Verfahrensstufe rote Blutzellen in Gegenwart der 1- bis 4fachen Menge Wasser — auf das Volumen der roten Blutkörperchen bezogen — sowie eines einwertigen anorganischen neutralen Salzes und einer kleinen Menge eines Übergangsmetallsalzes 10 bis 60 Minuten auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75°C erhitzt und den gebildeten Niederschlag abtrennt, und

in einer zweiten Verfahrensstufe der in Verfahrensstufe 1 erhaltenen Lösung unter Erhitzen auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75°C für 10 bis 60 Minuten ein Übergangsmetallsalz so lange zusetzt, bis die überstehende Flüssigkeit klar wird, den gebildeten Niederschlag von der Lösung abtrennt und — gewünschtenfalls — aus der erhaltenen Lösung die Superoxid-dismutase isoliert.

Die Ansprüche 2 bis 5 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Untersuchungen hatten ergeben, daß die größten Schwierigkeiten bei der Abtrennung und Reinigung von Superoxid-dismutase aus hämolysierten roten Blutzellen von einem Protein verursacht werden, das in den roten Blut/.v'iien enthalten ist, das leicht eine Komplexverbindung in Kombination mit Hömoglobin und/oder Superoxid-dismutase bildet, das eine starke Affinität zu Superoxid-dismutase hat, und das sich schwierig von Superoxiddismutase abtrennen läßt. Dieses Protein wurde auf Grund seines Verhaltens während der Denaturierung als ein Lipioprotein angesehen, das von Blutzelienmembranen stammt. Es wird nachfolgend als »Affinitäts-Protein« bezeichnet.

Dieses Al'finitäts-Protein hat die Eigenschaft, bei Behandlungen, wie Gefrieren, Lyophilisieren und Behandlung mit ο ganischen Lösungsmitteln, auf die eine Hitzebehandlung folgt, leicht denaturiert zu werden und eine Komplexverbindung in enger Kombination mit Hämoglobin und/oder Superoxid-dismutase zu bilden. Die Bildung einer solchen Komplexverbindung findet auch bei Alterung der roten Blutzellen statt.
Die gewöhnlich mit der Isolierung von reiner Superoxid-dismutase ausgefrorenen Blutzellen, lyophilisierten

Blutzellen und konserviertem Blut verbundenen Schwierigkeiten sind vermutlich auf die Anwesenheit eines solchen Komplexes von Affinitäts-Protein und Speroxid-dismutase zurückzuführen; trotz dieser Tatsache werden gefrorene Blutzellen, lyophilisierte Blutzellen und konserviertes Blut als die brauchbarsten Lieferanten für Superoxid-dismutase angesehen, sofern es gelingt, Superoxid-dismutase leicht, in reirem Zustand und hoher Ausbeute aus einem solchen Komplex abzutrennen.

Das Verfahren der Erfindung ist nicht nur auf die unbehandelten frischen roten Biutzellen anwendbar; mit gealterten roten Blutzellen, die lange Zeit konserviert waren, geforenen roten Blutzellen sowie lyophilisierten roten Blutzellen werden praktisch die gleichen hohen Ausbeuten an Superoxid-dismutase erhalten.

Wenn auch der Verwendung von roten Blutzellen, die frei von Blutplasma sind, in dem Verfahren der ίο Erfindung der Vorzug gegeben wird, so können auch rote Blutzellen, von denen das Blutplasma nicht vollständig entfernt worden ist, benutzt werden, ohne daß irgendein größeres Problem auftritt.

In der ersten Verfahrensstufe werden die roten Blutzellen mit Wasser versetzt, um die Hämolyse herbeizuführen und um das Rühren der hämolysierten roten Blutzellen während des Superoxid-dismutase-Isolationsverfahrens zu erleichtern. Die Wassermenge, die den roten Blutzellen zugesetzt wird, beträgt das 1- bis 4fache, vorzugsweise das 2- bis 3fache des Volumens der roten Blutzellen.

Die so gebildete Lösung hämolysierter roter Blutzellen wird auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75°C für 10 bis 60 Minuten, vorzugsweise im Bereich von 65 bis 70⁰C für 25 bis 40 Minuten, in Gegenwart eines einwertigen anorganischen neutralen Salzes und einer verhältnismäßig kleinen Menge eines Salzes eines Übergangsmetalls erhitzt.

Einige Beispiele für einwertige anorganische neutrale Salze sind: Lithiumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lihtiumnitrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumbromid, Kaliumbromid, Lithiumbromid und Ammoniumbromid. Einige Beispiele für Salze der Übergangsmetalle sind: wasserlösliche Salze von Kupfer, Cobalt und Mangen, z. B. Cu(NO₃J₂ · 3 H₂O, CuCl₂ · 2 H₂O, CuBr₂, CuCl, MnCl₂ ■ 4 H₂O und CoCl₂ · 2 H₂O, vorzugsweise Kupfer(II)chlorid und Kupfer(II)nitrat, da diese Kupfersalze die Eigenschaft haben, die nutzlosen Proteine selektiv zu denaturieren und deren Koagulation und Fällung zu fördern.

Die einwertigen anorganischen Neutralsalze haben die Funktion, durch Schwächung der Bindung zwischen Superoxid-dismutase und dem Affinitäts-Protein sowie den nutzlosen Proteinen die Superoxid-dismutase von dem Affinitäts-Protein und den nutzlosen Proteinen, die hauptsächlich denaturiertes Hämoglobin einschließen, abzutrennen.

Die Salze der Übergangsmetalle haben die Funktion, die Denaturierung der nutzlosen Proteine sowie deren Fällung zu fördern und die Abtrennung der Superoxid-dismutase von den nutzlosen Proteinen in hoher Reinheit und hoher Ausbeute zu erleichtern.

Um die Bindung zwischen Superoxid-dismutase und Affinitäts-Protein sowie anderen nutzlosen Proteinen zu schwächen, sollte die Konzentration an einwertigem anorganischem Neutralsalz in der Lösung der hämolysierten roten Blutzellen im Bereich von 0,2 Mol bis zur Sättigung, vorzugsweise im Bereich von 0,3 Mol bis 1,0 Mol liegen.

Bei den Salzen der Übergangsmetalle liegen die geeigneten Konzentrationen für Kupfersalz im Bereich von 1 χ 10-⁴ Mol bis 2 χ 10-⁴ Mol und für Mangansalz im Bereich von 1 χ 10-³ Mol bis 2 χ ΙΟ"³ Mol.

Während der ersten Verfahrensstufe werden die nutzlosen Proteine einschließlich des Affinitäts-Proteins und des Hämoglobins ausgefällt und abfiltriert. In dieser Stufe bleibt eine sehr geringe Menge an nutzlosen Proteinen in der überstehenden Flüssigkeit der Lösung der hämolysierten roten Blutzellen zurück.

In der zweiten Verfahrensstufe wird der so erhaltenen Lösung der hämolysierten roten Blutzellen — zur Entfernung der restlichen nutzlosen Proteine — eine weitere Menge des in der ersten Verfahrensstufe benutzten Übergangsmetallsalzes so lange unter Erhitzen der Lösung auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75° C für 10 bis 60 Minuten, vorzugsweise auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 68°C für 15 bis 30 Minuten, zugesetzt, bis die überstehende Flüssigkeit klar wird. Kupfersalz wird z. B. so lange nach und nach zugesetzt, daß die übersiehende Flüssigkeit nach Beendigung des Erhitzens leicht blau gefärbt ist.

Nach dem Abkühlen der Lösung der hämolysierten roten Biutzellen werden die ausgefallenen nutzlosen Proteine abfiltriert. Auf diese Weise werden praktisch alle nutzlosen Proteine entfernt, während die Superoxiddismutase, ohne denaturiert zu werden, in dem Filtrat zurückbleibt.

Das Filtrat wird zur Entfernung der einwertigen neutralen Salze und des Übergangsmetallsalzes gegen deionisiertes Wasser und/oder eine konventionelle Pufferlösung dialysiert.

Aus der so erhaltenen Lösung wird die Superoxid-dismutase durch ein Hochreinigungsverfahren, das die Abtrennung mittels Dialyse, DEAE-Zeliulose-Kolonnenchromatographie und Gelfiltration umfaßt, in reinem Zustand erhalten.

Eine weitere Verfahrensvariante zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus hämolysierten roten Blutzellen gemäß Erfindung umfaßt die oben angegebenen beiden Verfahrensstufen sowie eine weitere zusatzliche Zwischenstufe.

In dieser zusätzlichen Zwischenstufe wird — nach Beendigung der ersten Verfahrensstufe — der in der ersten Stufe erhaltenen überstehenden Flüssigkeit weiteres Übergangsmetallsalz in einer Menge von 1 χ 10-⁴ Mol bis 1 χ 10-³ MoI zugesetzt und die überstehende Flüssigkeit erneut auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 70⁰C für 15 bis 20 Minuten erhitzt. Die in dieser Zwischenstufe ausgefällten nutzlosen Proteine können nach Beendigung dieser Stufe oder später entfernt werden. Die anderen Stufen dieser Verfahrensvariante stimmen mit denen der zuvor beschriebenen Variante des Verfahrens der Erfindung überein. Diese zweite Verfahrensvariante ermöglicht die Ausbeute an Superoxid-dismutase — verglichen der der ersten Verfahrensvariante — zu steigern.

Im Zusammenhang mit dieser Zwischenstufe ist auf folgendes hinzuweisen: Übersteigt die Menge an Übergangsmetallsalz, die in der ersten Stufe zugeführt wird, die weiter oben angegebenen Mengen und wird die

Zwischenstufe weggelassen, nimmt die Endausbeute an Superoxid-dismutase ab.

Das Verfahren der Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen näher erläutert. In diesen Beispielen wurde Natriumeitrat als Antikoagulans für das Blut benutzt. Die Aktivitätsbestimmung der Superoxid-dismutase wurde nach dem Verfahren von McCord und Fridovich, veröffentlicht in Journal of Biochemistry, Bd. 244.6049(1969), durchgeführt.

Beispiel 1

Zu 255 g roten Blutzellen, die aus 600 ml frischem Rinderblut erhalten worden waren, gab man 25 g Natriumchlorid, 25 mg Cuprichlorid und 600 ml Wasser und mischte gut durch. Die erhaltene Mischung erhitzte man 30 Minuten auf 68°C, kühlte dann ab und filtrierte den ausgefallenen Niederschlag ab.

Das Filtrat versetzte man mit 25 mg Cuprichlorid und erhitzte die Mischung 10 Minuten auf 60°C.

Während man die Mischung auf 65°C erhitzte und auf dieser Temperatur hielt, gab man allmählich weiteres Kupferchlorid zu der Mischung, bis die Blaufärbung der überstehenden Flüssigkeit ein Maximum erreichte, ohne daß eine Trübung auftrat. Insgesamt wurden 380 mg Cuprichlorid der Mischung zugegeben, was 20 Minuten in Anspruch nahm; während dieser Zeit wurde die Mischung kontinuierlich auf 65° C erhitzt.

Die erhaltene Mischung wurde gekühlt, der Niederschlag abfiltriert, das Filtrat 48 Stunden gegen deionisiertes Walser dialysiert und dann filtriert.

Das erhaltene Filtrat dialysierte man über Nacht gegen 0,0025 Mol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), brachte es mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht und filtrierte die erhaltene Lösung, wobei man 850 ml Filtrat mit 109 080 Einheiten Superoxid-dismutase erhielt.

Diese Superoxid-dismutase-lösung gab man dann auf eine DE 52-Kolonne (1,9 χ 11,5 cm) (Handelsbezeichnung DEAE-Cellulose), die zuvor mit dem oben angegebenen Kaliumphosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, wobei die Superoxid-dismutase-lösung an der Kolonne adsorbiert wurde. Steigende Elution wurdt unter Verwendung von insgesamt 400 ml des gleichen Puffers mit einer Kaliumphosphatkonzentration von 0,0025 bis 0,075 Mol durchgeführt. Die aktiven Superoxid-dismutase-fraktionen wurden gesammelt, kombiniert, dialysiert und dann lyophilisiert. Die Ausbeute an Superoxid-dismutase im lyophilisierten Zustand betrug 43,0 mg mit 96 850 Einheiten.

B e i s ρ i e 1 2

Zu 417 g roten Rinderblutzellen, die zwei Jahre bei einer Temperatur von — 20°C konserviert worden waren, gab man 55 g Natriumbromid, 30 mg Cuprichlorid und 650 ml Wasser und mischte alles gut durch. Diese Mischung erhitzte man 25 Minuten auf 68°C, kühlte dann ab und filtrierte vom ausgefallenen Niederschlag ab.

Dieses Filtrat versetzte man mit 20 mg Cuprichlorid und erhitzte die erhaltene Mischung 15 Minuten auf 60°C.

Sodann erhitzte man die Mischung auf 65° C und gab weitere 600 mg Cuprichlorid zu, während man die Temperatur für weitere 15 Minuten aufrechterhielt.

Die Mischung kühlte man ab und filtrierte den Niederschlag ab, wobei man 1080 ml Filtrat erhielt, das man 48 Stunden gegen deionisiertes Wasser dialysierte und dann filtrierte.

Das Filtrat dialysierte man über Nacht gegen 0,0025 Mol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4), brachte es mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht, filtrierte die erhaltene Lösung und lyophilisierte sie dann, wobei man 285 mg Superoxid-dismutase mit 206 400 Einheiten erhielt. Diese Superoxid-dismutase löste man in 10 ml von 0,0025 Mol Akliumphosphatpuffer(pH 7,41 und gab die Lösung auf eine DE 52-Kolonne (1,9 χ 11,5 cm), die zuvor mit dem oben angegebenen Kaliumphosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, so daß die Superoxid-dismutase-lösung an der Kolonne adsorbiert wurde. Steigende Elution wurde unter Verwendung von insgesamt 500 ml des gleichen Puffers mit einer Kaliumphosphatkonzentration von 0,0025 bis 0,075 Mol durchgeführt. Die aktiven Superoxid-dismutase-fraktionen wurden gesammelt, kombiniert, dialysiert und dann lyophilisiert. Die Ausbeute an Superoxid-dismutase im lyophilisierten Zustand betrug 72,5 mg mit 179 100 Einheiten.

B e i s ρ i e 1 3

Zu 73,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen (die 210 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab man 30 g Natriumbromid, 20 mg Cuprichlorid und 600 m! Wasser, mischte alles gut durch und erhitzte 30 Minuten auf 65° C. Nach Kühlender Mischung filtrierte man den Niederschlag ab.

Sodann versetzte man das Filtrat mit 320 mg Cuprichlorid und erhitzte die Mischung 15 Minuten auf 6O⁰C.

Nach dem Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das erhaltene Filtrat 48 Stunden gegen deionisiertes Wasser und filtrierte es dann.

Das Filtrat dialysierte man über Nacht gegen 0,0025 Mol Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) und brachte es dann mit dem Puffer ins Gleichgewicht. Diese Lösung gab man nach Filtration auf eine DE 52-Kolonne (1,9 χ 11,5 cm), die zuvor mit dem oben angegebenen Kaliumphosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, so daß die Superoxid-dismutase-iösung an der Kolonne adsorbiert wurde. Es wurde eine steigende Elution unter Verwendung von insgesamt 500 ml des gleichen Puffers mit einer Kaliumphosphatkonzentration von 0,0025 bis 0.075 Mol durchgeführt. Die aktiven Superoxid-dismutase-fraktionen wurden gesammelt, kombiniert, dialysiert und dann lyophilisiert. Die Ausbeute an Superoxid-dismutase in lyophilisiertem Zustand betrug 34,5 mg mit 76 000 Einheiten.

Beispiel 4

Zu 315 g roten Blutzellen, die aus 30 Tage konserviertem Humanblut (in dem als Antikoagulans Säure-Citrat-Dextrose (ACD) benutzt worden war) erhalten worden waren, gab man 30 g Kaliumchlorid, 25 mg Cuprichlorid und 550 ml Wasser, mischte alles gut durch und erhitzte 30 Minuten auf 68°C. Nach Abkühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab.

Zu dem Filtrat gab man 300 mg Cuprichlorid und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 68°C.
Sodann kühlte man die Mischung und filtrierte den Niederschlag ab, wobei man 920 ml eines klaren hellblauen Filtrats erhielt, das man 48 Stunden gegen deionisiertes Wasser dialysierte und dann filtrierte.
Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 63 600 Einheiten.

Beispiel 5

Zu 105 g roten Schafsblutzellen, die 15 Tage bei 4°C konserviert worden waren, gab man 10 g Natriumchlorid, !5 6 g Cuprichlorid, CuCb ■ 2 H₂O, und 250 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 65⁰C, kühlte die Mischung ab und filtrierte den Niederschlag ab.

Sodann gab man 150 mg Cuprichlorid, CuCl₂ · 2 H₂O, zu dem Filtrat und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65° C.

Nach Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das Filtrat gegen deionisiertes Wasser und filtrierte es dann.

Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 19 860 Einheiten.

Beispiel 6

Zu 73,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen gab man 30 g Natriumnitrat, 20 mg Cuprinitrat, Cu(NO₃J₂ ■ 3 H₂O, und 600 ml Wasser, mischte alles gut durch, erhitzte die Mischung 25 Minuten auf 65°C, kühlte sie dann und filtrierte den Niederschlag ab.

Sodann versetzte man das Filtrat mit 280 mg Cuprinitrat, Cu(NO₃J₂ · 3 H₂O, und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65°C.

Nach Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das erhaltene Filtrat gegen deionisiertes Wasser und filtrierte es dann.

Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 94 300 Einheiten.

Beispiel 7

Zu 73,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen gab man 35 g Kaliumnitrat, 20 mg Cuprinitrat, Cu(NO₃J₂ ■ 3 H₂O, und 600 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 65°C, kühlte sie dann und filtrierte den Niederschlag ab.

Sodann versetzte man das Filtrat mit 300 mg Cuprinitrat, Cu(NO₃J₂ · 3 H₂O, und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65°C.

Nach dem Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das Fiitrat gegen deionisiertes Wasser und filtrierte es dann.

Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 83 600 Einheiten.

Beispiele

Zu 200 g gefrorenen roten Rinderblutzellen gab man 35 g Kaliumbromid, 30 mg Kupfer(II)bromid, CuBr₂, und ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 65°C, kühlte sie dann ab und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab.

Sodann versetzte man das Filtrat mit 400 mg Kupfer(II)bromid, CuBr₂, und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65° C.

Nach dem Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das Filtrat gegen deionisiertes Wasser und filtrierte es dann.

Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 87 500-Einheiten.

Beispiel 9

Zu 250 g frischen roten Rinderblutzellen gab man 15 g Lithiumchlorid, 20 mg Kupferchlorid, CuCI, und ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 67°C, kühlte sie dann und filtrierte den Niederschlag ab.

Das Filtrat versetzte man mit 320 mg Kupfer(I)chIorid und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 67°C.
Sodann kühlte man die Mischung, filtrierte den Niederschlag ab, dialysierte das erhaltene Filtrat gegen deionisiertes Wasser und filtrierte sodann.

Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 104 200 Einheiten.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die zweite Variante des Verrohrens der Erfindung mit der weiter oben erwähnten Zwischenstufe.

Beispiel 10

Zu 52,5 g lyophilisierten roien Rinderblutzellen gab man 15 g Lithiumnitrat, 20 mg Cuprinitrat, Cu(NCb): · 3 H2O, und 500 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 65°C, kühlte sie dann und filtrierte den Niederschlag eb.

Nach Beendigung dieser ersten Stufe gab man weitere 20 mg Cuprinitrat, Cu(NCh)2 ■ 3 H2O, zu dem Filtrat, erhitzte die Mischung 15 Minuten auf 68⁰C, kühlte sie dann und filtrierte den Niederschlag ab.

Zu dem erhaltenen Filtrat gab man dann 1,25 gCobalt(II)chlorid, CoCb · 2 H2O, und erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 70°C.
' Sodann kühlte man die Mischung, filtrierte den Niederschlag ab, dialysierte das Filtrat gegen deionisiertes

Wasser und filtrierte dann.
! Die Aktivität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 69 800 Einheiten.

; Beispiel 11

, Zu 60 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen gab man 12 g Lithiumchlorid, 150 mg Mangan(ll)chlorid,

MnCh · 4 H2O, und 600 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 30 Minuten auf 70⁰C, kühlte sie und filtrierte den Niederschlag ab.
Nach Beendigung dieser ersten Stufe gab man weitere 15 mg Kupfer(ll)chlorid, CuCb · 2 H2O, zudem Filtrat,

. erhitzte die erhaltene Mischung 20 Minuten auf 70° C, kühlte sie und filtrierte den Niederschlag ab.

',. Sodann gab man zu dem Filtrat 2,0 g Mangan(ll)chlorid, MnCl₂ · 4 H₂O, und erhitzte die Mischung 30

^;, Minuten auf 70°C.

|; Nach dem Kühlen der Mischung filtrierte man den Niederschlag ab, dialysierte das Filtrat gegen deionisiertes

, Wasser und filtrierte es dann.

; Die Aktvität der in dem Filtrat enthaltenen Superoxid-dismutase betrug 69 750 Einheiten.

Ί-· Um die Wirkung des einwertigen anorganischen neutralen Salzes auf die Leistungsfähigkeit der Abtrennung

V, von Superoxid-dismutase und auf die Aktivität der erhaltenen Superoxid-dismutase zu veranschaulichen, sind

J-" die folgenden Vergleichsversuche durchgeführt worden, wobei Natriumchlorid als einwertiges anorganisches

ν neutrales Salz verwendet wurde.

Vergleichsversuch 1-1

Zr 52,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen (die 150 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab mu:i 15 g Natriumchlorid (0,5 Mol), 20 mg Cuprichlorid und 500 ml Wasser, erhitzte die Mischung 60 Minuten auf 70"C und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab.

Dem Filtrat gab man weitere 230 mg Cuprichlorid zu, erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65° C und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab.

Die überstehende Flüssigkeit des Filtrats wurde dialysiert und dann lyophilisiert, wobei die Superoxid-dismutase erhalten wurde.

Die Aktivität der so erhaltenen Superoxid-dismutase betrug 63 000 Einheiten.

Vergleichsversuch 1-2

Zu 52,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzeüen (die 150 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab man 20 mg Cuprichlorid und 500 ml Wasser, erhitzte die Mischung 60 Minuten auf 70⁰C und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab.

Dem Filtrat setzte man weitere 230 mg Cuprichlorid zu und erhitzte die Mischung 20 Minuten auf 65° C. Inder Mischung war die Niederschlagsbildung unvollständig, jedoch der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat hatte eine rotbraune Färbung, und es hatte den Anschein, als ob eine vollständige Reinigung durch diese Filtration unmöglich war. Deshalb wurden weitere 220 mg Cuprichlorid zu dem Filtrat gegeben, der pH-Wert des Filtrats wurde mit Natriumhydroxid auf 5,6 eingestellt, die Mischung 20 Minuten auf 65°C erhitzt und der Niederschlag abfiltriert. Aus dem Filtrat wurde eine farblose überstehende Flüssigkeit (pH 5,8) erhalten.

ι Die überstehende Flüssigkeit wurde dialysiert und dann lyophilisiert, wobei man Superoxid-dismutase erhielt.

[ Die Aktivität der so erhaltenen Superoxid-dismutase betrug 11 700 Einheiten.

In Vergleichsversuch 1-1 wurde als einwertiges anorganisches Neutralsalz Natriumchlorid der Reaktionsmi-,' schung in der ersten Stufe zugesetzt, während im Vergleichsversuch 1-2 kein einwertiges anorganisches Salz in

-_r der ersten Stufe zugegeben wurde.

Bei diesen beiden Vergleichsversuchen wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Aktivität der Superoxid-dismutase Verhältnis

Vergleichsversuch 1-1 63 000 Einheiten 100,0

Vergleichsversuch 1-2 11 700 Einheiten 18,6

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch Zusatz des einwertigen anorganischen Neutralsalzes die Aktivität der Superoxid-dismutase bedeutend gesteigert wird.

Mit den nachfolgenden Vergleichsversuchen soll die Bedeutung der zweiten Verfahrensstufe, in der das Übergangsmetallsalz der Reaktionsmischung zugegeben wird, auf die Leistungsfähigkeit der Abtrennung der Superoxid-dismutase und auf die Aktivität der erhaltenen Superoxid-dismutase veranschaulicht werden.

Vergleichsversuch 2-1

In diesem Vergleichsversuch wurde die zweite Verfahrensstufe weggelassen:

Zu 52,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen (die 150 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab man 15 g Natriumchlorid, 15 mg Cuprichlorid und 500 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 60 Minuten auf 7O⁰C und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. Das erhaltene Filtrat war rotbraun gefärbt, es wurde dialysiert und dann lyophilisiert.

1. Die erhaltene Superoxid-dismutase war rotbraun gefärbt.

2. Das Gesamtgewicht der erhaltenen Proteine betrug 870 mg.

3. Die Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 74 400 Einheiten.

4. Die spezifische Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 86 Einheiten/Protein (mg).

Vergleichsversuch 2-2

In diesem Vergleichsversuch wurde der in der ersten Stufe gebildete Niederschlag nicht abfiltriert.
Zu 52,5 g lyophilisierten roten Rinderblutzellen (die 150 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab man 15 g Natriumchlorid, 15 mg Cuprichlorid und 500 ml Wasser, mischte gut durch und erhitzte die Mischung 60 Minuten auf 7O⁰C.

Nach dem Kühlen der Mischung gab man 1,9 g Cuprichlorid der Mischung zu, ohne den in der ersten Stufe gebildeten Niederschlag zu entfernen. Nach Einstellen des pH-Wertes der Mischung auf 5,6 erhitzte man die Mischung 20 Minuten auf 65°C, kühlte sie ab und filtrierte den Niederschlag ab, wobei man 520 ml eines farblosen Filtrats erhielt.

Das Filtrat wurde dialysiert und dann lyophilisiert.

1. Die erhaltene Superoxid-dismutase war leicht graugrün gefärbt.

2. Das Gesamtgewicht der erhaltenen Proteine betrug 185 mg.

3. Die Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 43 200 Einheiten.

4. Die spezifische Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 238 Einheiten/Protein (mg).

Vergleichsversuch 2-3

In diesem Vergleichsversuch wurden sowohl die erste Verfahrensstufe als auch die zweite Verfahrensstufe durchgeführt.

Zu 52,5 g lyophiüsierten roten Rinderblutzellen (die 150 ml frischen roten Rinderblutzellen entsprachen) gab man 15 g Natriumchlorid, 15 mg Cuprichlorid und 500 ml Wasser, mischte gut durch, erhitzte die Mischung 60 Minuten auf 70⁰C und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab.

Zu dem Filtrat gab man weitere 215 mg Cuprichlorid bei 6O⁰C, erhitzte die Mischung 15 Minuten auf 65'C, kühlte sie dann ab und filtrierte den Niederschlag ab, wobei man 500 ml hellblaues Filtrat erhielt.
Das Filtral wurde dialysiert und dann lyophilisiert.

1. Die erhaltene Superoxid-dismutase war weiß.

2. Das Gesamtgewicht der erhaltenen Proteine betrug 98 mg.

3. Die Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 73 250 Einheiten.

4. Die spezifische Enzymaktivität der Superoxid-dismutase betrug 747 Einheiten/Protein (mg).

Die Ergebnisse der Vergleichsversuche 2-1,2-2 und 2-3 sind folgender Tabelle zu entnehmen:

Vergleichs- Farbe der S.O.D.*) Proteingesamt- Enzym-Aktivität spezifische

versuch gewicht (Einheiten) Enzymaktivität

(Einheiten/ Protein (mg)

60

2-1 rotbraun 870 mg 74 400 85

2-2 leicht grau-grün 185 mg 43 200 238

2-3 weiß 98 mg 73 250 747

65

*) S.O.D. = Superoxid-dismutase.

Diese Vergleichsversuchsergebnisse zeigen, daß bei Fortfall der zweiten Verfahrensstufe der f.einheitsgrad
der Superoxid-dismutase stark herabgesetzt wird.

Die Beispiele dienen lediglich dazu, um das Verfahren der Erfindung dem Fachmann zu erläutertn. Selbstverständlich ist es auch möglich, die während des Verfahrens zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten
Blutzellen gebildeten Niederschläge nicht abzufikrieren. sondern statt dessen durch Zentrifugieren oder auf
irgendeine andere dem Fachmann bekannte Weise zu entfernen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzeüen unter Verwendung von Salzen 2wertiger Metalle, dadurch gekennzeichnet, daß man

in einer ersten Verfahrensstufe rote Blutzellen in Gegenwart der 1- bis 4fachen Menge Wasser — auf das Volumen der roten Blutkörperchen bezogen— sowie eines einwertigen anorganischen neutralen Salzes und einer kleinen Menge eines Ubergangsmetallsalzes 10 bis 60 Minuten auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75° C erhitzt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und

in einer zweiten Verfahrensstufe der in Verfahrensstufe 1 erhaltenen Lösung unter Erhitzen auf Temperaturen im Bereich von 60 bis 75⁰C für 10 bis 60 Minuten ein Übergangsmetallsalz so lange zusetzt, bis die überstehende Flüssigkeit klar wird, den gebildeten Niederschlag von der Lösung abtrennt und — gewünschtenfalls — aus der erhaltenen Lösung die Superoxid-dismutase isoliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der nach der ersten Verfahrensstufe nach Abtrennen des Niederschlags erhaltenen Lösung mindestens ein Übergangsmetallsalz in einer Menge, die |

ebenso groß wie oder geringer als die in der ersten Verfahrensstufe zugesetzte Menge an Übergangsmetall- feä

salz ist, zusetzt, auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 70⁰C erhitzt und den gebildeten Niederschlag vor '^

oder nach Durchführung der zweiten Verfahrensstufe entfernt Kjjj

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als einwertige anorganische f| neutrale Salze Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lithiumchlorid, Natriumnitrat Kaliumnitrat, Lithiumnitrat, ija

Natriumbromid, Kaliumbromid, Lithiumbromid und/oder Ammoniumbromid verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Übergangsmetallsalze Kupfer-, Cobalt- und/oder Mangansalze verwendet. ■ ν

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach der zweiten ;"; Verfahrensstufe nach Abtrennen des Niederschlags erhaltene Lösung einer Dialyse unterwirft und dann aus -

ihr durch Chromatographie die Superoxid-dismutase isoliert.