DE2101866C3 - Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichen reinem Orgotein - Google Patents
Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichen reinem OrgoteinInfo
- Publication number
- DE2101866C3 DE2101866C3 DE2101866A DE2101866A DE2101866C3 DE 2101866 C3 DE2101866 C3 DE 2101866C3 DE 2101866 A DE2101866 A DE 2101866A DE 2101866 A DE2101866 A DE 2101866A DE 2101866 C3 DE2101866 C3 DE 2101866C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- orgotein
- solution
- buffer
- minutes
- heated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
- B01J47/014—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor in which the adsorbent properties of the ion-exchanger are involved, e.g. recovery of proteins or other high-molecular compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
- C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
- C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
»Orgotein« ist die vom »United States Adopted Name Council« einem Metallchelat mit einem zweiwertigen
Metall eines im wesentlichen reinen, wasserlöslichen, ungiftigen, im wesentlichen nichtantigenetischen
und anti'nflammatorisch wirkenden Proteins kompakter Konfiguration zugeordnete freie Kurzbezeichnung (vgl.
J. A. M. A., 26. Mai 1969; Bd. 208, Nr. 8).
Das grundlegende Verfahren zum Herstellen von Orgotein ist in der OE-PS 3 15 202, der DT-PS 6 87 828
und in der NL-OS 66 14 177 beschrieben und besteht im
wesentlichen darin, dieses Orgotein — ein bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem
pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beeinanderliegenden Banden langsamer
a's Albumin aber schneller als y-Globulin
wanderndes Protein-Metall-Chelat — aus einer natürlichen Eiweißquelle, beispielsweise Rinderleber, dadurch
zu gewinnen, daß man die natürliche Eiweißquelle mit zweiwertige Metallionen, vorzugsweise Mn+ f, und
gegebenenfalls einen Puffer enthaltendem Wasser extrahiert und aus der erhaltenen Lösung von
wasserlöslichen Proteinen in bekannter Weise, jedenfalls aber unter kurzzeitigem Erhitzen dieser Orgotein
enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis höchstens 75°C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine
von leichter und schwerer löslichen Stoffen, das Orgotein, erforderlichenfalls unter Transchelatieren, in
Form eines 0,1 — 1,0% Metallionen aufweisenden Chelats, in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes
von zumindest einem der Metalle Mg, Ca. Fe, 7n. Co und Cu stammen, isoliert. Obzwar es bei diesem bekannten
Verfahren zum Herstellen von Orgotein durchaus möglich ist, aus einer nach dem Erhitzen einer Orgotein
enthaltenden Lösung des Orgotein allein durch Gelscheiben-Elektrophorese
zu gewinnen, wird doch wegen des raschen Verschmutzens des hierbei zu
21 Ol
verwendenden Gels durch Fremdproteine und auch wegen des sonstigen hohen Aufwandes beim Arbeiter,
nach der präparativen Gelscheiben-Elektrophorese vorzugsweise eine mehrstufige Arbeitsweise empfohlen,
wobei aufeinanderfolgend
a) fein zerkleinerte frische Rinderleber in einem eiskalten, Mn ++-Ion enthaltendem Puffer bis zur
im wesentlichen vollständigen Extraktion der löslichen Proteine aufgeschlämmt wird, ,0
b) aus der Lösung der Proteine in der kalten Pufferlösung mittels Aceton ein wesentlicher Anteil
der gelösten Proteine ausgefällt wird,
c) die ausgefällten Proteine in kaltem, Mn++-Ionen
enthaltendem Maleatpuffer gelöst werden,
d) die erhaltene Lösung etwa 20 Minuten auf 60°C erhitzt wird,
e) die Lösung sodann gekühlt wird und die ausgefällten denaturierten Proteine abgetrennt werden,
f) restliche der in der kalten Pufferlösung enthaltenen Proteine mit Äthanol ausgefällt werden,
g) die ausgefällten Proteine in kaltem, Mn ++-Ionen
enthaltendem Maleatpuffer gelöst werden,
h) die erhaltene Lösung gefriergetrocknet wird,
i) die beim Gefriertrocknen erhaltenen Feststoffe in kaltem, Mg++-Ionen enthaltenden Tris-Puffer [Tris-(hydroxy-methyl)-amino-methan] gelöst werden und aus der erhaltenen Lösung mit Ammonsulfat die Proteine fraktioniert gefällt werden und die bei einer etwa 45 bis etwa 75% der Sättigungskonzentration betragenden Konzentration an Ammonsulfat anfallenden Fraktionen erneut in kaltem, Mg+ + -Ionen enthaltendem Tris-Puffer gelöst werden und die erhaltene Lösung über eine mit quervernetztem Dextran gefüllte Kolonne chromatographiert wird und
i) die beim Gefriertrocknen erhaltenen Feststoffe in kaltem, Mg++-Ionen enthaltenden Tris-Puffer [Tris-(hydroxy-methyl)-amino-methan] gelöst werden und aus der erhaltenen Lösung mit Ammonsulfat die Proteine fraktioniert gefällt werden und die bei einer etwa 45 bis etwa 75% der Sättigungskonzentration betragenden Konzentration an Ammonsulfat anfallenden Fraktionen erneut in kaltem, Mg+ + -Ionen enthaltendem Tris-Puffer gelöst werden und die erhaltene Lösung über eine mit quervernetztem Dextran gefüllte Kolonne chromatographiert wird und
k) die erwünschten Fraktionen zwecks Abtrennens überschüssigen Puffers und nicht chelatisierter
Metallionen dialysiert werden, wobei zunächst gegen eine geringe Menge eines ein Magnesiumsalz
oder ein anderes Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltendes Wasser, dann gegen an
O-Phenanthrolin 10-3-molares Wasser und schließlich
gegen reines Wasser dialysiert wird. Bei diesem bekannten Verfahren beträgt die auf Trockengewicht
der eingesetzten Rinderleber bezogene Ausbeute an Orgotein etwa 0,01 Gew.-%.
Trotz dieser komplizierten Arbeitsschritte bei der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß
der OE-PS 3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. der ' NL-OS 66 14 177 (abgehandelt in »Chemical Abstracts«,
[1968], 6193 r) bleiben mit dem Orgotein bei der Gelscheiben-Elektrophorese langsamer als das in Form
multipler Banden wandernde Orgotein wandernde und gelegentlich auch zwischen den auf Orgotein selbst
zurückzuführenden Banden als »Hintergrund« sichtbare Proteine vergesellschaftet, die selbst durch präparative
Gelscheiben-Elektrophorese von Orgotein nicht getrennt werden können. Die bei der bevorzugten (,0
Ausführungsform des Verfahrens gemäß der OE-PS 15 202 vom Orgotein nicht inehr abtrennbaren
Fremdproteint stören in weitaus den meisten Fällen die therapeutische Anwendung des Orgoteins nicht, da das
Orgotein in der Regel mit einer Reinheit von zumindest (,=,
90% und meist mit einer Reinheit von wesentlich mehr als 95% erhalten wird und erst bei einem Gehalt des
Orgoteins von mehr als 10% an Fremdproteinen das Auftreten von Allergien bei therapeutischer Verwendung
des Orgoteins wahrscheinlicher wird. Welche Mengen an Fremdproteinen nun beim Arbeiten nach
der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der OE-PS 3 15 202 mit dem Orgotein
vergesellschaftet bleiben, hängt in nicht geklärter Weise mit der als Ausgangsstoff verwendeten Eiweißquelle
zusammen, als welche, wie sich im Zuge späterer Untersuchungen gezeigt hat, rote Blutkörperchen von
Säugetieren besonders geeignet sind, da aus solchen roten Blutkörperchen besonders reines Orgotein
hergestellt werden kann, welches in l%iger Lösung bei einer Wellenlänge von 280 nm eine UV-Absorption
(Al;,;) von 2,3±0,2 statt 5,85 entsprechend der OE-PS
3 15 202 besitzt. Im Zuge weiterer Untersuchungen wurde gefunden, daß der in der OE-PS 3 15 202
angegebene Wert für AiJJ von 5,85 (0,585 bei einer
Konzentration von 1 mg/ml) darauf zurückzuführen ist, daß die mit dem Orgotein vergesellschafteten und
praktisch auch durch präparative Gelscheiben-Elektrophorese vom Orgotein nicht abtrennbaren Fremdproteine
beträchtliche Mengen an für die UV-Absorption bei 280 nm verantwortlichen Tyrosin- und Tryptophanresten
enthalten und damit selbst in einer Menge von nur 2% im Orgotein einen wesentlich größeren Beitrag
zur UV-Absorption bei 280 nm liefern als Orgotein selbst, welches entgegen früheren Annahmen nur einen
Tryptophanrest statt 2 Tryptophanresten und nur 2 Tyrosinreste statt 5 Tyrosinresten pro Molekül enthält.
Es ist nun Ziel der vorliegenden Erfindung, reines Orgotein aus entsprechend der OE-PS 3 15 202 bzw.
entsprechend der BE-PS 6 87 828 bzw. entsprechend der NL-OS 66 14 177 erhältlichem und als im wesentlichen
rein zu bezeichnendem Orgotein herzustellen und hierbei das weitere Reinigen eines solchen, im
wesentlichen reinen Orgoteins durch die aufwendige und dennoch nicht ganz zufriedenstellende präparative
Gelscheiben-Elektrophorese zu vermeiden. Die vorliegende Erfindung beruht hierbei auf der überraschenden
Feststellung, aaß eine Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein auf eine wesentlich höhere Temperatur
und eine wesentlich längere Zeit lang erhitzt werden kann, als es entsprechend den Angaben in der OE-PS
3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. der NL-OS 66 14 177 für eine neben Orgotein noch große Mengen
an Fremdproteinen enthaltende Lösung als zulässig zu erachten ist. Diese Feststellung ist besonders deshalb
überraschend, weil im Hinblick auf die Angaben in der OE-PS 3 15 202, in der BE-PS 6 87 828 und in der NL-OS
66 14 177 anzunehmen war, daß beim Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein die
Stabilität des Orgoteins nicht größer sein würde als beim Erhitzen einer großen Menge an Fremdproteinen
enthaltenden Lösung und hierbei das Orgotein in einem unzulässig großen Ausmaß zerstört v/erden würde.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von reinem
Orgotein aus im wesentlichen reinem Orgotein, welches zäh anhaftende wärmelabile Fremdproteine enthält, von
welchen die meisten bei der Gel-Elektrophorese langsamer wandern als Orgotein und welche den Wert
für A'li," einer Lösung von Orgotein wesentlich über
2,3 ±0,2 anheben, etwa das gleiche Molekülvolumen wie Orgotein besitzen, beim Erhitzen in Pufferlösungen auf
6O0C während 10 bis 20 Minuten stabil sind und in Puffern, in Gemischen aus Puffern und organischen
Lösungsmitteln und in Ammonsulfatlösungen etwa die gleiche Löslichkeit besitzen wie Orgotein. Dieses
21 Ol 866
Verfahren ist gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß zäh anhaftende Fremdproteine enthaltendes
im wesentlichen reines Orgotein in einer ein zweiwertiges Mstall in einem lonenradius von 0,60 bis
1,00 A enthaltenden und einen pH-Wert von 1 bis 4 oder 6 bis 11 besitzenden Pufferlösung auf eine Temperatur
von zumindest 65°C, bei welcher im wesentlichen reines Orgotein stabil ist, so lange erhitzt wird, bis der Wert für
Αϊ«", einer Lösung des Orgoteins 2,3 + 0,2 beträgt,
worauf die ausgefällten, unerwünschten Proteine von der Lösu; g des Orgoteins abgetrennt werden.
Auf diese Weise gelingt es, reines Orgotein selbst aus solchem im wesentlichen reinen Orgotein herzustellen,
welches im Hinblick auf seinen zu hohen Gehalt an Fremdproteinen für die therapeutische Verwendung
nicht geeignet ist, also mehr als etwa 10% an Fremdproteinen enthält. Ein wesentlicher Vorteil des
erfindungsgemäßen Verfahrens besteht hierbei darin, daß beim Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen
reinem Orgotein, auch die durch päparative Gel-Scheiben-Elektrophorese
nicht zur Gänze abtrennbaren und den »Hintergrund« für die auf Orgotein rückzuführenden
Banden im Elektrophorogramm bildenden Fremdproteine praktisch zur Gänze abgetrennt werden
können.
Falls das erfindungsgemäße Verfahren in unmittelbarem Anschluß an das Verfahren gemäß der OE-PS
3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. d.r NL-PS 66 14 177 durchgeführt wird und somit bekannt ist, auf
weiche Temperatur eine neben Orgotein beträchtliche Menge an Fremdproteinen enthaltende Lösung zv-'ecks
Abtrennens der wärmelabilen Proteine erhitzt worden ist, ist es zweckmäßig, eine Lösung des erhaltenen, im
wesentlichen reinen Orgoteins, auf eine höhere Temperatur als im Zuge der Herstellung des im
wesentlichen reinen Orgoteins angewandte zu erhitzen, da damit die Gewähr gegeben ist, daß die im im
wesentlichen reinen Orgotein noch vorhandenen Fremdprotein: praktisch zur Gänze abgetrennt werden.
Da aber bei der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der genannten Literaturstelle eine
Orgotein neben beträchtlichen Mengen an Fremdproteinen enthaltende Lösung ohnedies nur auf eine
Temperatur von 50—65°C erhitzt wird, ist es ausreichend,
gemäß der Erfindung, die Wärmebehandlung einer Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins bei
etwa 700C durchzuführen und hierbei eine Erhitzungsdauer von zumindest 30 Minuten, also eine wesentlich
längere Erhitzungsdauer, einzuhalten, als sie im Zuge der Herstellung des im wesentlichen reinen Orgoteins
eingehalten werden kann.
In den folgenden Tabellen I und II sind physikalische und chemische Eigenschaften des in erfindungsgemäßer
Weise hergestellten reinen Orgoteins angegeben. Das Aminosäureprofil des Orgoteins ist in Gramm Aminosäure
pro 100 g Protein angegeben. Das aus dem Aminosäureprofil errechnete Molekulargewicht wurde
im Hinblick darauf berechnet, daß bei der spektrophotometrischen Bestimmung des Thyrosins zwei Thyrosinreste
festzustellen sind. Der Sedimentationskoeffizient wurde bei drei verschiedenen Konzentrationen, und
zwar 0,39, 0,54, 077 g/100 ml, ermittelt. Die spezifischen Viskositäten wurden bei fünf verschiedenen Konzentrationen,
und zwar bei 0,0124 bis 0,0452 g/ml, bestimmt. Das augenscheinliche spezifische Volumen wurde bei
fünf verschiedenen Konzentrationen, und zwar bei 0,0256 bis 0,0763 g/ml, in einem 0,05-m Phosphatpuffer
mit nH = 7.5 bestimmt. Der Friktionskocffi/.ieni /"wurde
aus der Gleichung
ί, = Λί-(1 -vq)/Ns
bestimmt, wobei ί, aus der Gleichung
bestimmt, wobei ί, aus der Gleichung
/o = 6 πτ),<3 A-fy/4 jt/V)1'3,
errechnet wurde. Der Wert ///, = 1.114 wurde aus der
modifizierten Einstein-Beziehung
///0= 1/0,61 log[T)]y
errechnet, wie sie von Poison angegeben wurde. Der
Wert für M stammt aus der Aminosäureanalyse. Der Sheraga-Mandelkern-Koeffizieni β wurde aus der
Gleichung
β = Νς[η] *%,Ι\ΡΙΙ(\ -γρ)
ermittelt. Der Stickstoff von Amidgruppen mit schwer gegen D austauschbarem H wurde mittels einer 5%igen
Proteinlösung in D2O bestimmt, wobei das R-Spektrum
zwischen 5,25 und 7,8 μπι alle 8 Minuten innerhalb einer
Gesamtzeit zwischen 10 und 40 Minuten durchlaufen wurde.
Eigenschaften von aus Rinderleber gewonnenem reinem Orgotein
Elementaranalyse
50,05% C, 7,92% H, 25.15% 0,16.00% N,
1,1% S, 0% P
1,1% S, 0% P
Aminosäureprofil (Reste pro Molekül)
Alanin | 20 |
Arginin | 9 |
Asparagin | 34 |
Cystin/2 | 8 |
Glutaminsäure | 24 |
Glycin | 51 |
Histidin | 13 |
Isoleucin | 16 |
Leucin | 19 |
Lysin | 21 |
Methionin | 4 |
Phenylalanin | 9 |
Prolin | 12 |
Serin | 17 |
Threonin | 24 |
Tryptophan | 1 |
Tyrosin | 2 |
Valin | 30 |
Molekulargewicht | |
Gelfiltration | 34 000+ 750 |
Saccharose-Dichtegradient | 34 000 ±1000 |
Osmometrie | 35 300 ±1000 |
Aminosäureprofil | 35 000 |
Sedimentationskoeffizient | |
s':',„ w see. (0,85% NaCl) | 3.32 · 10 !! |
Isoelektrischer Punkt | |
Citrat-Phosphat-Puffer | 5,5 + 0,2 |
Isoionischer Punkt
5.35 + 0,05
21 Ol
Absorption. A -„,
(Glycin-Puffer.pHS.S)
lntnnsischc Viskosität
I'iirlicllcs spc/.itischcs Volumen
j* ml/g, gemessen
)' ml/g, berechnet
)' ml/g, berechnet
Lriktionsverhältnis
(IL
(IL
Scheraga-Mandelkern-Koeffizicnt
2.3 ±0.2
3.r)
0.7214
0.7224
0.7224
1.174; 1,114
2.22 ■ 10 "
2.22 ■ 10 "
Schwer gegen D austauschbarer
Wasserstoff von Amidgruppen
Wasserstoff von Amidgruppen
> 80%
Aininosiiiireprofil von Orgotein
aus verschiedenen Rohstoffen
aus verschiedenen Rohstoffen
In Tabelle Il ist das Aminosäureprofil in Gramm
Aminosäuren pro 100 g Protein angegeben. Das Protein wurde 24, 48 bzw. 72 Stunden hydrolisiert, wobei als
Vcrglcichsstandard dem Hydrolysegemisch Norlcucin zugesetzt wurde. Tryptophan wurde spektrophotomctrisch
bestimmt. Cystin/2 und Methionin wurden nach Oxydation mit Perameisensäure als Cysteinsäurc bzw.
als Methionsulfon bestimmt.
Aminosäurcprofi | I win Orgotein (g/ltlO μ | Protein) | Schal | l'lcrd | Kaninchen | I IuIm |
Leber | 6.2 | 5,9 | 6.0 | 7.3 | ||
Rimi | Rote Blutkörperchen | 3.2 | 2,0 | 2,8 | 2,6 | |
Alanin | 6.4 | Rind | 11.4 | 10,8 | 10,8 | 11,4 |
Arginin | 2,9 | 6,3 | 1,8 | 2,0 | LB | 3,1 |
Asparagin | 10,7 | 2.6 | 7,2 | 10.0 | 8,0 | 8,3 |
Cystin/2 | 2,5 | 11.2 | 17,2 | 15,9 | 17,1 | 17,7 |
Glutaminsäure | 7.8 | 2.0 | 4,5 | 6,2 | 5,3 | 5,4 |
Glycin | 16.4 | 7.7 | 5.8 | 4,7 | 4,9 | 4,8 |
Histidin | 4,0 | 16.3 | 5,5 | 5,9 | 6,9 | 4,7 |
Isoleucin | 5.2 | 5,0 | 8.1 | 8,8 | 6,7 | 6.5 |
Leucin | 6,0 | 5,7 | 0.6 | 1,7 | 0,8 | 1.0 |
Lysin | 6,6 | 5.4 | 2.2 | 2,9 | 2,8 | 2,6 |
Methionin | 1.2 | 6,6 | 4.8 | 3,7 | 4.2 | 4,1 |
Phenylalanin | 2,8 | 0.8 | 4.7 | 4,8 | 5,7 | 4,6 |
Prolin | 4,0 | 2,5 | 6.2 | 5,2 | 6.6 | 5,8 |
Serin | 5.4 | 4.1 | 0.3 | 0,3 | 0 | 0,3 |
Threonin | 7.8 | 5,3 | 0,6 | 0,3 | 0,2 | 0,7 |
Tryptophan | 0,3 | 7,7 | 9,1 | 8,9 | 9,8 | 9,4 |
Tyrosin | 0,6 | 0,2 | ||||
Valin | 9,7 | 0,7 | ||||
10,0 |
100,3
100,1
99,4 100,0
100,4
100.3
Beim praktischen Arbeiten nach dem erfindungsge- so
mäßen Verfahren sollten die folgenden Angaben beachtet werden:
Eine Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein wird auf etwa 65 bis 75°C, vorzugsweise auf etwa 700C,
erhitzt. Bei Temperaturen oberhalb 800C wird selbst
reines Orgotein so rasch zerstört, daß die Ausbeute wesentlich verringert wird. Aus diesen Gründen liegt die
Arbeitstemperatur vorzugsweise unterhalb etwa 80°C.
Die für das Abtrennen der gesamten wärmelabilen Fremdproteine erforderliche Erhitzungsdauer ist etwa
umgekehrt proportional der gewählten Arbeitstemperatur und beträgt in der Regel zumindest 1 Stunde bei
65° C. Bei einer Arbeitstemperatur von etwa 70° C beträgt die Erhitzungsdauer zumindest 30 Minuten,
wobei die Erhitzungsdauer vorzugsweise mit 45 bis 60 Minuten gewählt wird. Bei einer Arbeitstemperatur von
etwa 75° C ist nur eine Erhitzungsdauer von etwa 20 Minuten erforderlich, wobei die Erhitzungsdauer 30
Minuten nicht überschreiten sollte, weil bei dieser Temperatur innerhalb 60 Minuten Orgotein etwa zur
Hälfte zerstört wird.
Das Erhitzen wird in einer Pufferlösung vorgenommen, in welcher das Orgotein löslich und stabil ist. Der
pH-Wert solcher Pufferlösungen liegt zweckmäßig zwischen 1 und 4 einerseits und 6 und 11 anderseits.
Vorzugsweise werden Pufferlösungen mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9 verwendet. Zur Herstellung
der Pufferlösung geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise Ammonphosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.
Maleinsäure zusammen mit NaOH, Zitronensäure zusammen mit Natriumeitrat Essigsäure
zusammen mit Natriumacetat, Zitronensäure zusammen mit Diammonphosphat, Bernsteinsäure zusammen mit
NaOH, saures Natriumaleat zusammen mit NaOH (vgl. Gormoni, »Methods in Enzymology«, Bd. I, S.
136-146 [1955], insbesondere die Puffer Nr. 5-8 und
10—18). Die Konzentration der Pufferlösung kann
innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise 10 4- bis 10 '-m, vorzugsweise etwa 10 '- bis
10 -'-m sein, liegt also stets im Bereich stark verdünnter Lösungen. Vorzugsweise wird ein Puffer aus Glycin in
physiologischer Kochsalzlösung verwendet, dessen pH-Wert auf etwa 8,5 eingestellt ist. Aus Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
und physiologischer Kochsalzlösung bzw. EDTA und Boraten hergestellte Puffer, vorzugsweise ebenfalls mit einem pH-Wert von etwa
8,5, können ebenfalls verwendet werden.
Um das Orgotein vor Abbau zu schützen, werden Pufferlösungen verwendet, die zumindest ein lösliches
Salz eines zweiwertigen Metalls mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 A, enthalten. Die Konzentration des
zweiwertigen Metallsalzes kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise zwischen 10 ~b
bis 10"2 molar sein. Einige Ionen zweiwertiger Metalle fällen das Orgotein bei bestimmten Konzentrationen.
Aus diesem Grunde soll die Konzentration von Mg-, Mn-, Ca- und Co-Salzen unterhalb 0,2-m oder,
vorzugsweise unter 0,02-m liegen. Die Konzentration von Cu- bzw. Zn-Salzen soll unter 10~4 bzw. 10 5
gewählt werden. Ein Gemisch aus Mg++ bei 10-J-m,
Cu++ bei 10-4-m und Zn++ bei 10-5-m gewährleistet
den bevorzugten Metallgehalt des Orgoteins.
Der beim erfindungsgemäßen Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein erzielbare
Wirkungsgrad beim selektiven Fällen der am Orgotein zäh anhaftenden, wärmelabilen Fremdproteine ist auch
von der Konzentration des Orgoteins in der Pufferlösung abhängig. Um beste Ergebnisse zu erzielen, soll die
Konzentration 5 bis 20 g/l betragen. Bei einer Konzentration von weniger als 5 g/l macht sich der
Einfluß zu starker Verdünnung bemerkbar, wogegen bei einer Konzentration von mehr als 20 g/l, beispielsweise .-.s
50 g/l, sowohl das Isolieren des Orgoteins erschwert als auch die Reinheitssteigerung nicht mehr so ausgeprägt
ist.
Nach dem Erhitzen werden die ausgefällten Fremdproteine von der Lösung des Orgoteins, beispielsweise
durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt, worauf die erhaltene klare Lösung dialysiert wird, um die
Puffersubstanz, überschüssige Metallsalze und lösliche niedrigmolekulare Spaltprodukte (diese besitzen eine
hohe Absorption bei 280 nm), zu beseitigen. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet, um reines
Orgotein als Feststoff zu erhalten. Hierbei kann in der in der OE-PS 3 15 202 bzw. BE-PS 6 87 828 angegebenen
Weise vorgegangen werden.
Pharmakodynamisch kann die antiinflammatorische Wirkung des reinen Orgoteins nach dem Bioversuch
von Ungar bestimmt werden, bei welchem sich bei
einer Dosierung von 0,4 mg/kg eine Inhibition der künstlich erzeugten Entzündung von zumindest 30%
zeigen soll. Die Reinheit des Orgoteins kann nach der
Dialyse durch die UV-Absorption bei 280 nm bestimmt werden, wobei sich für Am>
ein Wert von weniger als 3,0, vorzugsweise etwa 23 ± 0,2, ergeben soll. Die Reinheit
des Orgoteins kann auch durch Bestimmung des Tyrosins und des Tryptophans ermittelt werden, wobei
für aus Rinderleber gewonnenes Orgotein etwa 2 Tyrosinreste und 1 Tryptophanrest gefunden werden
sollen.
Für die Elektrophorese können mit einem dünnen Gel aus Argarose beschichtete Platten verwendet werden,
wobei ein Puffer verwendet wird, der an Tris 0,02molar, an Glycin 0,15molar und an EDTA 0,0003molar ist und
0,01% Thymol und 0,01% Natriumazid enthält und auf einen pH-Wert von 8,45 eingestellt ist. Bei einer
Stromstärke von 4 niA und einer Spannung von etwa 280 bis 340 V ergab sich hierbei eine Laufzeit von 30
Minuten.
Entwickelt wird mit Amido Black oder C'oomassie Blue; Probeabmessungen 1 λ bei einer 25 mg Protein
pro ml enthaltende Lösung.
Bei quantitativer Durchführung der Gelscheiben-Elektrophorese
werden angefärbte Elektrophorogramme auf Dünnschichtagarose in Streifen geschnitten, die
Streifen auf Objektträger I χ 3ZoII) gelegt, worauf mikroskopiert wird. Die einzelnen Objektträger werden
in den Transporteur eines Spektrophotometers (Modell 240), eingesetzt, wobei die Ablesungen bei 595 nm
vorgenommen werden, wenn mit Amido-Schwarz angefärbt wurde. Um maximale Auflösung zu erhalten,
wurde die kleinste Apertur (0,05 χ 2,3 mm) verwendet. Die erhaltenen Aufzeichnungen werden durch Planimetrieren
quantitativ ausgewertet. Alle Aufzeichnungen wurden zweifach und dreifach gemacht und wichen
höchstens um ± 0,5 cm2 voneinander ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden durch gleichzeitig Vergleichsversuche enthaltende Ausführungsbeispiele
näher erläutert, gemäß welchen entsprechend Beispiel 1 der OE-PS 3 15 202 hergestelltes,
im wesentlichen reines Orgotein als Ausgangsstoff verwendet wurde.
Lösungen von im wesentlichen reinem Orgotein (Reinheit etwa 90%) in 0,005-m Glycin-Puffer von
pH = 8,5 und mit einem Gehalt von 0,9% NaCI, welche Lösungen 5 mg Protein pro ml enthielten, wurden in 5
reine Glasgefäße gleicher Größe pipettiert. Das verwendete Orgotein enthielt 10,5% langsam wandernde
Fremdproteine, ermittelt aus einem mit Amido Black entwickelten Elektrophorogramm. Das Gefäß Nr. 1
wurde zu Vergleichszwecken verwendet, während die Gefäße 2 bis 5 samt Inhalt 15,30,45 bzw. 60 Minuten auf
700C erhitzt wurden.
Im Anschluß daran wurden die Lösungen, einschließlich der Vergleichszwecken dienenden Lösung, durch
ein Millipore-Filter filtriert, worauf der Proteingehalt des klaren Filtrats durch Biuret-Reaktion bestimmt
wurde. Jede der Eprouvetten enthielt
0,5 ml filtrierte Orgoteinlösung,
0,5 ml Pufferlösung,
1,5 ml Biuret-Reagens.
0,5 ml Pufferlösung,
1,5 ml Biuret-Reagens.
Die erhitzten Proben wurden auf Dünnschichtagarosegelen elektrophoretisch geprüft. Langsam wandernde
Stoffe und den Hintergrund bildende Stoffe wurden vom Orgotein beim Erhitzen auf 700C während
15 Minuten in einem gewissen Ausmaß und zu einem größeren Ausmaß bei Erhitzen auf 700C während 30
Minuten entfernt Durch Erhitzen der Proben auf 700C während 45 bis 60 Minuten gelang es, diese Verunreinigungen
vollständig zu entfernen, was dadurch deutlich wurde, daß auch der Hintergrund des Elektrophorogramms
wesentlich klarer war.
Nachdem die Eprouvetten 15 Minuten auf 37°C erhitzt worden waren, wurden die Eprouvetten gegen
eine Blindprobe aus Pufferlösung bei 555 nm geprüft. Die Absorption der Orgoteinlösungen bei 555 nm steht
in direkter Linearer Beziehung zur Konzentration des Orgoteins in der Lösung, wie die folgende Tabelle zeigt
Konzentration | Absorption | Konzentration | Absorption |
des Proteins | hei 555 nm | des Proteins | hei 555 nm |
in mg/ml | in mg/ml | ||
0.2 | 0,0207 | 1,2 | 0,124 |
0,4 | 0,0415 | 1,4 | 0,145 |
0,6 | 0,062 | 1,6 | 0,166 |
0,8 | 0,083 | 1,8 | 0,186 |
1,0 | 0,10.1 | 2,0 | 0,207 |
Der Gesamtverlust an Protein während der Wärmenachbehandlung kann aus der vor und nach der
Wärmebehandlung bestimmten Absorption derselben bei 555 nm ermittelt werden. Der Gesamtverlust an
Protein in % der ursprünglich vorliegenden Menge wurde aus folgender Formel errechnet:
(Proteinkonzentration nach dem Erhitzen) ■ 100
ursprüngliche Proteinkonzentration
ursprüngliche Proteinkonzentration
Der bei den obigen Versuchen ermittel'e Proteinverlust
während der erfindungsgemäßen Wärmebehandlung ist in der folgenden Tabelle angegeben.
Erhitzungs- | Λ555 | Protein | Protein |
bedingangen | konzentration | verlust | |
(aus Eichkurve) | in % | ||
in mg/ml |
Blindversuch
15 min
bei 70 C
30 min
bei 70 C
45 min
bei 70 C
60 min
bei 70 C
15 min
bei 70 C
30 min
bei 70 C
45 min
bei 70 C
60 min
bei 70 C
0,254
0,205
0,205
2,5
2,0
0,2000 1,95
0,189 1,85
0,189 1,85
0,189 1,85
0,189 1,85
0
20
20
22
26
26
26
26
.15
Beim Erhitzen der Proteinlösungen auf 70° C während 60 Minuten ergab sich ein Proteinverlust von 26%. Da
das eingesetzte Orgotein etwa 10% Fremdproteine enthielt, ergibt sich damit ein Verlust von 16% des
Orgoteins durch eine Wärmebehandlung bei 70° C während 45 bzw. 60 Minuten.
Um einen Vergleich durchführen zu können, wurden die Arbeitsbedingungen beim Erhitzen der im Zuge der
Herstellung von im wesentlichen reinem Orgotein So
vorliegenden Lösung von Proteinen verschärft, wobei statt 20 Minuten aul 6O0C 1 Stunde auf 70° C erhitzt
wurde. Entfernte man aus der so behandelten Lösung die ausgefällten Proteine, konnte bei elektrophoretischer
Prüfung der klaren Lösung Orgotein nur mehr in geringen Mengen festgestellt werden.
LJm zu erfahren, ob im Zuge der Herstellung von im wesentlichen reinem Orgotein (vgl. OE-PS 3 15 202 bzw.
BE-PS 6 87 828) eine nach dem ersten Erhitzen jedoch noch vor der Gel-Filtration durchgeführte Wärmenachbehandlung
brauchbare Ergebnisse liefert, wurde der bei einer Ammonsulfatkonzentration von 45 bis 65%
entstandene Niederschlag 60 Minuten auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Dieser Niederschlag, welcher
unmittelbar vor der Gel-Filtration anfällt, stellt ein Zwischenprodukt dar, das etwa 20% Orgotein enthält.
Dieser Niederschlag wurde in 0,025-m Tris-GIycin-Puffer
von pH 7,0, welcher an Mg+ + 10-3molar, an Cu+ +
10 4InOIaTUHdUIiZn'1 10 "'molar war, gelöst, worauf
die erhaltene Lösung so lange dialysiert wurde, bis die .Sulfatreaktion negativ ausfiel und schließlich gefriergetrocknet
wurde. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in einer Menge von 10 mg Protein pro ml in 0,9%
Kochsalz enthaltendem 0,005 Glycin-Puffer gelöst, wobei der ursprüngliche pH-Wert dieses Puffers von 0,5
auf 7,2 abfiel. Bei einer Probe wurde der pH-Wert mittels NaOH wieder auf 8,5 eingestellt. Die Proben
wurden 1 Stunde auf die in der folgenden Tabelle angtgebene Temperatur erhitzt.
Aussehen Absorption
Λ2«ιι Λ 680
1. Vergleich
2. 60 C
3. 65 C
4. 70 C
5. 70 C (pH 8,5)
klar
trüb
trüber
sehr trüb
sehr trüb
trüb
trüber
sehr trüb
sehr trüb
0,74
1,00
1,22
1,22
1,10
1,00
1,22
1,22
1,10
0,025
0,054
0,078
0,095
0,060
0,054
0,078
0,095
0,060
0,085 0,083 0,085 0,070 0,083
Unter Berücksichtigung von A^so, /^55 (Biuret) und
^680 (Trübung) (es handelt sich um die Absorptionen bei
280,555 bis 680 nm) und des Aussehens des Elektrophorogramms auf Dünnschichtagarose (30 Minuten in
0,02-m Tris-Glycin-Puffer von pH = 8,45 bei 3,5 mA und 280 bis 340 V, wobei 1 λ oder 2 λ von Lösungen
einer Konzentration von 10 mg/ml verwendet wurden) scheint eine Arbeitstemperatur von 70° C sowohl bei
einem pH-Wert von 7,2 als auch bei einem pH-Wert von 8,5 das Optimum darzustellen. Im Anschluß wurden
folgende quantitativen Versuche vorgenommen.
Je 200 mg des obenerwähnten, etwa 20% Orgotein enthaltenden Zwischenproduktes wurden in je eines
von zwei sauberen Glasgefäßen eingebracht. Das Zwischenprodukt wurde in einem Fall in 20 ml eines
0,9% Kochsalz enthaltenden 0,005-m Glycin-Puffers von pH = 8,51 gelöst, wobei der pH-Wert auf 7,6
absank. Im anderen Fall wurde das Zwischenprodukt in 20 ml eines 0,2 Gew.-% Kochsalz enthaltenden 0,005-m
Glycin-Puffers gelöst, dessen pH-Wert zuvor mit 0,1 -m NaOH auf 10,0 eingestellt worden war, wobei der
pH-Wert während des Auflösens auf 9,5 absank.
Jede der beiden Proteinlösungen wurde eine Stunde auf 70°C erhitzt, wobei beide Lösungen milchigweiß
getrübt wurden, jedoch kein Niederschlag entstand. Beim Kühlen der Lösungen auf 5°C in einem Eisbad
entstand am Rand der Glasgefäße ein gelartiges Material, wobei jedoch die Proteinlösungen trüb blieben
und kein Niederschlag festgestellt werden konnte.
Die Proteinlösungen wurden sodann durch ein Versapore-Filter filtriert, wobei jedoch das Filtrat nach
wie vor trüb blieb und am Versapore-Filter lediglich einige Stücke des gelartigen Materials zurückblieben.
Sodann wurde jedes der Filtrate über Nacht gegen entsalztes Wasser dialysiert Nach nochmaligem Austausch
des entionisierten Wassers war die Leitfähigkeit des zur Dialyse verwendeten Wassers vernachlässigbar,
jedoch waren die Proteinlösungen nach wie vor trüb, wobei noch immer kein Niederschlag festgestellt
werden konnte. Es wurde eine weitere Stunde dialysiert, wobei das entsalzte Wasser nochmals ausgetauscht
wurde. Nunmehr hatte sich ein Niederschlag gebildet. Jede der Proteinlösungen wurde nunmehr über ein
Millipore-Filter filtriert, wobei klare Filtrate erhalten wurden, die anschließend gefriergetrocknet wurden.
21 Ol 866
Ausbeule an Prolein aus der mil
pH = S.5 angesetzten Lösung
pH = S.5 angesetzten Lösung
1Ul(Cr
23 mg oder
23
200
200
KK) = 11.5"
Ausheule an Protein aus der
pH -- IO angesetzten Lösung
pH -- IO angesetzten Lösung
mit Puffer von
I 7 mg oder
17
2(H)
2(H)
KK) = 8.5%
Unter Verwendung der so erhaltenen Produkte hergestellte Elektrophorogramme zeigten, daß das
durch Erhitzen in einem Puffer von pH = 8,5 erhaltene Produkt nunmehr wesentlich reiner und praktisch frei
von langsam wandernden Stoffen war. Die Ausbeute war jedoch niedrig und betrug nur 11,5%. Da die
Gesamtausbeute bei Überführung des bei einer Ammonsulfatkonzentration von 45 bis 65% erhaltenen
Niederschlags durch zweimalige Gel-Filtration über Sephadex in reines Orgotein etwa 10% beträgt und bei
Vorschaltung eines nochmaligen Erhitzens vor der Gel-Filtration die Ausbeute an reinem Orgotein nicht
mehr als 3 bis 4%, also in der Regel weniger als 'Λ der
normalerweise erzielbaren Ausbeute beträgt, ist ein
nochmaliges Erhitzen eines Orgotein enthaltenden Zwischenproduktes vor der Gel-Filtration ohne Vorteil.
Demgegenüber werden durch nochmaliges Erhitzen eines im wesentlichen reinen Orgoteins nach der
Gel-Filtration über Sephadex die langsam wandernden Verunreinigungen und die den Hintergrund des
l-lcktrophorogramms erzeugenden Verunreinigungen
mit einem Verlust von nur etwa 10 bis 25% an Orgotein beseitigt.
Um den Einfluß der erfindungsgemäßen Wärmebehandlung auf die Absorption des Orgoteins bei 280 nm
(/42Wi) zu bestimmen, wurden 100 mg im wesentlichen
reinen Orgoteins in 40 ml eines 0,9% Kochsalz enthaltenden 0,005-m Glycin-Puffers von pH = 8,5
gelöst, womit eine 2,5 mg Orgotein pro ml enthaltende Lösung erhalten wurde, die sodann 45 Minuten auf 700C
erhitzt und schließlich zwecks Abtrennens des Niederschlages zentrifugiert wurde.
Die nach dem Zentrifugieren verbleibende Flüssigkeit wurde schließlich noch über ein Millipore-Filter filtriert,
wobei die Absorption des Filtrats bei 555 und 280 nm (A-,vi bzw. /428(i) bestimmt wurde. Die erhaltenen
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt.
Probe | Biuret | -4 W korr.*) |
l'rotcinkonz. mg/ml |
A ?S(] | •4.1SIi korr.'I |
•4j«ii/mg |
Unverdünnt | 0,212 | 0,210 | 2,05 | _ | ||
I :4 verdünnt | 0,055 | 0,051 | 0,50 | 0,264 | 0,259 | 0.518') |
*) Cüvettenkorrektur. 1I Vor der Dialyse. |
Der Verlust an Protein betrug insgesamt 2,50 mg minus 2,05 mg = 0,45 mg, was einem Verlust von 18%
entspricht. Durch Gelscheiben-Elektrophorese war der Gehalt des im wesentlich reinen Orgoteins an
Verunreinigungen mit etwa 10% bestimmt worden, woraus sich ein Verlust von etwa 8% Orgotein während
der Reinigung ergab.
In weiteren Versuchen wurde das Filtrat der erhitzten
Pufferlösung eine Stunde gegen ein an Tris 0,03molaren
und an Glycin 0,005molaren Puffer von pH = 7,8 welcher außerdem an Mg+4 10-3molar, an
Cu+ + 10-4molarundanZn+ + 10 -'molar war und 0,02%
Natriumazid enthielt, dialysiert, worauf nochmals gegen entsalztes Wasser dialysiert, dann filtriert und schließlich
gefriergetrocknet wurde. Die Absorption des Orgoteins bei 280 nm fiel nach der Dialyse und dem
Gefriertrocknen beträchtlich, u. zw. auf 0,24 ± 0,02 pro mg Protein ab. Durch die Dialyse scheinen einige der bei
280 nm stark absorbierenden Verunreinigungen niedrigen Molekulargewichts entfernt worden zu sein. Bei
anderen Proben von Orgotein betrug die nach einstündigem Erhitzen auf 700C jedoch noch vor der
Dialyse zu beobachtende Absorption bei 280 nm 0,2780 pro mg Protein. Anschließende Dialyse der
klaren Flüssigkeit bewirkte keine nennenswerte Verringerung der Absorption bei 280 nm. Die Absorption
einer weiteren Probe an Orgotein betrug nach dem Erhitzen und der Dialyse 0,252 pro mg Protein.
Der beim Erhitzen entstandene Niederschlag wurde in 0,1 ml 0,02-m Tris-G!ycin-Puffer von pH = 8,45
verrieben, jedoch war dieser Niederschlag in diesem Puffer nicht nennenswert löslich. Im Anschluß wurden
noch 0,4 ml eines 1 Gew.-% Saccharose enthaltenden 0,1-m Tris-Gylcin-Puffers von pH = 10,6 zugesetzt,
wobei eine geringe Menge des Niederschlags in Lösung zu gehen schien. Nach dem Abzentrifugieren des nicht
4> gelösten Niederschlags wurde die klare überstehende Flüssigkeit der Elektrophorese unterworfen, wobei aus
der Intensität der mit Coomassie Blue vorgenommenen Entwicklung auf eine Proteinkonzentration von etwa
so 0,5 mg ,
■—= -~ = 0.17 mg ml
3 ml
3 ml
geschlossen werden mußte. Hätte sich der Niederschlag zur Gänze gelöst, dann hätte die Konzentration der
Lösung 1,8 mg/0,5 ml = 3,6 mg/ml betragen müssen. Es sind somit
0.17
3,6
3,6
100 = 4.7%
des Niederschlages gelöst worden.
Dem nicht in Lösung gegangenen Niederschlag wurden 0,5 ml einer 0,01 η NaOH-Lösung zugesetzt,
wobei der gesamte Niederschlag in Lösung ging. Ein aus dieser Lösung hergestelltes Elektrophorogramm zeigte
nur nicht identifizierbare verwaschene Banden, wie sie für denaturierte Proteine typisch sind
Claims (14)
1. Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichem reinen Orgotein, welches zäh s
anhaftende wärmelabile Fremdproteine enthält, von welchen die meisten bei der Gel-Elektrophorese
langsamer wandern als Orgotein und welche den Wert für A;ii einer Lösung von Orgotein wesentlich
über 2.3 + 0,2 anheben, etwa das gleiche Molekülvolumen
wie Orgotein besitzen, beim Erhitzen in Pufferlösungen auf 600C während 10 bis 20 Minuten
stabil sind und in Puffern, in Gemischen aus Puffern und organischen Lösungsmitteln und in Ammonsulfatlösungen
etwa die gleiche Löslichkeit besitzen wie Orgotein, dadurch gekennzeichnet, daß zäh anhaftende Fremdproteine enthaltendes im
wesentlichen reines Orgotein in einer ein zweiwertiges Metall mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 Ä
enthaltenden und einen pH-Wert von ] bis 4 oder 6 bis 11 besitzenden Pufferlösung auf eine Temperatur
von zumindest 65° C, bei welcher im wesentlichen reines Orgotein stabil ist, so lange erhitzt wird, bis
der Wert für A:m einer Lösung des Orgoteins
2,3 ±0,2 beträgt, worauf die ausgefällten unerwünschten Proteine von der Lösung des Orgoteins
abgetrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmebehandlung einer Lösung
des im wesentlichen reinen Orgoteins bei etwa 7O0C
während zumindest 30 Minuten durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen
reinen Orgoteins in einem einen pH-Wert von etwa 8,5 besitzenden Glycin-Kochsalz-Puffer war- is
mebehandeli wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung
Mg+ ■> -.Cu++-und Zn + +-Ionen enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 4, ^o
dadurch gekennzeichnet, daß eine 5 bis ?0 mg Orgotein pro Liter enthaltende Pufferlösung wärmebehandelt
wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen 4s
reinen Orgoteins in einem Mg++-, Cu++- und Zn++-Ionen enthaltenden Glycin-Kochsalz-Puffer
mit einem pH-Wert von etwa 8,5 während 45 bis 60 Minuten auf etwa 700C erhitzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen
reinen Orgoteins in einem Mg++-, Cu+f- und Zn++-Ionen enthaltenden Tris-Glycin-Puffer mit
einem pH-Wert νοΐϊ etwa 7,8 während 45 bis 60
Minuten auf etwa 700C erhitzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Wärmebehandlung
eine Lösung eines weitgehend unreinen Orgoteins in einer ein zweiwertiges Metallsalz mit
einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 A enthaltenden Pufferlösung auf eine Temperatur von mindestens
500C, jedenfalls aber auf eine Temperatur unterhalb
der bei der Wärmebehandlung eingehaltenen Temperatur, erhitzt wird, bis im wesentlichen die
gesamten, jedoch noch nicht die gesamten wärmela- <>s
bilen Fremdproteine, entfernt sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß während der zuerst vorzunehmenden
Wärmehehandlung eine Temperatur von 60 bis 65° C und während der später vorzunehmenden Wärmebehandlung
eine Temperatur von 65 bis 75°C eingehalten wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Orgoteins in
einem einen pH-Wert von etwa 8,5 aufweisenden Glycin-Kochsalz-Puffer wärmebehandelt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8,9 oder
10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mg + + -, Cu + + und
Zn ++-Ionen enthaltende Pufferlösung verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des
Orgoteins in der Pufferlösung auf 5 bis 20 mg/ml eingestellt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Orgoteins in
einem einen pH-Wert von etwa 8,5 besitzenden und Mg++-, Cu++- und Zn++-Ionen enthaltenden
Glycin-Kochsalz-Puffer 45 bis 60 Minuten auf etwa 70° C erhitzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Orgoteins in
einem einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweisenden und Mg++-, Cu++- und Zn++-Ionen enthaltenden
Tris-Glycin-Puffer 45 bis 60 Minuten auf etwa 7O0C erhitzt wird.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US353870A | 1970-01-16 | 1970-01-16 | |
US349270A | 1970-01-16 | 1970-01-16 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2101866A1 DE2101866A1 (de) | 1971-07-22 |
DE2101866B2 DE2101866B2 (de) | 1977-11-03 |
DE2101866C3 true DE2101866C3 (de) | 1978-06-29 |
Family
ID=26671830
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2101866A Expired DE2101866C3 (de) | 1970-01-16 | 1971-01-15 | Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichen reinem Orgotein |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JPS4948721B1 (de) |
BE (1) | BE765380A (de) |
CA (1) | CA924640A (de) |
CH (2) | CH572942A5 (de) |
DE (1) | DE2101866C3 (de) |
DK (1) | DK131090B (de) |
FR (1) | FR2081438B1 (de) |
GB (1) | GB1293483A (de) |
IL (1) | IL35943A (de) |
NL (1) | NL150009B (de) |
SE (2) | SE404488B (de) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3763137A (en) * | 1971-12-07 | 1973-10-02 | Diagnostic Data Inc | Isolation of orgotein from red blood cells |
JPS5712993A (en) * | 1980-06-23 | 1982-01-22 | Fujirebio Inc | Isolation of superoxide dismutase |
DE3410159A1 (de) * | 1984-03-20 | 1985-09-26 | Alfred Dipl.-Biochem. 7400 Tübingen Gärtner | Verfahren zur gewinnung von cu(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)zn(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)superoxiddismutase aus roten blutzellen von wirbeltieren |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL32097A (en) * | 1968-05-13 | 1973-08-29 | Diagnostic Data Inc | Isolation of orgotein from blood |
-
1970
- 1970-12-24 CA CA101505A patent/CA924640A/en not_active Expired
- 1970-12-31 IL IL35943A patent/IL35943A/xx unknown
-
1971
- 1971-01-08 NL NL717100222A patent/NL150009B/xx not_active IP Right Cessation
- 1971-01-08 GB GB0050/71A patent/GB1293483A/en not_active Expired
- 1971-01-13 FR FR7100918A patent/FR2081438B1/fr not_active Expired
- 1971-01-15 DE DE2101866A patent/DE2101866C3/de not_active Expired
- 1971-01-15 CH CH66271A patent/CH572942A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1971-01-15 DK DK17271AA patent/DK131090B/da unknown
- 1971-01-15 SE SE7100483A patent/SE404488B/xx unknown
- 1971-01-16 JP JP46001056A patent/JPS4948721B1/ja active Pending
- 1971-04-06 BE BE765380A patent/BE765380A/xx not_active IP Right Cessation
-
1973
- 1973-09-24 SE SE7312972A patent/SE417277B/xx unknown
-
1974
- 1974-08-09 JP JP9139874A patent/JPS5619876B2/ja not_active Expired
-
1975
- 1975-11-11 CH CH1458075A patent/CH602782A5/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS4948721B1 (de) | 1974-12-23 |
BE765380A (fr) | 1971-08-30 |
GB1293483A (en) | 1972-10-18 |
CH602782A5 (de) | 1978-08-15 |
DE2101866B2 (de) | 1977-11-03 |
FR2081438A1 (de) | 1971-12-03 |
DK131090B (da) | 1975-05-26 |
NL150009B (nl) | 1976-07-15 |
SE404488B (sv) | 1978-10-09 |
FR2081438B1 (de) | 1974-04-12 |
DK131090C (de) | 1975-10-27 |
IL35943A (en) | 1974-01-14 |
JPS5619876B2 (de) | 1981-05-09 |
IL35943A0 (en) | 1971-02-25 |
NL7100222A (de) | 1971-07-20 |
CH572942A5 (de) | 1976-02-27 |
CA924640A (en) | 1973-04-17 |
DE2101866A1 (de) | 1971-07-22 |
JPS5069215A (de) | 1975-06-10 |
SE417277B (sv) | 1981-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0302948B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Steviosiden aus pflanzlichem Rohmaterial | |
DE2333883C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Humanalbumin | |
DE69007057T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Gelatine aus Fischhaut. | |
DE2801607A1 (de) | Verfahren zum gewinnen von gereinigtem albumin aus blutplasma | |
DE2922561C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Proteinisolaten aus unerwünschte Polyphenole enthaltenden pflanzlichen Mehlen | |
DE2101866C3 (de) | Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichen reinem Orgotein | |
DE3124228C2 (de) | Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen | |
DE3139093C1 (de) | Kosmetisches Mittel | |
WO1988000828A1 (fr) | Agent antiviral | |
DE3016548A1 (de) | Verfahren zur herabsetzung der thermischen stabilitaet von mikrobiellem mucor-rennin und dessen verwendung zur kaesebereitung | |
DE69009428T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Pfirsichblätterextraktes und dessen Verwendung als Badezusatz. | |
DE1817466C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von intravenös injizierbaren und pyrogen freien Salzen des Lysozyms | |
DE2415079C3 (de) | Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Blutplasma | |
DE824210C (de) | Verfahren zur Herstellung reiner Aminosäuren | |
EP1008350A1 (de) | Stabilisiertes Antithrombin III-Präparat | |
DE2520012C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung einer loslichen Sojabohnenproteinfraktion | |
DE2733923A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von humanalbumin | |
DE331887C (de) | Verfahren zur Herstellung Ioeslicher, entfaerbter, geruch- und geschmackloser Eiweissstoffe aus Blut | |
DE2835220C2 (de) | ||
DE2828944C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Lysozym | |
DE2855827A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von human- chorion somatomammotropin | |
DE1065133B (de) | Verfahren zur Reinigung von aus Speichel bzw. Speicheldruesen gewonnenem Rohparotin | |
DE805519C (de) | Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Kobaltkomplex-Verbindungen | |
AT83725B (de) | Verfahren zur Herstellung entfärbter, geruch- und geschmackloser Eiweißstoffe aus Blut. | |
AT227882B (de) | Verfahren zur Gewinnung von Heparin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |