DE2101866B2

DE2101866B2 - Verfahren zum herstellen von reinem orgotein aus im wesentlichen reinem orgotein

Info

Publication number: DE2101866B2
Application number: DE19712101866
Authority: DE
Inventors: Wolfgang San Francisco Calif. Huber (V.St.A.)
Original assignee: Diagnostic Data Inc
Current assignee: GT Biopharma Inc
Priority date: 1970-01-16
Filing date: 1971-01-15
Publication date: 1977-11-03
Also published as: DE2101866C3; CA924640A; FR2081438B1; CH602782A5; NL150009B; DK131090C; JPS5069215A; IL35943A; DK131090B; CH572942A5; DE2101866A1; IL35943A0; NL7100222A; GB1293483A; JPS4948721B1; SE417277B; FR2081438A1; SE404488B; JPS5619876B2; BE765380A

Description

»Orgotein« ist die vom »United States Adopted Name Council« einem Metallchelat mit einem zweiwertigen Metall eines im wesentlichen reinen, wasserlöslichen, ungiftigen, im wesentlichen nichtantigenetischen und antiinflammatorisch wirkenden Proteins kompakter Konfiguration zugeordnete freie Kurzbezeichnung (vgl. ]. A. M. A. 26. Mai 1969; Bd. 208, Nr. 8).

Das grundlegende Verfahren zum Herstellen von Orgotein ist in der OE-PS 3 15 202, der DT-PS 6 87 828 und in der NL-OS 66 14 177 beschrieben und besteht im wesentlichen darin, dieses Orgotein — ein bei der Gelscheiben-Elektrophorese sowohl bei einem pH-Wert von 9,4 als auch bei einem pH-Wert von 3,8 in Form von knapp beeinanderliegenden Banden langsamer als Albumin aber schneller als ^-Globulin wanderndes Protein-Metall-Chelat — aus einer natürlichen Eiweißquelle, beispielsweise Rinderleber, dadurch zu gewinnen, daß man die natürliche Eiweißquelle mit zweiwertige Metallionen, vorzugsweise Mn⁺+, und gegebenenfalls einen Puffer enthaltendem Wasser extrahiert und aus der erhaltenen Lösung von wasserlöslichen Proteinen in bekannter Weise, jedenfalls aber unter kurzzeitigem Erhitzen dieser Orgotein enthaltenden Lösung auf eine Temperatur bis höchstens 75°C zwecks Abtrennens der wärmelabilsten Proteine von leichter und schwerer löslichen Stoffen, das Orgotein, erforderlichenfalls unter Transchelatieren, in Form eines 0,1 — 1,0% Metallionen aufweisenden Chelats, in welchem zumindest 65% des Metallgehaltes von zumindest einem der Metalle Mg, Ca, Fe, Zn, Co und Cu stammen, isoliert. Gbzwar es bei diesem bekannten Verfahren zum Herstellen von Orgotein durchaus möglich ist, aus einer nach dem Erhitzen einer Orgotein enthaltenden Lösung des Orgotein allein durch Gelscheiben-Elektrophorese zu gewinnen, wird doch wegen des raschen Verschmutzens des hierbei zu

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»!•wendenden Gels durch Fremdproteine und auch egen des sonstigen hohen Aufwandes beim Arbeiten jch der präparativen Gelscheiben-Elektrophorese Drzugsweise eine mehrstufige Arbeitsweise empfohlen, obei aufeinanderfolgend '

a) fein zerkleinerte frische Rinderleber in einem eiskalten, Mn⁺+-lon enthaltendem Puffer bis zur im wesentlichen vollständigen Extraktion der löslichen Proteine aufgeschlämmt wird,

b) aus der Lösung der Proteine in der kalten Pufferlösung mittels Aceton ein wesentlicher Anteil der gelösten Proteine ausgefällt wird,

c) die ausgefällten Proteine in kaltem, Mn⁺+-Ionen enthaltendem Maleatpuffer gelöst werden,

d) die erhaltene Lösung etwa 20 Minuten auf 60⁰C erhitzt wird,

e) die Lösung sodann gekühlt wird und die ausgefällten denaturierten Proteine abgetrennt werden,

f) restliche der in der kalten Pufferlösung enthaltenen Proteine mit Äthanol ausgefällt werden,

g) die ausgefällten Proteine in kaltem, Mn⁺+-Ionen enthaltendem Maleatpuffer gelöst werden,

h) die erhaltene Lösung gefriergetrocknet wird,
i) die beim Gefriertrocknen erhaltenen Feststoffe in kaltem, Mg⁺+-Ionen enthaltenden Tris-Puffer [Tris-(hydroxy-methyl)-amino-methan] gelöst werden und aus der erhaltenen Lösung mit Ammonsulfat die Proteine fraktioniert gefällt werden und die bei einer etwa 45 bis etwa 75% der Sättigungskonzentration betragenden Konzentration an Ammonsulfat anfallenden Fraktionen erneut in kaltem, Mg⁺ +-Ionen enthaltendem Tris-Puffer gelöst werden und die erhaltene Lösung über eine mit quervernetztem Dextran gefüllte Kolonne chromatographiert wird und

k) die erwünschten Fraktionen zwecks Abtrennens überschüssigen Puffers und nicht chelatisierter Metallionen dialysiert werden, wobei zunächst gegen eine geringe Menge eines ein Magnesiumsalz oder ein anderes Salz eines zweiwertigen Metalls enthaltendes Wasser, dann gegen an O-Phenanthrolin 10-³-molares Wasser und schließlich gegen reines Wasser dialysiert wird. Bei diesem bekannten Verfahren beträgt die auf Trockengewicht der eingesetzten Rinderleber bezogene Ausbeute an Orgotein etwa 0,01 Gew.-%.

Trotz dieser komplizierten Arbeitsschritte bei der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der OE-PS 3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. der ' NL-OS 66 14 177 (abgehandelt in »Chemical Abstracts«, [1968], 6193 r) bleiben mit dem Orgotein bei der Gelscheiben-Elektrophorese langsamer als das in Form multipler Banden wandernde Orgotein wandernde und gelegentlich auch zwischen den auf Orgotein selbst zurückzuführenden Banden als »Hintergrund« sichtbare Proteine vergesellschaftet, die selbst durch präparative Gelscheiben-Elektrophorese von Orgotein nicht getrennt werden können. Die bei der bevorzugten t,o Ausführungsform des Verfahrens gemäß der OE-PS 202 vom Orgotein nicht mehr abtrennbaren Fremdproieine stören in weitaus den meisten Fällen die therapeutische Anwendung des Orgoteins nicht, da das Orgotein in der Regel mit einer Reinheit von zumindest 90% und meist mit einer Reinheit von wesentlich mehr als 95% erhalten wird und erst bei einem Gehalt des Orffoteins von mehr als 10% an Fremdproteinen das

30

35

40

45 Auftreten von Allergien bei therapeutischer Verwendung des Orgoteins wahrscheinlicher wird. Welche Mengen an Fremdproteinen nun beim Arbeiten nach der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der OE-PS 3 15 202 mit dem Orgotein vergesellschaftet bleiben, hängt in nicht geklärter Weise mit der als Ausgangsstoff verwendeten Eiweißquelle zusammen, als welche, wie sich im Zuge späterer Untersuchungen gezeigt hat, rote Blutkörperchen von Säugetieren besonders geeignet sind, da aus solchen roten Blutkörperchen besonders reines Orgotein hergestellt werden kann, welches in l%iger Lösung bei einer Wellenlänge von 280 nm eine UV-Absorption (A;iö) von 2,3 + 0,2 statt 5,85 entsprechend der OE-PS 3 15 202 besitzt. Im Zuge weiterer Untersuchungen wurde gefunden, daß der in der OE-PS 3 15 202 angegebene Wert für \\\m von 5,85 (0,585 bei einer Konzentration von 1 mg/ml) darauf zurückzuführen ist, daß die mit dem Orgotein vergesellschafteten und praktisch auch durch präparative Gelscheiben-Elektrophorese vom Orgotein nicht abtrennbaren Fremdproteine beträchtliche Mengen an für die UV-Absorption bei 280 nm verantwortlichen Tyrosin- und Tryptophanresten enthalten und damit selbst in einer Menge von nur 2% im Orgotein einen wesentlich größeren Beitrag zur UV-Absorption bei 280 nm liefern als Orgotein selbst, welches entgegen früheren Annahmen nur einen Tryptophanrest statt 2 Tryptophanresten und nur 2 Tyrosinreste statt 5 Tyrosinresten pro Molekül enthält.

Es ist nun Ziel der vorliegenden Erfindung, reines Orgotein aus entsprechend der OE-PS 3 15 202 bzw. entsprechend der BE-PS 6 87 828 bzw. entsprechend der NL-OS 66 14 177 erhältlichem und als im wesentlichen rein zu bezeichnendem Orgotein herzustellen und hierbei das weitere Reinigen eines solchen, im wesentlichen reinen Orgoteins durch die aufwendige und dennoch nicht ganz zufriedenstellende präparative Gelscheiben-Elektrophorese zu vermeiden. Die vorliegende Erfindung beruht hierbei auf der überraschenden Feststellung, daß eine Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein auf eine wesentlich höhere Temperatur und eine wesentlich längere Zeit lang erhitzt werden kann, als es entsprechend den Angaben in der OE-PS 3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. der NL-OS 66 14 177 für eine neben Orgotein noch große Mengen an Fremdproteinen enthaltende Lösung als zulässig zu erachten ist. Diese Feststellung ist besonders deshalb überraschend, weil im Hinblick auf die Angaben in der OE-PS 3 15 202, in der BE-PS 6 87 828 und in der NL-OS 66 14 177 anzunehmen war, daß beim Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein die Stabilität des Orgoteins nicht größer sein würde als beim Erhitzen einer großen Menge an Fremdproteinen enthaltenden Lösung und hierbei das Orgotein in einem unzulässig großen Ausmaß zerstört werden würde.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichen reinem Orgotein, welches zäh anhaftende wärmelabile Fremdproteine enthält, von welchen die meisten bei der Gel-Elektrophorese langsamer wandern als Orgotein und welche den Wert für AS einer Lösung von Orgotein wesentlich über 2,3 ±0,2 anheben, etwa das gleiche Molekülvolumen wie Orgotein besitzen, beim Erhitzen in Pufferlösungen auf 6O⁰C während 10 bis 20 Minuten stabil sind und in Puffern, in Gemischen aus Puffern und organischen Lösungsmitteln und in Ammonsulfatlösungen etwa die gleiche Löslichkeit besitzen wie Orgotein. Dieses

Verfahren ist gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß zäh anhaftende Frenidproteine enthaltendes im wesentlichen reines Orgotein in einer ein zweiwertiges Metall in einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 A enthaltenden und einen pH-Wert von 1 bis 4 oder 6 bis 11 besitzenden Pufferlösung auf eine Temperatur von zumindest 65°C, bei welcher im wesentlichen reines Orgotein stabil ist, so lange erhitzt wird, bis der Wert für Ai;-, einer Lösung des Orgoteins 2,3 ±0,2 beträgt, worauf die ausgefällten, unerwünschten Proteine von der Lösung des Orgoteins abgetrennt werden.

Auf diese Weise gelingt es, reines Orgotein selbst aus solchem im wesentlichen reinen Orgotein herzustellen, welches im Hinblick auf seinen zu hohen Gehalt an Fremdproteinen für die therapeutische Verwendung nicht geeignet ist, also mehr als etwa 10% an Fremdproteinen enthält. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht hierbei darin, daß beim Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein, auch die durch päparative Gel-Scheiben-Elektrophorese nicht zur Gänze abtrennbaren und den »Hintergrund« für die auf Orgotein rückzuführenden Banden im Elektrophorogramm bildenden Fremdproteine praktisch zur Gänze abgetrennt werden können.

Falls das erfindungsgemäße Verfahren in unmittelbarem Anschluß an das Verfahren gemäß der OE-PS 3 15 202 bzw. der BE-PS 6 87 828 bzw. der NL-PS 66 14 177 durchgeführt wird und somit bekannt ist, auf welche Temperatur eine neben Orgotein beträchtliche Menge an Fremdproteinen enthaltende Lösung zwecks Abtrennens der wärmelabilen Proteine erhitzt worden ist, ist es zweckmäßig, eine Lösung des erhaltenen, im wesentlichen reinen Orgoteins, auf eine höhere Temperatur als im Zuge der Herstellung des im wesentlichen reinen Orgoteins angewandte zu erhitzen, da damit die Gewähr gegeben ist, daß die im im wesentlichen reinen Orgotein noch vorhandenen Fremdproteine praktisch zur Gänze abgetrennt werden. Da aber bei der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der genannten Literaturstelle eine Orgotein neben beträchtlichen Mengen an Fremdproteinen enthaltende Lösung ohnedies nur auf eine Temperatur von 50—65°C erhitzt wird, ist es ausreichend, gemäß der Erfindung, die Wärmebehandlung einer Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins bei etwa 70°C durchzuführen und hierbei eine Erhitzungsdauer von zumindest 30 Minuten, also eine wesentlich längere Erhitzungsdauer, einzuhalten, als sie im Zuge der Herstellung des im wesentlichen reinen Orgoteins eingehalten werden kann.

In den folgenden Tabellen I und II sind physikalische und chemische Eigenschaften des in erfindungsgemäßer Weise hergestellten reinen Orgoteins angegeben. Das Aminosäureprofil des Orgoteins ist in Gramm Aminosäure pro 100 g Protein angegeben. Das aus dem Aminosäureprofil errechnete Molekulargewicht wurde im Hinblick darauf berechnet, daß bei der spektrophotometrischen Bestimmung des Thyrosins zwei Thyrosinreste festzustellen sind. Der Sedimentationskoeffizient wurde bei drei verschiedenen Konzentrationen, und zwar 0,39, 0,54, 077 g/100 ml, ermittelt. Die spezifischen Viskositäten wurden bei fünf verschiedenen Konzentrationen, und zwar bei 0,0124 bis 0,0452 g/ml, bestimmt. Das augenscheinliche spezifische Volumen wurde bei fünf verschiedenen Konzentrationen, und zwar bei 0,0256 bis 0,0763 g/ml, in einem 0,05-m Phosphatpuffer mit dH = 7,5 bestimmt. Der Friktionskoeffizicnt /"wurde

aus der Gleichung

bestimmt, wobei f„ aus der Gleichung

errechnet wurde. Der Wert /7Λ, = 1,114 wurde aus der modifizierten Einstein-Beziehung

///■„=1/0,61 log[i;]y

errechnet, wie sie von P ο 1 s ο η angegeben wurde. Der Wert für M stammt aus der Aminosäureanalyse. Der Sheraga-Mandelkern-Koeffizient β wurde aus der Gleichung

β = Ns[I]] "³η_ο/Μ2/3(1->'())

ermittelt. Der Stickstoff von Amidgruppen mit schwer gegen D austauschbarem H wurde mittels einer 5%igen Proteinlösung in D₂O bestimmt, wobei das R-Spektrum zwischen 5,25 und 7,8 μπι alle 8 Minuten innerhalb einer Gesamtzeit zwischen 10 und 40 Minuten durchlaufen wurde.

Tabelle I

Eigenschaften von aus Rinderleber gewonnenem reinem Orgotein

Elementaranalyse

50,05% C, 7,92% H, 25,15% 0,16,00% N,
1,1% S, 0% P

Aminosäureprofil (Reste pro Molekül)

Alanin	20
Arginin	9
Asparagin	34
Cystin/2	8
Glutaminsäure	24
Glycin	51
Histidin	13
Isoleucin	16
Leucin	19
Lysin	21
Methionin	4
Phenylalanin	9
Prolin	12
Serin	17
Threonin	24
Tryptophan	1
Tyrosin	2
Valin	30
Molekulargewicht
Gelfiltration	34 000 ± 750
Saccharose-Dichtegradient	34 000 ±1000
Osmometrie	35 300 ±1000
Aminosäureprofil	35 000
Sedimentationskoeffizient
s%. w see. (0,85% NaCl)	3,32 · 10"
Isoelektrischer Punkt
Citrat-Phosphat-Puffer	5,5 + 0,2

Isoionischer Punkt

5,35 ±0,05

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Absorption, A I«;

(Glycin-Puffer,pH8,5)

lntrinsische Viskosität

Partielles spezifisches Volumen

γ ml/g, gemessen
γ ml/g, berechnet

Friktionsverhältnis

fifo

Scheraga-Mandelkern-Koeffizient

Tabelle 11

2,3 ±0,2

3,5

0,7219
0,7224

2,22 ■ 10-^b

Schwer gegen D austauschbarer
Wasserstoff von Amidgruppen

> 80%

Aminosäureprofil von Orgotein
aus verschiedenen Rohstoffen

In Tabelle II ist das Aminosäureprofil in Gramm Aminosäuren pro 100 g Protein angegeben. Das Protein wurde 24, 48 bzw. 72 Stunden hydrolisiert, wobei als Vergleichsstandard dem Hydrolysegemisch Norleucin zugesetzt wurde. Tryptophan wurde spektrophotometrisch bestimmt. Cystin/2 und Methionin wurden nach Oxydation mit Perameisensäure als Cysteinsäure bzw. als Methionsulfon bestimmt.

Aminosäureprofil von	Orgotein (g/100	g Protein)	Schaf	Pferd	Kaninchen	Huhn
	Leber		6,2	5,9	6,0	7,3
	Rind	Rote Blutkörperchen	3,2	2,0	2,8	2,6
Alanin	6,4	Rind	11,4	10,8	10,8	11,4
Arginin	2,9	6,3	1,8	2,0	1,8	3,1
Asparagin	10,7	2,6	7,2	10,0	8,0	8,3
Cystin/2	2,5	11,2	17,2	15,9	17,1	17,7
Glutaminsäure	7,8	2,0	4,5	6,2	5,3	5,4
Glycin	16,4	7,7	5,8	4,7	4,9	4,8
Histidin	4,0	16,3	5,5	5,9	6,9	4,7
Isoleucin	5,2	5,0	8,1	8,8	6,7	6,5
Leucin	6,0	5,7	0,6	1,7	0,8	1,0
Lysin	6,6	5,4	2,2	2,9	2,8	2,6
Methionin	1,2	6,6	4,8	3,7	4,2	4,1
Phenylalanin	2,8	0,8	4,7	4,8	5,7	4,6
Prolin	4,0	2,5	6,2	5,2	6,6	5,8
Serin	5,4	4,1	0,3	0,3	0	0,3
Threonin	7,8	5,3	0,6	0,3	0,2	0,7
Tryptophan	0,3	7,7	9,1	8,9	9,8	9,4
Tyrosin	0,6	0,2
Valin	9,7	0,7
10,0

100,3

100,1

99,4 100,0

100,4

100,3

Beim praktischen Arbeiten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sollten die folgenden Angaben beachtet werden:

Eine Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein wird auf etwa 65 bis 75⁰C, vorzugsweise auf etwa 7O⁰C, erhitzt. Bei Temperaturen oberhalb 80⁰C wird selbst ss reines Orgotein so rasch zerstört, daß die Ausbeute wesentlich verringert wird. Aus diesen Gründen liegt die Arbe'itstemperatur vorzugsweise unterhalb etwa 80° C.

Die für das Abtrennen der gesamten wärmelabilen Fremdproteine erforderliche Erhitzungsdauer ist etwa <,₀ umgekehrt proportional der gewählten Arbeitstemperatur und beträgt in der Regel zumindest 1 Stunde bei 65°C. Bei einer Arbeitstemperatur von etwa 70° C beträgt die Erhitzungsdauer zumindest 30 Minuten, wobei die Erhitzungsdauer vorzugsweise mit 45 bis 60 t,_s Minuten gewählt wird. Bei einer Arbeitstemperatur von etwa 75⁰C ist nur eine Erhitzungsdauer von etwa 20 Minuten erforderlich, wobei die Erhitzungsdauer 30 Minuten nicht überschreiten sollte, weil bei dieser Temperatur innerhalb 60 Minuten Orgotein etwa zur Hälfte zerstört wird.

Das Erhitzen wird in einer Pufferlösung vorgenommen, in welcher das Orgotein löslich und stabil ist. Der pH-Wert solcher Pufferlösungen liegt zweckmäßig zwischen 1 und 4 einerseits und 6 und 11 anderseits. Vorzugsweise werden Pufferlösungen mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9 verwendet. Zur Herstellung der Pufferlösung geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise Ammonphosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Maleinsäure zusammen mit NaOH, Zitronensäure zusammen mit Natriumeitrat, Essigsäure zusammen mit Natriumacetat, Zitronensäure zusammen mit Diammonphosphat, Bernsteinsäure zusammen mit NaOH, saures Natriumaleat zusammen mit NaOH (vgl. Gormoni, »Methods in Enzymology«, Bd. I, S. 136-146 [1955], insbesondere die Puffer Nr. 5-8 und 10—18). Die Konzentration der Pufferlösung kann

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ίο

innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise ICM- bis 10-'-m, vorzugsweise etwa 10-³- bis 10-²-m sein, liegt also stets im Bereich stark verdünnter Lösungen. Vorzugsweise wird ein Puffer aus Glycin in physiologischer Kochsalzlösung verwendet, dessen pH-Wert auf etwa 8,5 eingestellt ist. Aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und physiologischer Kochsalzlösung bzw. EDTA und Boraten hergestellte Puffer, vorzugsweise ebenfalls mit einem pH-Wert von etwa 8,5, können ebenfalls verwendet werden.

Um das Orgotein vor Abbau zu schützen, werden Pufferlösungen verwendet, die zumindest ein lösliches Salz eines zweiwertigen Metalls mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 Ä, enthalten. Die Konzentration des zweiwertigen Metallsalzes kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise zwischen 10"⁶ bis 10~² molar sein. Einige Ionen zweiwertiger Metalle fällen das Orgotein bei bestimmten Konzentrationen. Aus diesem Grunde soll die Konzentration von Mg-, Mn-, Ca- und Co-Salzen unterhalb 0,2-m oder, vorzugsweise unter 0,02-m liegen. Die Konzentration von Cu- bzw. Zn-Salzen soll unter ΙΟ"⁴ bzw. 10~⁵ gewählt werden. Ein Gemisch aus Mg⁺+ bei 10"³-m, Cu⁺⁺ bei 10-⁴-m und Zn⁺⁺ bei 10-⁵-m gewährleistet den bevorzugten Metallgehalt des Orgoteins.

Der beim erfindungsgemäßen Erhitzen einer Lösung von im wesentlichen reinem Orgotein erzielbare Wirkungsgrad beim selektiven Fällen der am Orgotein zäh anhaftenden, wärmelabilen Fremdproteine ist auch von der Konzentration des Orgoteins in der Pufferlösung abhängig. Um beste Ergebnisse zu erzielen, soll die Konzentration 5 bis 20 g/l betragen. Bei einer Konzentration von weniger als 5 g/l macht sich der Einfluß zu starker Verdünnung bemerkbar, wogegen bei einer Konzentration von mehr als 20 g/I, beispielsweise 50 g/l, sowohl das Isolieren des Orgoteins erschwert als auch die Reinheitssteigerung nicht mehr so ausgeprägt ist.

Nach dem Erhitzen werden die ausgefällten Fremdproteine von der Lösung des Orgoteins, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt, worauf die erhaltene klare Lösung dialysiert wird, um die Puffersubstanz, überschüssige Metallsalze und lösliche niedrigmolekulare Spaltprodukte (diese besitzen eine hohe Absorption bei 280 nm), zu beseitigen. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet, um reines Orgotein als Feststoff zu erhalten. Hierbei kann in der in der OE-PS 3 15 202 bzw. BE-PS 6 87 828 angegebenen Weise vorgegangen werden.

Pharmakodynamisch kann die antiinflammatorische Wirkung des reinen Orgoteins nach dem Bioversuch von Ungar bestimmt werden, bei welchem sich bei einer Dosierung von 0,4 mg/kg eine Inhibition der künstlich erzeugten Entzündung von zumindest 30% zeigen soll. Die Reinheit des Orgoteins kann nach der Dialyse durch die UV-Absorption bei 280 nm bestimmt werden, wobei sich für Am, ein Wert von weniger als 3,0, vorzugsweise etwa 2,3 ± 0,2, ergeben soll. Die Reinheit des Orgoteins kann auch durch Bestimmung des Tyrosins und des Tryptophans ermittelt werden, wobei für aus Rinderleber gewonnenes Orgotein etwa 2 Tyrosinreste und 1 Tryptophanrest gefunden werden sollen.

Für die Elektrophorese können mit einem dünnen Gel aus Argarose beschichtete Platten verwendet werden, wobei ein Puffer verwendet wird, der an Tris 0,02molar, an Glycin 0,15molar und an EDTA 0,0003molar ist und 0,01% Thymol und 0,01% Natriumazid enthält und auf

einen pH-Wert von 8,45 eingestellt ist. Bei einer Stromstärke von 4 mA und einer Spannung von etwa 280 bis 340 V ergab sich hierbei eine Laufzeit von 30 Minuten.

Entwickelt wird mit Amido Black oder Coomassie Blue; Probeabmessungen 1 λ bei einer 25 mg Protein pro ml enthaltende Lösung.

Bei quantitativer Durchführung der Gelscheiben-Elektrophorese werden angefärbte Elektrophorogramme auf Dünnschichtagarose in Streifen geschnitten, die Streifen auf Objektträger 1 χ 3 Zoll) gelegt, worauf mikroskopiert wird. Die einzelnen Objektträger werden in den Transporteur eines Spektrophotometers (Modell 240), eingesetzt, wobei die Ablesungen bei 595 nm vorgenommen werden, wenn mit Amido-Schwarz angefärbt wurde. Um maximale Auflösung zu erhalten wurde die kleinste Apertur (0,05 χ 2,3 mm) verwendet Die erhaltenen Aufzeichnungen werden durch Planimetrieren quantitativ ausgewertet. Alle Aufzeichnunger wurden zweifach und dreifach gemacht und wicher höchstens um + 0,5 cm² voneinander ab.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgender durch gleichzeitig Vergleichsversuche enthaltende Aus führungsbeispiele näher erläutert, gemäß welcher entsprechend Beispiel 1 der OE-PS 3 15 202 hergestell tes, im wesentlichen reines Orgotein als Ausgangsstof verwendet wurde.

Beispiel 1

Lösungen von im wesentlichen reinem Orgoteir (Reinheit etwa 90%) in 0,005-m Glycin-Puffer vor pH = 8,5 und mit einem Gehalt von 0,9% NaCl, welche Lösungen 5 mg Protein pro ml enthielten, wurden in i reine Glasgefäße gleicher Größe pipettiert. Da; verwendete Orgotein enthielt 10,5% langsam wandern de Fremdproteine, ermittelt aus einem mit Amido Blacl· entwickelten Elektrophorogramm. Das Gefäß Nr. 1 wurde zu Vergleichszwecken verwendet, während di( Gefäße 2 bis 5 samt Inhalt 15,30,45 bzw. 60 Minuten au 70°C erhitzt wurden.

Im Anschluß daran wurden die Lösungen, einschließ lieh der Vergleichszwecken dienenden Lösung, durch ein Millipore-Filter filtriert, worauf der Proteingehal des klaren Filtrats durch Biuret-Reaktion bestimm wurde. Jede der Eprouvetten enthielt

0,5 ml filtrierte Orgoteinlösung,
0,5 ml Pufferlösung,
1,5 ml Biuret-Reagens.

Die erhitzten Proben wurden auf Dünnschicht agarosegelen elektrophoretisch geprüft. Langsam wan dernde Stoffe und den Hintergrund bildende Stoffi wurden vom Orgotein beim Erhitzen auf 70°C währen« 15 Minuten in einem gewissen Ausmaß und zu einen größeren Ausmaß bei Erhitzen auf 70⁰C während 3' Minuten entfernt. Durch Erhitzen der Proben auf 70°( während 45 bis 60 Minuten gelang es, diese Verunreini gungen vollständig zu entfernen, was dadurch deutlic wurde, daß auch der Hintergrund des Elektrophorc gramms wesentlich klarer war.

Nachdem die Eprouvetten 15 Minuten auf 37°( erhitzt worden waren, wurden die Eprouvetten gege eine Blindprobe aus Pufferlösung bei 555 nm geprüf Die Absorption der Orgoteinlösungen bei 555 nm steh in direkter Linearer Beziehung zur Konzentration de Orgolcins in der Lösung, wie die folgende Tabelle zeigt

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Konzentration	Absorption	Konzentration	Absorption
des Proteins	bei 555 nm	des Proteins	bei 555 nm
in mg/m!		in mg/ml
0,2	0,0207	1,2	0,124
0,4	0,0415	1,4	0,145
0,6	0,062	1,6	0,166
0,8	0,083	1,8	0,186
1,0	0,103	2,0	0,207

Der Gesamtverlust an Protein während der Wärmenachbehandlung kann aus der vor und nach der Wärmebehandlung bestimmten Absorption derselben bei 555 nm ermittelt werden. Der Gesamtverlust an Protein in % der ursprünglich vorliegenden Menge wurde aus folgender Formel errechnet:

(Proteinkonzentration nach dem Erhitzen) · 100
ursprüngliche Proteinkonzentration

Der bei den obigen Versuchen ermittelte Proteinverlust während der erfindungsgemäßen Wärmebehandlung ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Erhitzungs- Λ 555 Protein- Proteinbedingungen konzentration verlust

(aus Eichkurve) in %

in mg/ml

Blindversuch
15 min
bei 70⁰C
30 min
bei 70^DC
45 min
bei 7OX
60 min
bei 70"C

0,254
0,205

0,2000

0,189

2,5
2,0

1,95
1,85
1,85

0
20

22
26
26 10-⁴molar und an Zn^{+ +} 10-⁵molar war, gelöst, worauf die erhaltene Lösung so lange dialysiert wurde, bis die Sulfatreaktion negativ ausfiel und schließlich gefriergetrocknet wurde. Das gefriergetrocknete Produkt wurde in einer Menge von 10 mg Protein pro ml in 0,9% Kochsalz enthaltendem 0,005 Glycin-Puffer gelöst, wobei der ursprüngliche pH-Wert dieses Puffers von 0,5 auf 7,2 abfiel. Bei einer Probe wurde der pH-Wert mittels NaOH wieder auf 8,5 eingestellt. Die Proben wurden 1 Stunde auf die in der folgenden Tabelle angegebene Temperatur erhitzt.

Beim Erhitzen der Proteinlösungen auf 70°C während 60 Minuten ergab sich ein Proteinverlust von 26%. Da das eingesetzte Orgotein etwa 10% Fremdproteine enthielt, ergibt sich damit ein Verlust von 16% des Orgoteins durch eine Wärmebehandlung bei 70°C während 45 b:-:w. 60 Minuten.

Um einen Vergleich durchführen zu können, wurden die Arbeitsbedingungen beim Erhitzen der im Zuge der Herstellung von im wesentlichen reinem Orgotein vorliegenden Lösung von Proteinen verschärft, wobei statt 20 Minuten auf 60°C 1 Stunde auf 70°C erhitzt wurde. Entfernte man aus der so behandelten Lösung die ausgefällten Proteine, konnte bei elektrophoretischer Prüfung der klaren Lösung Orgotein nur mehr in geringen Mengen festgestellt werden.

Um zu erfahren, ob im Zuge der Herstellung von im wesentlichen reinem Orgotein (vgl. OE-PS 3 15 202 bzw. BE-PS 6 87 828) eine nach dem ersten Erhitzen jedoch noch vor der Gel-Filtration durchgeführte Wärmenachbehandlung brauchbare Ergebnisse liefert, wurde der bei einer Ammonsulfatkonzentration von 45 bis 65% entstandene Niederschlag 60 Minuten auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Dieser Niederschlag, welcher unmittelbar vor der Gel-Filtration anfällt, stellt ein Zwischenprodukt dar, das etwa 20% Orgotein enthält. Dieser Niederschlag wurde in 0,025-m Tris-Glycin-Puffer von pH 7,0, welcher an Mg⁺ * 10 'molar, an Cu ' ·

Aussehen Absorption

Λ 280 Λ 680

-4555

Vergleich

6O⁰C

65"C

70⁰C

70^DC (pH 8,5)

klar
trüb
trüber
sehr trüb
sehr trüb

0,74 1,00 1,22 1,22 1,10

0,025 0,054 0,078 0,095 0,060

0,085 0,083 0,085 0,070 0,083

Unter Berücksichtigung von Λ280, Λ555 (Biuret) und /Wet) (Trübung) (es handelt sich um die Absorptionen bei 280,555 bis 680 nm) und des Aussehens des Elektrophorogramms auf Dünnschichtagarose (30 Minuten in 0,02-m Tris-Glycin-Puffer von pH = 8,45 bei 3,5 mA und 280 bis 340 V, wobei 1 λ oder 2 λ von Lösungen einer Konzentration von 10 mg/ml verwendet wurden) scheint eine Arbeitstemperatur von 70° C sowohl bei einem pH-Wert von 7,2 als auch bei einem pH-Wert von 8,5 das Optimum darzustellen. Im Anschluß wurden folgende quantitativen Versuche vorgenommen.

Je 200 mg des obenerwähnten, etwa 20% Orgotein enthaltenden Zwischenproduktes wurden in je eines von zwei sauberen Glasgefäßen eingebracht. Das Zwischenprodukt wurde in einem Fall in 20 ml eines 0,9% Kochsalz enthaltenden 0,005-m Glycin-Puffers von pH = 8,51 gelöst, wobei der pH-Wert auf 7,6 absank. Im anderen Fall wurde das Zwischenprodukt in 20 ml eines 0,2 Gew.-% Kochsalz enthaltenden 0,005-m Glycin-Puffers gelöst, dessen pH-Wert zuvor mit 0,1-m NaOH auf 10,0 eingestellt worden war, wobei der pH-Wert während des Auflösens auf 9,5 absank.

Jede der beiden Proteinlösungen wurde eine Stunde auf 70°C erhitzt, wobei beide Lösungen milchigweiß getrübt wurden, jedoch kein Niederschlag entstand Beim Kühlen der Lösungen auf 5° C in einem Eisbac entstand am Rand der Glasgefäße ein gelartige! Material, wobei jedoch die Proteinlösungen trüb blieber und kein Niederschlag festgestellt werden konnte.

Die Proteinlösungen wurden sodann durch eii Versapore-Filter filtriert, wobei jedoch das Filtrat nacl vvie vor trüb blieb und am Versapore-Filter lediglicl einige Stücke des gelartigen Materials zurückblieben.

Sodann wurde jedes der Filtrate über Nacht gegei entsalztes Wasser dialysiert. Nach nochmaligem Aus tausch des entionisierten Wassers war die Leitfähigkei des zur Dialyse verwendeten Wassers vemachlässigba jedoch waren die Proteinlösungen nach wie vor trül wobei noch immer kein Niederschlag fcstgestel werden konnte. Es wurde eine weitere Stunde dialysier wobei das entsalzte Wasser nochmals ausgetauscl wurde. Nunmehr hatte sich ein Niederschlag gebilde Jede der Proteinlösungen wurde nunmehr über ei Millipore-Filter filtriert, wobei klare Filtrate erhalte wurden, die anschließend gefriergetrocknet wurden.

21 Oi

Ausbeute an Protein aus der mit Puffer von pH = 8,5 angesetzten Lösung

23 mg oder

23
200

100 = 11,5%

Ausbeute an Protein aus der mit Puffer von pH = 10 angesetzten Lösung

17 mg oder

17
ÜÖÖ

100 = 8,5%

Unter Verwendung der so erhaltenen Produkte hergestellte Elektrophorogramme zeigten, daß das durch Erhitzen in einem Puffer von pH = 8,5 erhaltene Produkt nunmehr wesentlich reiner und praktisch frei von langsam wandernden Stoffen war. Die Ausbeute war jedoch niedrig und betrug nur 11,5%. Da die Gesamtausbeute bei Überführung des bei einer Ammonsulfatkonzentration von 45 bis 65% erhaltenen Niederschlags durch zweimalige Gel-Filtration über Sephadex in reines Orgotein etwa 10% beträgt und bei Vorschaltung eines nochmaligen Erhitzens vor der Gel-Filtration die Ausbeute an reinem Orgotein nicht mehr als 3 bis 4%, also in der Regel weniger als V₃ der normalerweise erzielbaren Ausbeute beträgt, ist ein

nochmaliges Erhitzen eines Orgotein enthaltenden Zwischenproduktes vor der Gel-Filtration ohne Vorteil. Demgegenüber werden durch nochmaliges Erhitzen eines im wesentlichen reinen Orgoteins nach der Gel-Filtration über Sephadex die langsam wandernden Verunreinigungen und die den Hintergrund des Elektrophorogramms erzeugenden Verunreinigungen mit einem Verlust von nur etwa 10 bis 25% an Orgotein beseitigt.

IO

Beispiel 2

LJm den Einfluß der erfindungsgemäßen Wärmebehandlung auf die Absorption des Orgoteins bei 280 nm (A280) zu bestimmen, wurden 100 mg im wesentlichen reinen Orgoteins in 40 ml eines 0,9% Kochsalz enthaltenden 0,005-m Glycin-Puffers von pH = 8,5 gelöst, womit eine 2,5 mg Orgotein pro ml enthaltende Lösung erhalten wurde, die sodann 45 Minuten auf 70° C erhitzt und schließlich zwecks Abtrennens des Niederschlages zentrifugiert wurde.

Die nach dem Zentrifugieren verbleibende Flüssigkeit wurde schließlich noch über ein Millipore-Filter filtriert, wobei die Absorption des Filtrats bei 555 und 280 nm (^555 bzw. Λ₂8ο) bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angeführt.

Λ555 Λ555 Proteinkonz. .4280

Biuret korr.*) mg/ml

A 2811

korr.*

Unverdünnt	0,212	0,210	2,05
1 :4 verdünnt'	0,055	0,051	0,50
*) Cüvcttenkorrektur.
') Vor der Dialyse.

0,264

0,259

0,518'

Der Verlust an Protein betrug insgesamt 2,50 mg minus 2,05 mg = 0,45 mg, was einem Verlust von 18% entspricht. Durch Gelscheiben-Elektrophorese war der Gehalt des im wesentlich reinen Orgoteins an Verunreinigungen mit etwa 10% bestimmt worden, woraus sich ein Verlust von etwa 8% Orgotein während der Reinigung ergab.

In weiteren Versuchen wurde das Filtrat der erhitzten Pufferlösung eine Stunde gegen ein an Tris 0,03molaren und an Glycin 0,005molaren Puffer von pH = 7,8 welcher außerdem an Mg⁺+ 10~³molar, an Cu⁺ + 10-⁴molarundanZn^{4 +} 10-⁵molar war und 0,02% Natriumazid enthielt, dialysiert, worauf nochmals gegen entsalztes Wasser dialysiert, dann filtriert und schließlich gefriergetrocknet wurde. Die Absorption des Orgoteins bei 280 nm fiel nach der Dialyse und dem Gefriertrocknen beträchtlich, u. zw. auf 0,24 ± 0,02 pro mg Protein ab. Durch die Dialyse scheinen einige der bei 280 nm stark absorbierenden Verunreinigungen niedrigen Molekulargewichts entfernt worden zu sein. Bei anderen Proben von Orgotein betrug die nach einstündigem Erhitzen auf 70⁰C jedoch noch vor der Dialyse zu beobachtende Absorption bei 280 nm 0,2780 pro mg Protein. Anschließende Dialyse der klaren Flüssigkeit bewirkte keine nennenswerte Verringerung der Absorption bei 280 nm. Die Absorption einer weiteren Probe an Orgotein betrug nach dem Erhitzen und der Dialyse 0,252 pro mg Protein.

Der beim Erhitzen entstandene Niederschlag wurde in 0.1 ml 0,02-m Tris-Glycin-Puffer von pH = 8,45 verrieben, jedoch war dieser Niederschlag in diesem Puffer nicht nennenswert löslich. Im Anschluß wurden noch 0,4 ml eines 1 Gew.-% Saccharose enthaltender 0,1-m Tris-Gylcin-Puffers von pH = 10,6 zugesetzt wobei eine geringe Menge des Niederschlags in Lösung zu gehen schien. Nach dem Abzentrifugieren des nich gelösten Niederschlags wurde die klare überstehend« Flüssigkeit der Elektrophorese unterworfen, wobei au der Intensität der mit Coomassie Blue vorgenommene! Entwicklung auf eine Proteinkonzentration von etwa

0,5 mg
3 ml

= 0.17 mg/ml

geschlossen werden mußte. Hätte sich der Niederschla zur Gänze gelöst, dann hätte die Konzentration di Lösung 1,8 mg/0,5 ml = 3,6 mg/ml betragen müssen. 1 sind somit

0,17

100 = 4,7%

des Niederschlages gelöst worden.

Dem nicht in Lösung gegangenen Niederschi wurden 0,5 ml einer 0,01 η NaOH-Lösung zugesel wobei der gesamte Niederschlag in Lösung ging. Ein ; dieser Lösung hergestelltes Elektrophorogramm zei] nur nicht identifizierbare verwaschene Banden, wie für denaturierte Proteine typisch sind.

Claims

21 Ol Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von reinem Orgotein aus im wesentlichem reinen Orgotein, welches zäh s anhaftende wärmelabile Fremdproteine enthält, von welchen die meisten bei der Gel-Elektrophorese langsamer wandern als Orgotein und welche den Wert für A:_Mi einer Lösung von Orgotein wesentlich über 2,3±0,2 anheben, etwa das gleiche Molekülvolumen wie Orgotein besitzen, beim Erhitzen in Pufferlösungen auf 60⁰C während 10 bis 20 Minuten stabil sind und in Puffern, in Gemischen aus Puffern und organischen Lösungsmitteln und in Ammonsulfatlösungen etwa die gleiche Löslichkeit besitzen wie Orgotein, dadurch gekennzeichnet, daß zäh anhaftende Fremdproteine enthaltendes im wesentlichen reines Orgotein in einer ein zweiwertiges Metall mit einem lonenradius von 0,60 bis 1,00 Ä enthaltenden und einen pH-Wert von 1 bis 4 oder 6 bis 11 besitzenden Pufferlösung auf eine Temperatur von zumindest 65° C, bei welcher im wesentlichen reines Orgotein stabil ist, so lange erhitzt wird, bis der Wert für A™ einer Lösung des Orgoteins 2,3 ±0,2 beträgt, worauf die ausgefällten unerwünschten Proteine von der Lösung des Orgoteins abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmebehandlung einer Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins bei etwa 70°C während zumindest 30 Minuten durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins in einem einen pH-Wert von etwa 8,5 besitzenden Glycin-Kochsalz-Puffer warmebehandelt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung Mg <- + -, Cu + + - und Zn + + -Ionen enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine 5 bis 20 mg Orgotein pro Liter enthaltende Pufferlösung wärmebehandelt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins in einem Mg⁺+-, Cu⁺+- und Zn⁺+-Ionen enthaltenden Glycin-Kochsalz-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 8,5 während 45 bis 60 Minuten auf etwa 70° C erhitzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des im wesentlichen reinen Orgoteins in einem Mg⁺+-, Cu⁺⁺- und Zn⁺+-Ionen enthaltenden Tris-Glycin-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,8 während 45 bis 60 Minuten auf etwa 70°C erhitzt wird. 5,5

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Wärmebehandlung eine Lösung eines weitgehend unreinen Orgoteins in einer ein zweiwertiges Metallsalz mit einem lonenradius von 0,60 bis 1,00 Ä enthaltenden ho Pufferlösung auf eine Temperatur von mindestens 50°C. jedenfalls aber auf eine Temperatur unterhalb der bei der Wärmebehandlung eingehaltenen Temperatur, erhitzt wird, bis im wesentlichen die gesamten, jedoch noch nicht die gesamten wärmelabilen Fremdproteine, entfernt sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß während der zuerst vorzunehmenden Wärmebehandlung eine Temperatur von 60 bis 65° C und während der später vorzunehmenden Wärmebehandlung eine Temperatur von 65 bis 75⁰C eingehalten wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Orgoteins in einem einen pH-Wert von etwa 8,5 auiweisenden Glycin-Kochsalz-Puffer wärmebehandelt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8,9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mg⁺ -, Cu ⁺ + und Zn + +-Ionen enthaltende Pufferlösung verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Orgoteins in der Pufferlösung auf 5 bis 20 mg/ml eingestellt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des orgoteins in einem einen pH-Wert von etwa 8,5 besitzenden und Mg⁺+-, Cu+ + - und Zn⁺+-Ionen enthaltenden Glycin-Kochsalz-Puffer 45 bis 60 Minuten auf etwa 70° C erhitzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des Orgoteins in einem einen pH-Wert von etwa 7,8 aufweisenden und Mg++-, Cu++- und Zn++-Ionen enthaltenden Tris-Glycin-Puffer 45 bis 60 Minuten auf etwa 7O⁰C erhitzt wird.