DE2064296A1

DE2064296A1 - Verfahren zur Herstellung eines Inhi bitors pathologischer Prozesse und Ver wendung desselben

Info

Publication number: DE2064296A1
Application number: DE19702064296
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Villepreux; Jasmin Claude Paris; Mathe Georges La Norville; Raynaud Marcel Versailles; Chermann (Frankreich). P
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1969-12-31
Filing date: 1970-12-29
Publication date: 1971-07-15
Also published as: AT301749B; DE2064296C2; NL7019097A; CA956573A; FR2073293B1; FR2073293A1; JPS4940922B1; BE760727A; DK128054B; LU62332A1; CH533988A; GB1326928A

Description

PATENTANWALT

DR. HAN3 ULRICH MAY

D 8 MÖNCHEN 2, OTTOSTRASSE 1a ? Π R Λ ? 9 R

TELEGRAMME: MAYPATENT MÖNCHEN TELEFON C081O 0936 32

I-4-P-2/921 München, 2 9, Dez, 1970

B 3528 Dr.M./V

IHSTlIUT PASTEPR in Paris / grankreich

Verfahren sur Herstellung eines Inhibitors pathologischer Prozesse und Verwendung desselben,,

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors pathologischer Prozesse» welcher inabesondere die Entwicklung von Leukämien und anderen Krebakrankheiten hemmen kann-,

Die Erfindung betrifft ferner die nach diesem Verfahren erhaltenen Inhibitoren sowie die therapeutischen Anwendungen derselben bei der Behandlung von Leukämien und Krebakrankheiten beim Tier und beim Menschen»

Im Verlauf früherer Untersuchungen konnten die Erfinder bereite eeigen, dass der Mäuseleukämievirus (friend-Virus, Hauscher-Virus) in dem Niederschlag aktiviert vorliegt, der aus mit Polyäthylenglykol behandelten Aufbereitungen infisierter Rohzellen erhalten wird«

Diese Feststellung führte die Erfinder eu der Annahme, ·»

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-²- 206Λ296

mUeee ein Inhibitor vorhanden sein} der in der Roh -Aufbereitung die Virusalctivität hemmen kanne

Durch die Erfindung soll nan ein Verfahren aur Herstellung eines solchen Inhibitors geschaffen werden, eier benutzt werden kann, um leukämische oder andere krebsartige pathologische Prozesse,, insbesondere solche vom Typ der Leukämie, zu hemmen₀

Dieoe Aufgabe wird gemäss der Erfindung gelbst durch ein Verfahren zur Herstellung einen Inhibitors pathologischer Prozesse, welches im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Zellaufbereitung einer ersten Fällung in neutralem Milieu unterworfen wird, der erhaltene Niederschlag von der Überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die Flüssigkeit einer zweiten Fällung in aaurem Milieu miterivorfen und der durch diese zweite Fällung erhaltene Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt wird, welche ilen Inhibitor enthält,

Ein wirksamer Inhibitor kann naeh äiesera Verfahren, ausgehend von pathologischen Zellen, beispielsweise einer Suspension tierischer Zellen, die in vivo kultiviert und mit dem Leukämievirus infiziert sind, erhalten werdetn Es hat sich jedoch gezeigt, daß das Verfahren nicht nur unter Verwendung von infizierten Zellen, wie in äcn früheren Untersuchungen der Erfinder, sondern auch unter Verwendung von Zellen normaler, nicht pathologischer Gewebe wirksam durchgeführt werden kann₀

Gemäß den besonderen AuofUhrungsformen des erfindungagemößen Verfahrens besteht die Zcllzubereitung daher aus einer S us pen«·

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aion von Seilen» die

1. aus normalen (nicht pathologischen) Geweben, vorzugsweise lymphartigen Geweben»

2η au» in vitro-Külturen von aue uolchen Geweben gewonnenen Zellen,

3«, aus mit Viren, insbesondere einem Viroe vom Leukämietyp, infiEierten Zellkulturen erhalten wurden,

Bei dem erfind ungegemäßeη Verfahren kann die in neutralem IiI-U.eii durchgeführte ere te Fällung vorteilhafterweise bewirkt waröen, indem die Zelleubereltung mit einem Alkohol, insbesondere mit Polyäthylenglykol, in Berührung gebracht wird, wobei de:? Alkohol vorzugsweise mit einer Konsentration swisohen 'i. und 1C i»_% bezogen auf das Gemisch, angewandt wird.

Die naoh der ersten Fällung abgetrennte Flüssigkeit wird der zweiten Fällung unterworfen. Hierfür ist ein bevoreugtes Reagens die Silico- Wolframsäure mit einem llolverhältnie von 1 Silikation auf 12 WolframAtionen.

Die verschiedenen Stufen des Verfahrens werden im allgemeinen bei einer tiefen Temperatur durchgeführt, die «wischen -10⁰C und + 10⁰C, vorzugsweise «wischen 0 und 4⁰O liegt»

Die Erfindung umfaast ferner außer den duroh dieses Verfahren erhaltenen Inhibitoren, deren therapeutische Verwendungen but präventiven oder kurativen Behandlung tierischer oder menschlicher Leukämien oder von Sarcomen.

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Insbesondere konnte experimentell die Präventivwirkung Je« Inhibitors an Mäusen, denen zuvor eine hohe Dosis Leukömievirus injiziert worden war, und seine inhibierende Wirkung auf die ■Sarcoma »Umwandlung normaler MBusezellen, welche der Einwirkung des Mäusesarcomvirus von Moloney ausgesetzt waren, gezeigt werden,, .

Der erfindungsgemäß erhaltene Inhibitor ist jedoch verschieden vom Interferon und bekannten Interferon-Induktoren (synthetische Polyrlbonucleotlde, Komplexe von Nucleinsäure und Polysacchariden), deren antileukfimlsche Eigenschaften bereits nachgewiesen wurden,, Insbesondere besitzt der Inhibitor nicht die Artspe2ifitäit des Interferons« Beispielsweise hemmt der aus Mäusezellen extrahierte Inhibitor die Entwicklung des Sarcomvirus von Hous auf Hlihner-Flbrcjlastett,, Der Inhibitor hemmt in vi « tro die aarcomatöse Umwandlung, die durch sarcomatogene Mäuseviren hervorgerufen wird» welche auf normale Mäusefibro/iasten einwirken. Der Inhibitor wirkt, wenn er nach der Fixierung des "Virus an den Zellen, beispielsweise 2 bis 8 Stunden später, augesetzt wird, was beim Interferon nicht der Pail ist*

Die Erfindung wird im folgenden erläutert durch die Beschreibung von beispielhaften Ausfuhrungsformeno

Beispiel 1

Die als Ausgangsmaterial benutzte Zelleubereitung wird hier aus In vivo Kulturen von infizierten tierischen Zellen, genau-' er aus der Milz von leukämisehen Mäusen (die mit dem Friend· Virus infiziert sind) erhalten, die in einer physiologischen

Lösung suspendiert werden» Die Zellsuapension, welche etwa 100 mg (Gewicht in feuchten Zustand) pro Milliliter enthält, wird wiederholt zentrifugiert» um nach bekannten Methoden die intakten Zellen und die Zellbruchstüeke abzutrennen«, Man zentrifugiert beispielsweise zweimal nacheinander je 10 Minuten bei 5000 und anschliessend bei 10 000

Der so erhaltene Zellextrakt wird einer ersten Fällung unterworfen, die durch Zugabe de3 unter der Handelsbezeichnung "Carbövvax 6000" bekannten Polyäthylenglykols hervorgerufen wird, Da3 Polyäthylenglykol wird allmählich zur Zellzubereitung zugesetzt, bis seine konzentration im Gemisch 5 Grew_o# beträgto Nach 3-stUndigem Kontakt bei 4⁰C wird das Gemisch 20 Minuten mit 10 000 UpM bei 4⁰C zentrifugiert, um den durch die Reaktion gebildeten Niederschlag abzutrennen« Der Niederschlag wird verworfen«

Zu der durch die vorangehende Zentrifugierung vom Niederschlag getrennten liberstehenden Flüssigkeit wird dann ein gleiches Volumen 12-Wolframkieaelsäure zugefügt.. Im. beschriebenen besonder ren Fall wird dieses Reagenz aus den entsprechenden Natriumsalzen wie folgt hergsstelltj 26,7 g Na₃SiO,, 8 HgO und 397 g Na₂WO., 2 H₂O werden in 2,5 1 Wasser gelöst. 75 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zugesetzt, und es wird 5 Stunden lang am RUokfluß gekocht. Die erhaltene Lösung wird filtriert, dann abgekühlt und mit Vasser auf 5 1 aufgefüllte

Die Zugabe der Sillcowolframsöure eur Überstehenden Flüssigkeit

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BAD ORIGINAL·

der ersten Fällung bewirkt eine »weite Fällung, die bei einem pH in der Größenordnung von 1_fO eintritt„ Man läßt das Gemisch Über Nacht bei einer Temperatur von O bis 4⁰O reagieren,, Die Abtrennung des gebildeten niederschlage erfolgt dann, durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM während 30 Miauten bei einer Temperatur von 4⁰Co

Die nach diesem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch Zugabe von konzentriertem Alkali (Natriumhydroxydlösung) bis auf eisen pH von 7_t0 neutralisiert* Sie wiPd an-" schliessend durch Dialyse gegen destilliertes Y/asser gereinigt und insbesondere von Salzen befreit» die womöglich durch die Behandlung eingeführt wurden» Anschließend wird die Lösung lyephilisiert» Das erhaltene Produkt stellt den Roh-Inhibitor dar» Es kann anschließenden Reinigungen unterworfen werden«

Dieser Inhibitor wurde mit einer Dosis von 10 bis 100 Mikrograram 4 Tage vor einer verhältnismäßig hohen Dosis Leukämievirus Mäusen injiziert«, Die3e Virusdosis wurde so gewählt,, daß sie bei ^ 100 ?S der nicht geimpften Tiere eine Leukämie mit Splenomegalie, Anwesenheit von leukämischen Zellen im Blutkreislauf und Tod der Versuchstiere im Verlauf von 2 Monaten bewirkte» Keine dieser Polgen trat bei den Mäusen auf, welche den Rohinhibitor 4 Tage vor dem Virus erhalten hatten»

Beispiel 2

Es wurde in gleicher V/eise verfahren, wobei jedoch ZellBUspen-Bionen verwendet wurden, die nicht aus infizierten Zellen,

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BAD

sondern aus von normalen lymphartigen Geweben (insbesondere MiIa, Thyraua oder lymphatische Ganglien) erhalten und in vitro kultiviert gehalten wurden (gleichgültig ob es sich um erat gewonnene Zellkulturen oder weitergeaüohtete Stämme handelte), oder aus Zerkleinerungsprodukten oder ßxtrakten der glei-chen Gewebe, die vom Tier oder Menschen entnommen sein können»

Beispiel 3

An verschiedenen Zellsuspensionen wurden die gleichen Arbeitegänge wie im Beispiel 1 vorgenommen, wobei jedoch der Anteil des der Zubereitung zugesetzten Polyäthylenglykole «wischen 2 und 10 Gew₃«# verändert wurde α Be scheint, daß die besten Päl« lungsbedingungen bei Werten in der Größenordnung von 4 bis 6 % erhalten werden»

Ebenso wurde der Anteil Sllicowolframsäure verändert, welcher der bei der vorangehenden Stufe verbleibenden Überstehenden Flüssigkeit zugesetzt wurde, um die sweite Fällung zu bewirken. Insbesondere wurde ei'ne 12-Wolframkieseleäure benutzt, die wie im Beispiel 1 hergestellt worden war und in einem Verhältnis von 2 Volumen auf 1 Volumen der nach der Polyäthylenglykolfällung überstehenden Flüssigkeit und in verschiedenen anderen Verhältnissen zwischen O₉3 und 3 Volumen eugesetet wurde»

Durch Veränderung der Kon»entration der Silico-Wolframsäure und nicht nur der Menge der benuteten Lösung wird die molare Konzentration der iiilico-Wolframaäure in der behandelten Flüssigkeit verändert und zwar bis auf fUnffaoh höhere oder fünffach niedrigere Werte als im Beispiel 1,

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Beiojgiel^

Die Tabelle I fUh.^i verschiedene Versuchsergebnisse auf_f welche die antileakfrflieene Aktivität dös Inhibitors an Mäusen zeigen*

In alien Fallen besteht der Inhibitor aus der lyephilisierten überstehenden Flüssigkeit^ die nach der 12-7'olframkieselsöure-Fällung anfällt und aus einer Kultur von Zellen JLSV^ (mit dem Rauscher-Virus chronisch infizierten Milz- und Thy~ muszeilen von Mäusen) hergestellt wurde«, Die Mäuse erhielten diesen Inhibitor in verschiedenen Dosen im G-emiach mit dem Friend-Virus, dessen leukUmogene Wirkung₍. die je nach Versuch verschieden ist» in der Tabelle als Milfcdosis ("spieen dose") SDf-Q ausgedruckt ist»

Die Ergebnisse zeigen eine faet vollständige Inhibierungswirkung bei Inhibiterdosen von O₅25 bis 5 mg in den mit einem Virustiter 21 SD,.₍. durchgeführten Versuchen» FUr einen Titer Über 100 SD₅₀ ist die Inhibierung nicht vollständig, jedoch . beobachtet man eine deutliche Abnahme des mittleren Gewichts der Mils der behandelten Mäuse, wobei dieses Gewicht drei Wochen nach der Injektion der Virussuspension bestimmt wurde.

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TABELLE I

Inhlbi kor· Virua dösig mg

21

null

5 i

Durchschnitt a- Anzahl leummigewichte der Mil« scher Hau·« zur ng Anzahl behandelter

Mäuse

168 177 171 187 160

10/10 0/10 0/10 1/10 0/10

100

null

700

374

10/10

5/9

10

Qttll

425

182

10/10

1/10

72

null

918

211

10/Yo

2/9

135

0,10

Beispiel S

Tabelle II seiet die Ergebnisse von Untersuchungen.der Aktivität des Inhibitors ouf die Wirkung, welche der IMUaeBftYoomvlruatyp Moloney in vitro auf eabryonal· Mäuseflbroblasten ausübt. Der Inhibitor wer n%eh dem Verfehren des Beispiels 1 aus Mil«- und Thynussellen fön mit den Hauacher-Vlrus (JLSYe) chronisch

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BAD ORIQINAI.

infizierten Mäusen oder aus mit dem Mäuaesarcomvirua von MoIoney (MSV) chronisch infizierten Milzfibroblastön-Zellen hergestellt

Die Inhibitorwirkung wurde in vitro durch die Ansahl gebildeter Höfe (JJ¹U) gemessen- bis Ergebnisse »eigen, dafl der Inhibitor die Bildung dieser Höfe verhindert=,

'JPABELLE II

Herkunft Inhibitor« Zugesetzte*¹ Anzahl wiederge- Hemmung
doeie(ag) Virus fPU fundener Höfe i>

	2	216	1	99*5
	1	216	3	9β,6
JLSV₅	1	117	t	99,1.
	0,500	117	13	89, ί
HSV	2 1	328 328	83 130	69_ν3 57,1
HSV	ί 0.500	ns 128	6 32	95,3 75,0

1 772 O 100

0,1 772 183 76

BeliDltl 6

Die hier wieder^egebenen Versucheergebnise· Beigen, das* der Inhibitor auf den VSV Virus (Veeicular öto«otitle Viru«) in keiner Weise analog dem Interferon wirkt,

In diesen Untersuchungen wurden in JSaglt-M*di»a (lyoph^iertee (ji^öö-liediu·) kultivierte Zellta L mit 5 i> Kalbeeeru« versetzt, trypeinieiert. In ialoon-Plett·» werden 50 000 Zellen pro Looh

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für den Hierotest gegeben.

24 Stunden späte?, wenn die Zellen am Zusammenfließen sind, inkubiert man eic mit:

1 einer Inhibitorlösung, die aus JLSV^ - Zellen hergestellt ist und 1 mg des Produkts pro ml enthält, sowie anschließend mit Verdünnungen um den Paktor 2 bis auf t/16;

2. mit einer Lösung des Interferone der Vergleichsmäuse, die auf 1/1OO_S 1/200, 1/400, 1/eOO, 1/1600 verdünnt iet_r

2 Löcher pro Punkt»

An Ende von 24 stunden wechselt man das Milieu. Man gibt dann etwa 1000 TCIDr₀ von auf Zellen präpariertem VSV (Vesicular Stomntitis virus) au«

Als Kontrolle dienen Platten ohne Virus und Zellen mit dem Virus allein. Nach Verlauf von 24 bis 48 stunden liest man die Lyse ab» welche vcn 0 bis 3*- bewertet wirdc Die Ergebnisse der Tabelle III zeigen, daß der Inhibitor im Gegensatz zum Interferon keinerlei Schut'zwirfcung hat.

Die Abwesenheit dea Interferon-Effekts zeigt sich auch durch die

folgenden Tatsachen:

1* Eine einzige Injektion verhütet bei der empfindlichen Matts die Induktion von Leukämien durch den Friend- oder Rauscher-Virus und von Sarcomeu durch den M-MSV (Mäuee-Sareom-Virus)

2- Die Wirkung Beißt sich selbat_twenn das Produkt 4 Tage vorher injiziert wird_e während das Interferon nur eine kürzere Lebensdauer hat<■

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TABELLE III

Interferon	1/100 0	+ψ*	1/200 0	V4	ΐ/400 1/6C 0 +	1/1600
Inhibitor	1/2	O		1/8	1/16
Vergleichs» Virus
Vergleichs se Ilen

BEISPIEL 7

Einer Gruppe von 6 1 1/2 Monate alten Schweizer Mäusen werden 0_s15 ml einer 50 mg/ml von aus JLSVe Zellen hergestelltem Inhibitor enthaltenden Lösung injizierte

Eine Kontrollgruppe von 2 Mäusen erhält 0,15 ml 0,9 $ige NaCl-Lösungo

Nach Verlauf von 2_P 6 und 9 Stunden nach der Injektion des Produktes werden 2 Mäuse der ersten Gruppe getötete In dem durch Blutentzug erhaltenen Serum sucht man in dem im vorigen Beispiel beschriebenen System nach der Anwesenheit von Interferone. Die Verdünnungen des Serums sind 1/10, 1/20, 1_s40_e

Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV aufgeführt«. Sie eeigen» daß im Serum der behandelten Tiere keine Induaierung der Interferon-Synthese eintritt, sodaß der Inhibitor nicht einer Inter·

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feron induzierenden Substanz ("Interferon inducer") ähneln kann*

2ABELLE_IV

Serum Verdünnung Α[λο i/lO

Mit dem Inhibitor 2h

6h
9h

behandelte jauumj cu ψ+*

Kontrolle Serum
(0„9# NaCl) +++ +++

Kontrolle Zellen O

Kontrolle Virus +4+

Die 0?aboX'i.e V fUhrt experimentelle ErgebniaEje der Inhibitorwirkung auf die Friend-Leukämie bei der Maus fUr verschiedene Herkunft des Inhibitors auf, der nach dem Verfahren des Beispiels 1 entweder aus verschiedunen menschlichen Geweben (Tabelle V) oder aus verschiedenen tierischen Quellen hergestellt wurde„

BAD ORIGINAL

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VerdUnnungT"""**" """^TneaKTTleiä- Durch- "TnJizier- Herdes indizier- kämiaoher schnltta« te Inhi- kunft ten Prlend^leu- Mäuse zur An- gewicht der bltor- des Inküraiachen Plaemas isahl behandelter Milz (wa) dosis hibl-

^J tors

	10/10 β/9	486 345	O O	—-
ίο--	3/* O 1/10	229 168	5 5	menoch liehe Leuco- cyten.
5 Jf 4	4/10 2/10	297 234	5 5	mensch liche MlIa
	6/9 Χ/10	465 147	5 5	LHK₆
ΙΟ"³ 5.10-f 5,1ο"*⁴	0/7 0/10 4/10 0/ίΟ	148 130 267 164	5 5 I ί	JLGV₅
5_&1O^w4	10/10 10/10	722 438	O	. ι . ■ in
to"³	4/10 2/9	237 237	5 5	Normale Mils V. Ratten
10"* 5*1θ"⁴	6/10 3/10	299 221	5 5	Normale HiIa ν. Mausen
5*1G"⁴	10/IO 9/1.0	i 115 .307	O O
5,1Ο"⁴	0/10	143 173	5 5	Etth» rail a
	3/10 2/10	223 191	5	Affen- miläs
5.iO~⁴	1/tO 1/1 p	129 158	5 1	Kalbs- thyrnua

*) Kulturen von stammen normaler menschlicher Lymphocytes.

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BAD

Claims

" ΐ» ;iil"l'ü ^!=i" !■ !!JWIiJ¹I: .--■=■!.-. .■■-- !;■-. ■.:-

.Ji ^{η 1;} ?■ Ά t a η a ρ r Ii C h e

Ir. Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors pathologischer PrOKeSSe₉ dadurch gekennzeichnet, daß eine Zeil zubereitung einer ersten Fällung mit Polyäthylenglykol unterworfen wird, .der erhaltene Niederschlag von der Überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die Flüssigkeit einer zweiten Fällung mit Silico-Wolfram-Säure unterworfen und der bei dieser »weiten Fällung erhaltene Niederschlag von der liberstehenden Flüssigkeit abgetrennt wird, welche den Inhibitor enthält«

2» Verfahren noch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Silico-Wolfram-Säure mindestens su Beginn ein Molverhältnis von 1 Slllcation auf 12 Wolframationen enthält (12-Wolfram-Kieselsäure)₀

3« Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ZellKUbereitung eine Suspension von Zellen normaler Gewebe and insbesondere lymphartiger Gewebe istο

4- Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension aus Zellkulturen hergestellt ist, die von vom Tier oder Menschen entnommenen und in vitro kultivierten Geweben gewonnen sind₀

5, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelleubereitung aus mit einem Virus, insbesondere vom Leukämietyp, infizierten Zellkulturen erhalten wird.

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Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5₉ dadurch ge« kennzeichnet, daß die erste Fällung durch Zugabe von PoIyöthylenglyfcol bis zu einer Konsentration zwischen 2 und 10 56_e vorzugsweise zv/isohen 4 und 6 $>_% vorgenommen wird»

7ο Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6« dadurch gekennzeichnet, daß die Fällungen bei einer Temperatur zwischen ·» 10 und ♦" 1O⁰G, vorzugsweise etwa O bis 4⁰O, durchgeführt werden»

Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Inhibitors zur Verhütung und Behandlung von Leukämien und Sarcomen»

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