DE2655690A1

DE2655690A1 - Arzneimittelzubereitungen

Info

Publication number: DE2655690A1
Application number: DE19762655690
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Chermann; Claude Jasmin; Georges Mathe; Marcel Raynaud
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1975-12-10
Filing date: 1976-12-08
Publication date: 1977-06-23
Also published as: BE848836R; FR2334366A2; FR2334366B2

Description

5 Köln ι 7. Dezember 1976

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR), 13/ Rue Madeleine Michelis_f Neuilly sur Seine (Frankreich)

Arzneimittelzubereitungen (Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 24 35 746.8)

Gegenstand des Hauptpatents (Patentanmeldung

P 24 35 746.8) sind Heteropolyanionverbindungen mit antiviralen Eigenschaften/ insbesondere eine Wolfram- und Antimonverbindung/ die mit HPA 23 bezeichnet ist, und deren Herstellung insbesondere im Beispiel beschrieben wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen und Weiterentwicklungen des Gegenstandes des Hauptpatents.

Zur Herstellung der Verbindung HPA 2 3 in Form ihres Ammoniumsalzes wird eine wäßrige Lösung, die das Sb-Ion enthält, in der Wärme mit einer 1-molaren Natriumwolf ramat lösung umgesetzt. Das Reaktionsmedium wird im wesentlichen neutral gehalten, indem konzentriertes Ammoniumhydroxyd in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß das Reaktionsmedium farblos wird. Hierdurch wird das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt. Das Salz wird abfiltriert und in üblicher Weise aufgearbeitet.

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Telefon:(0221i 234541 -4 - TA-«:S. 23Ü7 dü|>a d 1-1- ;r„,-,ni D;.i'ir-.jl..-ni K-In

Die Reaktionstemperatur liegt unter der Siedetemperatur des Reaktionsmediums, z.B. bei etwa 8O⁰C. Die das Sb ion enthaltende wäßrige Lösung wird vorteilhaft durch Auflösen von SbCl₃ in gesättigter NH^Cl-Lösung hergestellt.

In der Hauptanmeldung werden ferner die antiviralen Eigenschaften des Produkts HPA 23 beschrieben, das insbesondere in vivo gegen leukomogene und sarkomatogene Viren wirksam ist.

Gemäß einem ersten Merkmal hat die Erfindung das Ziel, die Struktur des Produkts HPA 23, dessen Herstellung bereits in der Hauptanmeldung beschrieben wird, zu präzisieren. Wie Untersuchungen des Infrarot-Spektrums und des Raman-Spektrums ergeben haben, ist das Produkt HPA 23 nicht ein 5-Wolfram-2-antimoniat, sondern dieses Heteropolyanion hat die Strukturformel

Die Heteropolyanionverbindung gemäß der Erfindung ist somit eine Natrium-antimon(III)-wolfram(VI)-Verbindung. Es handelt sich somit gleichzeitig um eine Komplexverbindung und ein saures Salz. Die Verbindung kann als solche oder in Form von Ammoniumsalzen oder Metallsalzen, insbesondere in Form von Alkali- und Erdalkalisalzen vorliegen. Vorzugsweise hat das Produkt die Form des Ammoniumsalzes der Formel

Das Produkt kann ferner in Form zahlreicher Hydrate vorliegen. Alle hydratisieren Formen der Natrium-Antimon(III) wolfram(VI)-Verbindung/fallen in den Rahmen der Erfindung. In der bevorzugten Ausführungsform als Ammoniumsalz liegt die Verbindung insbesondere in Form eines Hydrats mit

8 Wassermolekülen vor.

/"Antimon(III)-wolfram (VI)-Sodat

Hinsichtlich der Struktur ist die erfindungsgemäß verwen-

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dete Heteropolyanionverbindung eine Natrium-9-antimon(III)-21-wolfram (VI)-Verbindung, die im Zentrum neun Antimonatome Sb und um diese Atome verteilt 21 Wolframatome enthält. Der charakteristische Wert des Verhältnisses r = W/Sb liegt somit bei etwa 2,4.

Die Erfindung umfaßt ferner alle isomeren Formen des oben genannten Heteropolyanions.

Unter die Erfindung fallen ferner nicht nur die vorstehend beschriebene Verbindung selbst, sondern auch Gemische, die durch Umwandlung der Verbindung unter dem Einfluß von Veränderungen des pH-Wertes erhalten werden. Die neue Heteropolyanionverbindung gemäß der Erfindung, d.h. die Natrium-9-antimon(III)-21-wolfram(VI)-Verbindung, ist bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7, d.h. in der Nähe des Neutralpunktes, stabil. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung dieser Verbindung als Arzneimittel.

Wie bereits erwähnt, kann die Heteropolyanionverbindung HPA 23 als solche oder in saurer Form verwendet werden. Vorzugsweise wird sie in Form von pharmazeutisch unbedenklichen Metallsalzen verwendet. Vorteilhaft werden die Alkali- oder Erdalkalisalze einschließlich der Ammoniumsalze verwendet. Die gebräuchlichsten Salze sind die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze. Hiervon werden die Ammoniumsalze bevorzugt.

Zur Herstellung der Natrium-9-Antimon(III)-21-wolfram(VI)-Verbindung in Form ihres Ammoniumsalzes wird eine wäßrige Lösung, die das Ion Sb enthält, heiß mit einer 1-molaren Natriumwolframatlösung umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhydroxyd in einer genügenden Menge, um das Reaktionsgemisch farblos zu halten, im wesentlichen neutral gehalten. Hierdurch wird das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt, das abfiltriert und anschließend in üblicher Weise behandelt wird.

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Die Reaktionstemperatur liegt unter der Siedetemperatur des Reaktionsgemisches, z.B. bei etwa 8O⁰Ci Die wäßrige Lösung, die das Ion Sb enthält, wird vorteilhaft hergestellt, indem SbCl₃ in einer gesättigten NH₄C1-Lösung gelöst wird.

Das Endprodukt ist das Natrium-9-antimon(III)-21-wolfram(VI)-ammoniumsalz, dessen pH-Wert in wäßriger Lösung bei etwa 6,7 liegt. Das Salz liegt in Form eines Hydrats der folgenden Formel vor:

)₁₈·8 H₃O

Fig. 1 zeigt das Infrarot-Spektrum der Heteropolyanionverbindung /NaSb₉ W Og₆JZ(NH₄)₁₈, die in Kaliumchlorid gelöst ist. Die charakteristischen Wellenlängen sind in der Abbildung genannt.

Fig. 2 zeigt das Raman-Spektrum dieser Verbindung im festen Zustand.

Bei pH 7,5 in einer gepufferten Lösung, die 0,5-molar an Tris und 0,5-molar an NaCl war, zeigte das Polarogramm des Produkts zwei Spannungen bei -1,11 und -1,22 V gegen eine gesättigte Kalomelelektrode.

Die Herstellung der Verbindung HPA 23 wird im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel Herstellung von /NaSb₉W₂₁Og_6-J(NH₄)_1Q-8 H₂O

Zu 125 ml einer auf 8O⁰C erhitzten wäßrigen 1-molaren Natriumwolframatlösung wird eine wäßrige Lösung gegeben, die das Sb -ion enthält und durch Auflösen von 11,4g SbCl₃ in 50 ml NH₄Cl erhalten worden ist. Unmittelbar vor Beendigung der Zugabe der das Sb -Ion enthaltenden Lösung wird konzentriertes Ammoniumhydroxyd in einer solchen Menge zugesetzt, daß das Reaktionsmedium farblos wird. Das ausgefällte Ammoniumsalz der Heteropolyanion-

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verbindung wird abfiltriert, mit verdünnter NH₄Cl-Lösung gewaschen und abschließend aus destilliertem Wasser umkristallisiert. Die erhaltene Verbindung besteht aus reinem Natrium-9-antimon(IIÖ-21-wolfram(VI)-ammoniumsalz. Die Verbindung liegt in wässriger Lösung in Form eines Tetrameren vor. Die wässrige Lösung hat einen pH—Wert von etwa 6,7. Die Verbindung ist in wässriger Lösung bei einem pH-Wert von etwa 7 beständig. Im natürlichen Zustand hat sie die Form eines weißen Pulvers, das in Wasser sehr leicht löslich ist. Das kristalline Produkt ist bei Raumtemperatur beständig und verändert sich nicht.

Für die pharmakologischen Versuche wird die Verbindung in physiologischer Kochsalzlösung, d.h. in einer 0,9%igen wässrigen NaCl-Lösung gelöst.

Das vorstehende Beispiel zeigt, daß das Produkt genau in der gleichen Weise, wie in der Hauptanmeldung beschrieben, hergestellt wird. Die vorliegende Zusatzanmeldung hat somit lediglich die Aufgabe, die Struktur der Verbindung HPA 23 zu präzisieren.

Die Erfindung umfaßt ferner Arzneimittelzubereitungen, die als Wirkstoff die Verbindung HPA 23 in Verbindung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten. In einer besonderen Ausführungsform sind die Arzneimittelzubereitungen gemäß der Erfindung in Form von injizierbaren Präparaten, z.B. in wässriger Lösung (physiologische Kochsalzlösung), bei einem pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes für die Injektion bei Mensch oder Tier formuliert.

Gemäß einem weiteren Merkmal ist die Erfindung auf Arzneimittelzutereitungen gerichtet, die in Kombination eine therapeutisch wirksame Menge HPA 23 und Interferon enthalten. In diesem Zusammenhang ist zu

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bemerken, daß frühere Untersuchungen (siehe Hauptpatent) gezeigt haben, daß HPA 23 nicht die Interferonbildung anregt.

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden,daß ein Synergismus zwischen HPA 23 und Interferon besteht. Dieser Synergismus wurde eindeutig an Mäusen nachgewiesen, die intraperitoneal 50 mg/kg HPA 23 und intraperitoneal oder intravenös 75.000 Internationale Einheiten Interferon (jeweils pro Maus) eine Stunde und sechs Stunden vor der subkutanen Impfung mit 100 DL,-Q-Dosen des Virus der Encephalomyocarditis (EMC) erhielten. Insbesondere wurde eine stark ausgeprägte Wirkung von HPA 23 auf das Präparat des Stamms VR 129 des EMC-Virus festgestellt, das ein Zonenphänomen zeigt. HPA 23 vermag somit die Interferonbildung zu verändern, wobei die Wirkung durch gewisse Viren, z.B. die EMC-Viren, ausgelöst wird.

Die pharmakologischen Eigenschaften des Produkts HPA werden ausführlich in der Hauptanmeldung beschrieben. Es erübrigt sich somit, erneut hierauf einzugehen. In der folgenden Beschreibung werden jedoch ergänzende Ergebnisse hinsichtlich der Wirkung von HPA 23 auf Infektionen genannt, die bei Mäusen durch Viren der Encephalomyocarditis (EMC) und der vesikulären Stomatitis (VSV) hervorgerufen werden. Diese Versuche wurden in vivo durchgeführt und bestätigen die bemerkenswerten Eigenschaften von HPA 23 als Antivirusmittel. In der Hauptanmeldung wurde bereits festgestellt, daß HPA 23 eine hohe antivirale Wirksamkeit in vitro gegen zahlreiche nicht-onkogene RNS- und DNS-Viren hat. Die nachstehend beschriebenen pharmakologischen Versuche wurden mit zwei Stämmen des EMC-Virus und einem Stamm des Virus der· vesikulären Stomatitis (VSV) durchgeführt.

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In-vivo-Versuche

Mäuse: CD-1-Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Alter von 4 bis 6 Wochen (gekauft bei Charles River, Elbeuf, Frankreich) wurden für alle Versuche verwendet.

Virus: Die von der American Type Culture Collection stammenden Stämme VR 129 und V 77 des EMC-Virus wurden verwendet. Die Mutterlösungen der beiden Stämme ATCC VR 129 und ATCC V 77 wurden aus Hirne>itrakten von

im

Mäusen nach einer einzigen Passage in vivo/Laboratorium hergestellt. Die Mäuse wurden mit dem Virus subkutan in einer Menge von 0,2 ml/Maus geimpft. Das Präparat des EMC-Virus VR 129, bestimmt durch subkutane

7 5 Impfungen, enthielt 10 ' DLt-j-j/0,2 ml, während die

Lösung des EMC-Stammes V 77 10⁷>° DL₅₀A),2 ^ml enthielt. Eine DL™ bei den Mäusen (subkutane Impfung) entsprach drei TCID₅₀ beim Stamm VR 129 und 10 TCID₅₀ beim Stamm V 77 bei Monoschicht-Kulturen von L-Zellen.

Eine Mutterlösung eines Indiana-Stammes der Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) wurde in L-Zellen der Maus hergestellt und hatte nach intranasaler Impfung

bei der Maus einen Titer von 10 LD₅₀/ml. Die intranasale Impfung wurde bei leicht mit Äther anästhesierten Mäusen vorgenommen, wobei 0,1 ml Virussuspension langsam tropfenweise in den äußeren Teil der Nase gegeben wurde. In den Versuch wurden Mäuse, die das Inoculum durch Inhalation aufgenommen hatten, einbezogen.

HPA 23: Das HPA 23 wurde nach dem im Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt. Es wurde unmittelbar vor dem Gebrauch in destilliertem Wasser gelöst und gewöhnlich intraperitoneal (i.p.) und bei gewissen Versuchen subkutan verabreicht.

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Toxizität von HPA 23 bei der Maus

Die akute Toxizität wurde durch einfache intraperitoneale Injektion von HPA 23 in zunehmenden Dosen bei CD-1-Mäusen (10 Tiere pro Dosis) bestimmt, die an fünf aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet wurden. Die subakute Toxizität v/urde durch Injektion von zunehmenden Dosen der Verbindung bei CD-1-Mäusen einmal täglich an fünf aufeinanderfolgenden Tagen bestimmt. Die Tiere wurden an den auf die letzte Injektion folgenden fünf Tagen beobachtet. Auf diese Weise konnten die akuten und subakuten DL_5Q-Werte für HPA 23 berechnet werden. Während der Durchführung der Versuche zur Bestimmung der akuten Toxizität war es ebenfalls möglich, die schwächste Dosis von HPA 23 zu bestimmen, die, ohne eines der Tiere zu töten, dennoch einen wesentlichen Gewichtsverlust verursachte.

Interferon

Murines Interferon wurde in Monoschichtkulturen von L-Zellen der Maus hergestellt, denen das mit UV-Licht deaktivierte Virus der Newcastle-Krankheit (J.S.Youngner, A.Scott, I.V.Hallum und W.R.Stinebring "Interferon production by inactivated Newcastle disease virus in cell culture and in mice", Journal of Bacteriology 92 (1966) 862) zugesetzt worden war. Die Präparate wurden eine Nacht bei pH 2 und anschliessend 48 Stunden mit dreimaligem Auswechseln des Zellkulturmediums dialysiert.

Vermehrung des Virus im Blut und Hirn von behandelten Mäusen und Vergleichsmäusen, die mit dem EMC-Virusstamm VR 129 infiziert wurden.

Um zu ermitteln, ob der Schutz von Mäusen, die mit dem EMC-Virusstamm VR 129 infiziert worden sind, einer Hemmung der Vermehrung des Virus durch HPA 23 entspricht, wurden zwei Gruppen von 30 Mäusen subkutan

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mit 20 DLc₀ des Virus geimpft. Eine Gruppe wurde mit HPA 23 behandelt (100 mg/kg i.p. eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem EMC-Virus), während die andere Gruppe, der destilliertes Wasser injiziert wurde, zum Vergleich diente. In jeder Gruppe wurde an 15 Mäusen die Mortalität während der auf die Injektion folgenden 10 Tage bestimmt. Titrationen des Virus wurden im Blut und Gehirn der anderen Mäuse 1, 2 und 3 Tage nach dem Beimpfen mit dem Virus vorgenommen, wobei für jeden Punkt vereinigte Proben von fünf Mäusen verwendet wurden. Die Titrationen wurden durch subkutane Impfung von Zehnerverdünnungen jeder vereinigten Probe bei ausgewachsenen CD-1-Mäusen unter Verwendung von 10 Mäusen für jede Verdünnung und gleichzeitig parallel hierzu in Röhrchenkulturen von L-Zellen vorgenommen, die unter den gleichen Verdünnungsbedingungen behandelt wurden. Die Mortalität der Mäuse und der signifikante zytopj^athogene Effekt in den Zellkulturen diente als Endpunkt für die Reaktion.

Statistische Analysen

2 Der X -Test wurde für die statistische Analyse des

Prozentsatzes der überlebenden Tiere angewendet. Der Wilcoxon-Test diente zum Vergleich der Überlebensdauern.

Ergebnisse Toxizität von HPA 23

Die akute Toxizität bei ausgewachsenen Mäusen wurde mit einer Dosis von 750 mg/kg HPA 23 ermittelt. Die schwächste Dosis, die einen wesentlichen Gewichtsverlust bei normalen Mäusen verursacht, wurde mit 250 mg/ kg i.p. ermittelt.

Wirkungen von HPA 23 auf Infektionen mit EMC und VSV

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen mit dem Stamm VR 129 des EMC-Virus zusammenge-

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stellt. Ein starker Schutz der Tiere wurde durch intraperitoneale oder subkutane Injektion von HPA 23 . eine Stunde vor dem Beimpfen mit etwa 20 DL^₀ des Virus pro Maus erzielt.

Unter Berücksichtigung einer gewissen Zahl von Einzelversuchen, deren Bedingungen in Tabelle I genannt sind, wurde die Dosis von 100 mg/kg i.p. als die wirksamste gewählt, obwohl die Dosis von 50 mg/kg i.p. noch eine

einmal hohe Wirksamkeit zeigte, wenn sie/vor dem Beimpfen mit dem Virus verabreicht wurde. Subkutane Verabreichungen von HPA 23 erwiesen sich ebenfalls als wirksam, aber diese Darreichungsart bildete nicht den Gegenstand eingehender Untersuchungen, da sie den Nachteil hatte, daß sie mit der für die Beimpfung mit dem Virus angewendeten Methode identisch war. Der Vergleich mit den Toxizitätszahlen von HPA 23 bei nicht infizierten Mäusen zeigt, daß die Dosis der Verbindung, die sich am regelmäßigsten als wirksam gegen die durch das EMC-Virus hervorgerufene Mortalität erwies, d.h. 100 mg/kg i.p., 7,5mal niedriger ist als die bei der Bestimmung der akuten Toxizität festgestellte DL₅₀ von HPA 23, das auf dem gleichen Wege verabreicht wurde (750 mg/kg i.pi) und 3,5mal niedriger ist als seine subakute Toxizität (350 mg/kg i.p.). Mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg wurde noch ein starker Schutz gegen EMC-Viren festgestellt, wenn die Mäuse die Verbindung 4 Stunden nach der Beimpfung mit dem Virus erhielten, jedoch wurde keine Wirkung festgestellt, wenn die Behandlung 24 Stunden nach der Impfung mit dem Virus einsetzte.

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Tabelle 1

Wirkung von HPA 23 auf die nen Mäusen durch den Stamm (subkutane Impfung mit dem

Infektion von ausgewachse-VR 12 ⁹ des EMC-Virus Virus)

Behandlung	Dosis	Verab	Überlebende	Statisti
mit HPA 23	von	rei	Tiere/Gesamt	sche
	HPA 23	chung	zahl der in	Bewertung
	mg/kg		fizierten
			Mäuse

Vergleichs—
tiere

1 Std.v.d.
Beimpfen mit
dem Virus

8/150 (5,3%)

25 i.p. 5/20 (25,0%) P<0,001

50 i.p. 24/35 (68,5%) P <0,001

100 i.p. 54/85 (63,5%) NS

100 s.c. 13/30 (43,3%) P<0,001

4 Std. nach
Beimpfung mit 50 dem Virus

24 Std. nach 50 Beimpfuna mit,
dem Virus

'100

i.p. 4/15 (26,6%)

i.p. 18/30 (60,0%)

i.p. 0/15 (0,0%)

i.p. 3/30 (10,0%)

NS

P <0,001 NS NS

NS: Statistisch nicht signifikant.

In Tabelle 2 sind die Ergebnisse eines Vergleichs zwischen den Stämmen V 77 und VR 129 des EMC-Virus hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegenüber der Schutzwirkung von HPA 23 bei Mäusen, die mit den Viren infiziert waren, zusammengestellt. Bei diesem Versuch war die Mortalität bei den Vergleichstieren, die mit dem Stamm VR 129 infiziert waren, geringer als bei der in Tabelle 1 angegebenen Versuchsdurchführung. Dennoch war die Wirksamkeit von HPA 23 mit einem ziemlich hohen Dosis/Wirkung-Verhältnis vergleichbar. Andererseits war bei den mit dem Stamm V 77 geimpften

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Mäusen der Prozentsatz der Mäuse, die bis zum Tag. +4 nach dem Beimpfen mit dem Virui überlebten, durch die Behandlung mit HPA 23 wesentlich gestiegen, aber selbst bei der Dosis von 100 mg/kg i.p. überlebte keine Maus bis zum Tag +10. Zwar schützte die Behandlung mit HPA 23 einen sehr hohen Anteil der Mäuse vollständig gegen den Tod durch den Stamm VR 129 (keines der Tiere starb als Folge der Infektion nach dem lo.Tag nach der Infektion), jedoch verlängerte sie die mittlere Überlebensdauer der mit dem Stamm V 77 infizierten Mäuse nur um einige Tage.

Tabelle 2

Wirkung von HPA 23 auf die Infektion von ausgewachsenen Mäusen mit den Stämmen VR 129 und V 7-7 des EMC-Virus

Virus- Dosis Mittlere Überlebende Tiere/ Statistische

Stamm v.HPA 23 Überle- geimpfte Tiere Bewertung

DL₅₀,(mg/kg bensdauer _{Tag +4 Tag +1Q}

_ .. ι.p. ) lage Impfung £ ^S*^c*

VR 129

77

vor fung dem	Beimp- mit Virus)	5 A
0		6,0
25		N D
50		N D
100		3,2
.0		3,3
25		kA
50		HA
K)O

10/15	V15	P	NB ■	■	<	0,05 *
12/15	5/15	P	<	<	0,01
14/15	8/15		<
15/15	12/15			NB
5/15	2/15	P	0,05*
6/15	0/15	P	0,01
11/15	0/15
13/15	0/15

♦Am Tag +4

NB = Auf Grund der hohen Zahl überlebender Tiere am Tag +10 nicht bestimmt.

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In Tabelle 3 sind die Ergebnisse eines Versuchs zur Ermittlung der Wirksamkeit der Behandlung mit HPA bei Mäusen zusammengestellt, die mit steigenden Mengen des Stamms VR 129 des EMC-Virus geimpft wurden. Auch hier wurde ein vollständiger Schutz einer großen Zahl der Mäuse erzielt, nachdem den Tieren 200 DLc₀ des Virus, d.h. lOmal mehr als die übliche Menge, verabreicht worden war,.während mit einem Inoculum von 2000 DL₅₀ keine längere Überlebensdauer als im Falle der Infizierung mit 20 DL₅₀ des Stamms V 77 festgestellt wurde. Bei diesen Versuchen wurde ebenso wie bei den in Tabelle 2 zusammengestellten Versuchen das HPA 23 aufeinmal eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem Virus verabreicht. Eine Schutzwirkung von HPA 23 gegen intranasale Infektion mit dem Virus der vesikulären. Stomatitis (VSV) wurde ebenfalls nachgewiesen (Tabelle 4). 30 bis 50% der mit HPA 23 behandelten Mäuse waren vollständig geschützt. Die restlichen Tiere hatten eine längere mittlere Überlebensdauer, die mit derjenigen der Vergleichstiere vergleichbar war.

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Tabelle 3

Wirkung von HPA 23 auf die Infektion von ausgewachsenen Mäusen mit dem Stamm VR 129 des EMC-Virus (steigende Inoculum-Menqen)

Dosis des	Dosis	0	Überlebende Tiere/	Tiere	Statisti
Virus	von TA,	100	geimpfte	Tag +10	sche Bewer
(DL / Maus7,	mg/kg i.p.	150	Tag +4		tung
Impfung	(1 Std.
S.C.	vor der
	Beimp-
	funq)		5/15
20	0	12/15	14/15	P <0,01
	• loo	I5/I5	I5/15	P <0,01
	150	I5/I5	O/I5
200	0'	5/I5	T/15	P < 0,01
	100	H/15	S/15	P < 0,01
	150	I5/I5	O/I5
2000	3/15	I/I5	P < 0,01*
	11/15	I/I5	p <- o,oi^K
	10/15

»Am Tag +4.

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Tabelle 4

Wirkung von HPA 23 auf die intranasale Infektion von ausgewachsenen Mäusen mit 80 DL₅₀ des Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) (Stamm Indiana)

Behandlung (1 Std. vor dem Beimpfen mit dem Virus)	Mittlere Überlebens dauer der gestorbenen Tiere	Tage	10 Tage nach der Impfung noch le bende Mäuse	Statisti sche Be wertung
Ohne Behandlung	5,9 +_ 2,0	t»	1/25
HPA 23	7,3 + 2,4		8/25	P<0,01
50 mg/kg i.p.		tt
HPA 23 100 mg/kg i.p.	8,2 +■ 2,3	auf	12/25	P<0,001
Fehlende Wirkung von HPA 23		den Gehalt	an EMC-
Virus im Blut und im Gehirn

Um festzustellen, ob der Schutz der mit HPA 23 behandelten Mäuse gegen letale Infektion durch den Stamm VR 129 des EMC-Virus auf eine Hemmung der Vermehrung des Virus in vivo zurückzuführen war, wurde der Virusgehalt im Blut und im Gehirn von Vergleichstieren und von behandelten Mäusen 1, 2 und 3 Tage nach der Beimpfung mit dem Virus bestimmt. Wie üblich bestand die Behandlung aus einer einzigen intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg HPA 23 eine Stunde vor der Infizierung. Die Titrationen wurden parallel an Mäusen und an Kulturen der L-Zellen durchgeführt (Genauigkeit der beiden Versuche _+ 0,5 log^._Q): Die beiden Methoden lieferten im wesentlichen gleiche Ergebnisse und ließen eine mäßige Virämie, die ihre Spitze am Tag +2 hatte, und einen starken Anstieg des Virus-Titers im Gehirn um 4 log^₀ zwischen dem Tag +2 und dem Tag +3 erkennen. Hinsichtlich des Virus-Gehalts im Blut und im Gehirn während eines beliebigen der drei bei diesem Versuch gewählten Intervalle wurde keine statistisch signifikante Differenz zwischen den behandelten Mäusen und

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den Vergleichstieren festgestellt: Die Zahl der Mäuse, die nicht zur Entnahme von Blut- und Gehirnproben getötet wurden und langer als 10 Tage überlebten, betrug 0/15 bei der Vergleichsgruppe und 11/15 bei der mit HPA 23 behandelten Gruppe. Ein hoher Anteil der letztgenannten Mäuse überlebte somit, obwohl der Virusgehalt in ihrem

η
Gehirn (etwa 10 infektiöse Einheiten pro ml) die gleichen Werte erreichte wie bei den Vergleichstieren, die zu 100% starben-.

Synergismus zwischen HPA 23 und Interferon

Bei Titrationen des Stammes VR 129 des EMC-Virus in Kulturen von L-Zellen wurde ein besonderes Zonenphänomen festgestellt, das im Falle des Stammes V 77 fehlte: Die zytopathogenen Effekte waren bis zu einer 1000-fachen Verdünnung der Virus-Suspension nicht sichtbar. Anschließend wurde die Möglichkeit des Synergismus zwischen dem Verfahren und exogenem Interferon der Maus untersucht. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Der Synergismus wurde bei Mäusen, die 50 mg/kg i.p. des Produkts HPA 23 und 75.000 internationale Einheiten Interferon i.p. oder i.v. pro Maus 1 Stunde bzw. 6 Stunden vor der subkutanen Beimpfung mit 100 DL-- des Virus erhalten hatten, eindeutig nachgewiesen.

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O CD OO ro

ο co co ο

Tabelle 5

Synergismus zwischen HPA 23 und murinem Interferon bei der mit EMC-Viren, Stamm ATCC VR 12 9, infizierten Maus.

Behandlung*	Ohne	HPA 23	HPA 23 50 mg/kg i.p.	HPA 23 100 mg/kg i.p.
Ohne Interferon		0/15	1/10	4/10
	3,1 ±	0,7 Tage	4,5 ± 1,9 Tage	6,8 +_ 2,6 Tage
Unverdünntes Interferon 75.000 I.E./Maus i.p.	7,1 _±	5/10 3,1 Tage	9/10 9,4 _+_ 1,8 Tage	Versuch·nicht durchgeführt
Interferon 1 : 3		3/10	Versuch nicht	7/10
25.000 I.E./Maus i.p.	5,5 _±	3,0 Tage	durchgeführt	8,2 +_ 2,7 Tage
Interferon 1 : 9		1/10	Versuch nicht	Versuch nicht
8000 I.E./Maus i.p.	4,4 +_	2,1 Tage	durchgeführt	durchgeführt
Unverdünntes Interferon		6/10	10/10	Versuch nicht
75.000 I.E./Maus i.v.	7,7 i	2,9 Tage	>10,0 Tage	durchgeführt

i?

•Behandlung mit Interferon: 6 Stunden vor dem Beimpfen mit dem Virus. Behandlung mit HPA 23: 30 Minuten vor dem Beimpfen mit dem Virus

cn

cn cn

CD

CD CD

Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Versuche bestätigen und erweitern die bereits gemachten Beobachtungen hinsichtlich der Schutzwirkung von HPA 23 in vivo gegen letale Virusinfektionen bei Mäusen. Die Behandlung der Tiere kurz vor oder nach der Beimpfung mit dem Enzephalomyocarditis-Virus (EMC) oder dem Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) mit Dosen von HPA 23, die weit unter den toxischen Dosen dieses konzentrierten Mineralions liegen, bei einer Darreichungsart, die von derjenigen, die üblicherweise für die Beimpfung mit dem Virus angewendet wird, verschieden ist, führte zu einer erheblichen Verlängerung der Überlebensdauer und zu einem vollständigen Schutz eines großen Teils der Mäuse.

Eine der interessantesten Schlußfolgerungen aus diesen Versuchen betrifft den Synergismus zwischen Interferon und der Verbindung HPA 23. Wie die Werte in Tabelle 5 zeigen, wurde dieser Synergismus im Falle der Infektion mit dem EMC-Virus festgestellt.

Die Ergebnisse weiterer Versuche an Mäusen, die mit EMC-Viren infiziert worden waren, sind in den folgenden Tabellen 6 und 7 zusammengestellt.

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T a b e 1 le

σ co ao ro σι

	Lebende	Mäuse	nach Infizierunq mit	^DL50	300 DL₅₀	3000 DL₅₀	EMC-Viren	300 DL₅₀ 3000 DL₅₀	15
Überlebens dauer, Tage	Vergleichsvirus	15	15	15		I5	15
	3 DL₅₀ 30	15·	15	15		15	15
0	15	15	15	15		15	15
ι	15	15	15	14		IS	11
2	15	12	5	5		14 ·	1
3	15	8	1	0		9	1
4	15 ■	6	0			7	1
5	14	5				7	1
β	14	5				7	1
7	15	5				7
8	15	5				7	1/15
9	15	5/15	0/15	0/15		7/15
10	15
überlebende am Tag +10	15/15


HPA 23 2 mg/Maus i.p. (verabreicht 30 Minuten vor Infizierung
30 DL₅₀
15
I5
15
15
15
• 15
14
14
14
14
14
14/15

i.p. = intraperitoneal

cn cn cn CD CD CD

Tage nach
Infektion

Tabelle, 7
Nach Infektion mit EMC-Viren überlebende Mäuse

VV IF IF IF

rein 1/3 1/9

i.p. i.p. i.p.

ABC D

IF HPA

rein 1 mg

i.v. i.p.

E F

HPA 23 2 mg i .p. G

IF rein+
ΗΡΑ 23
mg
H

IF 1/3+
ΗΡΑ 23
mg
K

IF rein + IV+HPA mg L

CO CO O

'
α

10

Endgültig
überlebende Tiere

.15

15
15
14

10

• 8

10
10
10
10

7 3 3 3

10
10
10
10
5

1
τ

10 10 10 10

9 8 6

6 6

0/15 5/10 3/10 1/10 6/10 1/10

10 10 10 10 10

10
10
10
10
10

9
9
9

CJ

9
9/10

, 1°

■ 10

10

■ 7

; 7
7
7/10

10

10/10

W = Vergleichsvirus
IP = Interferon

i.p. = intraperitoneal i.v. = intravenös

CD CO CD

In den vorstehenden Tabellen 5 bis 7 bedeuten:

A Vergleichsvirus

B murines Interferon,75000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.p. verabreicht.

C murines Interferon, 25000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.p. verabreicht.

D murines Interferon, 8000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.p.verabreicht.

E murines Interferon, 75000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.v. verabreicht.

F HPA-23, 1 mg/Maus

30 Minuten vor der Infizierung i.p. verabreicht.

G HPA-23, 2 mg/Maus

30 Minuten vor der Infizierung i.p. verabreicht.

H murines Interferon, 75000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.p. verabreicht, + 1 mg HPA-23/Maus, -30 Minuten.

K murines Interferon, 25000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.p. verabreicht, + 2 mg HPA-23/Maus, -30 Minuten.

L murines Interferon, 75000 Einheiten/Maus

6 Stunden vor der Infizierung i.v. verabreicht, + 1 mg HPA-23/Maus, -30 Minuten.

i.p. = intraperitoneal
i.v. = intravenös

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Claims

Patentansprüche

[I) Arzneimittelzubereitung für die Prophylaxe und Therapie von Virusinfektionen bei Mensch und Tier und von pathologischen Prozessen, die _auf Viren zurückzuführen sind, enthaltend als Wirkstoff die Heteropolyanionverbindung Natrium-9-antimon(III)-21-wolfram(VI) der Formel

—1P— WO/
2) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Heteropolyanionverbindung in Form eines Ammonium- oder Metallsalzes, insbesondere eines Alkali- oder Erdalkalisalzes, das in Form eines Hydrats vorliegen kann, vorhanden ist.
3) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff die Verbindung der Formel

(NH₄)

enthält.
4) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung in Form eines Hydrats der folgenden Formel vorhanden ist:

/NaSb₉W₂₁O_86-Z(NH₄)₁₈.8 H₃O
5) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem eine synergistisch wirksame Menge Interferon enthält.

ORIGINAL INSPECTED

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