DE3307799C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Isothiosemi­ carbazonen zur Bekämpfung von infektiösen Viren.

Verfahren zur Herstellung von Isothiosemicarbazonen werden in Bokin Bobai, (J. Antibact. Antifung. Agents) Bd. 9, Nr. 12, Seiten 551-561 (1981) beschrieben. Weiterhin wird hierin offenbart, daß gewisse der Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung als Verbindungen mit Antivirus­ aktivität beschrieben werden, eine schwache antibak­ terielle Aktivität aufweisen. Darüber hinaus ist von anderen Thiosemicarbazonen oder Amidinohydrazonver­ bindungen bekannt, daß sie Antivirusaktivität auf­ weisen (Kitasato Arch. of Exp. Med., Bd. 46, S. 73-81 (1973); ibid., Bd. 48, S. 23-30 (1975); ibid., Bd. 48, S. 125-130 (1975); ibid.; Bd. 48, S. 165-170 (1975); ibid., Bd. 48, S. 171-181 (1975); ibid., Bd. 50, S. 39-46 (1977); und Nature, Bd. 181, S. 352-353 (1958).

Aufgabe der Erfindung ist, eine neue Verwendung von Isothiosemicarbazonen zur Bekämpfung von infektiösen Viren, insbesondere zur Bekämpfung von Influenza-Viren, aufzuzeigen.

Die vorstehende Aufgabe wird durch die Verwendung von Isothiosemi­ carbazonen der allgemeinen Formel (I) oder einem Säure­ salz davon gelöst.

worin bedeuten:

R₁ ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Phenylgruppe, die unsubstituiert ist oder mit einer Alkoxygruppe, enthaltend 1 bis 12 Kohlenstoffatome, substituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenylethenylgruppe der allgemeinen Formel (II)

(worin R₅ und R₆, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogen­ atom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffato­ men bedeutet);
R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe;
R₃ eine Niedrigalkylgruppe oder eine Benzylgruppe; und
R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung der genannten Verbindung zur Bekämpfung von Influenzavirus.

Der hier verwendete Begriff "Niedrigalkylgruppe" be­ deutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffato­ men. Halogen schließt Fluor, Chlor, Brom und Jod ein.

Die erfindungsgemäß verwendeten Isothiosemicarbazone der all­ gemeinen Formel (I) kann man leicht und in hohen Aus­ beuten herstellen, indem man ein Aldehyd oder Keton der allgemeinen Formel

(worin jedes R₁ und R₂, die vorher für die allgemeine Formel (I) angegebenen Bedeutungen haben), mit einem Thiosemicarbazid der allgemeinen Formel

(worin R₄ die vorher in der allgemeinen Formel (I) angegebene Bedeutung hat) umsetzt, unter Erhalt eines Thiosemicarbazons der allgemeinen Formel

(worin jedes R₁, R₂ und R₄ die vorher angegebenen Be­ deutungen haben), worauf man dann das so gebildete Thiosemicarbazon mit einem Halogenid der allgemeinen Formel X-R₃ (worin X ein Halogenatom darstellt und R₃ die vorher angegebene Bedeutung hat) umsetzt. Die Iso­ thiosemicarbazone kann man auch herstellen, indem man eine Carbonylverbindung der oben erwähnten Formel

mit einem Isothiosemicarbazid der allgemeinen Formel

(worin R₃ und R₄ die vorher angegebenen Bedeutungen ha­ ben) umsetzt. Diese Verfahren zur Herstellung von Iso­ thiosemicarbazonen sind in der vorerwähnten Druckschrift Bokin Bobai (das in der Übersetzung lautet: "Journal of Antibacterial and Antifungal Agents"), Bd. 9. Nr. 12, S. 551-561 (1981) beschrieben worden.

Von den Verbindungen, die als wirksame Antiviruskompo­ nente bei den Zusammensetzungen und Anwendungsmethoden gemäß der Erfindung verwendet werden, sind zwar eine Reihe davon bekannte Verbindungen, wobei jedoch die Verbindungen mit den Nr. 6, 9, 11 bis 16, 31, 32, 41, 45, 46 und 47 in Tabelle 1 neue Verbindungen sind, die aus der Literatur noch nicht bekannt waren. Die vorerwähnte Literaturstelle offenbart, daß die bekann­ ten Verbindungen eine schwache antibakterielle Aktivi­ tät aufweisen. Andererseits ist es bisher nicht be­ kannt gewesen, daß Isothiosemicarbazone eine Antivi­ rusaktivität aufweisen. Aufgrund von Untersuchungen über die Aktivitäten von Isothiosemicarbazonen gegen Influenzavirus, unter Verwendung einer Hühner-Chorion­ allantois-Membran-Kulturmethode wurde festgestellt, daß Isothiosemicarbazone der vorstehenden allgemeinen Formel (I) eine große proliferationsinhibierende Aktivität und eine beachtliche virusabtötende Aktivi­ tät aufweisen.

Typische Beispiele für Isothiosemicarbazone, die als Antiviruskomponente bei den erfindungsgemäßen Zusam­ mensetzungen und Anwendungsmethoden verwendet werden können, werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt, sollen aber nicht den Umfang der vorliegenden Erfin­ dung begrenzen.

Tabelle 1

Synthesebeispiele für die erfindungsgemäß verwende­ ten Verbindungen und Beispiele, in denen deren Anti­ viruswirkung gezeigt wird, werden später angegeben. Die erfindungsgemäßen Antivirusverbindungen haben eine Antiviruswirkung, die größer ist als die der Adamantanamin-Hydrochlorid-Verbindungen.

Bei der Bewertung der akuten Toxizität (LD₅₀-Wert) der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden die Ver­ bindungen Nr. 4 und Nr. 25 der Tabelle 1 ausgesucht und auf ihre akuten Toxizitäten bei intraperitonealer Verabreichung an Mäusen untersucht. Die LD₅₀-Werte der Verbindungen 4 bzw. 25 betragen 200 mg/kg bzw. 150 mg/kg. Diese Werte zeigen, daß die erfindungsge­ mäßen Antivirusverbindungen sicher angewendet werden können.

Die Antivirus-Arzneimittel gemäß der Erfindung kön­ nen in verschiedenen Arzneimittelformen vorliegen, z. B. als Arzneimittel für eine orale Verabreichung, für Injektionen, wobei man übliche pharmazeutische Herstellungsverfahren anwendet. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen antiviralen Arzneimittel jedoch als oral zu verabreichende Arzneimittel zubereitet.

Die Dosis für die einem Individuum zu verabreichenden Arzneimittel hängt von dem Grad der Erkrankung, dem Gewicht und weiteren Bedingungen ab. Eine vorge­ schlagene antivirale Dosis für die erfindungsgemäßen Verbindungen liegt bei 10 bis 100 mg/Person und kann auf einmal oder in mehreren Einzelportionen pro Tag verabreicht werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Synthese­ beispiele und der Beispiele, in denen die Anwendbar­ keit untersucht wurde, gezeigt.

Zunächst werden einige Synthesebeispiele für Isothio­ semicarbazone und deren Säuresalze beschrieben. Die Verbindungsnummer entspricht der in Tabelle 1 angewen­ deten Numerierung.

Synthesebeispiel 1 Synthese von 4′-Chlorobenzaldehyd-S-methylisothio­ semicarbazon-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 6)

Zu einer Lösung von 1,41 g (0,01 Mol) 4-Chlorobenz­ aldehyd und 1,41 g (0,01 Mol) S-Methylisothiosemicarba­ zid-Hydrochlorid in 7 ml Methanol wurde Salzsäure gegeben, um die Lösung sauer einzustellen. Die erhal­ tene Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluß gehalten. Dann wurde sie noch warm filtriert. Das Filtrat wurde unter Berührung mit Luft abgekühlt und die abge­ schiedenen farblosen Nadeln wurden abgetrennt. Sie hatten einen Schmelzpunkt von 200 bis 201,5°C und die Ausbeute betrug 1,75 g. Die gleiche Substanz wurde weiterhin in einer Menge von 0,21 g erhalten, indem man sie unter Verwendung von Diethylether aus dem er­ haltenen Filtrat umkristallisierte. Somit betrug die Gesamtausbeute 1,96 g (75%).

Die Verbindungen mit den Nummern 1, 3, 4, 8, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 34, 35 und 37 wurden in gleicher Weise synthetisiert, wo­ bei jedoch anstelle von 4-Chlorobenzaldehyd die jewei­ ligen Carbonylverbindungen verwendet wurden.

Synthesebeispiel 2 Synthese von 2′,4′-Dichlorobenzaldehyd-S-butylisothio­ semicarbazon-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 9)

Zu einer Lösung von 1,90 g (0,01 Mol) 2,4-Dichloro­ benzaldehyd und 2,75 g (0,01 Mol) S-Butylisothiosemi­ carbazid-hydrojodid in 25 ml 85%igem Ethanol wurde zum Ansäuern der Lösung Salzsäure gegeben. Die erhal­ tene Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluß gehalten. Beim Abkühlen fiel ein Niederschlag aus, der unter Er­ halt von 2,9 g des Feststoffes filtriert wurde. Der Feststoff wurde in verdünntem heißen Ethanol gelöst und dann wurde eine wäßrige Lösung, enthaltend 1,7 g Bleiacetat-Trihydrat, zugegeben. Dabei fiel ein Nie­ derschlag aus. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit Salzsäure sauer eingestellt und konzentriert, bis sich Kristalle abschieden. Die Kri­ stalle wurden abfiltriert und aus 65%igem Ethanol umkristallisiert. Man erhielt farblose Körern mit einem Schmelzpunkt von 203 bis 205°C in einer Ausbeute von 1,6 g (54%).

Die Verbindungen entsprechend den Verbindungen mit den Nummern 15, 19, 32, 36 und 39, wurden jeweils in der gleichen Weise, wie im Synthesebeispiel 2 herge­ stellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von 2,4-Di­ chlorobenzaldehyd die entsprechenden Carbonylverbin­ dungen verwendet wurden.

Synthesebeispiel 3 Synthese von 3′,4′-Dichlorobenzaldehyd-S-methyliso­ thiosemicarbazon-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 11)

Zu einer Lösung von 2,6 g (0,15 Mol) 3,4-Dichloro­ benzaldehyd und 3,5 g (0,15 Mol) S-Methylisothio­ semicarbazol-Hydrochlorid in 25 ml 85%igem Ethanol wurde Salzsäure zum Ansäuern der Lösung gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluß gehalten. Beim Abkühlen schieden sich Kristalle ab, die abfiltriert wurden. Ein 4,2 g-Anteil der so erhaltenen Kristalle wurde im heißen verdünnten Ethanol gelöst und eine wäßrige Lösung, enthaltend 1,6 g Bleiacetattrihydrat, wurde zum Ausfällen eines Niederschlags zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert, das Filtrat wurde konzentriert und dann mit Salzsäure angesäuert. Da­ bei fielen Kristalle aus, die abfiltriert und aus Ethanol umkristallisiert wurden. Man erhielt 1,9 g (Ausbeute 74%) farblose Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 217 bis 218°C. Die entsprechende freie Base kann man aus dem konzentrierten Filtrat mit Diethylether extrahieren.

Die Verbindungen mit den Nummern 18, 20, 31, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 und 47 wurden in gleicher Weise wie in Synthesebeispiel 3 synthetisiert, wobei jedoch anstelle von Dichlorobenzaldehyd die entspre­ chenden Carbonylverbindungen verwendet wurden.

Synthesebeispiel 4 Synthese von Benzaldehyd-S-benzylisothiosemicarbazon- Hydrochlorid (Verbindung Nr. 2)

Zu einer Lösung von 1,79 g (0,01 Mol) Benzaldehyd­ thiosemicarbazon in 10 ml Methanol wurden 1,27 g (0,01 Mol) Benzylchlorid unter Rückfluß gegeben und der Rückfluß wurde 20 Minuten beibehalten. Nach dem Abkühlen wurden die abgeschiedenen Kristalle abfil­ triert, in Methanol gelöst und dann wurde zum Umkri­ stallisieren Diethylether zugegeben. Die abgeschie­ denen nadelförmigen, farblosen Kristalle hatten einen Schmelzpunkt von 180 bis 190°C. Ausbeute: 2,44 g (80%).

Die Verbindung Nr. 22 wurde in gleicher Weise wie oben hergestellt, wobei jedoch anstelle von Benzaldehyd­ thiosemicarbazon Acetophenonthiosemicarbazon verwen­ det wurde.

Synthesebeispiel 5 Synthese von 3′-Chlorobenzaldehyd-S-methyl-4-N-methyl­ isothiosemicarbazon-Hydrochlorid (Verbindung Nr. 5)

Eine Lösung aus 2,47 g (0,01 Mol) S-Methyl-4-N-methyl­ isothiosemicarbazid-hydrojodid und 1,40 g (0,01 Mol) 3-Chlorobenzaldehyd in 15 ml Methanol wurde mit Salzsäure angesäuert und 30 Minuten unter Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen wurde zu der Lösung Diethylether gegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Nieder­ schlag wurde abfiltriert, in einer kleinen Menge Ethanol gelöst und mit Natriumhydroxidlösung neutra­ lisiert. Die so gebildete freie Base wurde mit Di­ ethylether extrahiert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wurde Chlorwasserstoff hindurch­ perlen gelassen. Es fielen farblose Nadeln aus mit einem Schmelzpunkt von 191°C und in einer Ausbeute von 1,80 g (65%).

Die Verbindungen Nr. 7, 10 und 28 wurden in gleicher Weise wie oben hergestellt, wobei man jedoch die ent­ sprechenden Carbonylverbindungen verwendete und man erhielt sie in Form eines Hydrochlorids, in Form der freien Base bzw. als Hydrojodid.

Alle so hergestellten Verbindungen wurden durch Ele­ mentaranalyse und Infrarotspektren identifiziert.

Die Antiviruswirkung der erfindungsgemäßen Verbin­ dungen wird in den folgenden Beispielen gezeigt:

Untersuchungsbeispiel 1 Untersuchung der virusabtötenden Aktivität und der Virusproliferations-inhibierenden Aktivität unter Verwendung einer Hühnerei-Chorionallantois-Membran- Kulturmethode

Die nachfolgenden Versuche (1) bis (3) wurden zur Untersuchung der Antivirusaktivität unter Anwendung der bekannten Methode von T. Nishimura et al., Inter­ natioanl Congress of Chemotherapy in 1971, Seiten 325-327, durchgeführt.

(1) Toxizitätstest mit einer Hühnerei-Chorion­ allantois-Membran

Ein Stück einer runden Chorioallantois-Membran mit einem Durchmesser von 30 mm, wurde zu 0,9 ml einer Hank-ausgeglichenen Salzlösung (BSS) in einem Chorion­ allantois-Membran-Kulturrohr gegeben. Eine Reihe solche Rohre wurde hergestellt. In jedes Rohr wurde eine der Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindungen, zubereitet durch Serien-Zweifach-Verdünnung, in einer Menge von 0,1 ml zugegeben und dann wurde eine Schüt­ telkultur während 48 Stunden bei 36°C vorgenommen. Nach dem Inkubieren wurde die Chorionallantois- Membran mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen, in Trypan-Blau-Lösung während 1 Minute eingetaucht und dann gründlich mit PBS gewaschen. Die Konzentration, bei welcher zwei der vier Stücke der Chorionallantois- Membran, die für die jeweilige Verdünnungsstufe des Arzneimittels verwendet worden war, dunkelblau ge­ färbt war, wurde als 50%ige Toxizitätskonzentra­ tion bezeichnet.

(2) Versuch der virusabtötenden Wirkung in vitro

Ein gleiches Volumen (0,5 ml) an Influenzavirus, Adachi strain vom A₂-Typ (1000 MID₁₀₀/ml) wurde mit jeweils einer 0,5 ml-Lösung einer der erfindungsgemäßen Verbindungen, hergestellt durch eine Serien-Zehn­ fach-Verdünnung oder eine Serien-Zweifach-Verdünnung, vermischt und die Mischungen wurden 120 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde auf das 100fache verdünnt. Ein 0,2 ml-Anteil der ver­ dünnten Mischung wurde in ein Chorionallantois-Membran- Kulturrohr gegeben, in welches man zuvor 0,8 ml Hank- Lösung (BSS) gegeben hatte und dann wurde 48 Stunden bei 36°C eine Schüttelkultur durchgeführt. Nach dem Inkubieren wurde die Gegenwart von Hämaglutionation unter Verwendung des Hämaglutinationstestes untersucht und die 50%ige virusabtötende Konzentration wurde nach der Reed und Muench-Methode bestimmt.

(3) Virusproliferations-Inhibierungstest

Jeweils 0,1 ml-Anteile von Lösungen der erfindungs­ gemäßen Verbindungen, hergestellt durch Serien- Zweifach-Verdünnung, wurde in ein Chorionallantois- Membran-Kulturrohr gegeben, in welches man 0,8 ml Anteile von Hank-Lösung BSS zuvor gegeben hatte und die Chorionallantois-Membran wurde mit einem 0,1 ml- Anteil eines Influenzavirus Adachi strain vom A₂-Typ (100 MID₁₀₀/ml) inokuliert und dann wurde 48 Stunden bei 36°C eine Schüttelkultur durchgeführt. Nach dem Inkubieren wurde die 50%ige Virusproliferations- Inhibierungskonzentration in gleicher Weise wie vor­ her für den virusabtötenden Test beschrieben, in vitro bestimmt.

(4) Bestimmung des Virusabtötungsindex und des Virusproliferations-Inhibierungsindex

Der Index für die virusabtötende Wirkung und ein Virusproliferations-Inhibierungsindex wurden bestimmt, indem man die 50%ige toxische Konzentration der Verbindung zu der Chorionallantois-Membran durch die 50%ige virusabtötende Konzentration dividierte bzw. durch die 50%ige Virusproliferations-Inhibierungs­ konzentration.

Die Ergebnisse der vorerwähnten Versuche werden in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Antivirusaktivität von Isothiosemicarbazonen

Aus Tabelle 2 wird ersichtlich, daß die erfindungs­ gemäß eingesetzten Isothiosemicarbazone eine starke Viruspro­ liferations-Inhibierungsaktivität aufweisen und eine nie­ drigere Toxizität gegenüber Chorionallantois-Membran haben als Adamantanamin-Hydrochlorid, das als Kontroll­ probe verwendet wurde. Das zeigt, daß die verwendeten Verbindungen mit einer ausgezeichneten prolifera­ tionsinhibierenden Aktivität zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus weisen, im Gegensatz zu dem Fehlen einer virusabtötenden Aktivität bei Adamantan­ amin-Hydrochlorid, viele der eingesetzten Verbin­ dungen eine starke virusabtötende Aktivität auf. Deshalb sind die Isothiosemicarbazone gemäß der Erfindung sicherer in der Anwendung und man kann eine bessere Antiviruswirkung erwarten als bei dem als Kontroll­ probe verwendeten Adamantanamin-Hydrochlorid. Der hier verwendete Ausdruck "Antivirus" schließt sowohl eine virusabtötende Aktivität und/oder die Inhibierung von Virusproliferationen ein.

Claims (1)

1. Verwendung von Isothiosemicarbazonen der allgemeinen Formel (I) oder einem Säureaddi­ tionssalz davon: worin bedeuten:
   R₁ ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Phenylgruppe, die unsubstituiert ist oder mit einer Alkoxygruppe, enthaltend 1 bis 12 Kohlenstoffatome, substituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenylethenylgruppe der allgemeinen Formel (II) (worin R₅ und R₆, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet);
   R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl­ gruppe;
   R₃ eine Niedrigalkylgruppe oder eine Benzylgruppe; und
   R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkyl­ gruppe;
   zur Bekämpfung von infektiösen Viren.