DE3307799A1

DE3307799A1 - Isothiosemicarbazone enthaltende antivirusmittel und fungizide mittel

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Publication number: DE3307799A1
Application number: DE19833307799
Authority: DE
Inventors: Harumi Yokosuka Kanagawa Fukuyasu; Youzo Hachioji Tokyo Kazuno; Kuniomi Machida Tokyo Matsumoto; Tamio Kawasaki Kanagawa Nishimura; Hiroshige Machida Tokyo Toku; Tetsuro Yokohama Kanagawa Watanabe; Shin Yokohama Kanagawa Yoshii
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1983-03-04
Publication date: 1983-09-15
Also published as: GB2119650B; US4598095A; IT8347843A0; DE3307799C2; GB8305781D0; FR2522501A1; IT1170314B; FR2522501B1; GB2119650A; JPS58152815A; JPH0229046B2

Description

TAMIO NISHIMURA, KAWASAKI-SHI, KANAGAWA / JAPAN

Isothiosemicarbazone enthaltende Antivirusmittel und fungizide Mittel

Verfahren zur Herstellung von Isothiosemicarbazonen werden in Bokin Bobai, Bd. 9, Nr. 12, Seiten 551-561 (1981) beschrieben. Weiterhin wird in Bokin Bobai offenbart, dass gewisse der Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung als Verbindungen mit Antivirusaktivität beschrieben werden, eine schwache antibakterielle Aktivität aufweisen. Darüber hinaus ist von einigen Thiosemicarbazonen oder Amidinohydrazonverbindungen bekannt, dass sie Antivirusaktivität auf™ weisen (Kitasato Arch, of Exp. Med., Bd. 46, S. 73-81 (1973); ibid., Bd. 48, S. 23-30 (1975); ibid., Bd. 48, S. 125-130 (1975); ibid.; Bd. 48, S. 165-170 (1975); ibid., Bd. 48, S. 171-181 (1975); ibid., Bd. 50, S. 39-46 (1977); und Nature, Bd. 181, S. 352-353 (1958)

Aufgabe der Erfindung ist es, neue Antivirusmittel zur Verfügung zu stellen.

Sine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, mittels welcher man die Proliferation von Viren inhibieren kann und/oder die dazu fühig sind, Viren abzutöten. 5

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Verfahren aufzuzeigen zum Abtöten von infektiösen Viren, wie Influenza und/oder um deren Proliferation zu inhibieren.

Ein Ziel der Erfindung ist es auch, Zusammensetzungen aufzuzeigen, die in der Lage sind, die Entwicklung von pflanzenpathogenen Fungi zu verhindern oder diese zu vernichten.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Verfahren zu zeigen, mit denen man durch pflanzenpathogene Fungi verursachte Infektionen heilen und/oder verhindern kann. Weitere Ziele der Erfindung werden aus der Beschreibung erkennbar.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird eine neue Antiviruszusammensetzung zur Verfügung gestellt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Antivirus-usammensetzung, wie ein Arzneimittel, welches als antivirusaktive Komponente ein Isothiosemicarbazon der allgemeinen Formel (I) oder ein Säuresalz davon enthält:

R₁-C=N-NH-C=N-R. (I)

worin bedeuten:

R₁ ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine .Hydroxygruppe, eine Phenylgruppe, die unsubstituiert ist oder mit einer Alkoxygruppe, enthaltend 1 bis 12 Kohlenstoffatome, substituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenylethenylgruppe der allgemeinen Formel (II)

-CH=CH-

(II)

(worin R₅ und Rg, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet);

R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe;

R- eine Niedrigalkylgruppe oder eine Benzylgruppe; und
25

R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe.

Die Erfindung betrifft auch die Anwendung der Verbindungen der Formel (I) zum Abtöten oder zur Verhinderung der Proliferation von Viren, insbesondere von infektiösen Viren, wie dem Influenzavirus.

Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antifungizusammensetzungen zur Verfügung gestellt/ die eine Antifungi-wirksame Menge einer Verbindung der obigen Formel (I) enthalten und die in der Lage sind, Infektionen durch pathogene Fungi zu heilen und/oder zu verhindern. Weiterhin betrifft die Erfindung auch die Verwendung der Antifungi-wirksamen Verbindungen zum Verhindern, dass durch pathogene Fungi, insbesondere pflanzenpathogene Fungi, Infektionen verursacht werden oder sich ausbreiten.

Der hier verwendete Begriff "Niedrigalkylgruppe" bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Halogen schliesst Fluor, Chlor, Brom und Jod ein.

Die erfindungsgemässen Isothiosemicarbazone der allgemeinen Formel (I) kann man leicht und in hohen Ausbeuten herstellen, indem man ein Aldehyd oder Keton der allgemeinen Formel

R₁-C=O

^R2

(worin jedes R₁ und R₂ 1 die vorher für die allgemeine Formel (I) angegebenen Bedeutungen haben), mit einem Thiosemicarbazid der allgemeinen Formel

R₄-NH-C-NH-NH₂

S
30

(worin R₄ die vorher in der allgemeinen Formel (I)

angegebene Bedeutung hat) umsetzt, unter Erhalt eines Thiosemicarbazone der allgemeinen Formel

R₁-C=N-NH-C-NH-R
R₂ S

(worin jedes R-/ R_? und R₄ die vorher angegebenen Bedeutungen haben), worauf man dann das so gebildete Thiosemicarbazon mit einem Halogenid der allgemeinen Formel X-R₃ (worin X ein Halogenatom darstellt und R₃ die vorher angegebene Bedeutung hat) umsetzt. Die Iso thiosemicarbazone kann man auch herstellen, indem man eine Carbonylverbindung der oben erwähnten Formel

R₁-C=O

R₂

mit einem Isothiosemicarbazid der allgemeinen Formel

R₄-N=C-NH-NH₂

(worin R₃ und R₄ die vorher angegebenen Bedeutungen haben) umsetzt. Diese Verfahren zur Herstellung von Isothiosemicarbazonen sind in der vorerwähnten Druckschrift Bokin Bobai (das in der Übersetzung lautet: "Journal of Antibacterial and Anti'fungal Agents"), Bd. 9, Nr. 12, S. 551-561 (1981) beschrieben worden.

Von den Verbindungen, die als wirksame Antiviruskomponente bei den Zusammensetzungen und Anwendungsmethoden

gemäss der Erfindung verwendet werden, sind zwar eine Reihe davon bekannte Verbindungen, wobei jedoch die Verbindungen mit den Nr. 6, 9, 11 bis 16, 31, 32, 41, 45, 46 und 47 in Tabelle 1 neue Verbindungen sind, die aus der Literatur noch nicht bekannt waren. Die vorerwähnte Literaturstelle offenbart, dass die bekannten Verbindungen eine schwache antibakteriell Aktivität aufweisen. Andererseits ist es bisher nicht bekannt gewesen, dass Isothiosemicarbazone eine Antivirusaktivität aufweisen. Aufgrund von Untersuchungen über die Aktivitäten von Isothiosemicarbazonen gegen Influenzavirus, unter Verwendung einer Hühner-Chorionallantois-Membran-Kulturmethode wurde festgestellt, dass Isothiosemicarbazone der vorstehenden allgemeinen Formel (I) eine grosse proliferationsinhibierende Aktivität und eine beachtliche virusabtötende Aktivität aufweisen.

Typische Beispiele für Isothiosemicarbazone, die als Antiviruskomponente bei den erfindungsgemässen Zusammensetzungen und Anwendungsmethoden verwendet werden können, werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt, sollen aber nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen.
25

Tabelle 1

R₂'

^C=N-NH-C=N-Ri*

Verbindung Nr.

R2 R3

H CH-

Schmelz-Rit HX Punkt (⁰C)

H HC£ 169-171

Ci,

C£

[ρ

C£

^O

^{H HCÄ} 189-190

H CH, H HC£ 168

H HC£ 182

H CH₃ CH₃ HC£ 191

H HC£ 200-201

H CH₃ CH₃ HC£ 192-193

H CH:

H HC£ 199-200

Verbindung Nr.

10 11 12

13

15 16 17 18

Rl

C£

C£ OH

C£

Br

R2 R3

^{H CH}3

Schmelz-HX Punkt

H C₄H₉ H

H CH₃ CHi

(⁰C)
HC£ 203-205

92 - 95

H CH₃ H HC£ 217-218

H CH₃ H HC£ 182-183

H CH3 H HC£ 201-202

H CH₃ H HC£ 227-228

H Ci₄H₉ H HC£ 188-190

H CH₃ H HC£ 192-193

H CH₃ H HC£ 175-176

90-92

19 C₂H₅O-(O /- H C₄H₉ H HC£ 155-157

Verbindung Nr.

20

22 23 24

Rl

C₄H₉O

C£

R2 R3

H CH-

CH₃ CH₃

CH₃ -

C₃H₇ CH₃

CH₃ CH₃

	HX	Schmelz
Ru		punkt
	—	(⁰C)
H	HC £	96-97
H	HC £	203-204
H	HC £	211-212
H	HC £	191-192
H	223

25 26

CM^o)-

^CH3 ^CH3 ^H

²²²

C₂H₅ CH₃ H HC£ 188-189

27

C₃H7 CH₃ H HC£ 206-207

28 29 30 31

C£

Ci. Ci.

C₃H₇ CH₃ CH₃ HI 180-181

CH₃ CH₃ H HC £

CH₃ CH₃ H HC£

CH₃ CH₃ H HC£ 202-204

Verbindung Nr,

32

Ri

Cl Cl

Rz R3

Schmelzpunkt

(⁰C)

CH₃ C₄H₉ H HCJL 176-178

33

CH₃ CH₃ H HC£ 222

34

HO-(O

CH₃ CH₃ H HCi, 211-212

35

CH₃O

CH₃ CH₃ H HCi, 200-201

CH₃O

CH₃ C₁₄H₉ H HCJl 155-156

^CH3 ^CH3 ^{H HC£ 214}

38

C5H11O-/O)- CH₃ CH₃ H

86-87

39 C₅HnO-(O V CH₃ C₄H₉ H HC£ 178-180

40

CH₃ CH₃ H — 54-56

41 C₁₀H₂IO-(O y CH₃ CH₃ H HC£ 179-181

42

C£-(O yCH=CH- CH₃ CH₃ H — 129-131

43

CH=CH- CH₃ CH₃ H

99-101

Verbindung Nr.

R2 R3

Schmelzjx_ punkt CC)

44 C₁₊H₉O-ZoVcH=CH- CH₃ CH₃ H — 115-117

45 C₆H₁₃O-/ O V-CH=CH- CH₃ CH₃ H HC2, 182-183

46

- ^CH3 ^CH3

162-163

CH=CH- CH₃ CH₃ H HC£ 169-170

Synthesebeispiele für die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen und Beispiele, in denen deren Antiviruswirkung gezeigt wird, werden später angegeben. Die erfindungsgemässen Antivirusverbindungen haben eine Antiviruswirkung, die grosser ist als die der Adamantanamin-Hydrochlorid-Verbindungen.

Bei der Bewertung der akuten Toxizität (LD₅₀~Wert) der erfindungsgemässen Verbindungen wurden die Verbindungen Nr. 4 und Nr. 25 der Tabelle 1 ausgesucht und auf ihre akuten Toxizitäten bei intraperitonealer Verabreichung an Mäusen untersucht. Die LD_5Q-Werte der Verbindungen 4 bzw. 25 betragen 200 mg/kg bzw. 150 mg/kg. Diese Werte zeigen, dass die erfindungsgemassen Antivirusverbindungen sicher angewendet werden können.

Die Antivirus-Arzneimittel gemäss der Erfindung können in verschiedenen Arzneimittelformen vorliegen, z.B. als Arzneimittel für eine orale Verabreichung, für Injektionen, wobei man übliche pharmazeutische Herstellungsverfahren anwendet. Vorzugsweise werden die erfindungsgemässen antiviralen Arzneimittel jedoch als oral zu verabreichende Arzneimittel zubereitet.

Die Dosis für die einem Individuum zu verabreichenden Arzneimittel hängt von dem Grad der Erkrankung, dem Gewicht und weiteren Bedingungen ab. Eine vorgeschlagene antivirale Dosis für die erfindungsgemässen Verbindungen liegt bei 10 bis 100 mg/Person und kann auf einmal oder in mehreren Einzelportionen pro Tag verabreicht werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Synthesebeispiele und der Beispiele, in denen die Anwendbarkeit untersucht wurde, gezeigt. Ausser der Antivirusaktivität haben die erfindungsgemässen antiviralen Verbindungen auch, wie durch in vivo Versuche festgestellt wurde, eine ausgezeichnete Wirkung pflanzenpathogene Fungi zu inhibieren oder auszulöschen^ z.B» Reismehltau. In den späteren Beispielen werden auch Untersuchungen über die Anwendbarkeit und Brauchbarkeit dieser pestiziden, d.h. fungiziden Wirkung gezeigt«. Die Verbindungen der Formel (I) kann man zu flüssigen, pulverförmigen, benetzbaren Pulvern und ähnlichen Zusammensetzungen für die aussere Anwendung bei Pflanzen zubereiten. Andere übliche Trägermaterialien, oberflächenaktive Mittel und dergleichen sind dem Fachmann für die Herstellung von antifungalen Zusammensetzungen bekannt. Darüber hinaus wird in den nachfolgenden Beispielen der Bereich der antifungalen Dosierungen beschrieben.

Zunächst werden einige Synthesebeispiele für Isothiosemicarbazone und deren Säuresalze beschrieben. Die Verbindungsnummer entspricht der in Tabelle 1 angewendeten Numerierung.

Synthesebeispiel 1

Zu einer Lösung von 1,41 g (0,01 Mol) 4-Chlorobenzaldehyd und 1,41 g (0,01 Mol) S-Methylisothiosemicarbazid-Hydrochlorid in 7 ml Methanol wurde Salzsäure gegeben, um die Lösung sauer einzustellen. Die erhaltene Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluss gehalten. Dann wurde sie noch warm filtriert. Das Filtrat wurde unter Berührung mit Luft abgekühlt und die abgeschiedenen farblosen Nadeln wurden abgetrennt. Sie hatten einen Schmelzpunkt von 200 bis 201,5⁰C und die Ausbeute betrug 1,75 g. Die gleiche Substanz wurde weiterhin in einer Menge von 0,21 g erhalten, indem man sie unter Verwendung von Diethylether aus dem erhaltenen Filtrat umkristallisierte. Somit betrug die Gesamtausbeute 1,96 g (75 %) .

Die Verbindungen mit den Nummern 1, 3, 4, 8, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 34, 35 und 37 wurden in gleicher Weise synthetisiert, wobei jedoch anstelle von 4-Chlorobenzaldehyd die jeweiligen Carbonylverbindungen verwendet wurden.

Synthesebeispiel 2

l-S-but^lisothio-

Zu einer Lösung von 1,90 g (0,01 Mol) 2,4-Dichlorobenzaldehyd und 2,75 g (0,01 Mol) S-Butylisothiosemicarbazid-hydrojodid in 25 ml 85 %-igem Ethanol wurde zum Ansäuern der Lösung Salzsäure gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluss gehalten. Beim Abkühlen fiel ein Niederschlag aus, der unter Erhalt von 2,9 g des Feststoffes filtriert wurde. Der Feststoff wurde in verdünntem heissen Ethanol gelöst und dann wurde eine wässrige Lösung, enthaltend 1,7g Bleiacetat-Trihydrat, zugegeben. Dabei fiel ein Niederschlag aus. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das' Filtrat wurde mit Salzsäure sauer eingestellt und konzentriert, bis sich Kristalle abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert und aus 65 %-igem Ethanol umkristallisiert. Man erhielt farblose Körern mit einem Schmelzpunkt von 203 bis 205⁰C in einer Ausbeute von 1,6 g (54 %).

Die Verbindungen entsprechend den Verbindungen mit den Nummern 15, 19, 32, 36 und 39, wurden jeweils in der gleichen Weise, wie im Synthesebeispiel 2 hergestellt, mit der Ausnahme, dass anstelle von 2,4-Dichlorobenzaldehyd die entsprechenden Carbonylverbindungen verwendet wurden.
30

- 18 Synthesebeispiel 3

Zu einer Lösung von 2,6 g (0,15 Mol) 3 ,4-Dichlorobenzaldehyd und 3,5 g (0,15 Mol) S-Methylisothiosemicarbazol-Hydrochlorid in 25 ml 85 %-igem Ethanol wurde Salzsäure zum Ansäuern der Lösung gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluss gehalten. Beim Abkühlen schieden sich Kristalle ab, die abfiltriert wurden. Ein 4,2 g-Anteil der so erhaltenen Kristalle wurde im heissen verdünnten Ethanol gelöst und eine
wässrige Lösung, enthaltend 1,6 g Bleiacetattrihydrat, wurde zum Ausfällen eines Niederschlags zugegeben.

Der Niederschlag wurde abfiltriert, das Filtrat wurde konzentriert und dann mit Salzsäure angesäuert. Dabei fielen Kristalle aus, die abfiltriert und aus
Ethanol umkristallisiert wurden. Man erhielt 1,9 g

(Ausbeute 74 %) farblose Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 217 bis 218⁰C. Die entsprechende freie Base kann man aus dem konzentrierten Filtrat mit Diethylether
extrahieren.

Die Verbindungen mit den Nummern 18, 20, 31, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 und 47 wurden in gleicher Weise wie in Synthesebeispiel 3 synthetisiert, wobei
jedoch anstelle von Dichlorobenzaldehyd die entsprechenden Carbonylverbindungen verwendet wurden.

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Synthesebeispiel 4

Zu einer Lösung von 1,79 g (0,01 Mol) Benzaldehydthiosemicarbazon in 10 ml Methanol wurden 1,27 g (0,01 Mol) Benzylchlorid unter Rückfluss gegeben und der Rückfluss wurde 20 Minuten beibehalten. Nach dem Abkühlen wurden die abgeschiedenen Kristalle abfiltriert, in Methanol gelöst und dann wurde zum Umkristallisieren Diethylether zugegeben. Die abgeschiedenen nadeiförmigen, farblosen Kristalle hatten einen Schmelzpunkt von 180 bis 190⁰C. Ausbeute: 2,44 g (80 %).

Die Verbindung Nr. 22 wurde in gleicher Weise wie oben hergestellt, wobei jedoch anstelle von Benzaldehydthiosemicarbazon Acetophenonthiosemicarbazon verwendet wurde.

Synthesebeispiel 5
25

Eine Lösung aus 2,47 g (0,01 Mol) S-Methyl-4-N-methylisothiosemicarbazid-hydrojodid und 1,40 g (0,01 Mol) 3-Chlorobenzaldehyd in 15 ml Methanol wurde mit Salzsäure

angesäuert und 30 Minuten unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen wurde zu der Lösung Diethylether gegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde abfiltriert/ in einer kleinen Menge Ethanol gelöst und mit Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Die so gebildete freie Base wurde mit Diethylether extrahiert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wurde Chlorwasserstoff hindurchperlen gelassen. Es fielen farblose Nadeln aus mit einem Schmelzpunkt von 191⁰C und in einer Ausbeute von 1 ,80 g (65 %) .

Die Verbindungen Nr. 7, 10 und 28 wurden in gleicher Weise wie oben hergestellt, wobei man jedoch die entsprechenden Carbony!verbindungen verwendete und man erhielt sie in Form eines Hydrochlorids, in Form der freien Base bzw. als Hydrojodid.

Alle so hergestellten Verbindungen wurden durch EIementaranalyse und Infrarotspektren identifiziert.

Die Antiviruswirkung der erfindungsgemässen Verbindungen wird in den folgenden Beispielen gezeigt:

! ~ It.»

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Untersuchungsbeispiel 1

Die nachfolgenden Versuche (1) bis (3) wurden zur Untersuchung, der Antivirusaktivität unter Anwendung der bekannten Methode von T. Nishimura et al., International Congress of Chemotherapy in 1971, Seiten 325-327, durchgeführt.

(1) Toxizitätstest mit einer Hühnerei-Chorionallantois-Membran

Ein Stück einer runden Chorioallantois-Membran mit einem Durchmesser von 30 mm, wurde zu 0,9 ml einer Hank-ausgeglichenen Salzlösung (BSS) in einem Chorionallantois - Membran-Kulturrohr gegeben. Eine Reihe solche Rohre wurde hergestellt. In jedes Rohr wurde eine der Lösungen der erfindungsgemässen Verbindungen, zubereitet durch Serien-Zweifach-Verdünnung, in einer Menge von 0,1 ml zugegeben und dann wurde eine Schüttelkultur während 48 Stunden bei 36⁰C vorgenommen. Nach dem Inkubieren wurde die Chorionallantois-Membran mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen, in Trypan-Blau—Lösung während 1 Minute eingetaucht und dann gründlich mit PBS gewaschen. Die Konzentration, bei welcher zwei der vier Stücke der Chorionallantois-Membran, die für die jeweilige Verdünnungsstufe des

Arzneimittels verwendet worden war, dunkelblau gefärbt war, wurde als 50 %-ige Toxizitätskonzentration bezeichnet.

(2) Versuch der virusabtötenden Wirkung in vitro

Ein gleiches Volumen (0,5 ml) an Influenzavirus, Adachi strain vom Α,,-Typ (1000 MID.Q₀/ml) wurde mit jeweils einer 0,5 ml-Lösung einer der erfindungsgemässen Verbindungen, hergestellt durch eine Serien-Zehnfach-Verdünnung oder eine Serien-Zweifach-Verdünnung, vermischt und die Mischungen wurden 120 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschliessend wurde auf das 100-fache verdünnt. Ein 0,2 ml-Anteil der verdünnten Mischung wurde in ein Chorionallantois-Membran-Kulturrohr gegeben, in welches man zuvor 0,8 ml Hank-Lösung (BSS) gegeben hatte und dann wurde 48 Stunden bei 36⁰C eine Schüttelkultur durchgeführt. Nach dem Inkubieren wurde die Gegenwart von Hämaglutionation unter Verwendung des Hämaglutinationstestes untersucht und die 50 %-ige virusabtötende Konzentration wurde nach der Reed und Muench-Methode bestimmt.

(3) Virusproliferations-Inhibierungstest

Jeweils 0,1 ml-Anteile von Lösungen der erfindungsgemässen Verbindungen, hergestellt durch Serien-Zweifach-Verdünnung, wurde in ein Chorionallantois-Membran-Kulturrohr gegeben, in welches man 0,8 ml

Anteile von Hank-Lösung BSS zuvor gegeben hatte und
die Chorionallantois-Membran wurde mit einem 0,1 ml-Anteil eines Influenzavirus Adachi strain vom A₂-TyP (100 MID₁₀₀ZmI) inokuliert und dann wurde 48 Stunden bei 36°C eine Schüttelkultur durchgeführt. Nach dem
Inkubieren wurde die 50 %-ige Virusproliferations-Inhibierungskonzentration in gleicher Weise wie vorher für den virusabtötenden Test beschrieben, in vitro bestimmt.
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(4) Bestimmung des Virusabtötungsindex und des Virusproliferations-Inhibierungsindex

Der Index für die virusabtötende Wirkung und ein

Virusproliferations-Inhibierungsindex wurden bestimmt, indem man die 50 %-ige toxische Konzentration der
Verbindung zu der Chorionallantois-Membran durch die 50 %-ige virusabtötende Konzentration dividierte bzw. durch die 50 %-ige Virusproliferations-Inhibierungskonzentration.

Die Ergebnisse der vorerwähnten Versuche werden in
der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle 2

ANTIVIRUSAKTIVITÄT VON ISOTHIOSEMICARBAZONEN

Verbin dung Nr.	Toxizitätskon- zentration ge genüber einer Chorionallan- tois-Membran (mcg/ml)	5 0 %-ige Virus- 50 %-ige proliferations- virusabtöten- Inhibierungs- de Konzentra- konzentration _ tion (mcg/ml) (mcg/ml) /Index/* /Index?**	175	[ 5,7]
4	>1.000	18,5 [>54,0]	46	,4 [ 15,2]
8	706	19,8 [ 35,7]	31	,6 [ 19,9]
.9	632,5	115 [ 5,5]	46	,4 [ 15,2]
11	707	21,3 [ 33,2]	—	—
13	700	50 [ 14,0]	—	—
14 '	>1.000	15 [>66,7]	316	[ 3,2]
19	>1.000	39,7 [>25,2]	—	—
21	157,5	12,5 t 12,6]	215	[ 3,3]
24	707,5	25 [ 28,3]	215	[ 1,7]
25	354,2	14,4 [ 24,6]	—	—
28	793,8	63 Γ 12,61	100	t 1,8]
29	180	23,2 [ 7,7]	—	—
31	353,6	21,3 [ 16,6]

Fortsetzung Tabelle

Verbin dung Nr.	Toxizitätskon- zentration ge genüber einer Chorionallan- tois-Membran (mcg/ml)	50 %-ige Virus- 50 %-ige proliferations- virusabtöten- Inhibierungs- de Konzentra- konzentration _ tion (mcg/ml) (mcg/ml)/Index?* /Index?**	— ,
33	1.000	50 [ 20,0]	— —.
35	99,4	14_;2 [ 7,0]	—
37	88,8	12,5 [ 7,1]	— .—
38	>1.000	126 [> 8_;0]	145 [ 6,9]
41	1.000	>200 [< 5_;0]	170 [ 4,2]
42	710	100 [ 7,1]	316 [ 3,2]
43	>1.000	141 [ 7,1]	31,6 [>31,6]
46	>1.000	85,2 [>11,7]	648,8 [ 1,5].
Am	1.000	32,9 [ 30,4]

Adamantanamin-Hydrochlorid (Referenzverbindung)

Die Zahl in den Klammern stellt den Virusproliferations-Inhibierungsindex dar.

Die Zahl in den Klammern gibt den virusabtötenden Index an

Aus Tabelle 2 wird ersichtlich, dass die erfindungsgemässen Isothiosemicarbazone eine starke Virusproliferations-Inhibierungsaktivität aufweisen und eine niedrigere Toxizität gegenüber Chorionallantois-Membran haben als Adamantanamin-Hydrochlorid/ das als Kontrollprobe verwendet wurde. Das zeigt, dass erfindungsgeinäss Verbindungen mit einer ausgezeichneten proliferationsinhibierenden Aktivität zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus weisen, im Gegensatz zu dem Fehlen einer νirusabtötenden Aktivität bei Adamantanamin-Hydrochlorid, viele der erfindungsgemässen Verbindungen eine starke virusabtötende Aktivität auf. Deshalb sind die Isothiosemicarbazone gemäss der Erfindung sicherer in der Anwendung und man kann eine bessere Antiviruswirkung erwarten als bei dem als Kontrollprobe verwendeten Adamantanamin-Hydrochlorid. Der hier verwendete Ausdruck "Antivirus" schliesst sowohl eine virusabtötende Aktivität und/oder die Inhibierung von Virusproliferationen ein.

Untersuchungsbeispiel 2
25

Auf jeweils 8 Reissämlinge (Art: Jukkoku), die bis zum 4-Blatt-Stadium in einem Kunststofftopf mit einem Durchmesser von 6,5 cm gereift waren, wurde eine Versuchslösung, hergestellt durch Auflösen und Verdünnen der in Tabelle 1 gezeigten Verbindungen in der jeweils

27 -

angegebenen Konzentration, mit einer Sprühpistole in einer Menge von 35 ml pro 3 Töpfen aufgetragen. Nach dem Trocknen bei Raumatmosphäre wurden die Sämlinge in eine Feuchtigkeitskammer, die bei 24°C gehalten wurde, gestellt und durch gleichmässiges Besprühen mit einer Konidiensuspension von Reismehltaufungus (Pyricularia oryzae) besprüht. Nachdem man sie über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer gehalten hatte, wurden die Töpfe in ein Gewächshaus überführt. 7 Tage nach der Inokulierung wurde die Anzahl der Schäden festgestellt und gezählt. Für die untersuchten Substanzen wurde die Schutzwirkung nach folgender Gleichung erreichnet:

/ Anzahl der Läsionen bei Schutzwirkung (%) = (1- l^x

einem unbehandelten Los

Die Untersuchungsergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle

KONTROLLPRÜFUNG GEGENÜBER REISMEHLTAU

Verbin dung Nr.	Konzentration (ppm)	Schutzwirkung (%)
1	400	90
2	Il	85
3	»	96
4	Il	100
5	Il	93
6	Il	100
7	Il	75
8	Il	97
9	Il	100
10	Il	88
11	Il	98
12	Il	100
13	Il	100
14	Il	98
15	Il	93
16	Il	100
17	Il	100
18		100
19	"	100
20	Il	99
21	Il	100
22	Il	90
23	Il	93
24	Il	89
25	Il	100
26	Il	100

Fortsetzung Tabelle

Verbin dung Nr.	Konzentration (ppm)	Schutzwirkung (%)
27	400	100
28	Il	94
29	Il	90
30	Il	88
31	It	89
32	Il	96
33	Il	97
34	Il	93
35	Il	100
36	Il	95
37	Il	89
38	Il	100
39	Il	100
40	Il	85
41	Il	94
42	Il	88
43	Il	100
44	Il	100
45	Il	96
46	Il	77
47-	Il	96
Referenz fungizid*	300	96
keine Sprüh behandlung		0

* Als Referenzfungizid wurde ein im Handel erhältliches Fungizid, Hinosan Emulsion 30 (hergestellt von Nihon Toksuho Noyaku Seizo K.K., die 30 % 0-Ethyl-S,S-diphenyldithiophosphat enthält) verwendet.

- 30 -

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass die in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen sehr gut geeignet sind/ Mehltau zu bekämpfen. Diese Wirkung war aus der vorher genannten Literatur nicht abzuleiten. Weiterhin zeigen die Ergebnisse des Untersuchungsbeispiels 3/ dass die sehr gute Wirkung gegen Reismehltau nicht durch die MIC-Werte, die aus der Literatur bekannt waren, abgeleitet werden konnte.

Untersuchungsbeispiel 3

Die in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen wurden in niedrigen Konzentrationen aufgesprüht und es wurde ihre jeweilige Wirkung gegen Reismehltau in gleicher Weise wie beim Untersuchungsbeispiel 2 geprüft. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

K * f>

- 31 -

Tabelle 4

10

20

KONTROLLWIRKÜNG GEGENÜBER REISMEHLTAü MIT NIEDRIGEN DOSIERUNGEN

Verbin dung Nr.	Konzen tration (ppm)	keine Sprüh behandlung	Schutzwir- MIC-Wert (mcg/ml) kung (%) aus der Literatur **
10	100	67 12,5
30	Il	66 12,5
18	Il	gg
19 .	Il	93
20	Il	100
43	Il	97 ____
Referenz fungizid*	300	94
0

Es wurde das gleiche Referenzfungizid wie im Untersuchungsbeispiel 2 verwendet.

25

** Die MIC-Werte werden in der Spalte "Pyricularia oryzae" von Bokin Bobai, Bd. 9, Nr. 12, Seiten 551 bis 561 (1981) beschrieben.

30

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass die Verbindungen mit den Nr. 10 und 30 , deren MIC-Werte mit 12,5 mcg/ml bestimmt wurden, eine niedrige Schutzwirkung haben und dass andererseits die Verbindungen mit den Nr. 18, 19, 20 und 43, von denen man bisher

noch nie festgestellt hat, dass die die Proliferation von irgendeinem der in der vorerwähnten Literaturstel le beschriebenen pathogenen Fungi inhibieren, eine sehr gute Kontrollwirkung ergeben.

Untersuchungsbeispiel 4

Jeweils drei junge Gurkensänilinge (Sorte: Cucumis sativus L. cultivar, Tokiwa Jibai), die in einem porösen Topf der Grosse Nr. 3, bis zum Zwei-Blatt-Stadium gewachsen waren, wurden mit einer Lösung, die man erhalten hatte, indem man jeweils die in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen auf eine bestimmte Konzentration verdünnte, mittels einer Sprühkanone in einer Menge von 40 ml pro 3 Töpfe besprüht. Nach dem Trocknen bei Raumatmosphäre wurden diese Gurkensämlinge mit dem pathogenen Fungus von Gurkengrauschimmel (Botrytis cinerea) durch gleichmässiges Besprühen mit einer Suspension inokuliert. Die Suspension wurde hergestellt aus Mycelstücken (zuvor hergestellt durch Kultivieren des pahtogenen Fungus von Gurkengrauschimmel (Botrytis cinerea) während 5 Tagen auf einem Kartoffel-Zucker-Agar-Medium und Mahlen der so proliferierten Mycele mittels eines Homogenisators und Zugabe von Glukose in einer Konzentration von 0,5 %, um die Angriffswirkung der Krankheit zu beschleunigen). Anschliessend wurden die Pflanzen in einem Feuchtraum bei 24⁰C

- 33 -

gehalten und dann mit der Krankheit versetzt. 5 Tage nach der Inokulation wurde der Grad des Angriffs durch die Krankheit untersucht. Der Zustand, bei dem kein Angriff durch die Krankheit festgestellt wurde, wurde mit dem Index 0 bezeichnet und der Zustand, bei dem die Sämlinge faulten und dahinwelkten, wurde durch den Index 5 bezeichnet und die Indizes 1, 2, 3 und 4 wurden für die Zwischenstadien zwischen den beiden vorerwähnten Stadien, je nach dem Fortschreitungsgrad des Symptoms, verwendet. Ein Kontrollwert wurde nach folgender Gleichung erreichnet:

durchschnittlicher \ Krankheitsindex der

Kontrollwert

durchschnittlicher Krankheitsindex der unbehandleten Sämlinge /

χ 100

Die Untersuchungsergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt, 20

Tabelle 5

TEST FÜR DIE KONTROLLWIRKUNG GEGEN GURKENGRAUSCHIMMEL

Verbin dung Nr.	Konzentra tion (ppm)	Kontroll wert (%)
30	400	0
10	Il	0
20	It	56
38		90
43	Il	87
Referenz fungizid*	500	83
keine Sprü hung		0

* Das im Handel erhältliche Fungizid Euparen, befeuchtbares Pulver (hergestellt von Nihon Tokushu Noyaku Seizo K.K., enthaltend 50 % N'-(Dichlorofluoromethylthio)-N,N'-dimethyl-N¹-phenylsulfamid).

Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen die gleiche Tendenz wie bei Reismehltau. Das heisst, dass die Verbindungen mit den Nr. 30 und 10, von denen ein MIC-Wert von 12,5 mcg/ml bekannt ist, keine Kontrollwirkung aufwiesen und dass andererseits die Verbindungen mit den Nr. 38 und 43, die inaktiv gegen alle pflanzenpathogenen Fungi bei den in vitro-Versuchen waren, eine starke Kontrollwirkung ergaben.

Die vorerwähnten Ergebnisse zeigen deutlich, dass man eine antifungale Aktivität in vitro nicht in Zusammenhang bringen kann mit einer Kontrollwirkung in vivo.

Claims

HOFFMANN · EITLE** RA²RXNEI=I" \.^: 3307799'

PATENT-UND RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-ΙΝΘ. W. EITLE . DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FÜCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ΙΝΘ, K. GDRQ

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

38 327 o/wa

TAMIO NISHIMURA, KAWASAKI-SHI, KANAGAWA / JAPAN

Isothiosemicarbazone enthaltende Antivirusmittel und fungizide Mittel

PATENTANSPRUCH

Antivirusmittel und fungizide Mittel, enthaltend eine wirksame Menge an einem Isothiosemxcarbazon der allgemeinen Formel (I) oder einem Säureadditionssalz davon:
5

R₁-C=N-NH-C=N-R₄ (I)

R₂ S-R₃

worin bedeuten:
10

R₁ ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Phenylgruppe, die unsubstituiert

ist oder mit einer Alkoxygruppe, enthaltend 1 bis 12 Kohlenstoffatome/ substituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenylethenylgruppe der allgemeinen Formel (II)

CH=CH- _(II)

(worin Rj. und R_ß, die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet);

R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalky1-gruppe;

Ro eine Niedrigalkylgruppe oder eine Benzylgruppe und

R. ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe .
25