DE2435746C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel mit einer Heteropolyanionverbindung in einem geeigneten pharmazeutischen Träger.

Die Heteropolyanionverbindung im Arzneimittel gemäß der Erfindung enthält ein Heteropolyanion, in dem Antimon das Zentralatom ist, während die um dieses Zentralatom gruppierten Ligandengruppen Wolframionen sind, die untereinander über Sauerstoffatome verbunden sind.

Als Veröffentlichungen des Standes der Technik auf dem Gebiet der Heteropolyanionen sind die Arbeiten von P. Souchay "Ions min´raux condens´s" (Masson et Cie, Paris 1969) und "Polyanions et Polycations" (Gauthier-Villars, Paris 1963) zu nennen. Diese allgemeinen Arbeiten enthalten jedoch keine Angaben über die Herstellung von Heteropolyanionen, in denen Antimon das Zentralatom ist. Die chemische Definition von 5-Wolfram-2-antimoniat Pentawolframatodiantimoniat mit Sb-III) und seine Herstellung werden in der Veröffentlichung der C. R. Acad´mie des Sciences Paris, Band 274, 17. Januar 1972, Seite 209-212, beschrieben.

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel mit einer Heteropolyanion-Verbindung in einem geeigneten pharmazeutischen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Wolframato-Antimonationverbindung oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Metallsalze mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen einschließlich Ammonium enthält, die hergestellt wurden durch Umsetzen einer wäßrigen Lösung des Reaktionsgemisches, welche das Sb-III-Ion und eine 1-molare Natriumwolframatlösung enthält, im neutralen pH-Bereich unterhalb seiner Siedetemperatur.

Die Heteropolyanionen im Arzneimittel gemäß der Erfindung sind mineralische Ionen, die durch Kondensation von Wolframatomen W um ein Zentralion, nämlich Antimon Sb, erhalten werden. Die Heteropolyanionverbindung im Arzneimittel gemäß der Erfindung ist somit eine Wolframatoantimonationverbindung. Die ursprüngliche Bezeichnung "Wolframantimoniat" bzw. "5-Wolfram-2-antimoniat" wird nunmehr durch die Bezeichnung "Wolframatoantimonationverbindung" ersetzt. Für die Bezeichnung "Wolframatoantimoniat" bzw. deren unbedenkliche Metallsalze mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen einschließlich Ammonium wird im folgenden ferner die Kurzbezeichnung "HPA 23" (Heteropolyanion) benutzt.

Die ursprünglich angegebene Formel für das "HPA 23-Ion" wurde inzwischen korrigiert, wie aus den Literaturstellen J. nucl. inorg. Chem. Vol. 42 (1980), S. 1583 bis 1586, Current Chemotherapy and Immunotherapy Proc. 12th Int. Congr. of Chemotherapy, Florence, Italy, 19. bis 24. Juli 1981, S. 1071 bis 1073 und 1194 bis 1195 und GB-PS 15 73 002 hervorgeht. Sie lautet danach folgendermaßen: [NaSb₉W₂₁O₈₆]^18-.

Die Heteropolyanionverbindung im Arzneimittel gemäß der Erfindung ist sowohl eine Komplexverbindung als auch ein saures Salz. Sie kann daher sowohl als solche oder in Form des Ammoniumsalzes oder der Metallsalze, insbesondere der Alkali- und Erdalkalisalze vorliegen.

Die Heteropolyanionen kommen bekanntlich in Form zahlreicher Hydrate vor. Alle hydratisierten Formen der Wolframantimoniate fallen in den Rahmen der Erfindung.

Die Herstellung und die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Wolframantimoniate mit Sb-III-Ion werden in der Arbeit von P. Souchay und Mitarbeitern [C. R. Acad. Sc. Paris, Band 271, Seite 1337-1340 (30. 11. 1970)] beschrieben.

Für die Arzneimittel gemäß der Erfindung können alle isomeren Formen des oben genannten Heteropolyanions, soweit sie existieren, verwendet werden.

Unter die Heteropolyanionverbindung fallen auch Gemische, die durch Umwandlung des "HPA 23" unter dem Einfluß von Veränderungen des pH-Werts erhalten werden. Das "HPA 23" ist bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7, d. h. in der Nähe des Neutralpunktes, stabil. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhat bei der Verwendung als Arzneimittel. Hierauf wird nachstehend ausführlich eingegangen.

Für die Zwecke der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Heteropolyanionverbindung in Form von pharmazeutisch unbedenklichen Metallsalzen vorliegt. Hierbei kommen die Salze in Frage, die mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen einschließlich Ammonium gebildet werden. Verwendet werden zur Zeit die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze. Die Heteropolyanionverbindung kann, falls erforderlich, auch als solche in saurer Form verwendet werden.

Zur Herstellung des "HPA 23" in Form des Ammoniumsalzes wird eine wäßrige Lösung, die das SB-III-Ion enthält, heiß mit einer 1-molaren Natriumwolframatlösung umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxyd in einer genügenden Menge, um das Reaktionsgemisch farblos zu halten, im wesentlichen neutral gehalten. Hierdurch wird das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt, abfiltriert und anschließend in üblicher Weise behandelt.

Die Reaktionstemperatur liegt unter der Siedetemperatur des Reaktionsgemisches, z. B. bei etwa 80°C. Die wäßrige Lösung, die das Sb-III-Ion enthält, wird vorteilhaft hergestellt, indem SbCl₃ in einer gesättigten NH₄Cl-Lösung gelöst wird.

Als Endprodukt wird das "HPA 23"-Ammoniumsalz erhalten. Sein pH-Wert in wäßriger Lösung liegt bei etwa 6,7. Das Salz liegt in Form eines Hydrats der folgenden Formel vor:

Sb₂^IIIW₅O₂₀(NH₄)₄ · 8 H₂O

Dies entspricht einem Molekulargewicht von 1700.

Die vorstehend angegebene Formel wurde, wie aus den oben erwähnten Literaturstellen hervorgeht, korrigiert und lautet aufgrund verbesserter analytischer Methodik nunmehr

(NH₄)₁₈ [NaSb₉W₂₁O₈₆].

Aufgrund jüngster kristallographischer Untersuchungen hat sich herausgestellt, daß die schon in den oben genannten Literaturstellen angegebene Formel für das Anion, nämlich

[NaSb₉W₂₁O₈₆]^18-,

richtig ist, daß jedoch für die vorstehend genannte komplette Formel das Kation Na(NH₄)₁₇ lautet, so daß das "Ammoniumsalz" von "HPA 23" tatsächlich die Formel

Na(NH₄)₁₇[NaSb₉W₂₁O₈₆]

hat.

Da dieses Produkt sehr hygroskopisch ist, schwankt nach den heutigen Erkenntnissen gemäß der Technik von Karl Fischer entsprechend den obigen Veröffentlichungen die Zahl der Wassermoleküle für die Hydrate zwischen 8 und 42.

In wäßriger Lösung liegt das Salz in Form eines Tetrameren vor.

Das "HPA 23" ist ein wirksames Mittel für die Verhütung oder Heilung gewisser Virusaffektionen bei Mensch und Tier. In der FR-PS 21 17 803 und ihrem ersten Zusatz FR-PS 21 61 837 bzw. der DE-OS 21 62 373, wird bereits die Verwendung von Heteropolyanionverbindungen, die Bor, Silicium, Germanium, Phosphor oder Arsen als Zentralatome und Wolfram, Molybdän und Vanadium als Ligandatome enthalten, als Antivirusmittel beschrieben, jedoch sind die dort beschriebenen Verbindungen zwar Arzneimittel, die für gewisse Virusaffektionen wertvoll sind, aber ihre Aktivität in vivo auf die Viren der Leukämie und der Sarkome erweist sich als ungenügend. Ein bereits bekanntes und besonders wirksames Heteropolyanion ist das Natriumwolframsilicat. Diese Verbindung hat eine direkte virustötende Wirkung. Sie heftet sich an das Virus und bewirkt hierbei eine Löslichmachung des viralen Materials. Auf diese Weise ist das Natriumwolframsilicat sowohl durch Vorbehandlung der Zellen als auch während der viralen Adsorption wirksam. Eine Wirkung von Natriumwolframsilicat auf die Zellmembran ist äußerst wahrscheinlich. Völlig überraschend wurde nun gefunden, daß "HPA 23" Mäuse gegen Leukämien, die durch den Friend- Virus und die Plasmavariante hervorgerufen werden, zu schützen vermag. Wenn das Produkt am Tage der Impfung mit dem Virus injiziert wird, kann entweder ein vollständiger Schutz ohne nachweisbare Leukämie oder ein partieller Schutz erzielt werden, wie die Verminderung des mittleren Gewichts der Milz, die Senkung des Titers des Virus im Plasma und in der Milz und die Zunahme der mittleren Überlebensdauer zeigen. Mäuse können gegen den Friendschen Virus der Leukämie durch gleichzeitige Injektion von Virus und "HPA 23" immunisiert werden.

Wenn mit der Behandlung 3 und 7 Tage nach der Impfung mit dem Virus begonnen wird, wird bei zwei von vier Versuchen eine bedeutende Verringerung des mittleren Gewichts der Milz nach der Behandlung mit "HPA 23" erzielt.

Das "HPA 23" ist auch in der Lage, das Auftreten von Tumoren bei frischgeborenen Mäusen, die mit dem Virus M-MSV geimpft werden, zu verzögern. Das "HPA 23" regt nicht die Interferonbildung an und hat keine Wirkung auf eine aufgepfropfte Leukämie. Seine Wirkung erfordert keinen direkten Kontakt zwischen Virus und Produkt. Pharmakologische Versuche werden nachstehend ausführlich beschrieben. Die außergewöhnlichen Eigenschaften des "HPA 23" waren für den Fachmann völlig unverhersehbar. Das "HPA 23" wirkt weder durch Vorbehandlung noch während der Periode der Adsorption des Virus.

Das "HPA 23" dringt vielmehr in die Zelle ein, wie Untersuchungen mit dem Elektronenmikroskop (das Heteropolyanion ist für die Elektronen undurchlässig) bei der Verwendung von markiertem "HPA 23" zeigen, das in gewissen Zellfraktionen, insbesondere im Kern, wiedergefunden wird. Es ist während der ersten 24 Stunden nach der Adsorption des Virus, aber auch viel später zwischen der 48. und 72. Stunde wirksam. Eine genauere Untersuchung hat ergeben, daß die Wirkung von "HPA 23" zwischen der 69. und 72. Stunde nach dem Eindringen in das Virus liegt.

Das "HPA 23" hemmt stark die enzymatische RNS- abhängige DNS-Polymeraseaktivität der sarkomatogenen und leukomogenen Viren. Die hemmende Dosis 50% von "HPA 23" beträgt 1,25 µg/ml. Die enzymatische Reaktion wird sofort abgebrochen, sobald das "HPA 23" zugesetzt wird.

Die Hemmung durch "HPA 23" ist vom kompetitiven oder konkurrierenden Typ. Es ist möglich, diese Hemmung durch Zugabe des Hybrids rA dT aufzuheben, aber nicht durch das Poly-rA allein, das Oligo-dT allein oder das virale Enzym. Das "HPA 23" bindet sich weder an das Modell rA dT noch an Proteine noch an Nucleinsäuren.

Das "HPA 23" reduziert die Entwicklung der durch das Friend-Virus und die "Plasma Variant" von Chirigos ausgelösten Splenomegalie. Es verzögert ebenfalls das Auftreten von Tumoren durch das Moloney-Virus bei neugeborenen Mäusen. Seine Aktivität ist im Vergleich mit derjenigen des Interferons, der die Interferonbildung anregenden Stoffe oder andere antiviraler Produkte, die unter vergleichbaren Versuchsbedingungen verwendet werden, identisch oder ehe sogar überlegen. Versuche haben ergeben, daß dieses Produkt kein Anreger der Interferonbildung ist. Es ist bei drei Arten von Krankheiten wirksam: einer erythroblastischen Leukämie, einer undifferenzierten Leukämie und einem Muskelsarcom. Seine Wirkung ist somit nicht für eine Zielzelle spezifisch. Seine Aktivität erfordert keinen direkten Kontakt mit dem Virus, und die Möglichkeit einer Hemmung des Transports des Virus aus der Bauchhöhle in das Blut wird durch die hemmende Wirkung ausgeschlossen, wenn das Virus durch intravenöse Gabe eingeführt wird.

Die Herstellung des "HPA 23" in Form seines Ammoniumsalzes wird im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel Herstellung von (Sb₂W₅O₂₀)(NH₄)₄ · 8 H₂O oder nach neuesten Erkenntnissen Na(NH₄)₁₇[NaSb₉W₂₁O₈₆]

Eine wäßrige Lösung, die das Sb-III-Ion enthält und durch Auflösen von 11,4 g SbCl₃ in 50 ml einer gesättigten NH₄Cl-Lösung hergestellt worden ist, wird zu 125 ml einer auf 80°C gebrachten wäßrigen 1-molaren Lösung von Natriumwolframat gegeben. Unmittelbar vor Beendigung der Zugabe der das Sb-III-Ion enthaltenden Lösung wird konzentriertes Ammoniumhydroxid in einer solchen Menge zugesetzt, daß das Reaktionsmedium farblos wird. Das ausgefällte Ammoniumsalz des Heteropolyanions wird abfiltriert, mit verdünnter NH₄Cl-Lösung gewaschen und abschließend aus destilliertem Wasser umkristallisiert. Die erhaltene Verbindung besteht aus gereinigtem "HPA 23". Die Verbindung liegt in wäßriger Lösung in Form eines Tetrameren vor. Die wäßrige Lösung hat einen pH-Wert von etwa 6,7. Das Produkt ist in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von etwa 7 beständig. Im natürlichen Zustand hat es die Form eines weißen Pulvers, da in Wasser sehr leicht löslich ist. Das kristallisierte Produkt kann ohne Veränderung bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Für pharmakologische Versuche wird es vor dem Gebrauch in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (wäßrige Lösung mit 0,9% NaCl).

Um das "HPA 23" mit Sb¹²⁵ zu erhalten, wird eine gesättigte Lösung von Ammoniumchlorid (NH₄Cl), die 2 ml markiertes Antimonchlorid (0,53 mCi/ml) und 0,278 g nicht-markiertes Antimonchlorid enthält, heiß (etwa 60°C) zu 3 ml Natriumwolframat (0,33 g/ml) gegeben. Das Ammoniumsalz des markierten "HPA 23" fällt im Laufe der Herstellung aus und setzt sich während des Abkühlens weiter ab. Die Fällung wird abfiltriert, mit einer NH₄Cl-Lösung gewaschen und dann aus Wasser umkristrallisiert. Sie wird dann über Phosphorsäureanhydrid unter vermindertem Druck getrocknet und isoliert.

I. Einfluß des Heteropolyanions "HPA 23" auf die Friend′sche Leukämie

Versuche werden an Mäusen durchgeführt, die mit der Friend′schen Leukämie infiziert worden sind. Nach der Injektion einer bestimmten Dosis des für diese Krankheit verantwortlichen Virus wird festgestellt, daß alle Mäuse im allgemeinen zwischen dem 30. und 40. Tag eingehen. Zum Vergleich hiermit werden den Mäusen je 0,5 mg des Produktes "HPA 23" am zweiten Tag nach dem Tage der Injektion des Virus injiziert. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

Behandlung der Friend′schen Leukämie

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß eine Injektion des Produktes "HPA 23" nach der Infektion mit dem Virus eine sehr deutliche Abnahme der Splenomegalie zur Folge hat, ein Zeichen für einen Rückgang der Leukämie.

II. Toxikologische Untersuchung des Produktes "HPA 23"

Die toxikologische Untersuchung des Produktes "HPA 23" wurde an drei Tiergattungen durchgeführt:

dreifarbiges Meerschweinchen
neuseeländisches weißes Kaninchen
Spürhund (Beagle).

Das Produkt "HPA 23" wurde in Form einer physiologioschen Kochsalzlösung verabreicht.

Meerschweinchen

Die Versuchsdauer betrug 42 Tage. In dieser Zeit wurde das Produkt in zunehmenden Dosen von 2 bis 15 mg/kg/Tag subkutan und intravenös verabreicht.

Kaninchen

Die Versuchsdauer betrug 42 Tage. Das Produkt wurde intravenös in zunehmenden Dosen von 2 bis 32 mg/kg/Tag verabreicht.

Hund

Das Produkt wurde ebenfalls intravenös für 21 Tage in zunehmenden Dosen von 20 bis 100 mg/Hund/Tag verabreicht.

Unter den vorstehend genannten Versuchsbedingungen wurde das Produkt "HPA 23" von den Versuchstieren, d. h. von Meerschweinchen, Kaninchen und Hund, gut vertragen. Beim Meerschweinchen ist jedoch eine Schmerzerscheinung bei subkutaner Verabreichung sowie eine lokale nekrotische Erscheinung nach diesen Injektionen festzustellen. Für diese Tiergattung scheint die Verträglichkeit bei intravenöser Verabreichung besser zu sein. Beim Kaninchen wurden ebenfalls paravenöse Nekrosen festgestellt.

Bei den drei Tierarten war die allgemeine Verträglichkeit gut. Das Produkt wurde an 42 aufeinanderfolgenden Tagen beim Meerschweinchen und beim Kaninchen und 21 Tage beim Hund injiziert. Nach Beendigung der Versuche wurden alle Tiere getötet und die Orange histologisch und anatomisch untersucht. Keine Anomalie wurde festgestellt. Dies läßt auf eine gute Verträglichkeit des Produktes schließen. Alle Tiere wurden auf die Entwicklung des Gewichts und die Temperatur überwacht. Beim Hund wurde außerdem eine tägliche Nieren- und Leberbilanz aufgestellt. Alle diese Faktoren waren normal.

III. Untersuchungen der antiviralen Wirkung des Produkts "HPA 23"

Die folgenden Versuche wurden durchgeführt:

• a) in vitro:
  • a₁) Hemmung der Bildung von Herden durch das sarkomatogene Moloney-Virus auf Fibroblasten der embryonalen Maus.
  • a₂) Hemmung der Vermehrung des leukämogenen Virus (Test X, C nach P. W. Rowe und Mitarbeiter, Virology, 1970, 42, 1136).
  • a₃) Hemmung der Polymerisationsreaktion, die zur RNS-abhängigen DNS-Polymerase führt, gemäß D. Baltimore, Nature 225 (1970) 1209.
• b) in vivo:
  Friend′schen Leukämie,
  Leukämie, die durch Einimpfen des "Plasma variant" von Chirigos ausgelöst wird,
  Bildung von Tumoren an neugeborenen Mäusen durch den sarkomatogenen Moloney-Virus.

Die leukämogene Wirkung und die Entwicklung der Krankheit wurden nach zwei verschiedenen Methoden verfolgt:

• a) Durch Entnahme der Milz der Tiere am 21. Tag nach der Impfung mit dem Virus und Vergleich des Gewichts der Milz der behandelten Tiere mit der der unbehandelten Tiere.
• b) Ermittlung der Überlebenszeit der behandelten Tiere im Vergleich zu der den unbehandelten Tieren.

Hemmende Eigenschaften des Produkts "HPA 23" in vitro 1) Hemmung der Bildung von Herden

Die nach der Methode von Reed und Muench berechnete DI₅₀ (hemmende Dosis bei 50% der Tiere) beträgt 15 µg/ml Medium.

• a) Eine direkte viruzide Wirkung auf das Virus ist nicht vorhanden. Wenn das Virus und das "HPA 23" bei steigenden Dosen 1 Stunde bei 0°C in Berührung gehalten werden, ist keine Senkung des Titers, sondern im Gegenteil eine Aktivierung festzustellen (siehe Tabelle 2).
• b) Eine Fixierung des "HPA 23" am Virus findet nicht statt. Wenn "HPA 23"-Sb¹²⁵ verwendet und das Virus mit markiertem "HPA 23" zusammengeführt und das Gemisch mit einem Dichtegradienten (5 bis 55% Saccharose) zentrifugiert wird, erreicht das Virus das Gleichgewicht (1,14 bis 1,15 g/ml) und ist nicht radioaktiv markiert. Es hat somit das "HPA 23" nicht an sich gebunden.

Tabelle 2

Kontaktvirus-"HPA 23"

• c) "HPA 23" ist für die Zellen bei den hemmenden Dosen nicht toxisch. Das Zellwachstum wird in Gegenwart von "HPA 23" nicht beeinträchtigt. In behandelten Kolben werden die gleiche Zahl von Zellen und das gleiche Profil bezüglich des Einbaues von tritiiertem Thymidin (DNS-Synthese), von tritiiertem Uridin (RNS-Synthese) und von Selen-75-methionin (für die Protein-Synthese) wie bei den unbehandelten Kolben wiedergefunden.
• d) Das "HPA 23" wirkt weder bei der Vorbehandlung noch während der Absorption des Virus. Die beste Schutzwirkung wird erzielt, wenn das Produkt nach der Virusinfektion zugesetzt wird.

2) Hemmung der Bildung von Syncytia (Test X C): Die hemmende Dosis 50% beträgt 16 µg/ml Medium (siehe Versuchstyp in Tabelle 3). 3) Hemmung der Polymerisationsreaktion, die RNS-abhängige DNS-Polymerase eintreten läßt:

• a) Versuchsbericht von D. Baltimore,
• b) exogene Reaktion: Initiator rA-Oligo dT,
• c) DL₅₀ : 1,4 µg/ml Reaktionsmedium,
• d) sofortiger Stillstand der Polymerisationsreaktion bei Zugabe des "HPA 23";
• die Hemmung ist nicht reversibel, wenn eine Enzymlösung mit einer Heteropolyaniondosis inkubiert wird, die eine Hemmung von 50% ergibt, und auf 1/10 verdünnt, wird die Reaktionsgeschwindigkeit nicht verändert. Dies bedeutet, daß die Hemmung nicht aufgehoben wird.

Das "HPA 23" hemmt die Polymerasen, reagiert nicht mit den Ribonucleasen und den Desoxyribonucleasen, ist ohne Wirkung auf die Proteasen (Pronase, Pepsin, Trypsin) und bindet sich nicht an die Proteine (Albumin).

Tabelle 3

XC-Test

4) Hemmende Wirkung von "HPA 23" auf verschiedene Oncornaviren: a) Tollwutvirus

Versuche hatten die folgenden Ergebnisse:
DI₅₀ : 4 µg/ml;
keine direkte Wirkung auf das Virus;
ungiftig für die Zellen bei den angewandten Dosen.

b) andere Viren

Das Produkt "HPA 23" hat in vitro-Wirkung auf andere Viren, z. B. das Virus der vesikulären Stromatitis (VSV) und das Enzephalomyokarditis-Virus der Maus.

Hemmende Eigenschaften in vivo

Vorstehend wurde gezeigt, daß das "HPA 23" eine sehr starke antivirale in-vitro-Wirkung hat. Versuche wurden durchgeführt, um die antivirale in-vivo-Wirkung nachzuweisen. Diese Versuche erstreckten sich auf experimentelle Leukämie bei der Maus, die Friendsche Leukämie und die durch das "Plasma variant" von Chirigos induzierte Leukämie, wo Messungen der Leukämie durchgeführt werden können, nämlich 1) Messung des Grades der Splenomegalie am 21. Tag und 2) Messung der Überlebensdauer der Tiere, denen "HPA 23" verabreicht worden ist oder nicht.

Tabelle 4 zeigt die Antiviruswirkung des "HPA 23" auf zwei Typen von Leukämien. Das Produkt wurde 30 Minuten vor dem Virus injiziert (bemerkenswert ist die starke Abnahme der Splenomegalie). Es handelt sich sicherlich um eine Verminderung der Virusbildung, denn der Titer des Virus in der Milz oder im Plasma der behandelten Mäuse bestimmt und mit den Vergleichstieren verglichen wird, sind nur sehr wenig Viren wiederzufinden (Tabelle 5).

In Tabelle 6 sind Versuche zusammengefaßt, bei denen die Dosis des "HPA 23" verändert wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß ein ausgezeichneter Schutz bis 10 µg/Maus (eine einzige Injektion) erzielbar ist.

Tabelle 7 zeigt, daß es nicht notwendig ist, daß das Virus und das Produkt auf dem gleichen Wege injiziert werden, um eine Wirkung zu erzielen. Lediglich die orale Verabreichung ist unwirksam (Versuch 5).

Tabelle 8 zeigt, daß die geschützten Tiere gegen das Virus immunisiert sind. Wenn nämlich eine neue Dosis des Virus den behandelten und geschützten Mäusen injiziert wird, ist festzustellen, daß sich bei den Tieren die Krankheit nicht entwickelt.

Tabelle 4

Wirkung von "HPA 23" auf Leukämien, die durch das Friendsche Virus (FLV) und das "Plasma variant" (PV) verursacht werden

Tabelle 5

Bestimmung des Virus der Friendschen Leukämie im Plasma und in den Milzextraktionen

Tabelle 6

Beziehung der Dosis zur Wirkung von "HPA 23" auf die Friendsche Leukämie

Tabelle 7

Vergleich der verschiedenen Injektionsarten des "HPA 23" und der Friendschen Leukämie-Viren

Tabelle 8

Resistenz von Mäusen, die mit den Friendschen Leukämie- Virus (FLV) und "HPA 23" vorbehandelt wurden, gegen eine Kontrolldosis von FLV

Untersucht man die Überlebensdauer der Tiere, so ist festzustellen, daß alle Vergleichstiere am 30. Tag eingegangen waren. Die meisten behandelten Tiere überlebten bis zum 85. Tag. Das Plasma und die Milz der überlebenden Tiere wurden entnommen. Nach Beimpfen von normalen Mäusen wurde festgestellt, daß diese Mäuse keine Leukämie entwickelten. Die behandelten Tiere waren somit gesundet.

Es wurde ferner festgestellt, daß die Behandlung wirksam sein kann, wenn sie nach dem Ausbruch der Krankheit vorgenommen wird. Es gibt einen guten Schutz, wenn das "HPA 23" an den Tagen 2-4-6-8 oder auch in Form einer einzigen Injektion am 10. Tag oder in Form von mehreren Injektionen an den Tagen 14, 16, 18 und 20 verabreicht wird.

Weitere Versuche haben die Verzögerung im Auftreten von Tumoren, die durch das Moloney-Sacrom induziert wurden, bei neugeborenen Mäusen ergeben. Schließlich schützt das "HPA 23" die Mäuse gegen eine 100%ig tödliche Dosis des EMC-Virus (Enzephalomyokarditis).

Schlußfolgerung

"HPA 23" hat ein großes antivirales Spektrum. Es ist in vivo wirksam und wird gut vertragen.

Die vorstehenden Versuchsergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit der Heteropolyanionverbindungen, die Wolfram in Kombination mit Antimon enthalten, bei der Behandlung von Virusaffektionen. So ist das "HPA 23" ein wertvolles Antivirusmittel. Es ist besonders wirksam in vivo auf die leukämogenen und sacromatogenen Viren. Es hat ferner in vivo-Wirkung auf die Viren der Enzephalomyokarditis.

Die Verabreichung erfolgt durch Injektionen. Als Dosierungseinheit sind somit sterile Ampullen mit der wirksamen Konzentration. Der Wirkstoff kann mit einem für die Injektion geeigneten Träger kombiniert sein. Bei Anwendungen in der Veterinärmedizin eignet sich als Träger eine wäßrige Lösung oder ein Mineralöl. Beim Menschen werden 0,9%ige wäßrige Kochsalzlösungen bevorzugt, die sich als Träger eignen, der bei einem pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes injiziert werden kann. Der Wirkstoff ist in einer solchen Lösung vollständig löslich.

Bei einer vorteilhaften Form der Verabreichung wird der wäßrigen Lösung des Wirkstoffs unlösliches Kalciumphosphat beispielweise in einer Menge von 5 mg/ml Lösung zugesetzt. Versuche an Mäusen haben ergeben, daß man in dieser Weise ein Retardmedikament bilden kann.

Das Produkt "HPA 23^x" (radioaktive Form), das an Kalciumphosphat in wäßriger 0,9%iger Kochsalzlösung gekoppelt war, wurde Mäusen intraperitoneal injiziert. Täglich wurde eine Maus getötet und die Lokalisierung des Produkts vorgenommen. Der größte Teil des Produkts findet sich in der Leber (hepatitische Lokalisation), ein verhältnismäßig großer Teil in den Nieren und ein weniger großer Teil in den Lungen wieder. Unter diesen Bedingungen bleibt das Produkt mehr als 15 Tage im Organismus des Tieres. In Abwesenheit von Kalciumphosphat ist das Produkt in fünf Stunden ausgeschieden. Im Gegensatz hierzu geht es nach Zusatz von Kalciumphosphat sehr allmählich in die Orange über, und im Laufe der Zeit ist seine Ausscheidung im Urin im steigenden Maße festzustellen.

Die Salze von "HPA 23" können als Wirkstoffe in Arzneimittelzubereitungen verwendet werden, die in einem großen Bereich von Virusinfektionen für eine prophylaktische oder heilende Behandlung anwendbar sind. Diese Arzneimittel können auch mit anderen Mitteln mit Antiviruswirkung kombiniert sein.

Vorstehend wurde erwähnt, daß das "HPA 23" in vitro und in vivo gegen murine leukämogene und sarcomatogene Viren wirksam ist. Es wurde ferner gezeigt, daß es eine starke antivirale in vitro-Wirkung hat und Mäuse gegen Infektionen durch Viren der Enzephalomyokarditis schützt.

Die in-vitro-Aktivität von "HPA 23" auf die zytopathogenen Effekte, die durch die RNS-Viren und die DNS-Viren induziert werden, wurde an Kulturen von Affennierenzellen und menschlichen WI-38-Zellen untersucht, die in einem Medium, das 10% Kalbsserum enthielt, gezüchtet wurden.

In den Kulturen der Affennierenzellen und der menschlichen Zellen WI-38 betrug die höchste nicht-zytotoxische Konzentration von "HPA 23" 125 µg/ml Medium, wenn das "HPA 23" den zusammenfließenden Monoschichten zugesetzt wurde. Keinerlei Hemmung des Zellwachstums wurde festgestellt, wenn die Verbindung in einer Konzentration von 30 µg/ml den Kulturen im Augenblick der Übertragung der Zellen in das Medium zugesetzt wurde. Wenn die Kulturen eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem Virus mit "HPA 23"-Konzentrationen zwischen 15 und 125 µg/ml behandelt wurden, wurde eine erhebliche Hemmung des zytopathogenen Effekts (ZPE) zahlreicher DNS-Viren oder RNS-Viren erzielt. In Tabelle 9 sind die Ergebnisse genannt, die einerseits durch den VR-Koeffizienten (virus ratings) und andererseits durch die 50% hemmenden Dosen ausgedrückt sind. Der VR-Koeffizient mißt die Hemmung des zytopathogenen Effekts des Virus durch die Testverbindung bei verschiedenen Konzentrationen, wobei von der höchsten nichtzytotoxischen Dosis ausgegangen wird. Im Falle des menschlichen Rhinovirus vom Typ 1A wurde gezeigt, daß die Hemmung der Bildung neuer Viren, d. h. der Vermehrung der Hemmung des zytopathogenen Effekts parallel lief. Die Kinetik der hemmenden Wirkung wurde am Rhinovirus 1A und am Virus von Herpes simplex (HF) untersucht.

• a) Wenn das "HPA 23" in einer Konzentration von 30 µg/ml eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem Virus zugesetzt und anschließend in den Kulturen gehalten wurde, war es sehr wirksam.
• b) Wenn jedoch die Kulturen für zwei Stunden mit 125 µg/ml "HPA 23" behandelt und unmittelbar vor dem Beimpfen mit dem Virus gewaschen wurden, wurde keinerlei hemmende Wirkung festgestellt.
• c) Eine deutliche Verminderung der Antiviruswirkung wurde festgestellt, wenn die Kulturen zur Entfernung der aktiven Verbindung zwei Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus gewaschen wurden: VR = 0,7 im Vergleich zu 1,8 im Falle der nicht gewaschenen Kulturen.
• d) Bei den beiden Viren wurde noch eine starke hemmende Wirkung (VR = 1,0) festgestellt, wenn das "HPA 23" den Kulturen sechs Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus mit einem geringen Vielfachen der Infizierung erforderlichen Menge (<0,01 TCID₅₀/Zelle) zugesetzt wurde, aber eine Wirkung war kaum vorhanden, wenn das Produkt 24 Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus zugesetzt wurde (VR = 0,2). Das "HPA 23" hat keine direkte desaktivierende Wirkung auf die Infektiosität des Rhinovirus 1A und des Influenzavirus A₂, wenn die Virussuspensionen mit einer Lösung von 2,5 mg/ml "HPA 23" eine Stunde bei 37°C inkubiert werden.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Virus der Enzephalomyokarditis (EMC), Stamm V 77, erhalten. Die LB 57-Zellen wurden im minimalen Eagle-Medium mit 10% Serum des embryonalen Kalbs kultiviert. Die Dauer der Wirkung von "HPA 23" wurde nach der Plaque-Methode untersucht. Die Ergebnisse eines typischen Versuchs mit 40 µg "HPA 23"/ml sind in Tabelle 10 genannt. Ebenso wie beim Rhinovirus 1A und dem Virus von Herpes simplex waren die Vorbehandlung und die Behandlung während der Absorption unwirksam. "HPA 23" war in der letzten Phase der Vermehrung des Virus wirksam.

Tabelle 9

Antiviruswirkung von "HPA 23" Zellkulturen

Tabelle 10

Wirkung von "HPA 23" auf die Bildung von Plaques durch EMC (Stamm V 77)

Die Zeit 0 ist die Zeit der Beimpfen mit dem Virus. Dem Kulturmedium der behandelten Gruppen wurde "HPA 23" in einer Menge von 40 µgMl zugesetzt.

Die antivirale in vivo-Wirkung von "HPA 23" wurde bei mehreren letalen Infektionen der erwachsenen Charles River-Maus CD-1 untersucht. In Tabelle 11 sind die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen zusammengestellt, die im wesentlichen mit dem Virus der Enzephalomyokarditis (EMC), Stamm ATCC VR 129, vergleichbar sind. Ein starker Schutz der Tiere wurde festgestellt, wenn die Verbindung intraperitoneal (i. p.) oder subkutan (s. c.) eine Stunde vor dem Beimpfen mit 6-10 TCID-Maus verabreicht wurde, während orale Behandlungen unwirksam waren.

Tabelle 11

Wirkung von "HPA 23" auf die Infektion der Maus mit dem Virus der Enzephalomyokarditis

Bei den Versuchen, deren Ergebnisse in Tabelle 11 genannt sind, wurden die Viren subkutan injiziert, und zwar bei einer Behandlung einer Stunde vor der Verabreichung und bei drei Behandlungen eine Stunde vor, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Verabreichung von "HPA 23". Die Zahlen geben die überlebenden Mäuse im Verhältnis zur Gesamtzahl der infizierten Mäuse an.

Tabelle 12

Wirkung von "HPA 23" auf die Infektion der Maus mit dem EMC- Virus; Wirkung einer einzigen Behandlung zu verschiedenen Zeiten

Die Versuchstiere wurden mit dem Virus subkutan beimpft. Die Zahlen geben die überlebenden Mäuse im Verhältnis zur Gesamtzahl der infizierten Mäuse an.

Die wirksamste Dosis betrug 50 mg/kg i. p., d. h. sie war fünfzehnmal niedriger als die akute Toxizität DL₅₀ für die Maus bei dieser Art der Verabreichung und 7mal geringer als die subkutane DL₅₀ (Behandlungen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen). Die schwächste Dosis, die einen Gewichtsverlust verursachte, ist fünfmal höher (250 mg/kg i. p.), aber eine leichte vorübergehende Beruhigung wird noch bei einer Konzentration von 60 mg/kg i. p. festgestellt. Mit einer einzigen Behandlung mit 100 mg/kp i. p. (Tabelle 11) und mit einer niedrigeren Dosis 50 mg/kg i. p. wurde noch ein starker Schutz gegen EMC erzielt, wenn die Mäuse die Verbindung 4 Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus erhielten.

Dies ist verhältnismäßig spät, wenn berücksichtigt wird, daß bei diesem Versuchssystem die unbehandelten Tiere 4 bis 5 Tage nach dem Impfen eingehen. Wenn jedoch die Mäuse mit dem Stamm V 77 von EMC infiziert wurden, war der Schutz, der mit "HPA 23" unter gleichen Versuchsbedingungen erzielt wurde, viel weniger deutlich, aber immer noch stark.

Es wurde gefunden, daß "HPA 23" wirksam gegen die Infektion mit dem EMC-Virus war; aber keinerlei Schutzwirkung gegen die Infektion der Maus mit den folgenden Viren ausübte: Herpes simplex (Stamm Virtue) bei Impfung i. p., i. v. oder i. c., Semliki Forest Arbovirus (s. c.), West Nile Arbovirus (i. p.), Virus der Maul- und Klauenseuche, angepaßt an die Maus Typ C, und Virus A 2/ANN Arbor/2/62. Die Verbindung war auch unwirksam gegen die auf Herpes simplex zurückzuführende Virusinfektion, wenn sie an der gleichen Stelle wie das Virus (i. v. oder i. c.) verabreicht wurde, und gegen das Grippevirus (Influenza), wenn sie intranasal in einer Konzentration von 100 mg/kg wiederholt vor und nach dem Beimpfen mit dem Virus verabreicht wurde.

Abschließend ist festzustellen, daß "HPA 23" ein weites antivirales Wirkungsspektrum in Zellkulturen hat. Unter den Versuchsbedingungen der vorliegenden Erfindung hat "HPA 23" keine viruzide Wirkung auf diese Viren und hemmt nicht die Absorption und Penetration der Viren.

Es wurde gefunden, daß "HPA 23" eine wiederholte Wirkung in vivo nur gegen die murinen leukomogenen Viren und Enzephalomyokarditis (EMC)-Infektion hatte.

Claims (1)

1. Arzneimittel mit einer antiviralen Heteropolyanion-Verbindung in einem geeigneten pharmazeutischen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Wolframato-Antimonationverbindung oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Metallsalze mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen einschließlich Ammonium enthält, die hergestellt wurden durch Umsetzen einer wäßrigen Lösung der Reaktionsgemisches, welches das Sb-III-Ion und eine 1-molare Natriumwolframatlösung enthält, im neutralen pH-Bereich unterhalb seiner Siedetemperatur.