DE2435746A1

DE2435746A1 - Wolfram und antimon enthaltende heteropolyanionverbindung und ihre verwendung in arzneimitteln

Info

Publication number: DE2435746A1
Application number: DE2435746A
Authority: DE
Inventors: Jean Claude Chermann; Claude Jasmin; Georges Mathe; Marcel Raynaud; Val De Marne Villejuif
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1973-07-27
Filing date: 1974-07-25
Publication date: 1975-02-13
Also published as: DE2435746C2; GB1487397A; BE817718A; US4547369A; FR2245374A1; FR2245374B1; CA1054519A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD

DR.-ING. TH. MEYER DR.FUES Dl PL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL-ING. SELTING

5 KÖLN T, DEICHMANNHAUS

Köln, den 24.JuIi Ke/Ax/Bt/Bn.

Agence National de Valorisation de la Recherche (ANVAR) 13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly sur Seine (Frankreich)

Wolfram und Antimon enthaltende Heteropolyanionverbindung und ihre Verwendung in Arzneimitteln

Die Erfindung betrifft eine Heteropolyanionverbindung, die Wolfram in Kombination mit Antimon enthält. Die Erfindung ist insbesondere auf Arzneimittel gerichtet, die die Heteropolyanionverbindung gemäß der Erfindung enthalten und für die Verhütung und Heilung verschiedener Viruserkrankungen wertvoll sind.

Die Verbindung gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Heteropolyanion enthält, in dem Antimon das Zentralatom ist, während die um dieses Zentralatom gruppierten Ligandengruppen Wolframionen sind, die untereinander über Sauerstoffatome verbunden sind.

Als Veröffentlichungen des Standes der Technik auf dem Gebiet der Heteropolyanionen sind die Arbeiten von P. Souchay "Ions mineraux condenses" (Masson et Cie, Paris 1969) und "Polyanions et Polycations" (Gauthier-Villars, Paris 1963) zu nennen. Diese allgemeinen Arbeiten enthalten jedoch keine Angaben über die Herstellung von Heteropolyanionen, in denen Antimon das Zentralatom ist. Die chemische Definition von 5-Wolfram-2-antimoniat (III) und seine Herstellung werden in der Veröffentlichung der

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C.R.Academie des Sciences Paris, Band 274» 17.Januar 1972, Seite 209-212, beschrieben.

Die Heteropolyanionverbindung gemäß der Erfindung ist sowohl eine Komplexverbindung als auch ein saures Salz. Sie kann daher sowohl als solche oder in Form des Ammoniumsalzes oder der Metallsalze, insbesondere der Alkali- und Erdalkalisalze vorliegen.

Wie bereits erwähnt, sind die Heteropolyanionen mineralische Ionen, die durch Kondensation von Wolframatomen W um ein Zentralion, nämlich Antimon Sb, erhalten werden. Die Heteropolyanionvarbindung gemäß der Erfindung ist somit ein Wolframantimoniat.

Die Heteropolyanionen kommen bekanntlich in Form zahlreicher Hydrate vor. Alle hydratisierten Formen der Wolframantimdniate fallen in den Rahmen der Erfindung.

Die Heteropolyanionen werden durch die Reihe, zu der sie

W gehören, gekennzeichnet, indem das Verhältnis ^r

angegeben wird. In der "Reihe 11" hat das Verhältnis r den Wert 11. Die Herstellung und die physikalischen und chemischen Eigenschaften der 11-Wolframantimoniate (III) werden in der Arbeit von P.Souchay und Mitarbeitern (G.R.Acad.Sc. Paris, Band 271, Seite 1337-1340 (30.11.197O)) beschrieben.

Die Erfindung ist insbesondere auf die Verwendung von 5-Wolfram-2-antimoniat gerichtet. Dies ist eine Heteropolyanionverbindung, die im Zentrum zwei Antimonatome .Sb und um diese Atome fünf Wolframatome enthält, so daß das charakteristische Verhältnis r den Wert 2,5 hat.

Die Erfindung umfaßt ferner alle isomeren Formen des oben genannten Heteropolyanions, soweit sie existieren.

Unter die Erfindung fallen die Heteropolyanionverbindung selbst sowie Gemische, die durch Umwandlung des Wolfram-

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antimoniats unter dem Einfluß von Veränderungen des pH-Werts erhalten werden. Die neue HeteropolyanionverMnäung gemäß der Erfindung, d.h. das 5-Wolfram-2-antimoniat, ist "bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7, d.h. in der Nähe des Neutralpunktes, stabil. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung dieser Verbindung als Arzneimittel. Hierauf wird nachstehend ausführlich eingegangen.

Für die Zwecke der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Heteröpolyanionverbindung in Form von pharmazeutisch unbedenklichen Metallsalzen vorliegt. Hierbei kommen die Salze in Frage, die mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen einschließlich Ammonium gebildet werden. Verwendet werden zur Zeit die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze. Die Heteröpolyanionverbindung kann, falls erforderlich, auch als solche in saurer Form verwendet werden. ' j

Zur Herstellung von 5-Wolfram-2-antimoniat in Form des Ammoniumsalzes wird eine wässrige Lösung, die das Ion Sb enthält, heiß mit einer 1-molaren Natriumwolframatlösung umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhy.droxyd in einer genügenden Menge, um das Reaktionsgemisch farblos zu halten, im wesentlichen neutral gehalten. Hierdurch wird das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt, das abfiltriert und anschließend in üblicher Weise behandelt wird. i

Die Reaktionstemperatur liegt unter der Siedetemperatur des Reaktionsgemisches, z.B. bei etwa 80⁰C. Die wässrige Lösung, die das Ion Sb enthält, wird vorteilhaft hergestellt, indem SbCl, in einer gesättigten NHXl-Lösung gelöst wird.

Als"Endprodukt wird das 5-Wolfram-2-antimoniat von Ammonium erhalten. Sein pH-Wert in wässriger Lösung liegt bei etwa 6,7. Das Salz liegt in Form eines Hydrats der folgenden Formel vor:

H₂O

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Dies entspricht einem Molekulargewicht von 1700.

In wässriger Lösung liegt das Salz in Form eines Tetrameren vor. In der folgenden Beschreibung wird die letztgenannte Verbindung jeweils durch die Abkürzung TA bzw. HPA 23 bezeichnet.

Das Wolframantimoniat gemäß der Erfindung ist ein wirksames Mittel für die Verhütung oder Heilung gewisser Virusaffektionen bei Mensch und Tier. In der französischen Patentschrift 70.45.843 und ihrem ersten Zusatz 71.43.444 wird bereits die Verwendung von Heteropolyanionverbindungen, die Wolfram enthalten, als Antivirusmittel beschrieben, jedoch sind die dort beschriebenen Verbindungen zwar Arzneimittel, die für gewisse Virusaffektionen wertvoll sind, aber ihre Aktivität in vivo auf die Viren der Leukämie und der Sarkome erweist sich als ungenügend. Ein bereits bekanntes und besonders wirksames Heteropolyanion ist das Natriumwolframsilicat. Diese Verbindung hat eine direkte virustötende Wirkung. Sie heftet sich an das Virus und bewirkt hierbei eine Löslichmachung des viralen Materials. Auf diese Weise ist das Natriumwolframsilicat sowohl durch Vorbehandlung der Zellen als auch während der viralen Adsorption wirksam. Eine Wirkung von Natriumwolfrarasilicat auf die Zellmembran ist äußerst wahrscheinlich. Völlig überraschend wurde nun gefunden, daß 5-Wolfram-2-antimoniat (TA) Mäuse gegen Leukämien, die durch den Friend-Virus und die Plasmavariante hervorgerufen werden, zu schützen vermag. Wenn das Produkt am Tage der Impfung mit dem Virus injiziert wird, kann entweder ein vollständiger Schutz ohne nachweisbare Leukämie oder ein partieller Schutz erzielt werden, wie die Verminderung des mittleren Gewichts der Milz, die Senkung des Titers des Virus im Plasma und in der Milz und die Zunahme der mittleren Überlebensdauer zeigen. Mäuse können gegen den Priendschen Virus der Leukämie durch gleichzeitige Injektion von Virus und TA immunisiert werden.

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Wenn mit der Behandlung 3 und 7 Tage nach der Impfung mit dem Virus begonnen wird, wird bei zwei von vier Versuchen eine bedeutende Verringerung des mittleren Gewichts der Milz nach der Behandlung mit TA erzielt.

Das TA ist auch in der Lage, das Auftreten von Tumoren bei frischgeborenen Mäusen, die mit dem Virus M-MSV geimpft werden, zu verzögern. Das TA regt nicht die Interferonbildung an und hat keine Wirkung auf eine aufgepfropfte Leukämie. Seine Wirkung erfordert nicht einen direkten Kontakt zwischen Virus und Produkt. Pharmakologische Versuche werden nachstehend ausführlich beschrieben. Die außergewöhnlichen Eigenschaften des TA waren für den Pachmann völlig unvorhersehbar. Das· Ammoniumwolframantimoniat wirkt weder durch Vorbehandlung noch während der Periode der Adsorption des Virus.

Das Wolframantimoniat dringt in die Zelle ein, wie Untersuchungen mit dem Elektronenmikroskop (das Heteropolyanion ist für die Elektronen undurchlässig) oder die Verwendung von markiertem Wolframantimoniat zeigen, das in gewissen Zellfraktionen, insbesondere im Kern, wiedergefunden wird. Es ist während der ersten 24 Stunden nach der Adsorption des Virus, aber auch viel später zwischen der 48. und 72. Stunde wirksam. Eine genauere Untersuchung hat ergeben, daß die Wirkung von Wolframantimoniat zwischen der 69. und 72.Stunde liegt.

Das Wolframantimonat hemmt stark die enzymatische RNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität (l'aciivite'enzymatique ARN dependante ADN polymerase) der sarkomatogenen und leukomogenen Viren. Die hemmende Dosis 50$ von Wolframantimonat beträgt 1,25 Hg/ml. Die enzymatische Reaktion wird sofort abgebrochen, sobald das Wolframantimonat zugesetzt wird.

Die Hemmung durch 5-Wolfram-2-antimonat ist vom kompetiti-

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ven oder konkurrierenden Typ. Es ist möglich, diese Hemmung durch Zugabe des Hybrids rA dT aufzuheben, aber nicht durch das Poly-rA allein, das Öligo-dT allein oder das virale Enzym . Das Wolframantimonat bindet sich weder an das Modell rA dT noch an Proteine noch an Nucleinsäuren.

Das 5-Wolfram-2-antimonat reduziert die Entwicklung der durch das Priend-Virus und die "Plasma Variant" von Chirigos ausgelösten Splenomegalie. Es verzögert ebenfalls das Auftreten von Tumoren durch das Moloney-Virus bei neugeborenen Mäusen. Seine Aktivität ist mit derjenigen des Interferons, der die Interferonbildung anregenden Stoffe oder andere antiviraler Produkte, die unter vergleichbaren Versuchsbedingungen verwendet werden, identisch oder ehe sogar überlegen. Versuche haben ergeben, dass dieses Produkt kein Anreger der Interferonbildung ist. Es ist bei drei Arten von Krankheiten wirksam: einer erythroblastischen Leukämie,einer undifferenzierten Leukämie und einem Muskelsarcom. Seine Wirkung Ist somit nicht für eine Zielzelle (cellule cible).spezifisch. Seine Aktivität erfordert nicht einen direkten Kontakt mit dem Virus, und die Möglichkeit einer Hemmung des Transports des Virus aus der Bauchhöhle in das Blut wird durch die hemmende Wirkung ausgeschlossen, wenn das Virus durch intravenöse Injektion eingeführt wird.

Die Herstellung des TA-Produkts in Form seines Ammoniumsalzes wird im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel

Herstellung, von (Sb₃W₅O₂₀

Eine wässrige Lösung, die das Sb -Ion enthält und durch Auflösen von 11,4 g SbCl-* in 50 ml einer gesättigten NHhCl-Lösung hergestellt worden ist, wird zu

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125 ml einer auf 8o°C gebrachten wässrigen 1-molaren Lösung von Natriumwolframat gegeben. Unmittelbar vor Beendigung der Zugabe der das Sb -Ion enthaltenden Lösung wird konzentriertes Ammoniumhydroxyd in einer solchen Menge zugesetzt, dass das Reaktionsmedium farblos wird. Das ausgefällte Ammoniumsalz des Heteropolyanions wird abfiltriert, mit verdünnter NHhCl-Lösung gewaschen und abschliessend aus destilliertem Wasser umkristallisiert. Die erhaltene. Verbindung besteht aus gereinigtem Ammonium-5-wolfram-2-antimonat. Die Verbindung liegt in wässriger Lösung in Form eines Tetrameren vor. Die wässrige Lösung hat einen p_TI-Wert von etwa 6,7· Das

Produkt ist in wässriger Lösung bei einem ρ -Wert von

etwa 7 beständig. Im natürlichen Zustand hat es die Form eines weissen Pulvers, das in Wasser sehr leicht löslich ist. Das kristallisierte Produkt kann ohne Veränderung bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Für pharmakologische Versuche wird es vor dem Gebrauch in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (wässrige Lösung mit 0,9 /^ NaCl).

Um das Ammonium-5-wolfram-2-antimonat mit Sb ^ zu erhalten, wird eine gesättigte Lösung von AmmoniumchiorId (NH^Cl), die 2 ml markiertes Antimonchlorid (0,53 mCi/ml) und 0,278 g nicht-markiertes Antimonchlorid enthält, heiss (etwa 60⁰C) zu 3 ml Natriumwolframat (0,33 g/ml) gegeben. Das Ammoniumsalz des markierten 5-Wolfram-2-antimonats fällt im Laufe der Herstellung aus und setzt sich während des Abkühlens weiter ab. Die Fällung wird abfiltriert, mit einer NH^Cl-Lösung gewaschen und dann aus Wasser umkristallisiert. Sie wird dann über Phosphorsäurean- ■ hydrid unter vermindertem Druck getrocknet und isoliert.

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-δι. Einfluss des Heteropolyanions HPA 23 auf die Friend'sehe Leukämie

Versuche werden an Mäusen durchgeführt, die mit der Friend'sehen Leukämie infiziert worden sind. Nach der Injektion einer bestimmten Dosis des für diese Krankheit verantwortlichen Virus wird festgestellt, dass alle Mäuse im allgemeinen zwischen dem 30. und 40. Tag eingehen. Zum Vergleich hiermit werden den Mäusen je 0,5 mg des Produktes HPA 23 am zweiten Tag nach dem Tage der Injektion des Virus injiziert. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

Behandlung der Friend sehen Leukämie	5.10"⁴	ΙΟ"⁴ ι I I I
^\^^ VFA HPA ^^\^^	0,923 g 1,660 g 2,226 g 0,647 g	0,686 g ! 1,827 g 1,566 g 0,643 g
HPA 23 Tag 0 Tag 1 Tag 1, 7,14 Tag 0, 7,14	2,547 g	2,013 g .
Vergleichsvirus

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass eine Injektion des Produktes HPA 23 nach der Infektion mit dem Virus eine sehr deutliche Abnahme der Splenomegalie zur Folge hat, ein Zeichen für einen Rückgang der Leukämie.

II. Toxikologische Untersuchung des Produktes HPA 23 Die toxikologische Untersuchung des Produktes "HPA 23"

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wurde an drei Tiergattungen durchgeführt:

dreifarbiges Meerschweinchen neuseeländisches weisses Kaninchen Spürhund (Beagle).

Das Produkt HPA 23 wurde in Form einer physiologischen Kochsalzlösung verabreicht.

Meerschweinchen

Die Versuchsdauer betrug 42 Tage. In dieser Zeit wurde das Produkt in zunehmenden Dosen von 2 bis 15 mg/kg/Tag subkutan und intravenös verabreicht.

Kaninchen

Die Versuchsdauer betrug 42 Tage. Das Produkt wurde intravenös in zunehmenden Dosen von 2 bis 32 mg/kg/Tag verabreicht.

Das Produkt wurde ebenfalls intravenös für 21 Tage in zunehmenden Bösen von 20 bis 100 mg/Hund/Tag verabreicht.

Unter den vorstehend genannten Versuchsbedingungen wurde das Produkt " HPA 23" von den Versuchstieren, d.h. von Merrschweinchen, Kaninchen und Hund, gut vertragen. Beim Meerschweinchen ist jedoch eine Schmerzerscheinung bei subkutaner Verabreichung sowie eine lokale nekrotische Erscheinung nach diesen Injektionen festzustellen. Für diese Tiergattung scheint die Verträglichkeit bei intravenöser Verabreichung besser zu sein. Beim Kaninchen wurden ebenfalls paravenöse Nekrosen festgestellt.

Bei den drei Tierarten war die allgemeine Verträglichkeit gut. Das Produkt wurde an 42 aufeinanderfolgenden Tagen

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- ίο -

beim Meerschweinchen und beim Kaninchen und 21 Tage beim Hund injiziert. Nach Beendigung der Versuche wurden alle Tiere getötet und die Organe histfologisch und.anatomisch untersucht. Keine Anomalie wurde festgestellt. Dies lässt auf eine gute Verträglichkeit des Produktes schliessen. Alle Tiere wurden auf die Entwicklung des Gewichts und die Temperatur überwacht. Beim Hund wurde ausserdem eine tägliche Nieren- und Leberbilanz aufgestellt. Alle diese Paktoren waren normal.

III. Untersuchung der antiviralen Wirkung des Produkts

HPA 2? \

Die folgenden Versuche wurden durchgeführt:

a) in vitro: . ; a-, ) Hemmung der Bildung von Herden durch das sarkomatogene Moloney-Virus auf Fibroblasten der embryonalen Maus.

a₂) Hemmung der Vermehrung des leukämogenen Virus (Test X, C nach P.W. Rowe und Mitarbeiter, Virolory,* 1970, 42, 1136.)

a-*) Hemmung der Polymerisationsreaktion, die zur RNS-abhängigen DNS-Polymerase führt, gemäss D. Baltimore, Nature 225 (I97O) 1209.

b) in vivo;

Friend'sehe Leukämie,

Leukämie, die durch Einimpfen des "Plasma variant" von Chirigos ,ausgelöst wird.

Bildung von Tumoren an neugeborenen Mäusen durch den sarkomatogenen Moloney-Virus.

Die leukämogene Wirkung und die Entwicklung der Krankheit wurden nach zwei verschiedenen Methoden verfolgt:

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. - 11 - j

a) Durch Entnahme der Milz der Tiere am 21. Tag nach der Impfung mit dem Virus und Vergleich des Gewichts der Milz der behandelten Tiere mit der der unbehandelten Tiere. ;

b) Ermittlung der Überlebenszeit der behandelten Tiere

im Vergleich zu der den unbehandelten Tieren. j

Hemmende Eigenschaften des Produkts HPA 23 "in vitro" 1) Hemmung der Bildung von Herden I

Die nach der Methode von Reed und Muench berechnete DIc₀ (hemmende Dosis bei 50 £ der Tiere) beträgt 15 Wg/ ml Medium. |

a) Eine direkte virulizide Wirkung auf das Virus ist . nicht vorhanden. Wenn das Virus und das Antimonwolframat (TA) bei steigenden Dosen 1 Stunde bei 0°C in Berührung gehalten werden, ist keine Senkung des Titers, sondern im Gegenteil eine Aktivierung

festzustellen (siehe Tabelle 2 ). |

b) Eine Fixierung des Antimonwolframats am Virus i findet nicht statt. Wenn Antimonwolframat Sb ^ verwendet und das Virus mit markiertem Antimonwolframat zusammengeführt und das Gemisch mit einem Dichtegradienten (5 bis 55 % Saccharose) zentrifugiert wird,erreicht das Virus das Gleichgewicht (1,14 bis 1,15 g/ml) und ist nicht radioaktiv markiert. Es hat somit das Antimonwolframat nicht an sich gebunden.

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Tabelle 2

Kontaktvirus-Antimonwolframat

Virus

Virus + TA 1 mg/ml Virus +TA 2 mg/ml Virus +TA 5 mg/ml Virus + TA 10 mg/ml

1 Std. ä 0⁰C + 4°C

1 Std. ä O⁰C + 4°C

1 Std. έ O⁰C + 4°C

1 Std. ä 0°C + 4°C

FPO 44

85

65 Aktivierung

TNTC

c) Ammoniumantimonwolframat ist für die Zellen bei den hemmenden Dosen nicht toxisch. Das Zellwachstum wird in Gegenwart von Antimonwolframat nicht beeinträchtigt. In behandelten Kolben werden die gleiche Zahl von Zellen und das gleiche Profil bezüglich des Einbaues von tritiiertem Thymidin (DNS-Synthese), von tritiiertem Uridin (RNS-Synthese) und von Selen-75-methionin (für die Protein-Synthese) wie bei den unbehandelten Kolben

wiedergefunden. j

d) Das Antimonwolframat wirkt weder bei der Vorbehandlung noch während der Absorption des Virus. Die beste Schutzwirkung wird erzielt, wenn das Produkt nach der Virusinfektion zugesetzt wird. ;

2) Hemmung der Bildung von Syncytia (Test X C): : Die hemmende Dosis 50 % beträgt l6 ug/ml Medium (siehe Versuchstyp in Tabelle J5).

3) Hemmung der Polymerisationsreaktion, die RNS-abhängige DNS-Polymerase eintreten lässt:

a) Versuchsbericht von D. Baltimore,

b) exogene Reaktion: Initiator rA-Oligo dT,

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c) DL₁-Q : 1,4 iig/ml Reaktionsmedium '

d) sofortiger Stillstand der Polymerisationsreaktion bei Zugabe des Antimonwolframats; ^!

die Hemmung ist nicht reversibel, wenn eine Enzymlösung mit einer Heteropolyaniondosis inkubiert wird, die eine Hemmung von 50 % ergibt, und auf 1/10 verdünnt, wird die Reaktionsgeschwindigkeit nicht verändert. Dies bedeutet, dass die Hemmung nicht aufgehoben wird.

Das Antimonwolframat hemmt die Polymerasen, reagiert nicht mit den Ribonucleasen und den Desoxyribonucleasen, ist ohne Wirkung auf die Proteasen (Pronase, Pepsin, Trypsin) und bindet sich nicht an die Proteine (Albumin). . ;

Tabelle

Probe

XC - Test

Dosis mittleres Hemmung -⁰^n 7/ml Syncytium % y/mi

Vergleichsversuch

35

Antimonwolframat (TA)

9 15

74 57

16

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4) Hemmende Wirkung von Antimonwolframat auf verschiedene Oncornaviren:

a) Tollwutvirus:

Versuche hatten die folgenden Ergebnisse: DI₅₀: 4/Ug/ml;

keine direkte Wirkung auf das Virus; ungiftig für die Zellen bei den angewandten Dosen.

b) andere Viren:

Das Produkt HPA 23 hat in vitro-Wirkung auf andere Viren, z.B. das Virus der vesikulärem Stomatitis-.(VSV) und das Enzephalomyokarditls-Virus der Maus.

Hemmende Eigenschaften in vivo

Vorstehend wurde gezeigt, daß das Ammoniumantimonwolfrarnat eine sehr starke antivirale in-vitro-Wirkung hat. Versuche wurden durchgeführt, um die antivirale in-vivo-Wirkung nachzuweisen. Diese Versuche erstreckten sich auf experimentelle Leukämien bei der Maus, die Friendsche Leukämie und die durch das "Plasma variant" von Chirigos induzierte Leukämie, wo Messungen der Leukämie durchgeführt werden können, nämlich 1) Messung des Grades der Splenomegalie am 21. Tag und 2) Messung der Uberlebensdauer der Tiere, denen Antimonwolframat verabreicht worden ist oder nicht.

Tabelle 4 zeigt die Antiviruswirkung des Antimonwolframats auf zwei Typen von Leukämien. Das Produkt wurde 30 Minuten vor dem Virus injiziert (bemerkenswert ist die starke Abnahme der Splenomegalie). Es handelt sich sicherlich um eine Verminderung der Virusbildung, denn der Titer des Virus in der Milz oder im Plasma der behandelten Mäuse bestimmt und mit den Vergleichstieren verglichen wird, sind nur sehr wenig Viren wiederzufinden (Tabelle 5)·

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In Tabelle 6 sind Versuche zusammengefaßt, bei denen die Dosis des Antimonwolframats verändert wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß ein ausgezeichneter Schutz bis 10/Ug/Maus (eine einzige Injektion) erzielbar ist.

Tabelle 7 zeigt, daß es nicht notwendig ist, daß das Virus und das Produkt auf dem gleichen Wege injiziert werden, um eine Wirkung zu erzielen. Lediglich die orale Verabreichung ist unwirksam (Versuch 5)·

Tabelle 8 zeigt, daß die geschützten Tiere gegen das Virus imunisiert sind. Wenn nämlich eine neue Dosis des Virus den behandelten und geschützten Mäusen injiziert wird, ist festzustellen, daß sich bei den Tieren die Krankheit nicht entwickelt.

Tabelle 4

Wirkung von 5-Wolfram-2-antimonat auf Leukämien, die durch das Friendsche Virus (FLV) und das "Plasma variant" (PV) verursacht werden

Impf	Versuch Behandlung	mittleres Ge	statistische Sig
virus	+ )	wicht der Milz	nifikanz, ρ
		(mg)
FLV	ohne Be
	handlung	1250
	1 "2 mg	254	0,001
	1 mg	235	0,001
FLV	ohne Be
	handlung	2814
	2 2 mg	327	0,001
	1 mg	267	0,001
PV	ohne Be
	handlung	607
	3 2 mg	166	Οι,ΟΟΙ
	1 mg	228	0,001

+) Eine intraperitoneale Injektion von 5-Wolfram-2-antimonat wurde 30 Minuten vor dem Beimpfen mit den Viren vorgenommen .

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Tabelle 5

Bestimmung des Virus der Friendschen Leukämie im Plasma und in den Milzextrakten

Gruppen mittleres Ge-

wicht der Milz,

mg . im Plasma

Titer der Viren/0,2 ml

in der Milz

ohne Behandlung 2584

behandelt mit

2 mg TA 245

10⁵ SD

50
SD

50

4 2

SD

50

10² SD

Tabelle 6

Beziehung der Dosis	zur Wirkung	von 5-Wolfram-	Milz, mg	fikanz, ρ
2-antimonat auf die	Friendsche	Leukämie	1201
Versuch Behandlung '■ mittleres Gewicht statistische Signi-	278
der	221	0,001
keine Behandlung	237	0,001
2 mg	239	0,001
1 mg	2195
1 0,5 mg	234	0,001
0,2 mg	228	0,001
keine Behandlung	199	0,001
0,5 mg	290	0,001
2 0,2 mg	I35O
0,1 mg	208	0,001
0,05 mg	292	0,001
keine Behandlung	314	0,001
2 mg	3^5	0,001
1 mg	376	0,001
3 0,5mg	361	0,001
0,1 mg
0,05 mg
0,01 mg

Die Beimpfung mit dem Produkt TA und den Viren erfolgte intraperitoneal am Tag 0

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keine Behandlung	2814
i.p.	639
i.p.	33^
subkutan (s.c.)	1030
intramuskulär (i.m.)	599
keine Behandlung	932
i.p.	283
i.p.	349
i.m.	34i
s.c.	348

Tabelle 7

Vergleich der verschiedenen Injektionsarten des 5-Wolfram-2-antimonats und der Friendschen Leukämie-Viren

Versuch Injektion Verabreichung des TA mittleres Gewicht Nr. des Virus +) der Milz

i.p.

keine Behandlung 1245 i.p. i.p. (in Mischung mit

den Viren) 205

i.p. (getrennt) 235

i.p. . i.p. 240

keine Behandlung 2638

5 mg täglich in
i.p. . Mischung mit dem

Futter 2370

' Das Produkt TA wurde am Tag 0 verabreicht. Bei allen Versuchen außer Versuch 5 wurde eine einfache Injektion von 1 mg Produkt vorgenommen. Außer beim Versuch 3 wurden die Injektionen intraperitoneal 30 Minuten vor dem Beimpfen mit den Viren vorgenommen

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Tabelle 8

Resistenz von Mäusen, die mit den Friendschen leukämie-Virus (FLV) und 5-Wolfrarn-2-antimonat vorbehandelt wurden, gegen eine Kontrol !dosis von FLV

Versuch Vorbehandlung Impfung mit den Kon- mittleres Gewicht Nr. troll viren (Dosis und der Milz 3 Wo-

Tag) chen nach der Kontrol!dosis

	keine Behandlung	50	3D )	am 21. Tag	2199
		10 5	^SD50) ^SD50j	Tag	2251 1754
1	Injektion i.p. von 20 SD₅₀ von FLV und 2 mg TA am Tag 0	20 5	j SD₅₀) ^SD50) ^SD5o\|	am 42. Tag	509 363
2	keine Behandlung	10 5 2,5	^SD50> ^SD50)	am 42. Tag	2554 I623 445
	Injektion i.p. von 20 SD™ von 50 FLV und 2 mg TA am Tag 0 und am Tag 21	10 2,5	SD₅₀) ^SD50) ^SD50)	393 304 227

Untersucht man die Uberlebensdauer der Tiere, so 1st festzustellen, daß alle Vergleichstiere am 30. Tag eingegangen waren. Die meisten behandelten Tiere überlebten bis zum 85. Tag. Das Plasma und die Milz der überlebenden Tiere wurden entnommen. Nach Beimpfen von normalen Mäusen wurde festgestellt, daß diese Mäuse keine Leukämie entwickelten. Die behandelten Tiere waren somit gesundet.

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Es wurde ferner festgestellt, daß die Behandlung wirksam sein kann, wenn sie nach dem Ausbruch der Krankheit vorgenommen wird. Es gibt einen guten Schutz, wenn das Produkt an den Tagen 2 - ^ - 6 - 8 oder auch in Form einer einzigen Injektion am 10. Tag oder in Form von mehreren Injektionen an den Tagen 14, 16, 18 und'20 verabreicht wird. ;

Weitere Versuche haben die Verzögerung im Auftreten von Tumoren, die durch das Moloney- Sarcom induziert wurden, bei neugeborenen Mäusen ergeben. Schließlich schützt das Antimonwolframat die Mäuse gegen einelOCJaig tödliche Dosis des EMC-Virus (Enzephalomyokarditis). ■

Schlußfolgerung !

Ammoniumantimonwolframat hat ein großes antivirales Spektrum.

Es ist in vivo wirksam und wird gut vertragen. j

Die vorstehenden Versuchsergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit der Heteropolyanionverbindungen, die Wolfram in Kombination mit Antimon enthalten, bei der Behandlung von Virusaffektionen. So ist das Produkt TA oder HPA 2j5 ein wertvolles Antivirusmittel. Es ist besonders wirksam in vivo auf die leukämogenen und sarcomatogenen Viren. Es hat ferner in -vivo-Wirkung auf die Viren der Enzephalomyokarditis.

Die Verabreichung erfolgt durch Injektionen. Als Dosierungseinheit sind somit sterile Ampullen mit der wirksamen Konzentration. Der Wirkstoff kann mit einem für die Injektion geeigneten Träger kombiniert sein. Bei Anwendungen .in der Veterinärmedizin eignet sich als Träger eine wässrige Lösung oder ein Mineralöl. Beim Menschen werden 0,9#ige wässrige Kochsalzlösungen bevorzugt, die sich als Träger eignen, der bei einem pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes injiziert werden kann. Der Wirkstioff ist in einer solchen Lösung vollständig löslich. · .

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Bei einer vorteilhaften Form der Verabreichung wird der wässrigen Lösung des Wirkstoffs unlösliches Kalciumphosphat beispielsweise in einer Menge von 5 mg/ml Lösung zugesetzt. Versuche an Mäusen haben ergeben, daß man in dieser Weise ein Retardmedikament bilden kann.

Das Produkt HPA 2J* (radioaktive Form), das an Kalciumphosphat in wässriger 0,9$iger Kochsalzlösung gekoppelt war, wurde Mäusen intraperitoneal injiziert. Täglich wurde eine Maus getötet und die Lokalisierung des Produkts vorgenommen. Der größte Teil des Produkts findet sich in der Leber (hepatitische Lokalisation), ein verhältnismäßig großer Teil in den Nieren und ein weniger großer Teil in den Lungen wieder. Unter diesen Bedingungen bleibt das Produkt mehr als 15 Tage im Organismus des Tieres. In Abwesenheit von Kalciumphosphat ist das Produkt in fünf Stunden ausgeschieden. Im Gegensatz hierzu geht es nach Zusatz von Kalciumphosphat sehr allmählich in die Organe über, und im Laufe der Zeit ist seine Ausscheidung im Urin im steigenen Maße festzustellen.

Die Erfindung ist nicht auf die vorstehenden Angaben begrenzt. Die Salze von 5-Wolfram-2-antimonat können als Wirkstoffe in ArzneimittelZubereitungen verwendet werden, die in einem großen Bereich von Virusinfektionen für eine prophylaktische oder heilende Behandlung anwendbar sind. Diese Arzneimittel können auch mit anderen Mitteln mit Antiviruswirkung kombiniert sein. :

Vorstehend wurde erwähnt, daß das Ammonium-5-wolframpant imonat (AmTA) in vitro und in vivo gegennurine leukämogene und sarcomatogene Viren wirksam ist. Es wurde ferner gezeigt, daß AmTA eine starke antivirale in-vitro-Wirkung hat und Mäuse gegen Infektionen durch Viren der Enzephalomyokarditis schützt.

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Die in vitro-Aktivität von AmTA auf die zytopathogenen Effekte, die durch die RNS-Viren und die DNS-Viren induziert werden, wurde an Kulturen von Affennierenzellen und menschlichen WI-38-Zellen untersucht, die in einem Medium, das 10$ Kaiteserum enthielt, gezüchtet wurden.

In den Kulturen der Affennierenzellen und der menschlichen Zellen WI-38 betrug die höchste nicht-zytotoxische Konzentration von AmTA 125/Ug/ml Medium, wenn das AmTA den zusammenfließenden Monoschichten zugesetzt wurde. Keinerlei Hemmung des Zellwachstums wurde festgestellt, wenn die Verbindung in einer Konzentration von 30/Ug/ml den Kulturen im Augenblick der übertragung der Zellen in das Medium zugesetzt wurde. Wenn die Kulturen eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem Virus mit AmTA-Konzentrationen zwischen 15 und 125/Ug/ml behandelt wurden, wurde eine erhebliche Hemmung des zytopathogenen Effekts (ZPE) zahlreicher DNS-Viren oder RNS-Viren erzielt." In Tabelle 9 sind die Ergebnisse genannt, die einerseits durch den VR-Koeffizienten (virus ratings) und andererseits durch die 50$ hemmenden Dosen ausgedrückt sind. Der VR-Koeffizient mißt die Hemmung des zytopathogenen Effekts des Virus durch die Testverbindung bei verschiedenen Konzentrationen, wobei von der höchsten nichtzytotoxischen Dosis ausgegangen wird. Im Falle des menschlichen Rhinovirus vom Typ IA wurde gezeigt, daß die Hemmung der Bildung neuer Viren, d.h. der Vermehrung der Hemmung des zytopathogenen Effekts parallel lief. Die Kinetik der hemmenden Wirkung wurde am' Rhinovirus IA und am Virus von Herpes simplex (HF) untersucht.

a) Wenn das AmTA in einer Konzentration von j50/Ug/ml eine Stunde vor dem Beimpfen mit dem Virus zugesetzt und anschließend in den Kulturen gehalten wurde, war es sehr wirksam. * '

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b) Wenn jedoch die Kulturen für zwei Stunden mit 125 /Ug/ml AmTA behandelt und unmittelbar vor dem Beimpfen mit dem Virus gewaschen wurden, wurde keinerlei hemmende Wirkung festgestellt.

c) Eine deutliche Verminderung der Antiviruswirkung wurde festgestellt, wenn die Kulturen zur Entfernung der aktiven Verbindung zwei Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus gewaschen wurden: VR = 0,7 im Vergleich zu 1,8 im Falle der nicht gewaschenen Kulturen.

d) Bei den beiden Viren wurde noch eine starke hemmende Wirkung (VR = 1,0) festgestellt, wenn das AmTA den Kulturen sechs Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus mit einem geringen Vielfachen der Infizierung erforderlichen Menge (>0,01 TCID^n/Zelle) zugesetzt wurde, aber eine Wirkung war kaum vorhanden, wenn das Produkt 24 Stunden nach dem

. Beimpfen mit dem Virus zugesetzt wurde ( VR = 0,2). Das AmTA hat keine direkte deaktivierende Wirkung auf die Infektiösität des Rhinovirus IA und des Influenzavirus Ap, wenn die Virussuspensionen mit einer Lösung von 2,5 mg/ml AmTA eine Stunde bei 57 C inkubiert werden.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem Virus der Enzephalomyokarditis (EMC), Stamm V77, erhalten. Die LB 57-Zellen wurden im minimalen Eagle-Medium mit 10$ Serum des embryonalen Kalbs kultiviert. Die Dauer der Wirkung von AmTA wurde nach der Plaque-Methode untersucht. Die Ergebnisse eines typischen Versuchs mit 40/Ug AmTA/ml sind in Tabelle 10 genannt. Ebenso wie beim Rhinovirus IA und dem Virus von Herpes simplex waren die Vorbehandlung und die Behandlung während der Absorption unwirksam. AmTA war in der letzten Phase der Vermehrung des Virus wirksam.

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Tabelle 9

Antiviruswirkung	von AmTA auf	Zellkulturen	ID₅₀ +++) /Ug/ral
VIrUS⁺^	Zeilsub strat	VR⁺⁺⁾ Virus ratings	11
Adenovirus Typ 5	KB	1,7.	22
Coxsackie A-2	WI-38	1,0	125
Coronavirus (229E)	WI-38	0,4	-
Rhinovirus des Pferdes	Affenniere	0,0	<22
Herpes simplex Typ I (Stamm HF)	Affenniere	1,2	<n
Herpes simplex Typ I (Stamm HF)	WI-38	2,1	<22
Herpes simplex Typ I (Virtue) Influenza Α2/ΗΚ/68⁺⁺⁺⁺^ Synzytiumvirus "respi- ratoire (long)"	WI-38	1,2	<22
Rhinovirus Typ IA	Affenniere Affenniere	1,5 0,0	<22
Rhinovirus Typ IA	WI-38	1,5	<11
Rhinovirus Typ IB	Affenniere	1,7·	<11
Vakzine (WR)	WI-38	2,3	125
Affenniere	0,6

' In jeder Zellkultur, die in dem mit 2% Kalbsserum ergänzten Medium B-ME gehalten wurde, wurde das AmTA eine Stunde vor dem Beimpfen mit 10 bzw. 100 TCID™ der Testviren in
einer Konzentration von 125, 60, 30, 15 und 7 /Ug/ml zugesetzt. I

⁺⁺"'VR ist das Maß der Hemmung des zytopathogenen Effekts des Virus durch die Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen, wobei von der höchsten nicht-zytotoxischen Dosis ausgegangen wird. ■

Ein VR-Wert von 1,0 entspricht einer deutlichen Antivirus-

0,^<VR<0,9 entspricht einer mäßigen Antiviruswirkung.
0,1 ^ VR £0, ^JJ entspricht einer schwachen Antiviruswirkung.

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⁺⁺⁺) hemmende Dosis 50$

⁺⁺⁺) Die Vermehrung des Virus wurde in diesem Fall durch Blutadsorption, aber nicht durch einen zytopathogenen Effekt verfolgt.

Tabelle 10

Wirkung von 5-Wolfram-2-antimonat auf die Bildung von Plaques durch EMC (Stamm V?7)

Behändlungs- Zahl der
dauer Plaques

mittlere Hemmung statlsti-Zahl der % sehe Signi-Plaques fikanz

keine Behandlung 41-28-^1-29 32

O-3O Min. 39-20-35-34-31 32

30 Min.bis

24 Std. 12-9-12-9-9 ' 10

0 bis 24

Std. I6-I3-2I-I5-I8 16

69 54

NS

P<0,001

Die Zeit 0 ist die Zeit der Beimpfung mit dem Virus. Dem Kulturmedium der behandelten Gruppen wurde AmTA in einer Menge von 40/Ug/ml zugesetzt.

Die antivirale in vivo-Wirkung von AmTA wurde bei mehreren letalen Infektionen der erwachsenen Charles River-Maus CD-I untersucht. In Tabelle 11 sind die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen zusammengestellt, die im wesentlichen mit dem Virus der Enzephalomyokarditis (EMC), Stamm ATCC VR 129, vergleichbar sind. Ein starker Schutz der Tiere wurde festgestellt, wenn die Verbindung intraperitoneal (i.p.) oder subkutan (s.o.) eine Stunde vor dem Beimpfen mit 6-10 TCID/Maus verabreicht wurde, während orale Behandlungen unwirksam waren.

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Tabelle 11

Wirkung von AmTA auf die Infektion der Maus mit dem Virus der Enzephalomyokarditis

Unbehandelte 100 mg/kg i.p. 50 mg/kg i.p. 50 mg/kg i.p. Vergleichstiere 1 Behandlung 1 Behandlung 3 Behandlungen

4/120 (3,3 %) 54/85 (63,5 %

(P 0,001)

24/35 (68,5
(P 0,001)

31/45 (68,8 %) (P 0,001)

mg/kg i.p. 100 mg/kg s.c. 500 mg/kg p.o. 500 mg/kp p.o. Behandlung 3 Behandlungen 1 Behandlung 3 Behandlungen

5/20 (25
(P 0,001)

13/30 (43,3 g) 3/30 (10 (P 0,001) NS

3/30 (10 fo)

NS

Bei. den Versuchen, deren Ergebnisse in Tabelle 11 genannt sind, wurden die Viren subkutan injiziert, und zwar bei einer Behandlung einer Stunde vor der Verabreichung und bei drei Behandlungen eine Stunde vor, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Verabreichung von AmTA. Die Zahlen geben die überlebenden Mäuse im Verhältnis zur Gesamtzahl der infizierten Mäuse an.

b-

Tabelle 12

Wirkung von AmTA auf die Infektion der Maus mit dem EMC-Virus; Wirkung einer einzigen Behandlung zu verschiedenen Zeiten

Zeitpunkt der	100 mg/kg i.p.	50mg/kg i.p.	I behandelte	_
Behandlung			Vergleichs
			tiere
1 Stunde vor der	21/30(7Og)	9/15(60g) 4	/50(13,5*)
Infektion mit dem	P^O,001	PirO, 001
Virus
4 Stunden nach der	18/30 (60g)	4/15 (26,7g)	-
Infektion mit dem	P^O,001	NS
Virus
24 Stunden nach der	3/30 (log)	0/15 (og)
Infektion mit dem	NS	NS

Die Versuchstiere wurden mit-dem Virus subkutan beimpft. Die Zahlen geben die überlebenden Mäuse im Verhältnis zur Gesamtzahl der infizierten Mäuse an.

Die wirksamste Dosis betrug 5o mg/kg i.p., d.h. sie war fünfzehnmal niedriger als die akute Toxizität DL^₀ für die Maus bei dieser Art der Verabreichung und 7 mal geringer als die subkutane DL₅₀ (Behandlungen an 5■aufeinanderfolgenden Tagen). Die schwächste Dosis, die einen Gewichtsverlust verursachte, ist fünfmal höher (250 mg/kg i.p.), aber eine leichte vorübergehende Beruhigung wird noch bei einer Konzentration von 60 mg/kg i.p. festgestellt. Mit einer einzigen Behandlung mit 100 mg/kg i.p. (Tabelle 11) und mit einer niedrigeren Dosis 50 mg/kg i.p. wurde noch ein starker Schutz gegen EMC erzielt, wenn die Mäuse die Verbindung 4 Stunden nach dem Beimpfen mit dem Virus erhielten,

Dies ist verhältnismäßig spät,wenn berücksichtigt wird, dass bei diesem Versuchssyotem die unbehandelten Tiere 4 bis 5 Tage nach dem Impfen eingehen. Wenn jedoch die Mäuse mit dem Stamm V 77 von EMC infiziert wurden, war der Schutz, der mit AmTA unter gleichen Versuchsbedingungen erzielt wurde, viel weniger deutlich, aber immer noch stark. ■ i

Es wurde gefunden, dass AmTA wirksam gegen die Infektion mit dem EMC-Virus war, aber keinerlei Schutzwirkung gegen die Infektion der Maus mit den folgenden Viren ausübte: Herpes simplex (Stamm Virtue) bei Impfung i.p., i.v. oder i.e., Semliki Forest Arbovirus (s.o.), West Nile Arbovirus (i.p.), Virus der Maul- und Klauenseuche, angepasst an die Maus Typ C, und Virus A 2/ANN Arbor/2/62. Die Verbindung war auch unwirksam gegen die auf Herpes simplex zurückzuführende Virusinfektion, wenn sie an der gleichen Stelle wie das Virus (i.v. oder i.e.) verabreicht wurde, und gegen das Grippevirus (Influenza), wenn sie intranasal in einer Konzentration von 100 mg/kg wiederholt vor und nach dem

Beimpfen mit dem Virus verabreicht wurde. ]

Abschliessend ist festzustellen, dass AmTA ein weites antivirales Wirkungsspektrum in Zellkulturen hat. Unter den Versuchsbedingungen der vorliegenden Erfindung hat AmTA keine viruzide Wirkung auf diese Viren und hemmt nicht die Absorption und Penetration der Viren.

Es wurde gefunden, daß AmTA eine wiederholte Wirkung in vivo nur gegen die murinen Leukomogenen Viren und Enzephalomyokarditis (EMC)-Infektionen hatte.

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Claims

' - 28 Patent ansprüche

Heteropolyanionverbindung der allgemeinen Formel

ihre Hydrate und pharmazeutisch unbedenklichen Salze.

2) Arzneimittelzubereitungen, enthaltend eine Heteropolyanionverbindung, die Wolfram an Antimon gebunden enthält, in Form des 5-Wolfram-2-antimonions, oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze.

5) Arzneimittelzubereitungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie die 5-Wolfram-2-antimon-Heteropolyanionverbindung als solche oder in Form von pharmazeutisch unbedenklichen Ammoniumsalzen oder Metallsalzen, z.B. Alkali- oder Erdalkalisalzen, enthalten.

4) Arzneimittelzubereitungen nach Anspruch 1 bis j5, dadurch gekennzeichnet, dass sie Hydrate der 5-Wolfram« 2-antimon-Heteropolyanionverbindung enthalten.

5) Arzneimittelzubereitungen, enthaltend als Wirkstoffe Wolfram-Antimon-Heteropolyanionverbindungen, die hergestellt wurden durch Umwandlung der in Anspruch bis 4 genannten Verbindungen unter dem Einfluss von Änderungen des p_TT-Wertes, und Gemische dieser Verbindungen.

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6) Arzneimittelzubereitungen nach Anspruch 1 bis 5>^:* dadurch gekennzeichnet, dass sie das Wolfr'amantimonat der Formel

(NH

in der das Kristallwasser nicht berücksichtigt ist, enthalten.

7) Arzneimittelzubereitungen nach Anspruch 1 bis 6 in Form von wässrigen Lösungen, die den Wirkstoff und Calciumphosphat enthalten.

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