DE2705610A1

DE2705610A1 - Vakzin und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2705610A1
Application number: DE19772705610
Authority: DE
Inventors: Marc K Dr Med Wallack
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1976-06-01
Filing date: 1977-02-10
Publication date: 1977-12-15
Also published as: FR2353641A1; FR2353641B1; AU511071B2; NZ182891A; US4108983A; DE2705610C2; GB1520200A; CA1073814A; JPS52148617A; AU2173577A

Description

27056 Ί

Dlpl.-lng. Heinz Bardehle /

Patentanwalt *

• Minckcn 22. Kr-rs'r. 15. TH. 29 25 55

Postanschnii »/Jcchti. 25. Postfach ⁴

München, den k./rb-;un.-; ι ;

Mein Zeichen: P 2446
Anmelder: The Wistar Institute, Philadelphia, USA

Vakzin und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Vakzin, das die Immunantwort eines an einem Tumor leidenden Säugers gegen Säugertumoren, insbesondere gegen Species-spezifische Säugertumoren,stimuliert. Unter Species-spezifischen Tumoren versteht man diejenigen Tumore , die für eine bestimmte Species von Säugern spezifisch sind. Die Tumore können induziert werden, beispielsweise der BALB/C peritoneale Makrophagentumor, als GMMSVI2 bezeichnet, bei männlichen Mäusen, oder können spontan auftreten, wie dies beim Dickdarmkrebs bei Menschen der Fall ist.

Das Phänomen der viralen Onkolyse oder der Lyse von Tumor-

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zellen durch Viren mit der hieraus resultierenden postviralen, onkolytischen Immunität war angenähert 30 Jahre lang ein Gegenstand der Krebsforschung. Einer der bemerkenswertesten Beiträge auf diesem Gebiet ist die Arbeit von J.Lindenmann mit dem Titel "Viruses as Immunological Adjuvants in Cancer", Biochimica et Biophysica Acta, 355 (1974). 49-75. Dieser Artikel gibt einen detaillierten Überblick über die Geschichte der viralen Onkolyse von ihrem Beginn im Jahre 1929 bis zum Jahre 1974. Lindenmann berichtete auch» daß Influenza-A-Virus befähigt ist, transplantierte Ehrlich-Ascites-Zellen in den peritonealen Kavitäten von A^G-Mäusen zu lysieren, wenn er direkt in die mit dem Tumor gefüllte peritoneale Kavität injiziert wurde. Bei den Mäusen, die die Influenza-Onkolyse überlebten, wurde festgestellt, daß sich eine postvirale onkolytische Immunität entwickelt hatte. Sie waren gegenüber einem neuerlichen Befall mit demselben Tumor resistent. Vgl. Lindenmann, "Immunity to Transplantable Tumors Following Viral Oncolysis", J. Immunology, Band 92, Seiten 912-919 (1964).

Asada injizierte Mumpsvirus direkt in Tumoren von Patienten mit verschiedenen Arten Krebs in der Endphase, und bei 25 Ί» der Patienten zeigte sich eine gewisse Unterdrückung des Tumorwachstums. Vgl. T. Asada "Treatment of Human Cancer with Mumps Virus", Cancer, 34 (1907, 1974). Es wurden auch zahlreiche andere Viren in Säuger mit Tumoren injiziert, um eine in vivo virale Onkolyse zu bewirken. Zu den verwendeten Viren gehören Vesicular Stomatitis Virus, Reovirus, Mumps Virus und West Nile Virus. Obgleich diese Technik vielversprechend ist, läßt sie sich in der Praxis nur schwierig anwenden, da die meisten, nach dem Stand der Technik beschriebenen onkolytischen Viren gegenüber dem Menschen schädlich sind,und Versuche zur direkten "in vivo"-Infektion menschlicher Tumorsellen haben zu unbefriedigenden Ergebnissen geführt.

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Es wurden auch Versuche unternommen, die Immunantwort von Säugern auf nichtspecies-spezifische, transplantierbare Tumoren, wie beispielsweise Ehrlich Ascites, zu stimulieren, indem man in vitro ein virales Onkolysat von Influenza-A oder Vesicular Stomatitis Virus herstellte,die ihrerseits in einer Suspensionskultur von Ehrlich Ascites Zellen hergestellt wurden. Mäuse, die mit dem viralen Onkolysat aus Ehrlich Ascites immunisiert wurden, waren gegenüber einem intraperitonealen Befall mit lebenden Ehrlich Ascites Zellen resistent. Vgl. Häkkinen et al., "Induction of Tumor Immunity in Mice with Antigen Prepared Prom Influenza and Vesicular Stomatitis Virus Grown in Suspension Culture of Ehrlich Ascites Cells", Journal of the National Cancer Institute, Band 46, Nr. 6, Juni 1971.

Bandlow et al. stellten fest, daß Vacciniavirus bei der Bildung heterologer, cytotoxischer Antikörper gegen Wirtszellen-Antigene als immunologisches Adjuvans wirkt, und daß Meerschweinchen eine erhöhte, zellen-vermittelte Immunität gegen Wirtszellen-Antigene aufweisen, nachdem sie mit Gewebekulturzellen, die mit Vacciniavirus infiziert worden waren, immunisiert wurden. Vgl. Bandlow et al "Untersuchungen zum Mechanismus der immunologischen Adjuvanswirkung des Vacciniavirus", Archiv für die gesamte Virusforschung 38, 192-204 (1972) und "Increased Cellular Immunity Against Host Cell Antigens Induced by Vacciniavirus", Archiv für die gesamte Virusforschung 45» 122-127 (1974).

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein vlrus-lysiertes Species-spezifisches Tumorzellenvakzin (virales Onkolysat) für Säuger zu schaffen, bei dem es sich um ein aktives immunotherapeutisches Mittel gegen Species-spezifische Säugertumoren handelt und das keine schädliche Wirkung auf den Säuger ausübt.

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Die Erfindung soll ein virus-lysiertes Tumorvakzin (virales Onkolysat) schaffen, das ein aktives immunotherapeutisches Mittel gegen einige menschliche Tumoren bei Patienten darstellt. Erfindungsgemäß soll auch ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Onkolysat-Vakzins für Species-spezifische Tumorzellen geschaffen werden. Es soll ein Vakzin bereitgestellt werden, bei dem es sich um ein virales Onkolysat des autochthonen Tumors eines Patienten handelt, wobei das Vakzin zur Stimulierung des Immunmechanismus bestimmter Patienten gegen den autochthonen Tumor des zuerst genannten Patienten verwendet werden kann. Erfindungsgemäß soll schließlich ein Vakzin geschaffen werden, bei dem es sich um ein virales Onkolysat eines Species-spezifischen Tumors, insbesondere eines spontanen, malignen Tumors han^ delt, wobei das Vakzin zur Stimulierung des Immunmechanismus anderer Patienten derselben Species, die von demselben Typ von Tumor befallen wurden oder potentiell befallen sind, verwendet werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Vakzin zur Stimulierung des Immunmechanismus von Säugern gegen Speciesspezifische Tumoren gelöst» das aus einem viralen Onkolysat des genannten Tumors und einem Virus mit einer lytischen Wirkung auf die Zellen des Tumors besteht, wobei der Virus für den Säuger wesentlich weniger pathogen als der genannte Tumor ist und das virale Onkolysat das Produkt einer in vitro Onkolysereaktion darstellt.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Vakzin zur Stimulierung des Immunmechanismus von Säugern auf Species-spezifische Tumoren geschaffen, das dadurch hergestellt wurde, daß man einem Säuger Tumorgewebe entnimmt und Zellen dieses Tumors in einem Kulturmedium züchtet, die Zellen mit einem Virus infiziert, der zur Lyse dieser Zellen

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befähigt ist_t wobei dieser Virus für den Säuger weniger pathogen als der Tumor ist» und die Zellen und den Virus kultiviert, bis eine Onkolyse eingetreten ist.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzine, das zur Stimulierung des Immunmechanismus von Säugern auf Species-spezifische Tumoren, insbesondere spontane maligne Tumore, geeignet ist, geschaffen, bei dem man Zellen des Tumors in vitro mit einem Virus infiziert, der für den Säuger wesentlich weniger pathogen als der genannte Tumor ist, die mit Virus infizierten Zellen unter Kulturbedingungen hält, bis ein virales Onkolysat gebildet ist und das Onkolysat erntet.

Das so hergestellte Onkolysat ist zur Verabreichung an den Säuger geeignet.

Es ist wesentlich, daß der Virus, aus dem das Onkolysat gebildet ist, für den Säuger weniger pathogen ist als der Tumor, da anderenfalls wenig erreicht würde, falls der Säuger von der mit dem Virion verbundenen Krankheit befallen wird und ihr erliegt. Es ist auch erforderlich, daß der Virus auf die Tumorzellen, insbesondere auf menschliche Tumorzellen, eine lytische Wirkung ausübt. In dieser Hinsicht wurden erfindungsgemäß in vitro die Vakzinestärken von sechs viralen Vakzinen (Masern, Mumps, Rubella, Gelbfieber, Rabies und Vakzinia) gegen vier menschliche Tumorbefälle, Melanom, Lunge, Pharynx und Eierstöcke, untersucht. Hierbei wurde festgestellt, daß nur Vaccinia Vakzin auf die menschlichen Tumoren eine lytische Wirkung derselben Art wie der Influenza-Virus bei Ehrlich Ascites Zellen, besitzt. Darüber hinaus ist aufgrund der Tatsache, daß die Sicherheit von lysierten Tumorzellen-Vakzinen und Vaccinia Vakzin als solchem gegenüber dem Menschen schon früher festgestellt wurde, ein aus Vacoinia-lysierten Tumorzellen hergestelltes

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Onkolysat nicht schädlich. Obgleich die meisten Menschen schon früher einmal als Schutz gegen Pocken mit Vaccinia inokuliert worden sind, hat überraschenderweise diese frühere Innokulierung keinen Einfluß auf die Wirksamkeit des Vakzins.

Obgleich erfindungsgemäß Vacciniavirus als der zur Herstellung des viralen Onkolysats gebrauchte Virus gewählt wird, ist die Erfindung nicht alleine auf die Verwendung von Vacciniavirus beschränkt, da jedes andere lebende Virusvakzin gebraucht werden kann, soweit der Virus in der Lage ist, die Tumorzellen zu lysieren und gegenüber dem Säuger in den das virale Onkolysat injiziert werden soll, weniger pathogen als die Tumorzellen als solche ist.

Nach derzeit allgemein anerkannter Theorie sind alle Tumorzellen einer besonderen Art durch ein gemeinsames Tumor-Antigen gekennzeichnet, das sich üblicherweise an der Oberfläche der Tumorzelle befindet. Während ein Species-spezifischer Tumor in seiner spezifischen Wirts-Species wächst, wird der Immunmechanismus des Wirts auf irgendeine Weise unterdrückt oder ausgeschaltet. Wenn man jedoch Species-spezifische Tumorzellen durch lebenden Vacciniavirus lysiert, vereinigen sich das Antigen des Virus und das Antigen des Tumors unter Bildung eines Neo-Antigens, das nach der Injektion in einen Patienten dazu dient, den Immunmechanismus des Patienten gegen das Neo-Antigen und das Tumor-Antigen zu stimulieren. Dies erfolgt in höchst überraschender Weise auch dann, wenn der Wirt mit Vaccinia-Vakzin präimmunisiert ist. Da Tumor-Antigene bestimmten Tumorvarietäten gemeinsam sind, ist das Vakzin gegen Tumoren wirksam, die dasselbe Antigen in denselben Specien von Säugern tragen, unabhängig vom besonderen Wirt, von dem der Anfangstumor erhalten wurde.

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Erfindungsgemäß wird in Betracht gezogen, ein großes Volumen an Laboratoriums-Gewebekulturen Species-spezifischer oder autochthoner Tumoren von Tumorvarietäten, wie Hepatomazellen, Dickdarmkrebszellen und dergleichen, zu unterhalten. Aus diesen Laboratoriumskulturen können Zellen zur Herstellung von frischem Vakzin entnommen werden. Das Vakzin sollte an Patienten verabreicht werden, deren Tumoren durch übliche chirurgische Techniken nicht erreicht werden können. Alternativ kann man Vakzin, das aus Tumorzellen hergestellt wurde, welche von einem Patienten erhalten wurden, zur Stimulierung des Iminummechanismus anderer Patienten mit derselben Tumorvarietät verwenden.

Experimente mit Mäusen haben die Sicherheit und Wirksamkeit des Vakzins gegen Species-spezifische Tumoren bei Tiermodellen bestätigt. Bei diesen Experimenten gab es keine Todesfälle aufgrund des Vakzins; darüber hinaus versagte bei den mit dem Vaccinia-Onkolysat prävakzinierten Tieren das Wachstum der Tumore.

Herstellung des Vakzins

Man kann das Vaccinia-Onkolysat herstellen, indem man Monoschichten von Tumorzellen mit 1 ml lebendem Vacciniavirus infiziert und 96 Std. lang inkubiert. Dann wird das Onkolysat gefroren und dreimal aufgetaut und durch Zentrifugieren der lysierten Zellentrümmer bei 39 10Og während 45 Minuten bei O⁰C gewonnen. Man entfernt die überstehende Flüssigkeit und resuspendiert das Pellet in Kochsalzlösung und homogenisiert, um die weitere Zerstörung der Zellen zu bewirken. Das Lysat wird wiederum bei 39 100 g zentrifugiert und konzentriert, um eine Konzentration von 1 χ 10 Vaccinla-lysierten Tumorzellen pro ml zu erhalten. Dieses endgültige Konzentrat bildet ein Vakzin aus Vaccinia-Onkolysat.

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Alternativ zur Infektion der Monoschichten ist es äußerst bevorzugt und bildet einen Teil der Erfindung» die Tumorzellen durch den Vacciniavirus zu infizieren, während die Ttunorzellen in Suspension gehalten werden, und zwar aufgrund der Leichtigkeit, menschliche Tumorzellen kurze Zeiträume in Suspension am Leben zu erhalten. Der Vorteil der Suspeneionskultur besteht darin, daß der zur Herstellung des viralen Vakzine verwendete Tumor in Monoschichtkulturen gegebenenfalls schwierig zu züchten ist, jedoch leicht während kurzer Zeiträume in Suspension gezüchtet werden kann. Wenn die einem Patienten entnommenen Tumorzellen in Suspension gehalten werden, können sie leicht mit dem Vacciniavirus infiziert werden und das Onkolysat Vakzin kann schnell hergestellt und in denselben Patienten oder einen anderen Patienten mit demselben Typ von Tumor, d.h. Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs und dergleichen, wieder injiziert werden.

1. Tierexperimente

a) Tiere

Alle Experimente wurden bei BALB/C männlichen Mäusen, die zum Zeitpunkt der Implantation der Tumor-Isotransplantate (tumor isografts) 8 bis 10 Wochen alt waren,durchgeführt. Jede behandelte Gruppe und die Kontrollgruppe bestanden aus willkürlich verteilten 6 bis 8 Mäusen.

b) Tumorzellen

Bei allen Experimenten wurde ein SV40-transformierter BALB/C peritonealer Makrophagentumor bei der männlichen Maus, als GMMSVIo bezeichnet, verwendet. Es wurden Tumorzellen in Dosen im Bereich von 1 χ 10 bis 1 χ 1O^y Zellen subkutan in den linken Schenkel der Mäuse injiziert.

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Al

c) Virus

Es wurde ein Vacciniavirus-Standardvakzin erhalten und auf WI-38 Zellen unter Standardsedingungen kultiviert, um den Titer des Vakzine zu erhöhen. Die Titer des Vakzins wurden auf Monoschichten von ¥1-38 Zellen in Eagle's minimalem, essentiellem Medium (MEM), das 3 % Rinderfötusserum (FBS) enthält, bestimmt. Der Titer des Vakzine wurde auf angenähert 1 χ 10 TOID^/ml angehoben. Wenn die Experimente die Prävakzination mit Vacciniavirus vor der Vakzination mit dem Vaccinia-Onkolysat erforderten, wurde der Virus in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor der Injektion auf 1:1000 verdünnt.

d) Herstellung des Vakzlns

Das Vaccinia-Onkolysat wird hergestellt, indem man Monoschichten von 1 χ 10 GMMSVI₂ Tumorzellen mit 1 ml Vacciniavirus (1 χ 10⁸ TCID^/ml) infiziert und 96 Std. lang inkubiert. Dann wird das Onkolyeat dreimal gefroren und aufgetaut und durch Zentrifugieren der lysierten Zelltrümmer bei 39 100 g während 45 Min. bei O⁰C gewonnen. Anschließend resuspendiert man das Pellet in 10 ml Eagle's MEM ohne FBS und führt die weitere Zellenzerstörung unter Verwendung einer Dounce-Homogenisiervorrichtung durch. Dieses Lysat wird dann wiederum bei 39 100 g zentrifugiert und in ausreichend Eagle's MEM ohne FBS suspendiert, um eine Konzentrierung auf 1 χ 10 Vaccinia-lysierte Tumorzellen pro ml herbeizuführen. Diese endgültige Konzentration stellt das bei sämtlichen Tierexperimenten verwendete Vaccinia-Onkolysat dar. Das Vaccinia-Onkolysat wird stets subkutan in den rechten Schenkel injiziert. Menge und Anzahl Behandlungen sind im Text und in den Figuren beschrieben.

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e) Ergebnisse

0,3 ml Vaccinia-Onkolysat wurde am 17.» 12., 7.» 3. und Tag subkutan in den rechten Schenkel von Gruppen von 6 bis 8 Mäusen injiziert. Diese erhielten dann am Tage 0 entwe-

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der 1 χ 10 , 1 χ 10 oder 1 χ 10 Tumorzellen subkutan in den linken Schenkel. Die Mäuse wurden angenähert 60 Tage überwacht.

Im Vergleich zu den Kontrolltieren blieb bei den mit dem Vaccinia-Onkolysat vor der Verabreichung der Tumorzellen prävakzinierten Mäusen die Entwicklung von Tumoren am Injektionsort aus.

Ebenfalls im Vergleich zu den Kontrolltieren traten bei 6 Mäusen» die mit 0,3 ml Vacciniavirus (mit PBS auf 1 χ 10"¹ TCID_Rn/ml verdünnt) subkutan in den rechten

A.

Schenkel präimmunisiert und anschließend mit 1 χ 10 Tumorzellen immunisiert wurden, keine Bildungen von Tumoren auf.

2. Versuche am Menschen

a) Menschen

Es wurden die folgenden Krebspatienten für die Behandlung mit dem Vaccinia-Onkolysat (Vakzin aus Vaccinia-lysierten, spontanen Tumorzellen) ausgewählt:

(1) Krebspatienten, bei denen Tumorresektionen durchgeführt worden waren und die Tumormetastasen an lokalen und/oder regionalen Lymphknoten aufwiesen;

(2) Patienten, die einer Bestrahlungstherapie für den lokalisierten, jedoch nicht resektionsfähigen Krankheit sort unterworfen worden waren;

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(3) Patienten mit disseminierter Erkrankung, die chemotherapeutisch behandelt, jedoch als Endstadium angesehen wurde;

(4) Patienten mit einer so weit fortgeschrittenen Erkrankung, daß sie als chirurgisch, chemotherapeutisch oder radiotherapeutisch nicht mehr behandelbar angesehen wurden. Alle bei diesen therapeutischen Untersuchungen teilnehmenden Patienten wurden informiert und erklärten ihre Zustimmung durch Unterzeichnung einer Ermächtigung zur Untersuchungstherapie und zeigten ein verzögertes Hypersensitivitäts-Ansprechen auf einen der üblichen nochmals durchgeführten Antigen-Hauttest zur Bestimmung der Immunokompetenz. Ein wesentliches Erfordernis lag darin, daß die Zellen eines Tumors chirurgisch erhältlich waren und in einer Gewebekultur, entweder in Suspension oder in Monoschicht vermehrt werden konnten.

b) Herstellung des Vakzins

Tumorgewebe, das dem Patienten im Operationsraum entnommen wurde, wurde wie folgt entwickelt:

(1) Diejenigen Teile des Tumors, die nicht nekrotisch, fettig oder hämorrhagisch sind, werden mit Skalpellen fein zerschnitten und in Eagle's MEM mit 20 # PBS (Rinderfötusserum) plus Penicillin und Gentamicin gegeben;

(2) Das zerteilte Gewebe wird in einen Erlenmeyer-Kolben mit 30 ml einer 0,25%igen Trypsin- 1#igen Versene-Lösung gegeben und mit einem Magnetfisch gerührt, um eine Suspension von einzelnen Zellen zu erhalten;

(3) Man verwendet angenähert 1 χ 10 TCIDc_n/¹¹¹¹ lebenden

Vacciniavirus, um 1 χ 10 /ml Tumorzellen in der Suspension zu infizieren;

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(4) Die Virus-Tumorzellen-Suspension wird 96 Std. bei 37⁰C in Spinner's Medium inkubiert» während sowohl die Lyse der Tumorzellen» wie auch der Titer des Virus überwacht werden;

(5) Die Vacciniavirus-lysierte Tumorzellen-Suspension wird 60 Min. bei O⁰C bei 39 100 g gedreht (zentrifugiert), die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und das erhaltene Pellet wird in 10 ml Eagle's MEM als gewonnenes Onkolysat suspendiert. Dann wird das Onkolysat in einem sterilen Homogenisierungsrohr gesammelt, 20mal einer Dounce-Homogenisierung unterworfen, 60 Min. bei O⁰C bei 39 100 g zentrifugiert und das Pellet wird in einer ausreichenden Menge Eagle's MEM resuspendiert, um eine Konzentration von 1 χ 10 Vaccinia-lysierten Tumorzellen pro ml zu erhalten. Diese 1 ml aliquoten Anteile werden für späteren Gebrauch bei O⁰C eingefroren. Das Vakzin kann bis zu 2 Jahre bei -70⁰C - 10⁰C gelagert werden.

c) Verabreichung des Vakzins

Das Vakzin aus dem Vaccinia-Onkolysat mit einer Konzentration von 1 ζ 10 Vaccinia-lysierten Tumorzellen pro ml wird in 1 ml Dosen injiziert. Jede Dosis wird aufgeteilt und intradermal in den Oberschenkel, den Oberarm und den vorderen Thorax injiziert, um die regionalen Lymphknoten zu stimulieren. Die Onkolysat-Injektionen werden drei Monate lang alle zwei Wochen verabreicht.

d) Überwachung der Patienten

Während der Immunotherapie wurden die nachfolgenden Laboratoriumsuntersuchungen alle vier Wochen durchgeführt:

(a) CBC;

(b) BUN;

(c) Glukose;

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(d) SGPT;

(e) SGOT;

(f) LDH;

(g) Bilirubin;

(h) alkalische Phosphatase;

(i) quantitative Immunoglobuline;

(j) PHA-induzierte Plastogenese;

(k) Lymphocyten-Cytotoxizität;

(1) Vaccinia-Antikörpertiter; und

(m) Anergie-Kontrolle und DNCB.

e) Ergebnisse

Insgesamt 13 Tumorpatienten erhielten die vollständige Vaccinia-Onkolysat-Immunotherapie. Diese Patienten stellen vier Fälle von Dickdarmkarzinom, zwei Fälle von Gastrokarzinom, drei Fälle von Melanom, zwei Fälle von Ovarkarzinom, einen Fall von Pharyngeakarzinom und einen Fall von Thyroidkarzinom dar.

Die Patienten sprachen auf die Vaccinia-Onkolysat-Immuno therapie wie folgt an:

(1) 0/13 Patienten zeigten nachteilige Reaktionen;

(2) 6/13 Patienten starben;

(3) 6/7 der überlebenden Patienten zeigten verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen an den Stellen der Vakzininj ektion;

(4) 6/6 Patienten mit positiven Hautreaktionen auf das Vakzin zeigten erhöhte Antikörper-Titer;

(5) 6/6 Patienten mit positiven Hautreaktionen auf das Vakzin hatten frühere positive Reaktionen auf

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Common Recall Antigene;

(6) 6/6 Patienten mit positiven Hautreaktionen auf das Vakzin zeigten eine positive Lymphocyten-Transformation zu PHA;

(7) 2/6 Patienten mit positiven Hautreaktionen auf das Vakzin wiesen nach der Immunotherapie eine Verminderung der Tumorbelastung auf.

Fallberichte der beiden Patienten, die auf die Behandlung ansprachen:

(1) Fall 1

Eine 61 Jahre alte weibliche Person hatte ein malignes Melanom der Stufe III, das vom Rücken zur linken Achselhöhle und zur Leber metastatisch war, mit resultierender Hepatomegalie und abnormen Leberfunktionswerten. Die Patientin erhielt Behandlungen mit dem Vaccinia-Onkolysat zu sechs 1 ml-Dosen in einem Abstand von jeweils 2 Wochen. Jede Dosis wurde aufgeteilt und intradermal in die Oberarme, in den vorderen Thorax und in die Schenkel injiziert, wo sie zu einem massiven, verzögerten Hypersensitivitäts-Ansprechen an diesen Orten führten. Die Patientin weist nunmehr einen normalen Leber-Scan auf, die Hepatomegalie ist verschwunden, die Leberfunktionsdaten sind normal und es findet sich kein Anzeichen einer neuen, metastatischen Erkrankung.

(2) Fall 2

D.J. ist eine Frau von 46 Jahren, die wegen eines Dukes B-Dickdarmkrebses eine Abdominal-Perineal-Resektion hatte. Die Patientin entwickelte einen massiven, reziditiven lokalen Perinealtumor, der ge-

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genüber einer Radiotherapie refraktorisch war. Dann erhielt sie in Abständen von zwei Wochen Behandlungen mit dem Vaccinia-Onkolyeat zu vier 1 ml-Dosen. Jede Dosis wurde aufgeteilt und in der Nähe der regionalen Lymphknoten injiziert, wobei zwei Injektionen direkt in die perineale Tumormasse gemacht wurden. Die Patientin entwickelte ein signifikant verzögertes Hypersensitivitäts-Ansprechen am Ort des Tumors nach den intratumoralen Injektionen. In der Folge wurde eine 5O$ige Verringerung der Tumorgröße festgestellt.

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Claims

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Patentansprüche

Ay Verfahren zur Herstellung eines Vakzins zur Stimulierung des Immunmechanismus von Säugern auf Speciesspezifische Tumoren, dadurch gekennzeichnet t daß man Zellen eines Species-spezifischen Tumors in vitro mit einem Virus, der für den Sauger wesentlich weniger pathogen als der genannte Tumor ist, infiziert, die mit dem Virus infizierten Zellen unter Kulturbedingungen hält, bis ein virales Onkolysat gebildet ist und das Onkolysat gewinnt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus den Vacciniavirus verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Tumor einen spontanen malignen Tumor einsetzt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Sauger um einen Menschen handelt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Virus infizierten Zellen in einer Suspensionkultur gehalten werden.
6. Verfahren gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die mit dem Virus infizierten Zellen in Suspensionskultur hält.

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7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet, daß man Monoschichten von Tumorzellen mit Vacciniavirus infiziert, anschließend inkubiert, das Onkolysat dann mehrmals gefriert und wieder auftaut, die lysierten Zellenbruchstücke bei einer Temperatur von etwa O⁰C zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit entfernt, das erhaltene Pellet in Kochsalzlösung resuspendiert, homogenisiert, das Lysat wiederum zentrifugiert und konzentriert.
8. Vakzin zur Stimulierung des Immunmechanismus von Säugern auf Species-spezifische Tumoren, bestehend aus dem viralen Onkolysat eines Species-spezifischen Tumors und eines Virus mit einer lytischen Wirkung auf die Zellen des Tumors, wobei der Virus für den Säuger wesentlich weniger pathogen als der Tumor ist, und wobei es sich beim viralen Onkolysat um das Produkt einer in vitro Onkolysereaktion handelt.
9. Vakzin gemäß Anspruch 8, worin es sich beim Virus um Vacciniavirus handelt.
10. Vakzin gemäß Anspruch 9» worin es sich beim Säuger um einen Menschen handelt.
11. Vakzin gemäß Anspruch 8, hergestellt in vitro in Suspension skul tür der genannten Tumorzellen.
12. Vakzin gemäß Anspruch 9, wobei es sich beim Tumor um einen spontanen, malignen Tumor handelt.
13. Vakzin gemäß Anspruch 10, in vitro in SuspenBionskultur der genannten Tumorzellen hergestellt.

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14. Vakzin, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

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