DE2753312A1

DE2753312A1 - Heteropolyanionverbindungen, ihre herstellung und sie enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2753312A1
Application number: DE19772753312
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Chermann; Gilbert Herve; Claude Jasmin; Andre Teze
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1976-12-03
Filing date: 1977-11-30
Publication date: 1978-06-08
Also published as: FR2372633A2; CA1124989A; FR2372633B2; CH628005A5; JPH0212933B2; BE861233A; JPS5392400A; DE2760338A1; JPS6221732B2; JPS61165336A; GB1575940A

Description

PATENTANWÄLTE Dr.-Inrj. von Kieisler f 1V73

Dr.-Inrj. K. SchonwoM, Köln

Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln

Dr.-Intj. K. W. Eishold, Bad Soden

Di. J. F. Fui.s, Köln

Dipl.-Clu'in. Alck von Kn.'isler, Köln

Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln

Dipl.-Ing. G. Selling, Köln

5 KDLN 1

DLKJIM/.HNHAUS AM HAUPIIJAHNHOf

29.November 1977 AvK/Ax

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR), 13, Rue Madelaine Michelis
Neuilly-sur-Seine, Frankeich

Heteropolyanionverbindungen, ihre Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

809823/0733

Heteropolyanionvcrbindungen, ihre Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel.

Die Erfindung betrifft neue Heteropolvanionverbindungen, die V7olfram in Kombination mit Antimon enthalten. Die Erfindung umfaßt ferner Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

Die neuen Verbindungen sind wertvoll als Wirkstoffe für die Behandlung von Virusinfektionen bei Mensch und Tier sowie von pathologischen Prozessen, die auf Viren zurückzuführen sind. Die Erfindung ist ferner auf Arzneimittelzubereitungen gerichtet, die eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens einer dieser Verbindungen enthalten.

Gegenstand des Patents (Patentanmeldung

P 24 35 746.8) der Anmelderin sind Heteropolyanionen, die antivirale Eigenschaften aufweisen, insbesondere eine mit der Abkürzung "HPA23" bezeichnete Wolfram- und Antimonverbindung.

Zur Herstellung der Verbindung HPA23 in Form ihres Ammoniumsalzes wird eine wässrige Lösung, die das Ion Sb enthält, heiß mit einer 1-molaren Natriumwolframatlösung umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch Zusatz von konzentriertem Ammoniumhydroxyd in einer genügenden Menge, um das Reaktionsgemisch farblos zu

i halten, im wesentlichen neutral gehalten. Hierdurch wird das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt, das abfiltriert und anschließend in üblicher Weise behandelt wird.

Die Reaktionstemperatur liegt unter der Siedetemperatur des Reaktionsgemisches, z.B. bei etwa 80°C. Die wässrige Lösung, die das Ion Sb enthält, wird vorteilhaft

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hergestellt, indem SbCl₃ in gesättigter NH.Cl-Lösung gelöst wird.

Wie spätere Untersuchungen ergeben haben, ist das Produkt HPA23 ein Heteropolyanion der Formel

In Form seines Ammoniumsalzes hat das Produkt die Formel _£NaSb„W_₁O_^_/(NH.)_lp und kann in verschiedenen Formen, insbesondere eines Hydrats mit acht Wassermolekülen vorliegen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Heteropolyanionverbindungen, in denen die Stelle des Natriumatoms der Verbindung HPA23 unbesetzt oder mit anderen Metallionen besetzt ist. Die Erfindung umfaßt außerdem solche Heteropolyanionverbindungen in ihrer metallischen Form, d.h. in Form ihrer Salze mit Metallen oder mit Ammonium.

Gemäß einem ersten Merkmal ist die Erfindung somit auf eine neue allgemeine Klasse von Heteropolyanionen der Formel
^^7tl

gerichtet, in der M fehlen kann oder ein Alkali- oder Erdalkali außer Natrium ist und η in Fällen, in denen M fehlt, einen Wert von 19 oder den Wert 19-p hat, wenn ρ die Ladung des Ions M ist. Die negative Gesamtladung des Ions beträgt somit 19.

Das Polyanion (I) kann insbesondere in fester Form als Ammoniumsalz der Formel

_218&_(NH₄)₁₉ (II) isoliert werden.

Das Infrarotspektrum der Verbindung (II) ist in Fig.l dargestellt, die zum Zwecke der besseren Darstellung

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in Fig.la und Fig.Ib unterteilt worden ist (Konzentration 6/600 mg, KBr-Phase, Aufnahmeapparatur "Perkin-Elmer 225").

Zur Herstellung der Verbindung (II) wird von einer wässrigen Ammoniumwolframatlösung ausgegangen, der eine Lösung von Sb₃O₃ in HCl (oder SbCl₃ in gesättigtem NH₄Cl) heiß (60 bis 8O⁰C) zugesetzt wird. Durch Zusatz von konzentriertem Ammoniak wird anschließend nach Entfernung eines unlöslichen Teils das gewünschte Ammoniumsalz ausgefällt.

Die wässrige Ammoniumwolframatlösung wird hergestellt, indem Wolframsäureanhydrid WO- mit Ammoniak aufgeschlossen wird, während das WO₃ siedet. Ein Molverhältnis von 4,5:1 bis 5:1, d.h. 4,5 bis 5 Mol WO₃ pro Mol Sb₃O₃, ist zwischen WO₃ und Sb₂O₃ einzuhalten.

Als weitere Verbindungen, die das Heteropolyanion der Formel (I) enthalten, sind Verbindungen der Formel

/RSb₉W₂ ^₈₆JZm* ₁₈ (in)

zu nennen, in der M ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall außer Natrium, z.B. Kalium, Calcium oder Magne sium, und M¹ ein Alkalimetall wie Cäsium, Rubidium oder Kalium oder ein Erdalkalimetall, z.B. Calcium oder Barium, oder Ammonium oder quaternäres Ammonium ist.

Die Erfindung ist insbesondere auf eine neue Heteropolyanionverbindung der Formel

(IVl ι

gerichtet. Diese neue Verbindung kann als Kalium-9-antimon(III)-21-wolfram(VI)-Verbindung angesehen werden. Sie kann als solche oder in Form von Ammonium- oder Metallsalzen, insbesondere Alkali- oder Erdalkalisalzen, vorliegen. Ein typisches Beispiel ist das Ammoniumsalz der Formel

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(NH₄) ₁₈ (V)

Ein Beispiel einer besonders vorteilhaften Verbindung ist das Kaliumsalz des Heteropolyanions (IV). Dieses Salz hat die Formel

₈ (VI)

Oberhalb von 34O°C zersetzt sich die Verbindung (VI). Ihr Infrarotspektrum ist in Fig.2 dargestellt, die zum Zwecke der besseren Darstellung in Fig.2a und Fig.2b unterteilt worden ist. Dieses Infrarotspektrum wurde mit einem Spektrophotometer "Beckmann IR-12" mit KBr-Scheibe aufgenommen.

Fig.3 zeigt das Raman-Spektrum der Verbindung (VI). Die folgenden Bedingungen wurden angewandt:

Verbindung (VI) in Pulverform 15 5145 A* 400 mW Interferenzfilter PM 720 V Auflösung 4 cm"¹ Geschwindigkeit 50 cm"" /mn Coderg-Spektrometer PHO

Das Polyanion (II) kann als solches in destilliertem Wasser gelöst verwendet werden. Die Polyanionstruktur ist jedoch in Gegenwart der in der wässrigen Lösung vorhandenen Metallionen instabil, und diese Feststellung ermöglicht die Herstellung anderer Verbindungen gemäß der Erfindung nach einem ersten Verfahren. Hierbei

ist zu bemerken, daß die in der DT-PS (P 24

746.8) der Anmelderin beschriebene Verbindung HPA23 durch Behandlung des Polyanions (II) in wässriger Lösung mit einer 0,5-molaren NaCl-Lösung hergestellt werden

30 kann.

Die Verbindung (V) kann aus dem Polyanion (II) durch Behandlung des in Wasser gelösten Polyanions (II) mit

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einer KCl-L«sung, die beispielsweise 0,5-molar ist, hergestellt werden.

Weitere Verbindungen gemäß der Erfindung können in analoger Weise durch Behandlung des Polyanions (II) mit einer Lösung eines Metalls, dessen Einführung in das Ionengerüst gewünscht wird, hergestellt werden. Als Beispiel ist die Magnesiumverbindung zu nennen, die durch Behandlung des Polyanions (II) mit 0,5-molarer MgClp-Lösung erhalten wird.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können natürlich auch durch direkte Synthese hergestellt werden, wie in den später folgenden Beispielen beschrieben.

Die Produkte gemäß der Erfindung können in Form zahlreicher Hydrate vorliegen. Alle hydratisieren Formen dieser Verbindungen fallen in den Rahmen der Erfindung.

Das Polyanion (IV) besteht aus einem aus Ketten Sb-O-W-O-Sb gebildeten zentralen bicyclischen Hohlraum, der in seinem Zentrum ein K⁺-Ion enthält, und um den weitere W- und Sb-Atome vorhanden sind, wobei das Gesamtverhältnis r - W/Sb dicht bei 2,4 liegt.

Die Erfindung umfaßt ferner alle isomeren Formen der

Heteropolyanionen sowie Gemische, die durch Umwandlung ; der Heteropolyanionverbindungen unter dem Einfluß von

Änderungen des pH-Werts und der Art der Lösungen, in ■

denen sie sich befinden, erhalten werden. |

Wie bereits erwähnt, ist das Heteropoly_anion (II) in \ wässriger Lösung nicht beständig. Um es zu stabilisieren^

ist es zweckmäßig, es in wässriger Lösung in Gegenwart von Metal Honen, die in das Innere des Komplexes einzudringen vermögen, vorzugsweise Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumionen, zu halten.

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Im wässrigen Medium, das Kaliumionen enthält, insbesondere in einer wässrigen verdünnten Kaliumchloridlösung, ergibt das Heteropolyanion (II) die Verbindung (V) (Ammoniumsalz).

Die Verbindung HPA23 kann auch einer Ionenaustauschreaktion, in deren Verlauf das Kalium die Stelle der Natrium- und Ammoniumionen besetzt, unterworfen werden. Dies kann einfach durch Auflösen der Verbindung HPA23 in konzentrierter wässriger Kaliumchloridlösung erreicht werden. Hierbei erhält man ein Gemisch der Verbindungen HPA23, (V) und (VI).

Es ist jedoch vorteilhaft, die Verbindung (VI) nach einem Direktverfahren ausgehend von SbCl^, KCl und

K-WO- herzustellen. Bei diesem Verfahren wird eine

^{2 4} III

erste Lösung, die das Ion Sb enthält, hergestellt, indem das SbCl., heiß in einer gesättigten wässrigen KCl-Lösung gelöst wird. Diese erste Lösung wird einer zweiten Lösung zugesetzt, die aus einer wässrigen KpWO--Lösung besteht. Die Reaktionstemperatur beträgt 60 bis 90°C, insbesondere etwa 80⁰C. Am Schluß der Reaktion wird eine gesättigte Kaliumbicarbonatlösung zugesetzt, bis das Reaktionsgemisch farblos ist und sein pH-Wert dicht bei 7 liegt.

Die Verbindung (VI) wird während der Reaktion ausgefällt und scheidet sich während des Abkühlens weiter ab. Zur Reinigung wird die Fällung abfiltriert, dann mit KCl-Lösung, beispielsweise 0,5-molarer KCl-Lösung gewaschen und schließlich aus destilliertem Wasser umkristallisiert.

Das Mengenvernältnis der Reaktionsteilnehmer wird so gewählt, daß das Heteropolyanion, das der Verbindung (VI) entspricht, erhalten wird. Zu diesem Zweck wird 1 Gew.-Teil SbCl₃ pro 3,4 Gew.-Teile KpWO- verwendet. Beispielsweise wird eine 1-molare wässrige KpWO--Lösung

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verwendet und die entsprechende SbCl.«-Menge berechnet, die in der gesättigten KCl-Lösung gelöst werden muß.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

5 Beispiel 1

Herstellung von Z.^^b9^W2i°86—^^NH4^i9 ^: Verbindung der Formel (II).

Eine wässrige Lösung von Ammoniumwolframat wird hergestellt, indem 81 g Wolframsäureanhydrid (WO-) mit NH₃ (11 1,2-molares Ammoniak) unter Sieden aufgeschlossen wird. Dieser Lösung wird allmählich bei 8O⁰C eine Lösung von 21,8 g Antimontrioxyd (SbpO,) in 100 ml 6-molarer HCl zugesetzt. Nach erfolgter Zugabe werden etwa 20 ml 12-molares NH- zugesetzt. Hierbei bildet sich eine unlösliche Fällung, die schnell heiß abfiltriert wird. Das Ammoniumsalz /SbgW₂^Ogg__7(NH₄)^_g kristallisiert während des AbkUhlens der überstehenden Lösung. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert und dann mit gesättigter NH.Cl-Lösung gewaschen.

20 Beispiel 2

Herstellung der Verbindung /F^s^q^W2l°86—~^K18^{: Verb}*^ndun9 der Formel (VI)

Eine Lösung, die 12,2 g SbCl₃ enthält, das heiß in 50 ml gesättigter KCl-Lösung gelöst worden ist, wird allmählich zu 125 ml einer vorher auf 8O⁰C gebrachten wässrigen 1-molaren KpWO.-Lösung gegeben. Nach erfolgter; Zugabe werden etwa 20 ml gesättigte Kaliumbicarbonat- ' lösung so zugesetzt, daß das Gemisch farblos ist und j einen pH-Wert von etwa 7 hat.

Das Kaliumsalz des Heteropolyanions wird während der Herstellung ausgefällt und scheidet sich während des Abkühlens weiter ab. Die Fällung wird abfiltriert, mit

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0,5-molarer KCl-Lösung gewaschen und schließlich aus destilliertem Wasser umkristallisiert. Hierbei werden etwa 25 g der Verbindung (VI) erhalten. Das Infrarotspektrum und Raman-Spektrum sind in Fig.2 bzw. Fig«3 dargestellt.

Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der Heteropolyanionverbindungen der Formeln (II) und (III), insbesondere der Verbindung (VI), die nachstehend mit der Abkürzung "HPA39" bezeichnet wird, in Arzneimitteln für die prophylaktische und heilende Behandlung von Virusinfektionen bei Mensch und Tier und von Krankheiten, die durch Viren hervorgerufen werden. Die Erfindung umfaßt somit auch Arzneimittelzubereitungen, die als Wirkstoff die Heteropolyanionverbindungen (III), insbesondere die Verbindung HPA39, in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten. Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die Arzneimittelzubereitungen gemäß der Erfindung in Form von injizierbaren Präparaten, z.B. in wässriger Lösung (physiologische Kochsalzlösung), bei einem pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes für die Injektion bei Mensch und Tier formuliert.

Bei den ersten pharmakologischen Untersuchungen, die nachstehend beschrieben werden, wurde als Heteropoly- ^; anionverbindung das Produkt der Formel (VI) verwendet, das mit der Abkürzung HPA39 bezeichnet wird. Die Aktivität von HPA39 wurde mit der Natriumverbindung der Formel

verglichen, die mit der Abkürzung HPA23 bezeichnet wird. Die Versuche waren auf die Behandlung von Friendschen Leukämieviren abgestellt.

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Pharmakoloqische Versuche

Für die Versuche wurden männliche oder weibliche DBA--Mäuse verwendet, die ein Alter von 2 bis 3 Monaten und ein Gewicht von etwa 20 g hatten.

Ein Polyzythämie verursachender Stamm des Friendschen Virus (VFP), der seit einigen Jahren im Laboratorium gehalten worden war, wurde verwendet. Das virale Material bestand aus einem zellfreien Überstand, der durch Zentrifugieren von gemahlener leukämischer Milz in 0,5-molarer Lösung von PBS-Saccharose erhalten worden war. Die Titration des Virusmaterials erfolgte in vivo nach der Methode von Reed und Muench (American Journal of Hygiene 27 (1938) 493-497). Der Titer ist als SD₅₀ ("Spleen enlarging dose 50% » milzvergrößernde Dosis

15 50%) ausgedrückt.

Versuchsdurchführunq

Das Friendsche Virus wird der Maus intraperitoneal injiziert. Das Tier entwickelt hierauf eine charakteristische Splenomegalie. Da die Sterblichkeit bei den gewöhnlich gebrauchten Dosen 3 Wochen nach dem Beimpfen mit dem Virus auftritt, wurden die Tiere am Tag +21 nach der Infektion für die Untersuchung der Splenomegalie getötet. Die Milz wurde entnommen und jeweils einzeln gewogen. Jede Milz, deren Gewicht 250 mg über-

25 steigt, gilt als pathologisch.

Die Heteropolyanionen HPA23 und HPA39 werden meistens in physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser verdünnt. Sie werden wie das Virus intraperitoneal in einmaliger Dosis oder in wiederholten Dosen zu unterschiedlichen Zeiten nach der Infizierung mit dem Virus verabreicht.

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Ergebnisse

1) Schutzwirkung von HPA39 gegen Friendsche Leukämie

In der folgenden Tabelle I sind die Ergebnisse von zwei aufeinanderfolgenden Versuchen genannt, bei denen die Mäuse, die mit 20 SD₅₀ des Virus VFP beimpft worden waren, am gleichen Tag, an dem sie geimpft wurden, HPA39 in einer einzigen Dosis von 0,5 bis 2 mg erhielten. Die Überlebensdauer in Prozent wurde am 62.Tag nach der Injektion des Virus ermittelt.

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Tabelle

	i.p.	Wirkunq	1	- 1,349	von HPA 39	auf die Friendsche Leukämie	2,63	0,221 >	2,036	Überlebende Tiere in % Taq +62	Toxizitäf
	pro	Mittleres Gewicht der Milz in g Taq +21	2	- 0,897	Grenzwerte 9	1,598	0,252 >	0,443	nicht bestimmt
Injizierte Dosis von ΗΡΑ 39	i.p.	Vers.	1	0,402 ?·	=nicht best, nicht bestimmt	0,190 >	0,348	40
0	pro	Vers.	2	0,390 >	- 0,711	0,225 >	0,405	nicht bestimmt	0
	i.p.	Vers.	1	- 0,322	0,208 >	0,291	70
		Vers.	2	- 0,258	nicht bestimmt	0
		Vers.	1	- 0,308	100
0,5 mg pro	Vers.	2	« 0,262	nicht bestimmt	0
Maus,	Vers.	100
1 mg	Vers.
Maus,
2 mg
Maus,

•Die Toxizität stellt die prozentuale Sterblichkeit bei den mit den genannten Dosen behandelten Gruppen von 10 nicht-leukämischen Tieren dar,

-«j cn

-VS-f

2) Untersuchung des Ansprechens auf HPA39 in Abhängigkeit von der injizierten Virusdosis

Vom Standpunkt der Splenomegalie wurde die Wirkung einer einmaligen Injektion von 2 mg HPA39 für den Fall untersucht, in dem die Tiere mit steigenden Dosen von VFP von 5 bis 50 SD₅₀ pro Tier geimpft wurden. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle II genannt.

	Tabel	le II	Mittleres Gewicht der Milz, g	gegen VFP	,228 »	1	»	von HPA 39
Beziehung		0,619	Grenzwerte g	,158 >	0	,552
Virusdosis i .p.	von Dosis zu Wirkung von HPA39	0,253	0	,323 >	0	,310
^{5 SD}50	, Injizierte Dosis von HPA 39, mg i.p.	0,726	0	,160 >	0	,979
	0	0,269	0	,239 ^	1	,331
10 SD₅₀	2	1,052	0	,233 >	0	,989
	0	0,409	0	,328—>	2	,412
20 SD₅₀	2	1,651	0	,113 >	0	,180
	0	0,350	1		,721
50 SD₅₀	2		0		einer Behandlung der Friendschen LeukMmie durch
	0		wiederholte Injektionen
3. Versuch	2

Bei diesem Versuch wurden Tiere verwendet, die vorher mit 20 SD₅₀ von VFP geimpft worden waren. Untersucht wurde ' die Wirkung einer 5 Tage dauernden Behandlung, die aus ■ einer täglichen Injektion von 0,5 mg HPA 39 bestand.

Der Tag der Infizierung wurde als Tag 0 bezeichnet. Drei Perioden wurden gewählt: Vom Tag +3 bis zum Tag +7; vom Tag +10 bis zum Tag +14; vom Tag +17 bis zum Tag +21. Um den Stand der Krankheit zu Beginn jeder Behandlung festzustellen, wurden 10 Vergleichstiere an den Tagen + 10 und +17 getötet.

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Parallel hierzu wurde die Toxizität dieser Behandlung auf die nicht-leukämischen Tiere untersucht. Zwar scheint die kurzfristige Toxizität sehr gering zu sein, jedoch ist zu bemerken, daß 60 Tage nach Beendigung der Behandlung 50% dieser Tiere gestorben waren.

In der folgenden Tabelle III sind der Mittelwert des Gewichts der Milz 21 Tage nach der Infizierung sowie das durchschnittliche Gewicht der Milz zu Beginn jeder Behandlung angegeben.

10 Tabelle III

Wirkung von HPA39 bei der Behandlung der Friendschen Leukämie

Behandlungs- Mittleres Mittleres Grenzwerte, g periode Gewicht in g Gewicht in g (5 χ 0,5 mg) der Milz zu der Milz

Beginn der am Tag +21 Behandlung

0 1,202 O_t4O8—>2,594

Tag +3 bis +7 nicht ermit- 0,610· 0,204—>l_t 577 telt

Tag +10 bis +14 0,240 0,656· 0,250—>l,25O Tag +17 bis +21 0,500 0,532·· 0,263—^0,988

•Die Gewichtszunahme der Milz gibt den Verlauf der Entwicklung der Leukämie wieder.

25 ·«Stillstand der Leukämie.

4) Vergleichsversuch mit HPA23 und HPA39: Behandlung der durch VFP verursachten Splenomeqalle

In der folgenden Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengestellt, die mit einmaliger Injektion von 1 mg jedes der Produkte bei der Behandlung der durch VFP verursachten Splenomegalie 21 Tage nach der Injektion von 20 SD₅₀ erhalten wurden.

__ j

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Tabelle IV Vergleich der antiviralen Wirkung von HPA23 und HPA39

Behandlung Mittleres Grenzwerte, g (1 mg i.p.) Gewicht der 5 Milz, g

O 1,426

HPA 23 0,320

HPA 39 0,294

Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, daß die Produkte HPA23 und HPA39 einen sehr starken Rückgang der Splenomegalie bewirken. Dies beweist ihre Wirksamkeit zur Hemmung der Entwicklung der Friendschen Leukämie. Außerdem zeigt HPA39 eine stärkere Wirkung als HPA23.

Insgesamt lassen die vorstehenden Ergebnisse erkennen, daß HPA39, das den mit dem Virus der Friendschen Leukämie infizierten Mäusen verabreicht wird, keinerlei Toxizitätswirkung zeigt. HPA39 bringt die Entwicklung der Leukämie zum Stillstand. Beispielsweise ermöglicht es eine Dosis von 2 mg HPA39 pro Maus 100% der infizierten Mäuse, bis zum 62.Tag, an dem sie getötet werden, zu überleben.

Ferner wurde eine vorteilhafte Eigenschaft des Produkts HPA39 festgestellt, nämlich eine synergistische Wirkung, wenn es gleichzeitig mit Interferon verabreicht wird. Zum Nachweis dieses Synergismus zwischen HPA39 und ' Interferon wurden vier Gruppen von Mäusen verwendet und die Testverbindungen unter den folgenden Bedingungen verabreicht: !

Interferon: Vorbehandlung durch intraperitoneale Injektion von 5000 E/Maus 6 Stunden vor der Infizierung.

HPA39: 3 mg/Maus, intraperitoneal unmittelbar nach dem Beimpfen mit dem Virus.

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Encephalomyocarditis-Virus der Maus: 50 Letaldosen/Maus; subkutane Impfung.

Gruppe I: 10 Mäuse erhalten das Virus und dienen als Vergleichstiere.

Gruppe II: 10 Mäuse erhalten Interferon und 6 Stunden

später das Virus.

Gruppe III: 10 Mäuse erhalten subkutan das Virus und intraperitoneal die Verbindung HPA39.

Gruppe IV: 10 Mäuse erhalten Interferon und 6 Stunden später das Virus und HPA39.

Ergebnisse am 15.Tag Mortalität Gruppe I: Vergleichstiere 8/10 Gruppe II: Interferon allein 8/10

15 Gruppe III: HPA39 allein 8/10

Gruppe IV: HPA39 + Interferon 3/10

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen eindeutig die Überlegenheit der Kombination von HPA-39 und Interferon gegenüber den jeweils allein verwendeten Produkten.

Weitere In-vivo-Versuche wurden durchgeführt, um die

verschiedenen Verbindungen gemäß der Erfindung und verschiedene bekannte Vergleichsprodukte auf ihre prophylaktische Wirkung gegen die durch das Friendsche Virus bei der DBA-2-Maus (nach der vorstehend beschriebenen Methode) ausgelöste Leukämie zu testen. Zum Vergleich wurden HPA-23 und zwei organische Kryptäte getestet:

Cryptofix 222 (Merck): Formel ^cie^H36^N2°6

(Molekulargewicht 376)

Cryptofix 211 (Merck): Formel C₁₄H₂₉N₃O₄ (Molekulargewicht 288,35)

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Gruppen von je IO DBA_-Mäusen, die vorher mit dem Friendschen Virus geimpft worden waren, erhielten jedes der vorstehend genannten Produkte in einer Menge von 1 mg/Maus. Die Vergleichsgruppe erhält nur das Virus.

Die Mäuse werden 21 Tage nach dem Beimpfen mit dem Virus getötet. Die Milz wird jeweils entnommen und einzeln gewogen. Jede Milz, die mehr als 250 mg wiegt, gilt als leukämisch. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle V zusammengestellt. Wie die Tabelle zeigt, vermögen alle Produkte gemäß der Erfindung die durch das Friendsche Virus bei der Maus ausgelöste Splenomegalie zurückzudrängen, während die bekannten Kryptate unwirksam und sogar toxisch sind. Ferner ist die Verbindung (VI) oder HPA39 wirksamer als HPA23.

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Tabelle Wirkung der Produkte auf die Friend'sehe Leukämie "in vivo"

Behandlung Herstellungs- Mittleres Gewicht in g Grenzwerte Toxizität (1 mg/Maus i.p.) verfahren der Milz 21 Tage g des Produkts

nach der Infizierunq

O (Vergleichs tiere)	Synthese	1,426	+ 0,461	+ 0,097	0,740 2,063	0
Cryptofix 222 (Vergleich)	Synthese	1,3417	+ 0,700	+ 0,050	0,39S3 2,200	i
Cryptofix 211 (Vergleich)	Polyanion (II) + dest. Wasser	1 überlebendes Tier· 1,6439	+ 0,082
Polvanion(ii) . (D ^!	Synthese ⁽²⁾	0,342	+ 0,022	0,243 0,573	0
HPA 23 (Vergleich)	Polyanion (II) + NaCl 0,5 M	0,310	+ 0,030	0,222 0,391	0
HPA 23 (Vergleich)	Synthese ^v '	0,312	+ 0,094	0,174 0,415	0
HPA-39 (Polyanion VI)	Polyanion (II) + KCl 0,5 M	0,294	0,259 0,335	, 0
Polyanion (V)	Polyanion (II) + MgCl₂ 0,5 M	0,263	0,205 0,291	0
Polyanion mit Mg	0,400	0,266 0,602	0

(1) Polyanion (II) bedeutet das Polyanion /Sb₀W,.^,; 7(NH-) 19 in destillierten Wasser gelöst, wobei das Metall M fehlt. - 9 21 86- 4

(2) Synthese bedeutet, daß die Verbindung durch direkte Synthese hergestellt wurde im Gegensatz zu der analogen Verbindung, die durch Behandlung des Polyanions (II) mit einer Lösung, die ein Metallion, z.B. K oder Mg, enthielt, hergestellt worden ist.

Ergänzende pharmakologische Versuche wurden zur Ermittlung der Aktivität von HPA39 in vivo durchgeführt.

I) Friendsche Leukämie

Die Friendsche Leukämie wird bei der DBAp-Maus mit dem Polycythämie auslösenden Virusstamm hervorgerufen. Die zur Verfolgung des Verlaufs der Krankheit gewählten Kriterien sind die Splenomegalie und die Überlebensdauer. Die Tiere werden 21 Tage nach der Injektion des Virus getötet. Die Milz wird entnommen und jeweils einzeln gewogen.

Wirkung von HPA 39 auf die Splenomegalie

Wie die Ergebnisse in Tabelle VI zeigen, bessert HPA 39, das in einmaliger Dosis intraperitoneal am gleichen Tage wie das Virus (20 SDj-q) injiziert wird, erheblich die Splenomegalie. Bei diesem Versuch betrugen die Testdosen 1 bis 5 mg. Diese drei Dosen haben im wesentlichen die gleiche Wirkung, jedoch ist bei 5 mg eine gewisse Toxizität festzustellen.

In Tabelle VII sind die Ergebnisse eines Versuchs zusammengestellt, bei dem HPA 39 unter den gleichen Bedingungen, die vorstehend beschrieben wurden, gegen steigende Dosen des Virus geprüft wurden. Die Ergeb- , nisse zeigen, daß HPA 39 seine volle Wirksamkeit ohne j Rücksicht auf die Dosis des Virus bewahrt.

25 Wirkung von HPA 39 auf die Überlebensdauer

Untersucht wurde die Überlebendauer von Tiergruppen (20), die mit 20 SD₅₀ des Virus geimpft und am gleichen Tag mit einer einmaligen Dosis von HPA 39 von 0,5, 1 und 2 mg behandelt wurden.

Die mittlere Überlebensdauer betrug bei der Vergleichsgruppe 56 Tage, bei der mit 0,5 mg behandelten Gruppe 128 Tage, bei der mit 1 mg behandelten Gruppe 151 Tage

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und schließlich bei der mit 2 mg behandelten Gruppe 108 Tage. 200 Tage nach Beginn des Versuchs lebten noch 25% der mit 1 bzw. 2 mg behandelten Tiere.

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Tabelle VI Wirkung von HPA 39 auf die durch das Friendsche Virus ausgelöste Splenomegalie

Behandlung Zahl der Mortalität Mittleres Gewicht der Grenz- % der Milzen
Mäuse Tag 0 bis Milz + Standard- werte, g über 0,250 g
Tag + 21 abweichung, g

O (O OO

0

(Vergleich)

1,349 + 0,790

0,235 2,636

90%

0,324 + 0,060

0,252 1,436

100%

2 mg

10

0,308 + 0,053

0,225 0,405

90%

5 mg

10

3.bis 7.Tag 0,286 + 0,043

0,237 0,315

70 %

CTi CO CO

Tabelle VII

ΗΡΑ 39: Wirkung auf die durch verschiedene Dosen des Friendschen Virus ausgelöste Splenomeqalie

Friendsches HPA 39 Mittleres Gewicht Grenzwerte, g Virus der Milz, q

0 0,619 + 0,427 0,228
5 SD ~ 1,551

2 mg 0,253 + 0,043 0,158

0,310

0 0,697 + 0,268 0,318

1,120 10 SD

⁵⁰ 2 mg 0,269 + 0,050 0,160

0,331 Ö 1,102 + 0,644 0,239

20 SD₅₀ \ ¹^⁰⁹

2 mg 0,409 + 0,298 0,233

1,241

0 1,651 + 0,535 0,286

2 mg 0,350 + 0,155 0,278

0,406

Wirkungsdauer von HPA 39

In Tabelle VIII sind die Ergebnisse von Versuchen zusammengestellt, bei denen die Splenomegalie mit HPA behandelt wurde. Die Tiere erhielten sämtlich am Tag 0 ! des Versuchs 20 SD₅₀ des Friendschen Virus. Im ersten \ Teil der Tabelle sind die Versuche zusammengestellt, ' bei denen 5 Injektionen von 0,5 mg HPA 39/Tag an j fünf aufeinanderfolgenden Tagen vorgenommen wurden.

Unter diesen Bedingungen bewahrt HPA 39 eine bemerkenswerte Wirkung auf die Splenomegalie, jedoch ist diese Wirkung weniger stark als nach einmaliger Injektion des Produkts am gleichen Tag, an dem das Virus injiziert wurde. Im zweiten Teil der Tabelle ist die Wir-

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kung einer einmaligen Dosis von 2 mg des Produkts angegeben, das an verschiedenen Tagen nach dem Tag der Beimpfung mit dem Virus injiziert wurde.

Lediglich bei einer Injektion 2 Tage nach dem Virus ist eine gewisse Wirkung vorhanden, jedoch ist der erzielte Grad des Schutzes geringer als der Schutz, der erzielt wird, wenn die Verbindung am gleichen Tag wie das Virus injiziert wird.

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OD O CO αο ro co

Tabelle VIII

HPA 39: Wirkung verschiedener Behandlungen auf die durch das Friendsche Virus ausgelöste

Splenomeqalie

Behandlung Dosis

Tag +3 bis +7

Tag +4

Mittleres Gewicht der Milz +_ Standardabweichunq, q

1,202 + 0,643

5 χ 0,5mg 0,610 + 0,440

Taq +7

2 mg 2 mg

1,179 + 0,548

1.170 + 0,740

Grenzwerte

0,488 - 2,5943

0,204 - 1,577

Tag +10 bis	+14	5x0	,5mg	0,658 +	0,299	0,250	- 1,250
Tag +17 bis	+21	5x0	,5mg	0,532 +	0,289	0,263	- 0,988
0				1,438 +	0,550	0,727	- 2,493
Tag 0		*___LJ_*	mg	0,244 +	0,040	0,185	- 0,308
Tag -7		j 2	mg	1,488 +	0,443	0,762	- 2,033
Tag -4		2	mg	1,827 +	0,304	1,221	- 2,170
Tag -2		2	mg	1,668 +	0,569	0,764	- 2,233
Tag +2		2	mg	0,560 +	0,378	0,202	- 1,270

0,257 - 1,748

0,390 - 2,402

- Vh -

Wirkung von HPA 39 auf den Titer des Virus in der Milz

Der Virustiter in der Milz der Vergleichstiere wurde mit dem Virustiter in der Milz von Tieren verglichen, die am Tag 0 mit einer Dosis von HPA 39 behandelt wurden. Obwohl das Gewicht der Milz der behandelten Tiere wesentlich niedriger war als bei den Vergleichstieren, ist der Titer des Virus in den beiden Gruppen vergleichbar. Als Bestimmungsmethode diente die S⁺L~- Titration der gemahlenen Milz.

10 II) Enzophalomyokarditis

Ferner wurde der Einfluß von HPA 39 auf die letale Wirkung des Encenhalomyocarditis-Virus der Maus untersucht. Die Stämme V 77 L- und S. (Passage in der Kultur für den Stamm L~ und in vivo für den Stamm S₃), VR129 L₃ und S-, wurden verwendet. Das Produkt wurde in einmaliger Dosis (3 mg) intraperitoneal 30 Minuten vor der Infizierung mit 50 Ι-Ό des Virus durch subkutane Injektion injiziert.

Eine deutliche Steigerung der Zahl der überlebenden Tiere im Verhältnis zu den Vergleichstieren, die keine Injektion von HPA 39 erhalten hatten, wurde festgestellt.

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Claims

Patentansprüche

in der M abwesend sein kann oder ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall mit Ausnahme von Natrium ist, η einen Wert von 19 hat, wenn M abwesend ist, oder den Wert -p hat, wenn ρ die Ladung des Ions M ist.
2) Heteropolyanionverbindung nach Anspruch 1 mit der Formel

)₁₉ (H)

und dem in Fig.l dargestellten Infrarotspektrum.
3) Heteropolyanionverbindungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

/MSb₉W_{2 1}°₈₆_7m'₁₈ (in),

in der M ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall mit Ausnahme von Natrium und M' ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall oder Ammonium oder quaternäres Ammonium ist.
4) Verbindungen nach Anspruch 1 oder 3, gekennzeichnet durch die Formel

/KSb₉W₂₁O₈₆J/¹⁸" (IV) ,

insbesondere das Ammoniumsalz der Formel /KSb₉W_2a0₈₆_7( NH₄)₁₈ (V)
5) Verbindung nach Anspruch 1, 3 oder 4, gekennzeichnet durch die Formel

/KSb₉w₂₁o₈₆_7K₁₈ (VI),

eine Zersetzungstemperatur von 34O°C und das in Fig.2 dargestellte Infrarotspektrum und das in Fig.3 dargestellte Ramanspektrum.

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6) Verbindungen nach Anspruch 1 bis 5 in Form der Hydrate.
7) Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 2 mit der Formel

)₁₉, (H)

dadurch gekennzeichnet, daß man zu einer wässrigen Lösung von Ammoniumwolframat eine Lösung von Antimontrioxyd Sb₃O₃ in HCl oder von SbCl- in NH₄Cl gibt und anschließend konzentriertes Ammoniak zusetzt und hierdurch das gewünschte Ammoniumsalz ausfällt.
8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumwolframatlösung durch Aufschluß von siedendem Wolframsäureanhydrid WO- mit Ammoniak hergestellt worden ist.
9) Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionstemperatur zwischen 6O⁰C und dem Siedepunkt, beispielsweise bei 8O⁰C liegt.
10) Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man 4,5 bis 5 Mol WO₃ pro Mol Sb-O- verwendet.
11) Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch5 mit der Formel

dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Lösung, die das Ion Sb enthält, herstellt, indem man SbCl₃ heiß in einer gesättigten wässrigen KCl-Lösung löst, die erste Lösung zu einer zweiten Lösung gibt, die : aus einer wässrigen KpWO.-Lösung besteht, wobei die Reaktionstemperatur 60 bis 100⁰C, insbesondere etwa j 8O⁰C beträgt, und am Schluß der Reaktion eine gesättigt te Kaliumbicarbonatlösung zusetzt, bis das Reaktionsgemisch farblos ist und einen pH-Wert von etwa 7 hat.

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12) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 3,4 Teile SbCl-, bezogen auf eine 1-molare wässrige Lösung von K-WCK, verwendet.
13) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der formel (III), dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyanion (II) in wässriger Lösung behandelt, die ein Alkalioder Erdalkalimetallion, z.B. K, Ca oder Mg, insbesondere ein Salz, z.B. KCl oder MgCIp, enthält.
14) Arzneimittelzubereitung für die Prophylaxe und Therapie von Virusinfektionen bei Mensch und Tier und von pathologischen Prozessen, die auf Viren zurückzuführen sind, insbesondere Leukämien und Sarkomen, enthaltend als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung nach Anspruch 1 bis 6.
15) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem eine synergistisch wirksame Menge Interferon enthält.

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