DE2305553A1

DE2305553A1 - Arzneimittel zur behandlung von virusinfektionen

Info

Publication number: DE2305553A1
Application number: DE19732305553
Authority: DE
Inventors: Howard Milton Jenkin
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1972-02-04
Filing date: 1973-02-05
Publication date: 1973-08-09
Also published as: AU5183673A; FR2181704A1; JPS4887011A

Description

THE REGENTS OP THE UNIVERSITY OP MINNESOTA Minneapolis, Minnesota, V.St.A.

ⁿ Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen " Priorität: 4. Februar 1972, V.St.A., Nr. 223 692

Gegenstand der Erfindung sind neue Arzneimittel, insbesondere Impfstoffe, zur Behandlung von Virusinfektionen.

Bekannte, gegen Viren wirkende Mittel gehören anderen Verbindungsklassen als Lipoiden an und sind z.B. halogenierte Nucleotide, halogenierte Deoxyribonucleoside, Thiosemicarbazone, Amantadin und Novobiocin. Von diesen Verbindungen sind nur wenige zur Verabreichung an Menschen im Handel. Diese wenigen Verbindungen sind ausserdem nur in Gewebekulturen wirksam. Veröffentlichungen hierüber sind erschienen in (1) "Antiviral Substances¹¹, Annals of the New York Academy of Sciences, Band 130, Artikel 1, Seiten 1 bis 482 (1965), (2) The Second Conference

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on Antivirus Substances, Annals of the New York Academy of Sciences, Band 173, Artikel 1, Seiten 1 bis 844 (1970), Herausgeber Ernest C. Herrmann, (3) "Pharmacology of Viruses" von B. Goz und W.H. Prusoff "Annual Review of Pharmacology" lp_ (1970), Seiten 143 bis 170 und (4) "Microbiology", von B. Davis, Harper and Rowe, Inc., New York, New York 1967, Seiten 1177 bis 1181.

Amantadin ist äusserst spezifisch für Myxoviren und beeinträchtigt die Viruszellenattraktion. Es ist hauptsächlich als Arzneimittel für Experimente verwendet worden, doch wird es in steigendem Masse bei der Behandlung von Menschen eingesetzt.Ada-

mantidln-hydrochlorid ("Symmetral") wird besonders gegen Infektionen des Influenza-Virus angewandt» Rimantadin ist exrperimentell bei Menschen gegen Influenza-Viren eingesetzt worden. Eine äussere Anwendung von 5-Jod- bzw. 5-Brom-2'-deoxyuridln ist zur Behandlung von DNA-Virusinfektionen, insbesondere Herpes- und Adenovirus-Augeninfektionen, angewendet worden. Diese Arzneimittel können nicht ohne weiteres allgemein verabreicht werden. Arabinosid-cytosin ist in der gleichen Weise wie 5-Brom-2'-deoxyuridin verwendet worden. Rifampicin ist gegen Pocken- und Myxoviren in vitro eingesetzt worden. Das im Handel unter dem Namen "Marbaron" erhältliche Thiosemicarbazon ist insbesondere zur Behandlung von Pocken eingesetzt worden. Diese Verbindungen, von denen berichtet worden ist, dass sie gegen Viren aktiv sind, sind jedoch in vivo für eine systematische Behandlung von Viren viel zu ί

toxisch. Bei einigen dieser Verbindungen ist die Entwicklung j

j einer Virusresistenz .bekannt geworden, da eine Auswahl für !

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resistente Organismen stattfindet. Wenige der im Handel befindlichen und laufend verwendeten Arzneimittel werden für mensch liche Zwecke geeignet empfohlen, doch ist keines bekannt, das gegen Arboviren-Infektionen wirksam ist.

Der Erfindung lag nun die Aufgabe zu Grunde, Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, die gegen verschiedene Viren, insbesondere gegen Arboviren, wirksam sind. Die Erfindung löst diese Aufgabe. Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, insbesondere Impfstoffe, zur Behandlung von Virusinfektionen mit dem kennzeichnenden Merkmal, dass sie einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen, deren Salze oder Ester gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten.

Sa ist gefunden worden, dass Salze von zahlreichen der unter diese Klasse von Lipoiden fallenden Verbindungen, insbesondere Octadecensäuren, das Wachstum von Arboviren der Gruppe A und der Gruppe B sowie noch nicht klassifizierbarer Arboviren inhibieren, die in Zellkulturen und/oder in Mäusen mittels gegenüber dem Wirtstier nicht-toxischen Dosierungsmengen ge züchtet worden sind. Unter diesen Verbindungen sind die Salze der cis-6-Octadecensäure, kurz als 6-18:1 bezeichnet, wobei die Zahl 6 das die Doppelbindung tragende Kohlenstoffatom be zeichnet, (Petroselinsäure) am wirksamsten. Salze anderer un gesättigter Fettsäuren mit Doppelbindungen in der 4-, 6-, 12- und 14-Stellung inhibieren ebenfalls das Wachstum der Viren.

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_ 4 - ■

Die erfindungsgemässen Verbindungen inhibieren auch andere mit Lipoiden überzogene Viren, z.B. Myxoviren, wie Mumps-, Influenza- und Parainfluenza-Viren, ferner Pocken-, Papova-, Hepatitis-, Herpes-, Masern- und oncogene (geschwulstbildende) Viren.

Bs ist nun eine vollständige Reihe von geradkettigen cis-Octadecensäuren mit einer einzigen Doppelbindung an jedem möglichen Kohlenstoffatom in 2- bis 17-Stellung hergestellt worden. Diese Fettsäuren waren rein, wie durch Gaschromatographie, Massenspektralanalyse und Ozonolyse festgestellt worden ist. Von jeder der isomeren Δ-2- bis *-*17~Octadecensäuren sind die Natriumsalze - hergestellt worden, die dann mit Rinderalbumin versetzt worden sind, bevor sie in Gewebekulturen verwendet und in vivo studiert worden sind. Andere bei diesen Studien verwendete Fettsäuren mit Z\ 6- oder ZX1 2-Doppelbindungen bei zweifach-, dreifach- oder vierfach ungesättigten Verbindungen werden in über 99? 5pro*zentiger Reinheit erhalten. Die Fettsäuren werden einzeln in ein definiertes Medium gegeben, das zum Wachsen von Zellen von Hamsternieren, Affennieren und Novikoff-Rattenhepatom in Kulturen verwendet wird. Es wird der Stamm M5-596 des japanischen Encephalitis-Virus (JEV) zur Prüfung der Wirksamkeit jedes Isomeren dieser Octadecensäuresalze als Inhibitor gegen Viren verwendet. Dieses Virus wurde

1 I

ursprünglich aus dem zehnten Durchgang durch Gehirne von noch nicht entwöhnten Mäusen erhalten. Die bei den Untersuchungen verwendeten Virusimpfstoffe v/erden aus infizierten Nieren-21-Zellen von Junghamstern (BHK-21) hergestellt.■

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Die Zellen werden in einem Eagle'sehen Medium mit einem Minimum an wesentlichen Stoffen gezüchtet, das mit 5 Prozent Serum neugeborener Kälber ergänzt worden ist, das 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin enthält. Nach der Ausbildung einer einzelligen Schicht werden die Zellen 24 Stunden bei 37°C mit einem nicht ergänzten Waymuth-Medium bebrütet. Danach werden die Zellen mit 10 fleckenbildenden Einheiten von Viren und Zellen 90 Minuten bei Raumtemperatur beimpft. Danach werden die restlichen Viren mit der zu Grunde liegenden Salzlösung ausgewaschen. Das mit den Natriumsalzen der einzelnen Fettsäuren angereicherte Waymuth-Medium wird in einen Behälter gegeben. Die Zellen werden dann unterschiedliche Zeiten bei 37°C weiter bebrütet. Nach den betreffenden Intervallen werden die Viren aus der überstehenden Flüssigkeit und die Zellen gesammelt. Dann werden Infektionstitrationen unter Verwendung einer Versuchsplaque nach Schultz und Schlesinger (Virology V}_ (1963), Seiten 40 bis 48) durchgeführt. Die Einheiten bildenden Plaquen (PFU) werden aus den gemittelten Auszählergebnissen bestimmt.

Die Ergebnisse bei Gewebekulturen zeigen, dass das 6-18:1-Isomere bei Anwendung in einer Konzentration von 20/Ug/ml die Ansteckungsfahigke.it des Virus innerhalb 42 Stunden nach der Infektion um das Einhundertfache herabsetzt. Im Gegensatz hierzu liefern die 9-» 10-, 11- und 13-18:1-Isomeren im wesentlichen normale Wachstumstypen.(vergl. Tabelle I). Die 4-, 12- und 14-18:1-Isomeren setzen das Wachstum des Virus um das Zehn- bis Dreissigfache herab, bezogen auf das Ausgangsmaximum.

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Die Ansteckungsfähigkeit des mit Zellen vergesellschafteten Virus ist in Gegenwart des Inhibitors geringer. 4Q/Ug/ml des 6-18:1-Isomeren wirken vollständig inhibierend. Die gleiche Wirkung zeigen die zweifach-, dreifach- und vierfach ungesättigten Fettsäuren mit einer Doppelbindung in 12- oder in H-Stellung bei Konzentrationen von > 20/Ug/ml des Mediums (vergl. Tabelle II). Bis zu 40/Ug/ml zeigen die 9-, 10-, 11- und 13-18:1-Isomeren noch keine Inhibitorwirkung, jedoch bei 80/Ug/ml (vergl. Tabelle I). Normale Zellen werden praktisch nicht durch die Isomeren beeinflusst, wenn'diese in Konzentrationen von 80/Ug/ml vorliegen. Die 3-18:1- und 17-18:1-Isomeren inhibieren das Wachstum der Gastzellen bei 40/Ug/ml geringfügig und bei 80/Ug/ml sehr stark.

Unter Verwendung von Gemischen des Salzes des einzelnen Fettsäureisomeren plus intracranial in entwöhnten und noch nicht entwöhnten Mäusen eingeimpften Viren werden ebenfalls Versuche durchgeführt. Ein vollständiger. Schutz der Maus vor dem Tode wird bei Verwendung einer LDc₀-Dosis des Virus plus 200/Ug des Salzes der £-Octadecensäure■(Petroselinsäure) je Maus erhalten (vergl. Tabelle III). Bei den Mäusen sind bei den angegebenen Dosierungsmengen für die Fettsäuren keine Toxizitätserscheinungen festgestellt worden (vergl. Tabelle IV).

Weitere Prüfungen sind unter Verwendung des Fatriumsalzes des 6-18:1-Isomeren, das Mäusen auf verschiedene Arten und zu unterschiedlichen Behandlungszeiten verabreicht worden ist, gegen das japanische Encephalitis-Virus (JEV) und das

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Semliki Forest-Virus (SPV) durchgeführt worden, wobei sowohl der intraperitoneale (IP) als auch der intracraniale (IC) Erregerweg zur Einimpfung der Viren in die Mäuse angewendet worden ist. Die Ergebnisse sind aus den Tabellen V und VI ersichtlich. Bei jeder Versuchsreihe beträgt die Erreger-

1 η Β Dosis bei intracranialer Verabreichung 10 JEV, 10 ' SFV in 0,03 ml und bei intraperitonealer Verabreichung 10 ' JEV und 10 ' SFV in 0,2 ml. Die Behandlung erfolgt durch orale Verabreichung (Tabelle V) und auf intraperitoneale Weise (vergl. Tabelle VI) jeweils entweder 6 Stunden vor (B), oder 6 Stunden vor und 24 Stunden nach (A), oder 6 Stunden vor, 4 Stunden nach und 24 Stunden nach, oder 6 Stunden vor und 24 Stunden nach einer Einimpfung der Erregerdosis, wie es angegeben ist. Nach der jeweiligen Behandlungszeit werden 2 mg des Arzneimittels in 0,5 ml Volumen je 20 g Gewicht der Maus verabreicht. Weder bei einer wiederholt verabreichten Arzneimittelmenge noch bei einer einmaligen Dosis von 6 mg nach der jeweiligen Verabreichungsweise ohne Viruserregung werden Toxizitätserscheinungen festgestellt. Alle Pufferkontrollen sind negativ. Der gemittelte Todestag wird aus dem Todestag der Mäuse plus derjenigen noch nach 14 Tagen überlebenden Mäuse berechnet.

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- 23 Q 5 5-5-3

Tabelle I

Wirkung unterschiedlicher Mengen der cis-Qctadecensäuren auf die in Zellen von Nieren von Junghamstern gezüchteten japanischen Encephalitis-Firen

Verbindung ι^^^Αα Ergebnis des Virenwachstums

k2-18:1 20,0 etwas angeregt

5-18:1 2₅5 keine wesentliche Änderung gegenüber

der Ausgangsmenge

5₉O etwas angeregt

1O₉O etwa 10-fache .Zunahme

20,0 etwa .30-fache Zunahme'(max_oWachstum)

4O₁₉O etwa 30-fache Zunahme (max ο Wachs turn)

8O₅O - vollständige Inhibierung

4-18g1 2O₉O geringer Einfluss"auf das Wachstum

(2ö=fach unter der Äusgangsmenge)

	18g 1	2O₉O	etwas angeregt
6-	18s1	■2₉5	etwas itOiibiert
		5₉O"	"4=fs.che Abnahme
		1O₉O	8~faclie .Abnahme
		20 s 0	100-facli unter der, Ausgangsmenge
		4O₂O	vollständig inhibiert
		8O₀O	vollständig inhibiert
7=·	18g1	2O₂O " -	tO-faclie Zunahme
	18g 1 "	2O₉O	S-=f acli©" Zunahme " ■
9-	18g1	2,5	■geringe Zunahme

5 a 0 - 2-fache Zunahme

1-O₉O 10-fache Zunahme .

2O₉O 16-fache Zunahme

'4O₅O 16-fache Zunahme

8OpO vollständige Inhibierung

10-18:1 2O₃O ■ 5-fache Zunahme

11-18:1 2₉5 geringe Zunahme

5₉O 8-fache Zunahme 1O₉O "- 16-fache Zunahme

- 9 Tabelle I ( Fortsetzung )

Verbindung in^ue/ml Ergebnis des Virenwachstums '

16-fache Zunahme

18-fache Zunahme ( max. Wachstum)

vollständige Inhibierung

geringe ZunahmeC 10-fach unter der Ausgaigs·

menge) i 8- fache Zunahme (max. Wachs turn) 3-fache Zunahme (7-fach unter der

Ausgangsmenge) 3- bis 4-fache Zunahme

4-fache Zunahme

3- bis 4-fache Zunahme

*) Die Anregung der Viren beruht auf einer Zunahme gegenüber

Bestimmung der
der Virus-AusgangBmenge. Die/virusinhibierung beruht auf

der Differenz unterhalb der Höchstausbeute von 42 Stunden nach Infektion freigesetzten extrazellularen Viren und deutlich unterhalb der Virenausgangsmenge. Völlige Inhibierung > 10 -fache Verminderung der Virenausbeute. Dosis in ,ug/ml ist 20 mg/kg äquivalent.

^11-18:1	20,0
	40,0
	80,0
12-18:1	20,0
13-18:1	20,0
14-18:1	20,0
15-18:1	20,0
16-18:1	20,0
17-18:1	20,0

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Tabelle II eis,

Wirkung der/cis-Octadecadiensäure, der eis, eis, cis-Octadecatriensäure imd der all—eis-Eicosatetraensäure auf das Wachstum von in Zellen von Nieren von Junghamstern gezüchteten JE?

Verbindung in°ue/ml^& Ergebnis des Virenwachstums '

Ü9	,12-18*1	2,5	2,5	teilweise inhibiert
		5,0	5,0	80-fach inhibiert
		10,0	10,0	100-fach inhibiert
	•	20,0	20,0	vollständig inhibiert
9	,12,15-18:3	2,5	teilweise inhibiert
		5,0	50-fach inhibiert
		10,0	100-fach inhibiert
		20,0	vollständig inhibiert
5	,8,11,14-20	:4
		teilweise inhibiert
		100-fach inhibiert
		120-fach inhibiert
		vollständig inhibiert

*) Die Anregung der Viren beruht auf einer Zunahme gegenüber

Bestimmung der der Virus-Ausgangsmenge. Die/?irusinhibierung beruht auf

der Differenz unterhalb der Höchstausbeute von 42 Stunden nach Infektio.n freigesetzten extrazellularen Viren und deutlich unterhalb der Virenausgangsmenge. Völlige Inhibierung 5Ί0 -fache Verminderung der Virenausbeute. Dosis in /Ug/ml ist- 20 mg/kg äquivalent. . ;

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- 11 Tabelle III

Inhibierung des Wachstums von JEV in Mäusen durch 6-18:1

6-18:1 /Ug/Maus	Viren-Konzentration	4,6^a>
O	5,6^a>	5/9
200	8/8^b)	0/9
0/9

a) log MICLI)₅₀/Maus

b) Anzahl überlebender Mäuse / Gesamtzahl der in

24 Stunden gestorbenen Mäuse.

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- 12 Tabelle TV

Toxizität von 6-18;1 bei Mäusen

; geXrfcnr " tote / lebende

/Ug/MauB gSuee ^Mäuse

0 .1 k/a ^a)

2 1 0/6 ■

. . 0/7

n/8 4/8 0/8

^b) 2 . 7/7 ⁰V

a) Anzahl toter Mäuse / Gesamtzahl der Mäuse nach den innerhalb 24 Stunden auftretenden Todösfällen.

b) 6-18j1 sehr viskos.

c) 2 Tote nach 2 Stunden; 6 Tote nach 24 Stunden; 1 Tote nach 48 Stunden»

72 Stunden alte schweißer weisse Mäuse, die mit 0_?2 ml intracran-ial injiziert worden sind»

Verdünnungsmittel \ Phoophat-Puff'er mit 0_s5 Prozent Rinderalbumin PAP₉ pH 7₉4°

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	Tabelle V	Erreger-	Verab	Behandlung mit	Sterb	53	0	'gemittelter
	Arboviru3 - orale		folgung	und SPV	lich	0
		Virus	IC	Tote/Gesamtzahl	keit	100	Todeotag
Behand	JEV		IC		in $>	100
lungs-	JEV	IC	der Mäuse	87,5	100	8,5
dauer	JEV	IC		0	100
in Std.	JEV	IC	5/6	100	11,5
	JEV	IC	0/6	40
6B	JEV	IC	2/6	55
6B.24A	SPV	IC	0/6	40	4,7
6B.4A.24A	SPV	IC	0/6	60	5,0
4A	SPV	IC	6/6	17 .	5,0
	SPV	IP	6/6	100	5,2
6B	SPV	IP	5/5	100	4,7
6B,?4A	JEV	ΙΓ	5/5	100	10,8
6Β,ΊΑ,24Α	JEV	IP	6/6	100	15,5
24Λ	JKV	IP	2/5	100	12,5
	JEV	IP	2/6		8,8
6 B	JEV	IP	2/5		15,1
6B,?4A	SPV	IP	3/5		5,8
6B,4A,24A	SPV	IP	1/6	6,5
4A	SPV	IP	5/5	6,6
	SPV	6/6	6,1
6B	SPV	6/6	6,0
6B,24A		6/6
6B,4A,24A	6/6
24A

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Tabelle VI

Arbovirus - intraperitoneale Behandlung mit JEV und SFV

Behand	Erreger	Verab-	Tote/Gesamtzahl	Sterb	^;. gemittelter
lungs-		foIgung		lich
dauer	Virus	IC	der Mäuse	keit	Todestag
in Std.		IC		in i°
	JEV	IC	5/6	88	8,5
6B	JEV	IC	5/6	88	8,5
6B,24A	JEV	IC	3/5	60	8,5
6B,4A,24A	JEV	IC	5/6	88	9,7
6B,4A	JEV	IC	5/6	88	9,0
-	SFV	IC .	5/5	100	5,8
6B	SFV	IC	4/5	80	7,2
6B,24A	SFV	IC	6/6	100	5,5
6B,4A,24A	SFV	IP	5/5	100	4,8
6, 4A	SFV	IP	5/5	100	5,4
	JEV	IP	2/5	40	11,8
6B	JEV	IP	1/6	17	13,, 1
6B,24A	JEV	IP	2/6	33	12,5
6B,4A,24A	JEV	IP	2/6	33	13,3
6B,4A	JEV	IP	.2/6	33;	13,7
	SFV	IP	5/5	100	5,2
6B	SFV	IP	6/6	100	6,3
6B,24A	SFV	. IP	6/6	100	6,0
6B,4A,24A	SFV	6/6	100	5,2
6B,4A	SFV	5/5	100	5,3

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Die Ergebnisse zeigen, daos Schutz bei einem oral verabreichten Arzneimittel gegen JKV erzielt wird, wenn das Virus intracranial erregt wird} jedoch tritt kein Schutz auf, wenn das Virus intraperitoneal erregt wird. Das Semliki-Forost-Virus wird bei Anwendung einer niedrigeren Erregerdo3is als beim JEV auf intracraniale Weise durch keinerlei Verabreichungsbehandlung abgetötet. Wenn da» Seniliki-Forest-Virus als Erreger auf intraperitoneale Weise verwendet wird, tritt kein Schutz auf, jedoch ist die Erregerdosia viel höher als mit JEV. Wenn die intraperitoneale Behänd]ungswcise gegen eine ähnliche Erregerdosiri des jeweiligen Viruo entweder durch intracraniale oder intraperitoneale Injektion angewendet wird, tritt kein Schutz durch das Arzneimittel auf.

Das Arzneimittel ist jedoch wirksam sowohl gegenüber JKV als auch gegenüber SPV bei Anwendung entweder dos iritruperitonealen oder des intracranialen Erregerwegeo zur Einimpfung in Mäuse, wenn man das Gemisch aus Virus und Arzneimittel eine Stunde bei 25°C hält (vergl. Tabelle VII). Die Erregerdosen bei beiden Wegen sind die gleichen wie bei den in den Tabellen V und VI beschriebenen Prüfungen. Bei einer Versuchsreihe wird dan Arzneimittel sofort nach dem Vermischen verabreicht, während bei der parallelen Versuchsreihe die Prüfung eine Stunde nach dem Vermischen mit dem Virus erfolgt. Die Ergebnisse zeigen zweifelsfrei, dass das Arzneimittel sowohl gegen JEV als auch gegen SPV wirksam ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur

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Herstellung der Arzneimittel, insbesondere Impfstoffe, das·dadurch gekennzeichnet ist, dass man die einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen, ihre Salze oder Ester mit dem am Wachstum zu hindernden Virus in Gegenwart von V/asser vermischt und mindestens eine Stunde bei 20 bis 57°C stehen lässt.

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Tabelle VII

Kontakt-Experiment: JEV und SPV im Gemisch mit 6-18:1 und Mäusen verabreicht

Viruo

Konzentration	Dauer des	Erreger	Tote/Gesamt	Sterb
von 6-18:1	Stehenlas-	verab	zahl	lichkeit
	cens,	reichung	der Mäuse	in #
	Minuten

O	0	IC	5/6	87,5
100	0	IC	4/6	66,7
1000	0	IC	3/6	50,0
0	0	IP	2/5	40,0
100	0	IP	0/5	0
1000	0	IP	0/5	0
TW ,-,,„ ..„,,,,-.
(1.ClV "«.,.... r. .min . ι, 0	60	IC	6/6	100
100	60	IC	1/5	20
1000	60	IC	1/5	20
0	60	IP	2/5	40
100	60	IP	0/5	0
1000	60	IP	0/5	0
0	0	IC	6/6	100
100	0	IC	4/5	80
1000	0	IC	1/5	20
0	0	IP	3/5 ·'	60
100	0	IP	3/5	60
1000	0	IP	1/5	20
0	60	IC	6/6	100
100	60	IC	0/6	0
1000	60	IC	0/6	0
0	60 ,	IP	. 3/5	60
100	60	IP	0/5	0
1000	60	IP	0/5	0

kein
Virus

100

1000

0
0
0
0

IC IP IC IP

1/5

1/5 0/6

1/5

20

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Es werden weitere Prüfungen unter Verwendung von bereits Embryonen enthaltenden Eiern durchgeführt, die mit dem japanischen Encephalitis-Virus (JET) infiziert worden sind. Bei -75°C aufbewahrte japanische Encephalitis-Viren werden in einem Wasserbad von 57⁰C rasch aufgetaut und dann sofort bis 'zur Verwendung.in ein Eisbad gestellt. Diese Stamm-JEV werden mit einer 0,15 molaren Phosphatpufferlösung mit 0,5 Prozent fettsäurefreiem Rinderalbumin verdünnt. Eine Stammlösung des Natriumsalzes des 6-18;1-Isomeren wird ebenfalls mit einer 0,15 molaren Phosphat puff erl^jng mit 0,5 Prozent fettfreiem Rinderalbumin verdünnt. Dann werden.0,4 ml der Stamm-JEV-Losung zu. 1,6 ml Pufferlösung gegeben. Man erhält eine" Verdünnung von 1:5. Dann werden 0,2 ml der verdünnten Viruslösung zu 1,8 ml Pufferlösung gegeben". Alle Viruslösungen werden bis zur Verwendung in einem Eisbad gehalten. Das Arzneimittel wird in Konzentrationen von 0, 4, 40 und 400/Ug/ml in Phosphatpufferlösung hergestellt und bei Raumtemperatur stehengelassen. Unmittelbar vor der Beimpfung jeder Gruppe von 7 bis 12 Tage alten bereits Embryonen enthaltenden Eiern werden die entsprechenden Verdünnungen von JEV und Konzentrationen des Arzneimittels im Verhältnis 1 : 1 vermischt, um die gewünschte Endverdünnung des Virus und der Konzentration des Arzneimittels für das Einimpfen zu erhalten. Die Gesamtzeit zwischen dem Mischen des Virus und des Arzneimittels einerseits und der Beimpfung der 7 Tage alten Eier beträgt 2 Minuten, um eine mögliehe Wirkung einer Berührungsinhibierung der Virenansteckungs- j fähigkeit in vitro herabzusetzen. Jedes Ei wird über die \ , allantoische Höhle mit 0,2 ml des Gemisches beimpft, verschlos-j

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sen und dann 8 Tage bei 35⁰G bebrütet. Die Eier werden täglich durchleuchtet, um den Tod von Embryos festzustellen.

Wie aus Tabelle VIII ersichtlich ist, die über die Anzahl von toten Embryos je Anzahl Eier und in Klammern die nicht-spezifischen toten Embryos, die innerhalb 48 Stunden nach der Beimpfung festgestellt v/urden, berichtet, besteht ein Schutz der Embryos bei einer Arzrieimitteldosierung von 40/Ug und Viren-

2 3 4 3 mengen von 10 ' und 10.

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co

OO CO NJ

οα

Tabelle VIII

Wirkung von JEV und 6-18:1 auf das Wachstum von

Kückenembryos

l JEV PFU/Ei	yug der Verbindung je Ei	O	0,4.	0/7	4	40	0/7
kein Virus	0/5 (2).	6/6 (1)	1/4 (3)	2/5 (2)
1O⁶'⁵	5/5 -(2)	5/6 (1)	6/6 (1)	0/5 (2)
1O⁴'⁵	6/6 (1) 5/5 (2)	3/7	3/3 (4)	0/7
1O²'⁵	2/7	4/7

annuvnentienden
Die erfindungsgemäss /Verbindungen können in pharmazeutischen Zubereitungen vorliegen, die nach in der Pharmazie bekannten Weisen hergestellt worden sind. Zum Beispiel können für eine orale Verabreichung die Verbindungen in Rindereiweiss in Form eines Syrups oder Kapseln oder Cachets hergestellt werden, in denen Geschmacksstoffe, Schutzstoffe, Suspensionsmittel, Verdi ckungsst off e und/oder Emulgiermittel oder dergleichen eingearbeitet sein können. Pur eine parenterale Verabreichung können die Verbindungen in Form von injizierbaren Lösungen oder Sus pensionen vorliegen, die Puffersubstanzen, Bacteriostatika, Suspensionsmittel und/oder Verdickungsmittel und dergleichen enthalten können. Für eine äusserliche Anwendung der Verbindungen können sie in übliche Sprays, Kremes, Lotionen oder Salben eingearbeitet werden.

Die Dosierungen liegen im Bereich von etwa 25 bis 5000 mg/kg Körpergewicht und hängen von der Art und Häufigkeit der Verabreichung ab. Pur orale und intraperitoneale Verabreichungen können die Dosierungen etv/a 50 bis 3000 mg/kg Körpergewicht betragen, während für eine intracraniale Verabreichung viel niedrigere Dosierungen, und zwar im Bereich von etwa 25 bis 300 mg/kg verwendet werden. In jedem Fall ist es vorteilhaft, die höchstmögliche^ Dosis zu verabreichen, die gegenüber dem Wirtstier nicht toxisch ist. Aus Zweckmässigkeitsgründen und zur Vereinheitlichung beziehen sich die erfindungsgemäss durchgeführten Arbeiten auf die Verwendung der Natriumsalze. Es ist jedoch bekannt und anerkannt, dass in physiologischer Hinsicht die Kalium- und Ammoniumsalze den Natriumsalzen äquivalent sind.

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Da eine abgestufte Heizwirkung auf das Tiruswachstum durch die Dosierung des Arzneimittels gegeben ist, ist es möglich, die optimal wirkende Dosis des Arzneimittels herauszufinden, die eine niedrige Infektionsstufe aufrechtzuerhalten gestattet, was die Entwicklung einer dauernden Immunität gegen eine Infektion bei einem in Behandlung stehenden Patienten zulässt. Dies erfordert eine strenge Kontrolle der Arzneimittelverabreichung während der Infektion _% um dauernde pathologische Folgen zu verhindern. Dieses einzigartige System kann zur Entwicklung einer dauerhaften Immunität bei Leiden verwendet werden, die gegenwärtig durch Impftechniken schwierig zu verhindern sind.

Gegenwärtig können zahlreiche Arbovirus-Impfstoffe aus Mäusgehirn hergestellt werden.' Obwohl diese Präparate hochgradig gereinigt werden, können sie doch zu einer aseptischen Eneephalomyelitis infolge Reaktionen der Mausgehirnsubstanz führen,, die nicht vollständig aus dem Impfstoff entfernt werden kann. Viren, die in Gewebekulturen in Gegenwart des Serums gezüchtet, dann gereinigt und mit Formaldehyd inaktiviert*worden sind, können als Versuchsimpfstoffe verwendet werden. Zahlreiche dieser Zubereitungen sind zur Herbeiführung.einer dauerhaften Immuni-. tat gegen Arbovireninfektionen bei Kindern nicht voll wirksam. Die Viren können Jetzt nach dem erfindungsgemässen Verfahren in einem vollständig definierten System in vitro gezüchtet werden, um Viruspräparationen mit weniger. Verunreinigungen im Serum zu liefern als sie bisher erhalten werden konnten.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann demnach zur Herstellung besser~wirksamer Impfstoffe herangezogen werden.

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Claims

- 23 Patentansprüche

1. Arzneimittel, insbesondere Impfstoffe, zur Behandlung von Virusinfektionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen, deren Salze oder Ester gegebenenfalls zusammen mit pharmakologisch verträglichen TrägerStoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an den Natrium-, Kalium- und/oder Ammoniumsalzen der ungesättigten Fettsäuren.

3. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gees Fettsäuren mit/ kennzeichnet, dass / wenigstens einer Doppelbindung an

einem geradzahligen Kohlenstoffatom enthält.

4. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Salz einer Octadecensäure enthält,

5. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, .dass es ein Salz der £-Octadecensäure (Petrosellnsäure) enthält.

6. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine Dosierungseinheit in einer Einzel- oder Mehrfachdosierung von 25 bis 3000 mg ungesättigter Fettsäure, deren

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- 24 Salz oder Ester je leg Körpergewicht.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine oral zu verabreichende Dosierungseinheit in einer Einzeloder Mehrfachdosierung von 50 bis 5000 mg ungesättigter Fettsäure, deren Salz oder Ester je kg Körpergewicht.

8. Arzneimittel nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine intracranial zu verabreichende Dosierungseinheit in einer Einzel- oder Mehrfachdosierung von 25 bis 300 mg ungesättigter Fettsäure, deren Salz oder Ester je kg Körpergewicht.

9· Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis' 8 in Form eines Impfstoffes in Rinderserumalbumin.

10. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1 bis 8, gekennzeichnet durch eine äusserlich anzuwendende Verabreichungsform.

11.. Verfahren zur Herstellung, der Arzneimittel, insbesondere Impfstoffe, nach den Ansprüchen·1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die einfach öder mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen, ihre Salze oder Ester mit dem am Wachstum zu hindernden Virus in Gegenwart von Wasser vermischt und mindestens eine Stunde bei 20 bis 37°C stehen lässt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gemisch bei 25⁰C stehen lässt.

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