DE2064296A1

DE2064296A1 - Method for producing an inhibitor of pathological processes and using the same

Info

Publication number: DE2064296A1
Application number: DE19702064296
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Villepreux; Jasmin Claude Paris; Mathe Georges La Norville; Raynaud Marcel Versailles; Chermann (Frankreich). P
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1969-12-31
Filing date: 1970-12-29
Publication date: 1971-07-15
Also published as: DK128054B; CH533988A; FR2073293B1; AT301749B; FR2073293A1; NL7019097A; DE2064296C2; JPS4940922B1; LU62332A1; CA956573A; BE760727A; GB1326928A

Description

PATENTANWALTPATENT ADVOCATE

DR. HAN3 ULRICH MAYDR. HAN3 ULRICH MAY

D 8 MÖNCHEN 2, OTTOSTRASSE 1a ? Π R Λ ? 9 RD 8 MÖNCHEN 2, OTTOSTRASSE 1a? Π R Λ? 9 R

TELEGRAMME: MAYPATENT MÖNCHEN TELEFON C081O 0936 32TELEGRAMS: MAYPATENT MÖNCHEN TELEPHONE C081O 0936 32

I-4-P-2/921 München, 2 9, Dez, 1970I-4-P-2/921 Munich, December 2, 1970

B 3528 Dr.M./VB 3528 Dr.M./V

IHSTlIUT PASTEPR in Paris / grankreichIHSTlIUT PASTEPR in Paris / France

Verfahren sur Herstellung eines Inhibitors pathologischerProcess for the production of a pathological inhibitor Prozesse und Verwendung desselben,,Processes and use of the same,

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Inhibitors pathologischer Prozesse» welcher inabesondere die Entwicklung von Leukämien und anderen Krebakrankheiten hemmen kann-,The invention relates to a method for producing a Inhibitor of pathological processes, which in particular Inhibit the development of leukemia and other cancers can-,

Die Erfindung betrifft ferner die nach diesem Verfahren erhaltenen Inhibitoren sowie die therapeutischen Anwendungen derselben bei der Behandlung von Leukämien und Krebakrankheiten beim Tier und beim Menschen»The invention also relates to the inhibitors obtained by this process and to the therapeutic uses thereof in the treatment of leukemias and cancerous diseases in animals and humans »

Im Verlauf früherer Untersuchungen konnten die Erfinder bereite eeigen, dass der Mäuseleukämievirus (friend-Virus, Hauscher-Virus) in dem Niederschlag aktiviert vorliegt, der aus mit Polyäthylenglykol behandelten Aufbereitungen infisierter Rohzellen erhalten wird«In the course of previous studies, the inventors were able to prepare It is inherent that the mouse leukemia virus (friend virus, Hauscher virus) is present in activated form in the precipitate that comes from with Polyethylene glycol treated preparations of infected crude cells is obtained «

Diese Feststellung führte die Erfinder eu der Annahme, ·»This finding led the inventors to believe that · »

109829/1836109829/1836

-²- 206Λ296- ² - 206Λ296

mUeee ein Inhibitor vorhanden sein} der in der Roh -Aufbereitung die Virusalctivität hemmen kannean inhibitor must be present in the raw preparation can inhibit viral activity

Durch die Erfindung soll nan ein Verfahren aur Herstellung eines solchen Inhibitors geschaffen werden, eier benutzt werden kann, um leukämische oder andere krebsartige pathologische Prozesse,, insbesondere solche vom Typ der Leukämie, zu hemmen₀ The invention aur preparation should be of such an inhibitor provided nan a method can be used eggs to leukemic or other cancerous pathological processes ,, in particular those which inhibit the type of leukemia ₀

Dieoe Aufgabe wird gemäss der Erfindung gelbst durch ein Verfahren zur Herstellung einen Inhibitors pathologischer Prozesse, welches im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Zellaufbereitung einer ersten Fällung in neutralem Milieu unterworfen wird, der erhaltene Niederschlag von der Überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, die Flüssigkeit einer zweiten Fällung in aaurem Milieu miterivorfen und der durch diese zweite Fällung erhaltene Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt wird, welche ilen Inhibitor enthält,According to the invention, this object is achieved by a method for the production of an inhibitor of pathological processes, which is essentially characterized in that a Cell preparation subjected to a first precipitation in a neutral environment the precipitate obtained is separated from the supernatant liquid, the liquid of a second precipitation thrown out in an acidic environment and that caused by this second precipitation obtained precipitate separated from the supernatant liquid which contains ilen inhibitor,

Ein wirksamer Inhibitor kann naeh äiesera Verfahren, ausgehend von pathologischen Zellen, beispielsweise einer Suspension tierischer Zellen, die in vivo kultiviert und mit dem Leukämievirus infiziert sind, erhalten werdetn Es hat sich jedoch gezeigt, daß das Verfahren nicht nur unter Verwendung von infizierten Zellen, wie in äcn früheren Untersuchungen der Erfinder, sondern auch unter Verwendung von Zellen normaler, nicht pathologischer Gewebe wirksam durchgeführt werden kann₀ An effective inhibitor can be obtained according to these methods starting from pathological cells, for example a suspension of animal cells cultured in vivo and infected with the leukemia virus in the inventors' previous studies, but also using cells of normal, non-pathological tissues can be carried out effectively ₀

Gemäß den besonderen AuofUhrungsformen des erfindungagemößen Verfahrens besteht die Zcllzubereitung daher aus einer S us pen«·According to the special execution forms of the invention Procedure, the target preparation therefore consists of a pen «·

109829/1836109829/1836

aion von Seilen» dieaion of ropes »the

1. aus normalen (nicht pathologischen) Geweben, vorzugsweise1. from normal (non-pathological) tissues, preferably lymphartigen Geweben»lymphoid tissues »

2η au» in vitro-Külturen von aue uolchen Geweben gewonnenen2η in vitro cultures obtained from all tissues Zellen,Cells,

3«, aus mit Viren, insbesondere einem Viroe vom Leukämietyp,3 «, from with viruses, in particular a virus of the leukemia type, infiEierten Zellkulturen erhalten wurden,infected cell cultures were obtained,

Bei dem erfind ungegemäßeη Verfahren kann die in neutralem IiI-U.eii durchgeführte ere te Fällung vorteilhafterweise bewirkt waröen, indem die Zelleubereltung mit einem Alkohol, insbesondere mit Polyäthylenglykol, in Berührung gebracht wird, wobei de:? Alkohol vorzugsweise mit einer Konsentration swisohen 'i. und 1C i»_% bezogen auf das Gemisch, angewandt wird.In the method according to the invention, the pre-precipitation carried out in neutral IiI-U.eii can advantageously be brought about by bringing the cell overexposure into contact with an alcohol, in particular with polyethylene glycol, where de :? Alcohol preferably swisohen 'i with a consentration. and 1C i » _% based on the mixture is applied.

Die naoh der ersten Fällung abgetrennte Flüssigkeit wird der zweiten Fällung unterworfen. Hierfür ist ein bevoreugtes Reagens die Silico- Wolframsäure mit einem llolverhältnie von 1 Silikation auf 12 WolframAtionen.The liquid separated after the first precipitation becomes the subjected to second precipitation. A preferred reagent for this is the silico-tungstic acid with a molar ratio from 1 silication to 12 tungsten ions.

Die verschiedenen Stufen des Verfahrens werden im allgemeinen bei einer tiefen Temperatur durchgeführt, die «wischen -10⁰C und + 10⁰C, vorzugsweise «wischen 0 und 4⁰O liegt»The various stages of the process are in general carried out at a low temperature, the "wipe -10 ⁰ C and +10 ⁰ C, preferably" wipe 0 and 4 ⁰ O is located »

Die Erfindung umfaast ferner außer den duroh dieses Verfahren erhaltenen Inhibitoren, deren therapeutische Verwendungen but präventiven oder kurativen Behandlung tierischer oder menschlicher Leukämien oder von Sarcomen.The invention further includes, in addition to the inhibitors obtained by this process, the therapeutic uses of which are but preventive or curative treatment of animal or human leukemias or sarcomas.

109829/1836 ^BAD 109829/1836 ^BAD

Insbesondere konnte experimentell die Präventivwirkung Je« Inhibitors an Mäusen, denen zuvor eine hohe Dosis Leukömievirus injiziert worden war, und seine inhibierende Wirkung auf die ■Sarcoma »Umwandlung normaler MBusezellen, welche der Einwirkung des Mäusesarcomvirus von Moloney ausgesetzt waren, gezeigt werden,, .In particular, the preventive effect could be experimentally “inhibitor on mice previously exposed to high doses of leukemia virus had been injected, and its inhibitory effect on the sarcoma conversion of normal MBus cells, which the action of Moloney's mouse sarcom virus will be shown,.

Der erfindungsgemäß erhaltene Inhibitor ist jedoch verschieden vom Interferon und bekannten Interferon-Induktoren (synthetische Polyrlbonucleotlde, Komplexe von Nucleinsäure und Polysacchariden), deren antileukfimlsche Eigenschaften bereits nachgewiesen wurden,, Insbesondere besitzt der Inhibitor nicht die Artspe2ifitäit des Interferons« Beispielsweise hemmt der aus Mäusezellen extrahierte Inhibitor die Entwicklung des Sarcomvirus von Hous auf Hlihner-Flbrcjlastett,, Der Inhibitor hemmt in vi « tro die aarcomatöse Umwandlung, die durch sarcomatogene Mäuseviren hervorgerufen wird» welche auf normale Mäusefibro/iasten einwirken. Der Inhibitor wirkt, wenn er nach der Fixierung des "Virus an den Zellen, beispielsweise 2 bis 8 Stunden später, augesetzt wird, was beim Interferon nicht der Pail ist*The inhibitor obtained according to the invention is, however, different from interferon and known interferon inducers (synthetic Polyrlbonucleotlde, complexes of nucleic acid and polysaccharides), their anti-inflammatory properties have already been proven were ,, In particular, the inhibitor does not have the Species Specificity of Interferon «For example, it inhibits Mouse cells extracted inhibitor the development of the sarcoma virus from Hous on Chicken Flbrcjlastett ,, The inhibitor inhibits in vi « tro the aarcomatous transformation brought about by sarcomatogenic mouse viruses which act on normal mouse fibroids. The inhibitor works when it is stopped after the virus has fixed on the cells, for example 2 to 8 hours later becomes what is not the pail with interferon *

Die Erfindung wird im folgenden erläutert durch die Beschreibung von beispielhaften AusfuhrungsformenoThe invention is illustrated below by the description of exemplary embodiments

example 1

Die als Ausgangsmaterial benutzte Zelleubereitung wird hier aus In vivo Kulturen von infizierten tierischen Zellen, genau-' er aus der Milz von leukämisehen Mäusen (die mit dem Friend· Virus infiziert sind) erhalten, die in einer physiologischenThe cell preparation used as the starting material is here from in vivo cultures of infected animal cells, exactly- ' it is obtained from the spleen of leukemia mice (which are infected with the Friend · virus), which in a physiological

Lösung suspendiert werden» Die Zellsuapension, welche etwa 100 mg (Gewicht in feuchten Zustand) pro Milliliter enthält, wird wiederholt zentrifugiert» um nach bekannten Methoden die intakten Zellen und die Zellbruchstüeke abzutrennen«, Man zentrifugiert beispielsweise zweimal nacheinander je 10 Minuten bei 5000 und anschliessend bei 10 000Solution to be suspended »The cell suspension, which about 100 mg (weight in the moist state) per milliliter is centrifuged repeatedly according to known methods to separate intact cells and the cell fragments «, one centrifuges for example, twice in succession for 10 minutes each time at 5000 and then at 10,000

Der so erhaltene Zellextrakt wird einer ersten Fällung unterworfen, die durch Zugabe de3 unter der Handelsbezeichnung "Carbövvax 6000" bekannten Polyäthylenglykols hervorgerufen wird, Da3 Polyäthylenglykol wird allmählich zur Zellzubereitung zugesetzt, bis seine konzentration im Gemisch 5 Grew_o# beträgto Nach 3-stUndigem Kontakt bei 4⁰C wird das Gemisch 20 Minuten mit 10 000 UpM bei 4⁰C zentrifugiert, um den durch die Reaktion gebildeten Niederschlag abzutrennen« Der Niederschlag wird verworfen« The cell extract obtained in this way is subjected to a first precipitation, which is caused by adding de3 polyethylene glycol known under the trade name "Carbövvax 6000", Da3 polyethylene glycol is gradually added to the cell preparation until its concentration in the mixture is 5 Grew _o # o After 3 hours of contact with 4 ^° C., the mixture is centrifuged for 20 minutes at 10,000 rpm at 4 ^° C. in order to separate off the precipitate formed by the reaction. "The precipitate is discarded"

Zu der durch die vorangehende Zentrifugierung vom Niederschlag getrennten liberstehenden Flüssigkeit wird dann ein gleiches Volumen 12-Wolframkieaelsäure zugefügt.. Im. beschriebenen besonder ren Fall wird dieses Reagenz aus den entsprechenden Natriumsalzen wie folgt hergsstelltj 26,7 g Na₃SiO,, 8 HgO und 397 g Na₂WO., 2 H₂O werden in 2,5 1 Wasser gelöst. 75 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zugesetzt, und es wird 5 Stunden lang am RUokfluß gekocht. Die erhaltene Lösung wird filtriert, dann abgekühlt und mit Vasser auf 5 1 aufgefüllteAn equal volume of 12-tungsten keal acid is then added to the excess liquid separated from the precipitate by the previous centrifugation. In the particular case described, this reagent is prepared from the corresponding sodium salts as follows: 26.7 g Na ₃ SiO, 8 HgO and 397 g of Na ₂ WO., 2 H ₂ O are dissolved in 2.5 l of water. 75 ml of concentrated sulfuric acid are added and the mixture is boiled for 5 hours under the RUokfluss. The solution obtained is filtered, then cooled and made up to 5 liters with water

Die Zugabe der Sillcowolframsöure eur Überstehenden FlüssigkeitThe addition of the sillco tungsten acid to the supernatant liquid

10 9829/183610 9829/1836

BAD ORIGINAL·BATH ORIGINAL

der ersten Fällung bewirkt eine »weite Fällung, die bei einem pH in der Größenordnung von 1_fO eintritt„ Man läßt das Gemisch Über Nacht bei einer Temperatur von O bis 4⁰O reagieren,, Die Abtrennung des gebildeten niederschlage erfolgt dann, durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM während 30 Miauten bei einer Temperatur von 4⁰CoThe first precipitation causes a »further precipitation, which occurs at a pH in the order of magnitude of 1 _f O.“ The mixture is allowed to ^{react overnight at a temperature of 0 to 40} O. The precipitate formed is then separated off by centrifugation with 10,000 rpm for 30 serenaded at a temperature of 4 ⁰ Co

Die nach diesem Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch Zugabe von konzentriertem Alkali (Natriumhydroxydlösung) bis auf eisen pH von 7_t0 neutralisiert* Sie wiPd an-" schliessend durch Dialyse gegen destilliertes Y/asser gereinigt und insbesondere von Salzen befreit» die womöglich durch die Behandlung eingeführt wurden» Anschließend wird die Lösung lyephilisiert» Das erhaltene Produkt stellt den Roh-Inhibitor dar» Es kann anschließenden Reinigungen unterworfen werden«The supernatant obtained by this centrifugation is by addition of concentrated alkali (sodium hydroxide) to iron pH of 7 _t neutralized 0 * You wiPd Toggle "closing by dialysis against distilled Y / ater purified and freed particular salts" which might through the Treatment were introduced »The solution is then lyephilized» The product obtained represents the raw inhibitor »It can be subjected to subsequent cleaning«

Dieser Inhibitor wurde mit einer Dosis von 10 bis 100 Mikrograram 4 Tage vor einer verhältnismäßig hohen Dosis Leukämievirus Mäusen injiziert«, Die3e Virusdosis wurde so gewählt,, daß sie bei ^ 100 ?S der nicht geimpften Tiere eine Leukämie mit Splenomegalie, Anwesenheit von leukämischen Zellen im Blutkreislauf und Tod der Versuchstiere im Verlauf von 2 Monaten bewirkte» Keine dieser Polgen trat bei den Mäusen auf, welche den Rohinhibitor 4 Tage vor dem Virus erhalten hatten»This inhibitor was given at a dose of 10 to 100 micrograms 4 days before a relatively high dose of leukemia virus mice injected ", The virus dose was chosen so that it was at ^ 100? S of the non-vaccinated animals developed leukemia with splenomegaly, Presence of leukemic cells in the bloodstream and death of the test animals caused »None of these polar genes occurred in the mice that received the crude inhibitor Received 4 days before the virus »

Example 2

Es wurde in gleicher V/eise verfahren, wobei jedoch ZellBUspen-Bionen verwendet wurden, die nicht aus infizierten Zellen,The same procedure was used, except that cell-bust bions that were not used from infected cells,

109829/183S109829 / 183S

BADBATH

sondern aus von normalen lymphartigen Geweben (insbesondere MiIa, Thyraua oder lymphatische Ganglien) erhalten und in vitro kultiviert gehalten wurden (gleichgültig ob es sich um erat gewonnene Zellkulturen oder weitergeaüohtete Stämme handelte), oder aus Zerkleinerungsprodukten oder ßxtrakten der glei-chen Gewebe, die vom Tier oder Menschen entnommen sein können»but from normal lymphoid tissues (especially MiIa, Thyraua or lymphatic ganglia) and in vitro have been kept in cultivation (regardless of whether they are erat-derived cell cultures or further strained strains), or from comminution products or extracts of the same Tissues that can be taken from animals or humans »

Beispiel 3 At s pi el 3

An verschiedenen Zellsuspensionen wurden die gleichen Arbeitegänge wie im Beispiel 1 vorgenommen, wobei jedoch der Anteil des der Zubereitung zugesetzten Polyäthylenglykole «wischen 2 und 10 Gew₃«# verändert wurde α Be scheint, daß die besten Päl« lungsbedingungen bei Werten in der Größenordnung von 4 bis 6 % erhalten werden»At various cell suspensions, the same Work runs were made as in Example 1 except that the proportion of the added preparation polyethylene glycols "wipe 2 and 10 ₃ wt« # has been changed α Be appears that the best Pal "lung conditions at values in the order of 4 up to 6% will be received »

Ebenso wurde der Anteil Sllicowolframsäure verändert, welcher der bei der vorangehenden Stufe verbleibenden Überstehenden Flüssigkeit zugesetzt wurde, um die sweite Fällung zu bewirken. Insbesondere wurde ei'ne 12-Wolframkieseleäure benutzt, die wie im Beispiel 1 hergestellt worden war und in einem Verhältnis von 2 Volumen auf 1 Volumen der nach der Polyäthylenglykolfällung überstehenden Flüssigkeit und in verschiedenen anderen Verhältnissen zwischen O₉3 und 3 Volumen eugesetet wurde»The proportion of silicotungstic acid which was added to the supernatant liquid remaining in the previous step was also changed in order to bring about the further precipitation. In particular, a 12-tungsten silicic acid was used, which had been prepared as in Example 1 and was set in a ratio of 2 volumes to 1 volume of the supernatant liquid after the polyethylene glycol precipitation and in various other ratios between O ₉ 3 and 3 volumes »

Durch Veränderung der Kon»entration der Silico-Wolframsäure und nicht nur der Menge der benuteten Lösung wird die molare Konzentration der iiilico-Wolframaäure in der behandelten Flüssigkeit verändert und zwar bis auf fUnffaoh höhere oder fünffach niedrigere Werte als im Beispiel 1,By changing the concentration of the silico-tungstic acid and not only the amount of the solution used, the molar concentration of iiilico-tungstic acid in the treated liquid is changed, up to five times higher or five times lower than in example 1,

109829/183 6109829/183 6

Beiojgiel^Beiojgiel ^

Die Tabelle I fUh.^i verschiedene Versuchsergebnisse auf_f welche die antileakfrflieene Aktivität dös Inhibitors an Mäusen zeigen*The ^ Table I Fuh. I different test results on which the _f antileakfrflieene activity dös inhibitor indicate mice *

In alien Fallen besteht der Inhibitor aus der lyephilisierten überstehenden Flüssigkeit^ die nach der 12-7'olframkieselsöure-Fällung anfällt und aus einer Kultur von Zellen JLSV^ (mit dem Rauscher-Virus chronisch infizierten Milz- und Thy~ muszeilen von Mäusen) hergestellt wurde«, Die Mäuse erhielten diesen Inhibitor in verschiedenen Dosen im G-emiach mit dem Friend-Virus, dessen leukUmogene Wirkung₍. die je nach Versuch verschieden ist» in der Tabelle als Milfcdosis ("spieen dose") SDf-Q ausgedruckt ist»In all cases, the inhibitor consists of the lyephilized supernatant liquid which is obtained after the 12-7% silica precipitation and was prepared from a culture of cells JLSV (spleen and thyroid cells of mice chronically infected with the Rauscher virus) «, The mice received this inhibitor in various doses in the G-emiach with the Friend virus, whose leukUmogenic effect ₍ which varies depending on the experiment» is expressed in the table as Milfcdosis ("spit dose") SDf-Q »

Die Ergebnisse zeigen eine faet vollständige Inhibierungswirkung bei Inhibiterdosen von O₅25 bis 5 mg in den mit einem Virustiter 21 SD,.₍. durchgeführten Versuchen» FUr einen Titer Über 100 SD₅₀ ist die Inhibierung nicht vollständig, jedoch . beobachtet man eine deutliche Abnahme des mittleren Gewichts der Mils der behandelten Mäuse, wobei dieses Gewicht drei Wochen nach der Injektion der Virussuspension bestimmt wurde.The results show a completely complete inhibitory effect at inhibitor doses of O ₅ 25 to 5 mg in those with a virus titer of 21 SD. ₍ . Experiments carried out “For a titer above 100 SD ₅₀ , the inhibition is not complete, but a clear decrease in the mean weight of the mils of the treated mice is observed, this weight being determined three weeks after the injection of the virus suspension.

109829/1836109829/1836

TABLE I.

Inhlbi kor· Virua dösig mgInhlbi kor · Virua sleepy mg

2121st

nullzero

5 i5 i

Durchschnitt a- Anzahl leummigewichte der Mil« scher Hau·« zur ng Anzahl behandelterAverage number of leummigeweights of the Mil «scher Hau ·« zur ng number of treated

MäuseMice

168 177 171 187 160168 177 171 187 160

10/10 0/10 0/10 1/10 0/1010/10 0/10 0/10 1/10 0/10

100100

nullzero

700700

374374

10/1010/10

5/95/9

1010

QttllQttll

425425

182182

10/1010/10

1/101/10

7272

nullzero

918918

211211

10/Yo10 / Yo

2/92/9

135135

0,100.10

Beispiel SExample p

Tabelle II seiet die Ergebnisse von Untersuchungen.der Aktivität des Inhibitors ouf die Wirkung, welche der IMUaeBftYoomvlruatyp Moloney in vitro auf eabryonal· Mäuseflbroblasten ausübt. Der Inhibitor wer n%eh dem Verfehren des Beispiels 1 aus Mil«- und Thynussellen fön mit den Hauacher-Vlrus (JLSYe) chronischTable II is the results of activity studies of the inhibitor on the effect which the IMUaeBftYoomvlruatyp Moloney exerts on eabryonal · mouse fflbroblasts in vitro. Of the Inhibitor who n% eh the procedure of example 1 from Mil «- and Thynussellen hair dryer with the Hauacher-Vlrus (JLSYe) chronic

109829/1131109829/1131

BAD ORIQINAI.BATH ORIQINAI.

infizierten Mäusen oder aus mit dem Mäuaesarcomvirua von MoIoney (MSV) chronisch infizierten Milzfibroblastön-Zellen hergestellt infected mice or from Mäuaesarcomvirua from MoIoney (MSV) chronically infected spleen fibroblaston cells

Die Inhibitorwirkung wurde in vitro durch die Ansahl gebildeter Höfe (JJ¹U) gemessen- bis Ergebnisse »eigen, dafl der Inhibitor die Bildung dieser Höfe verhindert=,The inhibitory effect was measured in vitro by the number of formed halos (JJ ¹ U) - until results were found that the inhibitor prevented the formation of these halos =,

'JPABELLE II'J TABLE II

Herkunft Inhibitor« Zugesetzte*¹ Anzahl wiederge- Hemmung
doeie(ag) Virus fPU fundener Höfe i> Origin Inhibitor «Added * ¹ Number of re-inhibition
doeie (ag) virus fPU of found farms i>

22 216216 11 99*599 * 5 11 216216 33 9β,69β, 6 JLSV₅ JLSV ₅ 11 117117 tt 99,1.99.1. 0,5000.500 117117 1313th 89, ί89, ί HSVHSV 2
12
1 328
328328
328 83
13083
130 69_ν3
57,169 _ν 3
57.1 HSVHSV ί
0.500ί
0.500 ns
128 ns
128 6
326th
32 95,3
75,095.3
75.0

1 772 O 1001 772 O 100

0,1 772 183 760.1 772 183 76

BeliDltl 6BeliDltl 6

Die hier wieder^egebenen Versucheergebnise· Beigen, das* der Inhibitor auf den VSV Virus (Veeicular öto«otitle Viru«) in keiner Weise analog dem Interferon wirkt,The test results given here are beige, that is the inhibitor on the VSV virus (Veeicular öto "otitle Viru") in none Acts analogously to interferon,

In diesen Untersuchungen wurden in JSaglt-M*di»a (lyoph^iertee (ji^öö-liediu·) kultivierte Zellta L mit 5 i> Kalbeeeru« versetzt, trypeinieiert. In ialoon-Plett·» werden 50 000 Zellen pro LoohIn these investigations, cultured cells were added to JSaglt-M * di »a (lyophilized tea (ji ^ öö-liediu ·) with 5 i> Kalbeeeru«, trypeinieiert. In ialoon-Plett · »50,000 cells per looh

109829/1836109829/1836

für den Hierotest gegeben.given for the Hiero test.

24 Stunden späte?, wenn die Zellen am Zusammenfließen sind, inkubiert man eic mit:24 hours later? When the cells are confluent, incubate with:

1 einer Inhibitorlösung, die aus JLSV^ - Zellen hergestellt ist und 1 mg des Produkts pro ml enthält, sowie anschließend mit Verdünnungen um den Paktor 2 bis auf t/16;1 of an inhibitor solution made from JLSV ^ cells and contains 1 mg of the product per ml, and then with dilutions of the factor 2 up to t / 16;

2. mit einer Lösung des Interferone der Vergleichsmäuse, die auf 1/1OO_S 1/200, 1/400, 1/eOO, 1/1600 verdünnt iet_r 2. with a solution of the interferons of the control mice, the diluted 1 / 1OO _S 1/200, 1/400, 1 / eoo, 1/1600 _r iet

2 Löcher pro Punkt»2 holes per point »

An Ende von 24 stunden wechselt man das Milieu. Man gibt dann etwa 1000 TCIDr₀ von auf Zellen präpariertem VSV (Vesicular Stomntitis virus) au«At the end of 24 hours you change the environment. _{About 1000 TCIDr 0} of VSV (Vesicular Stomntitis Virus) prepared on cells are then added.

Als Kontrolle dienen Platten ohne Virus und Zellen mit dem Virus allein. Nach Verlauf von 24 bis 48 stunden liest man die Lyse ab» welche vcn 0 bis 3*- bewertet wirdc Die Ergebnisse der Tabelle III zeigen, daß der Inhibitor im Gegensatz zum Interferon keinerlei Schut'zwirfcung hat.Plates without virus and cells with the virus serve as controls alone. After 24 to 48 hours, the lysis is read off » which is rated from 0 to 3 * - c The results of Table III show that, in contrast to interferon, the inhibitor has no protective effect whatsoever.

Die Abwesenheit dea Interferon-Effekts zeigt sich auch durch dieThe absence of the interferon effect is also shown by the

folgenden Tatsachen:following facts:

1* Eine einzige Injektion verhütet bei der empfindlichen Matts die Induktion von Leukämien durch den Friend- oder Rauscher-Virus und von Sarcomeu durch den M-MSV (Mäuee-Sareom-Virus)1 * A single injection prevents the delicate matts from dieing Induction of leukemia by the Friend or Rauscher virus and of Sarcomeu by the M-MSV (Mäuee-Sareom-Virus)

2- Die Wirkung Beißt sich selbat_twenn das Produkt 4 Tage vorher injiziert wird_e während das Interferon nur eine kürzere Lebensdauer hat<■2- The effect of bite to selbat _t when the product is injected 4 days in advance _e only has a shorter life while the interferon <■

!09829/1836! 09829/1836

TABLE III

Interferoninterferon 1/100
01/100
0 +ψ*+ ψ * 1/200
01/200
0 V4V4 ΐ/400 1/6C
0 +ΐ / 400 1 / 6C
0 + 1/16001/1600 InhibitorInhibitor 1/21/2 OO 1/81/8 1/161/16 Vergleichs»
VirusComparison »
virus Vergleichs
se IlenComparison
se Ilen

EXAMPLE 7

Einer Gruppe von 6 1 1/2 Monate alten Schweizer Mäusen werden 0_s15 ml einer 50 mg/ml von aus JLSVe Zellen hergestelltem Inhibitor enthaltenden Lösung injizierteA group of 6 1 1/2 months old Swiss mice are injected with 15 ml of a solution containing 50 mg / ml of inhibitor prepared from JLSVe cells _{for 0 seconds}

Eine Kontrollgruppe von 2 Mäusen erhält 0,15 ml 0,9 $ige NaCl-Lösungo A control group of 2 mice receives 0.15 ml of 0.9% NaCl solution

Nach Verlauf von 2_P 6 und 9 Stunden nach der Injektion des Produktes werden 2 Mäuse der ersten Gruppe getötete In dem durch Blutentzug erhaltenen Serum sucht man in dem im vorigen Beispiel beschriebenen System nach der Anwesenheit von Interferone. Die Verdünnungen des Serums sind 1/10, 1/20, 1_s40_e After 2 _P 6 and 9 hours after the injection of the product, 2 mice of the first group are sacrificed. In the serum obtained by blood withdrawal, a search is made for the presence of interferons in the system described in the previous example. The dilutions of the serum are 1/10, 1/20, 1 _s 40 _e

Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV aufgeführt«. Sie eeigen» daß im Serum der behandelten Tiere keine Induaierung der Interferon-Synthese eintritt, sodaß der Inhibitor nicht einer Inter·The results are shown in Table IV. You own » that no induction of interferon synthesis in the serum of the treated animals occurs so that the inhibitor does not inter

10 9 8 2 9/183610 9 8 2 9/1836

feron induzierenden Substanz ("Interferon inducer") ähneln kann* feron inducing substance ("interferon inducer") may resemble *

2ABELLE_IV2TABLE_IV

Serum Verdünnung Α[λο i/lO Serum dilution Α [λο i / lO

Mit dem Inhibitor 2hWith the inhibitor 2h

6h
9h6h
9h

behandelte jauumj cu ψ+*treated jauumj cu ψ + *

Kontrolle Serum
(0„9# NaCl) +++ +++Control serum
(0 "9 # NaCl) +++ +++

Kontrolle Zellen OControl cells O

Kontrolle Virus +4+Control virus +4+

Die 0?aboX'i.e V fUhrt experimentelle ErgebniaEje der Inhibitorwirkung auf die Friend-Leukämie bei der Maus fUr verschiedene Herkunft des Inhibitors auf, der nach dem Verfahren des Beispiels 1 entweder aus verschiedunen menschlichen Geweben (Tabelle V) oder aus verschiedenen tierischen Quellen hergestellt wurde„The 0? AboX'i.e V leads to experimental results depending on the inhibitor effect on Friend's leukemia in mice for various origins of the inhibitor obtained by the method of Example 1 either from various human tissues (Table V) or was made from various animal sources "

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

109829/1838109829/1838

VerdUnnungT"""**" """^TneaKTTleiä- Durch- "TnJizier- Herdes indizier- kämiaoher schnltta« te Inhi- kunft ten Prlend^leu- Mäuse zur An- gewicht der bltor- des Inküraiachen Plaemas isahl behandelter Milz (wa) dosis hibl-DilutionT "" "**" "" "^ TneaKTTleiä- through-" TnJizier- hearth indexed information ten Prlend ^ leu- mice for weighting the bltor- des Inkuraiachen Plaemas isahl treated spleen (wa) dose hibl-

^J tors ^J tors

10/10
β/910/10
β / 9 486
345486
345 O
OO
O —---- ίο--ίο-- 3/* O
1/103 / * O
1/10 229
168229
168 5
55
5 menoch
liehe
Leuco-
cyten.menoch
borrowed
Leuco
cyten. 5 Jf 45 Jf 4 4/10
2/104/10
2/10 297
234297
234 5
55
5 mensch
liche
MlIaperson
liche
MlIa 6/9
Χ/106/9
Χ / 10 465
147465
147 5
55
5 LHK₆ LHK ₆ ΙΟ"³
5.10-f
5,1ο"*⁴ ΙΟ " ³
5.10-f
5.1ο "* ⁴ 0/7
0/10
4/10
0/ίΟ0/7
0/10
4/10
0 / ίΟ 148
130
267
164148
130
267
164 5
5
I
ί5
5
I.
ί JLGV₅ JLGV ₅ 5_&1O^w4 5 _& 1O ^w4 10/10
10/1010/10
10/10 722
438722
438 OO . ι . ■ in. ι. ■ in to"³ to " ³ 4/10
2/94/10
2/9 237
237237
237 5
55
5 Normale
Mils V.
RattenNormal
Mils V.
Rats 10"*
5*1θ"⁴ 10 "*
5 * 1θ " ⁴ 6/10
3/106/10
3/10 299
221299
221 5
55
5 Normale
HiIa ν.
MausenNormal
HiIa ν.
Mice 5*1G"⁴ 5 * 1G " ⁴ 10/IO
9/1.010 / IO
9 / 1.0 i 115
.307i 115
.307 O
OO
O 5,1Ο"⁴ 5.1Ο " ⁴ 0/100/10 143
173143
173 5
55
5 Etth»
rail aEtth »
rail a 3/10
2/103/10
2/10 223
191223
191 55 Affen-
miläsMonkey
miläs 5.iO~⁴ 5. OK ~ ⁴ 1/tO
1/1 p1 / tO
1/1 p 129
158129
158 5
15
1 Kalbs-
thyrnuaVeal
thyrnua

*) Kulturen von stammen normaler menschlicher Lymphocytes.*) Cultures of normal human stem Lymphocytes.

10 9829/183610 9829/1836

BADBATH

Claims

" ΐ» ;iil"l'ü ^!=i" !■ !!JWIiJ¹I: .--■=■!.-. .■■-- !;■-. ■.:-"ΐ»; iil "l'ü ^! = i "! ■ !! JWIiJ ¹ I: .-- ■ = ■! .-.. ■■ -!; ■ -. ■.: -

.Ji ^{η 1;} ? ■ Ά ta η a ρ r Ii C he

Ir. Process for the production of an inhibitor of pathological PrOKeSSe _9, characterized in that a cell preparation is subjected to a first precipitation with polyethylene glycol, the precipitate obtained is separated from the supernatant liquid, the liquid is subjected to a second precipitation with silico-tungsten acid and the The precipitate obtained after a long period of precipitation is separated from the excess liquid which contains the inhibitor «

2 »The method as claimed in claim 1, characterized in that the silico-tungsten acid used contains at least at the beginning a molar ratio of 1 sulfate to 12 tungstate ions (12-tungsten silicic acid) ₀

3 «Method according to claim 1 or 2, characterized in that Cell preparation is a suspension of cells from normal tissues and especially lymph-like tissue is o

4- The method according to claim 3, characterized in that the suspension is produced from cell cultures obtained from tissues taken from animals or humans and cultured in vitro ₀

5, method according to claim 1 or 2, characterized in that that the cell preparation made with a virus, in particular of the leukemia type, infected cell cultures.

109829/1838 bad109829/1838 bad

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5₉ dadurch ge« kennzeichnet, daß die erste Fällung durch Zugabe von PoIyöthylenglyfcol bis zu einer Konsentration zwischen 2 und 10 56_e vorzugsweise zv/isohen 4 und 6 $>_% vorgenommen wird»A method according to any one of claims 1 to 5 characterized ₉ ge "denotes that the first precipitation by addition of PoIyöthylenglyfcol to a Konsentration 2-10 56 _e preferably zv / isohen 4 and 6 _$>% is made"

7ο Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6« dadurch gekennzeichnet, daß die Fällungen bei einer Temperatur zwischen ·» 10 und ♦" 1O⁰G, vorzugsweise etwa O bis 4⁰O, durchgeführt werden»7. Method according to one of claims 1 to 6 «characterized in that the precipitations are carried out at a temperature between ·» 10 and ♦ "1O ⁰ G, preferably about 0 to 4 ⁰ O»

Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Inhibitors zur Verhütung und Behandlung von Leukämien und Sarcomen»Use of the inhibitor prepared according to one of Claims 1 to 7 for the prevention and treatment of leukemia and sarcomas »

109829/1836109829/1836