DE824210C

DE824210C - Verfahren zur Herstellung reiner Aminosäuren

Info

Publication number: DE824210C
Application number: DENDAT824210D
Authority: DE
Inventors: New York N. Y. Carl Neuberg und Hilda Lustig (V. St. A.)
Original assignee: Interchemical Corporation, New York, N. Y. (V. St. A.)
Priority date: 1946-01-19
Publication date: 1951-11-08
Also published as: US2462124A

Description

(WiGBl. S. 175)

AUSGEGEBEN AM 10. DEZEMBER 1951

p 34748 IVc j τ2 q D

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Gewinnung von Aminosäuren. Sie ist gerichtet insbesondere auf eine Methode, mit deren Hilfe es gelingt, auf einfache und wirtschaftliche Weise Aminosäuren von im wesentlichen quantitativen Ausbeuten zu erhalten. Die hierbei anfallenden Aminosäuren sind im Hinblick auf ihre physiologische Wirksamkeit frei von Hydrolyseprodukten der Proteine.

Die Aminosäuren haben bereits den Gegenstand weitgehender Forschungen gebildet, und viele Methoden wurden zu ihrer Gewinnung und Isolierung angewendet. Im allgemeinen handelt es sich um Auswahlmethoden, d. h. bei ihrer Anwendung wurden nur einige Aminosäuren isoliert, während andere verworfen wurden. Bisher ist noch kein allgemein wirksames Fällungsmittel erkannt worden, welches geeignet ist, alle Aminosäuren von allen Fremdstoffen zu trennen. Fremdstoffe oder Verunreinigungen, die in Säurehydrolysaten von Proteinstoffen vorkommen,TBesteHeiTneb'en Ammoniak, das leicht ausgetrieben werden kann, hauptsächlich aus Melanin oder Hummkörpern in Mengen \^τοη 3 % aufwärts von dem hydrolysieren Protein, deren Menge offensichtlich in gewissem Ausmaß von dem Verhältnis gewisser Bestandteile des in Betracht kommenden Proteins abhängt. Die Natur der Bildung von Humin in Säurehydrolysaten von Protein ist nicht genau bekannt. Sie wurde als eine Kondensation von Tryptophan angesehen und wahrscheinlich auch von Tyrosin mit Aldehyden. Ohne Zweifel kommt sie auch durch einen teilweisen Abbau und einen Wechsel der chemischen Konfiguration von Kohlehydraten zustande, welche häufig

in beträchtlichen Mengen mit verschiedenen Pröteinstoffen vergesellschaftet vorkommen. Kohlehydrate können als solche vorliegen oder als Glucosamine oder als Bestandteile der Nucleinsäure. Von letzterer rühren auch die Purine und Phosphorsäure her. Phosphatide und lipoide Begleitstoffe des Proteins können auch die Ursache anderer Verunreinigungelf im Hydrolysat sein.

Die meisten dieser Verunreinigungen, darunter

ιό auch ein Teil der Huminkörper, sind löslich. Ein Zeichen für die Löslichkeit des Humins ist die rötliche bis dunkelbraune Farbe des Hydrolysats. ^N Wegen dieser gleichzeitigen Löslichkeit von Fremdstoffen ist es bisher nicht möglich gewesen, eine wirksame Trennung von physiologisch unschädlicher und in ihrer Zusammensetzung gleich gebliebener Aminosäuremischung aus säurehydrolysierten Proteinen und insbesondere aus Proteinen geringen Reinheitsgrades herzustellen.

Es muß daran erinnert werden, daß jedes Protein ' und infolgedessen auch jedes Proteinhydrolysat ein bestimmtes Verhältnis der verschiedenen Aminosäuren, der Bausteine des Proteinmoleküls, enthält. Gerade das Verhältnis, in dem die nährwertsmäßig unentl>ehrlichen Aminosäuren vorliegen, bestimmt den biologischen Wert eines gegebenen Proteins ; oder Proteinhydrolysats.

\^ersucht man, nach einer Proteinhydrolyse mittels Säure das Aminosäuregemisch von Fremd-Stoffen des Hydrolysats zu reinigen und zu trennen, und wendet man hierbei Methoden wie Klärung mit Tierkohle, Konzentrieren im Vakuum und Umkristallisieren an, so wird man nicht nur auf übermäßige technische Schwierigkeiten stoßen, sondern man wird auch außerordentlich hohe allgemeine Verluste haben. Hierbei ist es von außerordentlicher Wichtigkeit, daß bei solchen Vorgängen eine Unausgeglichenheit des ursprünglichen Verhältnisses der Aminosäuren zueinander auftritt, weil die Verluste einiger Aminosäuren dazu führen, die Verluste anderer zu übersteigen. Das Endprodukt ist dann in vielen Fällen für besondere Ernährungszwecke oder wissenschaftliche Zwecke ungeeignet. Andererseits können Aminosäuren, die die geringsten Spuren der vorerwähnten Verunreinigungen aufweisen, im Hinblick auf die Toxizität dieser Fremdstoffe nicht intravenös angewendet werden. Es hat sich auch herausgestellt, daß diese Aminosäuregemische von geringerer Reinheit ernährungsmäßig bei einem Vergleich mit dem ursprünglichen Protein bei oraler Anwendung unterlegen sind.

Unter Berücksichtigung dieser offensichtlich unübersteigbaren Widerstände, die beim Reinigen von Säurehydrolysaten auftreten, wenn immer es sich nicht um die Gewinnung von Aminosäuren einzeln oder in spezifischen Gruppen handelt, sondern um die Gewinnung von Abbauprodukten des Proteins mit unveränderter Zusammensetzung für medizinische oder wissenschaftliche Zwecke, wurde dem Verfahren der enzymatischen Proteinhydrolyse der A^orzug gegeben unter Außerachtlassung der Schwierigkeiten, eine enzymatische Proteolyse vollständig durchzuführen.

So nützlich wie solche unvollständigen Hydrolysate des Proteins für gewisse Ernährungszwecke sein können, begrenzt die Anwesenheit von Peptiden und Dipeptiden ihren Wert wesentlich bei parenteraler Anwendung, beim Studium besonderer Ernährungsprobleme und bei Forschungen über den Zusammenhang von Diät und Entgiftung.

Während die Bildung von Metallsalzen der Aminosäuren bisher angewendet wurde, um einzelne Aminosäuren oder geschlossene zusammengehörige Gruppen auszufällen und zu trennen, \vurde gefunden, daß es möglich ist, Metallkomplexe zu bilden und alle Aminosäuren eines Proteinhydrolysats in Lösung zu halten und zugleich die in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen niederzuschlagen. Von dieser Möglichkeit kann beim Trennen und bei der Gewinnung, ausgehend von hydrolysiertem Protein, physiologisch reiner Aminosäuregemische mit günstigen Ausbeuten Gebrauch gemacht werden.

In Ausübung der Erfindung wird ein wäßriges Gemisch mit einem Überschuß, bezogen auf die theoretisch berechnete Menge, von naszierendem Metallhydroxyd behandelt, wobei die Aminosäuren unmittelbar in lösliche Metallverbindungskomplexe oder -salze übergeführt werden und wobei Verunreinigungen, die in der Lösung enthalten sind, als Niederschlag ausgeschieden werden. Nach Entfernung des Niederschlags wird die Lösung konzentriert, und zwar vorzugsweise bis unmittelbar vor die Kristallisationskonzentration, anschließend wird ein wassermischbarer Nichtlöser für die Metall-Aminosäure-Verbindungen hinzugegeben und der Niederschlag \^τοη der Mutterlauge getrennt. Der größte Teil der Aminosäuren liegt in Form von Metallverbindungen im Niederschlag vor; ein sehr geringer Teil bleibt in der Mutterlauge zurück. Die Metall-AminosäureA'erbindungen in der Mutterlauge können durch Konzentrieren und wiederholte Ausfällung gewonnen werden, worauf die Niederschläge vereinigt werden. Die freien Säuren werden aus den Salzen durch Behandlung mit einem Fällungsmittel für das Metall, z. B. durch Schwefelwasserstoff, frei gesetzt. Es erfolgt eine fast quantitative Gewinnung kristallinischer Aminosäuren.

Indessen können auch, wie gefunden wurde, Aminosäuregemische von befriedigendem Reinheitsgrad in vielen Fällen dann gewonnen werden, wenn die Verfahrenstufe der Lösungsausfällung der Metall-Aminosäure-Komplexe entfällt.

Das günstigste Reaktionmittel ist nascierendes Kupferhydroxyd, weil mit diesem ausgezeichnete Ergebnisse zu erzielen sind. Naszierendes Nickelhydroxyd oder Kobalthydroxyd wirkt wie nascierendes Kupferhydroxyd und kann gleichfalls verwendet werden. Diese sind aber teurer und demgemäß nicht so erwünscht. In gleicher. Weise können die Hydroxyde von Zink, Mangan oder Cadmium verwendet werden; sje ergeben aber häufig zähe Salze, die schwer zu behandeln und technisch weniger brauchbar sind.

In Ausübung der Erfindung wird z. B. von einem mit Schwefelsäure gewonnenem Hydrolysat eines Proteins ausgegangen. Das Hydrolysat enthält alle

Aminosäuren, aus denen das ursprüngliche Protein gebildet ist, mit Ausnahme von Tryptophan. Es enthält außerdem freies Ammoniak und wesentliche Anteile von Verunreinigungen. Die Schwefelsäure wird mit einem Hydroxyd von Barium oder anderer alkalischer Erden ausgefällt. Das vorhandene gebundene Ammoniak wird in freies Ammoniak umgesetzt und ausgetrieben. Bariumhydroxyd hat also eine doppelte Funktion.

ίο Ein aliquoter Teil der Lösung des Hydrolysats wird einige Stunden mtt Kupferkarbonat zur Bestimmung des in Lösung übergehenden Anteils gekocht und die Menge von Kupfersalz, vorzugsweise Kupfersulfat, die dem gelösten Karbonat äquivalent ist, wird berechnet. Ein geringer Überschuß, z. B. 10% über die theoretische Menge des erforderlichen Salzes, wird im Wasser gelöst und die Lösungen zusammengegeben. Nascierendes Kupferhydroxyd entsteht durch Umsetzung mit einem Alkali \vie Bariumhydroxyd oder einer anderen alkalischen Erde. Jenes setzt sich sofort mit den Aminosäuren zu den entsprechenden Kupferverbindungen um; es können Salze oder Komplexverbindungen entstehen. Die Anwendung des Sulfats und der Erdalkalihydroxyde haben den Vorteil, daß beide als unlösliche Stoffe entfernt werden können. Bei Anwendung von Calciumhydroxyd lassen sich die löslichen 'Spuren mit Barium und Oxalsäure entfernen. Der Niederschlag besteht in der Hauptsache aus Erdalkalisulfat und einem Überschuß von Kupferhydroxyd und entfernt nicht nur die Humine, Melanine und zahlreiche andere kolloidale Verunreinigungen durch Adsorption, sondern enthält auch unlösliche Kupfersalze anderer anwesender Verunreinigungen.

Die Lösung enthält nach der Trennung vom Niederschlag in der Hauptsache die Kupferverbindungen der Aminosäuren.

Die Lösung wird anschließend konzentriert, entweder bis zur Ausfällung oder bis kurz vor diese. Wird sie bis zur Ausfällung konzentriert, so fallen alle Kupferverbindungen aus; letztere können in Tetrahydrofurfurylalkohol und Wasser gelöst werden und durch Zugabe von Aceton oder einem anderen mischbaren Fällungsmittel umgefällt werden. Vorzugsweise wird die Konzentration bis kurz vor die Ausfällung gebracht, worauf die Lösung mit einem Fällungsmittel wie Aceton behandelt wird. Die Kupferverbindungen der Aminosäuren fallen als bläulich weißer, leicht nitrierbarer Niederschlag an. Ein Teil der Aminosäuren (überwiegend Prolin und Oxyprolin) verbleibt in der acetonhaltigen Mutterlauge. Auch dieser Anteil kann durch anschließende Konzentrierung und Ausfällung mit einem mischbaren Fällungsmittel gewonnen werden. Für diesen Zweck sind Methanol und Äthanol in gleicher Weise brauchbar; Äthanol wird aber vorzuziehen sein.

Die vereinigten Niederschläge werden in Wasser aufgenommen, und Kupfer wird aus der Lösung vorzugsweise mit Schwefelwasserstoff ausgefällt; alsdann wird die Lösung der Aminosäuren zur Kristallisation gebracht. Es fallen praktisch farblose Kristalle an. Das entstehende Gemisch enthält alle Aminosäuren, die im Säurehydrolysat enthalten sind, und zwar in überwiegend quantitativer Ausbeute.

Als Fällungsmittel für die Kupfersalze der Aminosäuren werden vorwiegend wasserlösliche Ketone, Äther und einige Alkohole angewendet. Die günstigste Trennung von zurückbleibenden Verunreinigungen erfolgt, wie gefunden wurde, mit j Ketonen wie Aceton, Methyläthylketon und dem cyclischen Äther Dioxan.

Beispiele

i. 100 g Casein werden mit 600 ecm 35prozentiger Schwefelsäure versetzt und auf Wasserbadtemperatur gehalten, bis der Hauptteil gelöst ist. Dann wird die Mischung unter Rückfluß während 16 Stunden gekocht. Statt dessen kann auch eine Erhitzung im Autoklaven bei iio° während 6 Stunden erfolgen.

Das Hydrolysat wird mit der berechneten Menge einer Bariumhydroxydlösung neutralisiert, wobei beide Lösungen zum Zwecke der besseren Ausfällung des Bariumsulfats heiß sein sollen. Zur Erzielung guter Ausbeuten ist es wesentlich, den Bariumsulfatniederschlag noch einmal mit 500 ecm Wasser auszukochen. Nach dem Filtrieren ist die Lösung, die vorher dunkelpurpurfarben \var, hell; der Bariumsulfatniederschlag hat große Mengen dunkelfarbiger Nebenprodukte adsorbiert.

Die Fähigkeit dieser Lösung, die noch Spuren \'on Barium enthalten kann, zur Lösung von Kupfer-II-oxyd wird folgendermaßen bestimmt. 10 ecm werden auf 100 ecm verdünnt, ein Überschuß von Kupferkarbonat wird zugegeben und die Mischung für einige Stunden auf dem Wasserbad gehalten. Nach einiger Zeit des Kochens wird sie filtriert und der Überschuß an Kupferkarbonat sorgfältig ausgewaschen und das Filtrat nebst der Waschflüssigkeit auf 250 ecm gebracht und Cu" jodometrisch bestimmt. Dann wird Kupferhydroxyd in der Hauptsache wie folgt gebildet: Eine Menge von Kupfersulfat, die 110% der Kupferaufnahme übersteigt und nach der Analyse berechnet wird, wird im Aminosäuregemisch unter leichter Erwärmung erhitzt und eine in bezug auf Kupfersulfat äquivalente Menge Bariumhydroxyd in Lösung zugegeben. Die tiefblaue Lösung der Kupferverbindungen der Aminosäuren entsteht sofort. Das Gemisch bleibt wenigstens 48 Stunden stehen. Der Niederschlag enthält neben Bariumsulfat und Kupferhydroxydüberschuß Kupfersalze von Nebenprodukten und anderen Verunreinigungen. Reduzierend wirkende Stoffe, die anwesend sein können, werden gleichzeitig unter Bildung kleiner Mengen Kupfer-I-oxyds zersetzt. Nach dem Filtrieren und Einengen im Vakuum auf etwa 250 ecm wird die Lösung in 4500 ecm Aceton gegossen. Der Hauptteil der Aminosäuren (83 bis 85 %>) fällt sofort in Form hellblauer Kupferverbindungen aus. Der kristalline Niederschlag kann sofort abgenutscht oder abgeschleudert werden. Er wird mit Aceton gewaschen und bildet die Fraktion I.

Die Acetonmutterlösung wird im Vakuum unter Rückgewinnung des Acetons auf 50 ecm eingeengt, und zu dem Konzentrat, in dem ein Teil der verbliebenen Kupfersalze zu kristallisieren beginnt, wird eine gleiche Menge Äthanol, das 10 bis 15 %> Äther enthält, unter heftigem Schütteln zugegeben. Die in Aceton gelösten Kupfersalze fallen dabei vollständig aus, so daß die abgefilterte Lösung nur leicht blau ist und verworfen werden kann. Der mit einem Äthanol-Äther-Gemisch gewaschene Niederschlag bildet die Fraktion II.

Die vereinigten Fraktionen I und II werden in ι 1 Wasser gelöst und die Kupfersalze mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Das Kupfersulfidfiltrat ist nur leicht gelb und bleibt über 24 Stunden im Kühlschrank stehen. Der größte Teil von Tyrosin scheidet sich ab als Kristalle von überraschender Reinheit und wird abfiltriert. Die Lösung wird nun von den letzten Spuren von Barium mit Schwefelsäure befreit. Nach vollständiger Verdunstung im Vakuum fallen die Aminosäuren als leicht gelbe Masse an und können zu einem weißen Pulver vermählen werden, das in Wasser zu 8 bis 10 % klar löslich ist. Die Lösung hat ein p^ von ungefähr 5 und ist beständig.

Die Ausbeute an trockenen Aminosäuren ist 85 bis 88 g; der Gesamtstickstoff ist 14,5 %. Auch eine konzentrierte Lösung gibt keine Biuretreaktion.
Das Verhalten der Kupfersalze, wie es oben beschrieben ist, war völlig überraschend, zumal einige \ Kupfersalze von Aminosäuren bekannt sind, die in Wasser nur sehr schwach löslich sind, z. B. die Kupfersalze von Cystin, Asparaginsäure oder Tyrosin. Indessen werden sie im Gemisch durch die Wirkung der in hohem Maße löslichen Kupfersalze der Diaminosäuren und gewisser aliphatischer Alpha-Aminomonocarbonsäuren in Lösung gehalten. Dieser Effekt, der bis jetzt unbekannt und ' nicht vorauszusehen war, kann auch an einer künstliehen Mischung von Aminosäuren beobachtet werden.

2. An Stelle des in Beispiel 1 genannten Bariumhydroxyds wird frisch zubereitetes Calciumhydroxyd zur Neutralisation der Schwefelsäure verwendet. Naszierendes Kupferhydroxyd wird in entsprechender Weise mit Calciumhydroxyd an Stelle von Bariumhydroxyd hergestellt. Nach Bestimmung der notwendigen Menge von Kupferionen werden molare Äquivalente Kupfersulfat und Calciumhydroxyd zugegeben, und das Hydrolysat wird stehengelassen bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank während etwa 24 Stunden. Nach Entfernung des festen Niederschlags werden die in der Flüssigkeit befindlichen Aminosäure-Kupfersalze mit Schwefelwasserstoff zersetzt. Das sich bildende Kupfersulfid, das offensichtlich auch noch Verunreinigungen, die im Hydrolysat zurückgeblieben sein können, zum.Niederschlag bringen kann, wird entfernt, und es bleibt eine Aminosäurelösung zurück, die im wesentlichen rein ist mit Ausnahme von geringen Mengen Calciumsulfat, die gelöst bleiben, aber leicht mittels Bariumhydroxyd und Oxalsäure entfernt werden können. Das Hydrolysat kann nun entweder als solches oder zur Herstellung kristallisierter Aminosäuren verwendet werden.

3. 100 g Bluteiweiß werden unter Rückfluß während etwa 16 Stunden mit Salzsäure hydrolysiert, wobei diese eine Stärke von 20 °/o, bezogen auf das Hydrolysatgemisch, hat. Der Extrakt wird von den verbleibenden oder während der Hydrolyse gebildeten Feststoffen getrennt und im Vakuum zu einer vorzugsweise sirupartigen Konsistenz verdickt, wobei gleichzeitig der größte Teil der Salzsäure entweicht. Zur Entfernung geringer Mengen von Salzsäure, die manchmal während 'der Vakuumkonzentration nicht abgeht, kann Bleicarbonat verwendet werden. Es ist aber angenehmer, besondere Ionenaustauscher zu verwenden, z. B. die unter den Handelsnamen Deacidite oder Amberlite IR-4 bekannten Stoffe, mit deren Hilfe die Entfernung von Mineralsäure ohne Verlust wesentlicher Aminosäuren erfolgen kann. Die Reinigung und Trennung der Aminosäuren von Fremdstoffen wird dann in derselben Weise, wie in Beispiel 1 oder 2 angegeben, vorgenommen. Ein Endprodukt, das hauptsächlich reich an unentbehrlichen Aminosäuren ist und so eine überlegene Brauchbarkeit für gewisse Zwecke besitzt, kann durch Steuerung des vorstehend beschriebenen Ionenaustauschverfahrens in der Weise erfolgen, daß unwichtige Bestandteile, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure, aus dem Aminosäuregemisch entfernt werden.

4. Nach derselben Vorbereitung wie in Beispiel 1 wird die Reinigung mit Nickelsalzen an Stelle von Kupfersalzen vorgenommen. Die Nickelaufnahme wird in analoger Weise durch Kochen mit Nickelkarbonat bestimmt und die Nickelbestimmung mit Dimethylglyoxim. Die Bildung von Nickelhydroxyd aus Nickelsulfat und Bariumhydroxyd ist entsprechend. Im Anschluß an diese Verfahrensstufe ist der Vorgang wieder der gleiche, wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben.

Auf die gleiche Weise kann auch Kobalt verwendet werden. Kobalt und Nickel bilden feste Aminosalze, wogegen die Hydroxyde von Zink, Mangan oder Cadmium zähe Metallsalze von Aminosäuren ergeben. Keines dieser Metalle ist so vorteilhaft wie Kupfer.

Natürlich enthält das zum Schluß vorliegende Aminosäurengemisch kein Tryptophan, welches bei no der Säurehydrolyse zerstört wird. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann auch auf Hydrolyse¹ produkte, die durch irgendeine enzymatische Hydrolyse gewonnen wurden, angewendet werden, soweit sie sich bei der Biuretprobe negativ verhalten. Ebenso kann auch jedes andere Protein außer dem genannten Casein oder Bluteiweiß verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:

i. Verfahren zur Herstellung reiner Aminosäuren aus· wäßrigen Hydrolysaten von Proteinstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß zu dem wäßrigen Hydrolysat ein Sulfat eines Metalls aus der Kupfer- oder Nickelgruppe und ein Erdalkalihydroxyd zugegeben, die festen Nieder-

Schläge abgetrennt und die gelösten Metall-Aminosäure-Verbindungen in die freien Aminosäuren übergeführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß Kupfersulfat \'er\vendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gelösten Metall-Aminosäure-Verbindungen mit Schwefelwasserstoff behandelt werden, der entstandene Niederschlag entfernt wird und aus der rückständigen Lösung die freien Aminosäuren in kristallisierter Form gewonnen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit Schwefelsäure hydrolisiert, die Schwefelsäure aus dem Hydrolysat mit Calciumhydroxyd entfernt, Ammoniak abgetrieben, Kupfersulfat im Überschuß über die zur Bildung von Kupferverbindungen aller anwesenden Aminosäuren erforderliche Menge hinaus zugegeben, Calciumhydroxyd in mit Bezug auf das angewendete Kupfersulfat äquivalenter Menge zugegeben wird, die festen Niederschläge entfernt werden und die Lösung bis fast zur Ausscheidung von Aminosäure-Kupfersalzen eingeengt wird, die Reste von Calciumsulfat als Calciumoxalat und Bariumsulfat entfernt werden, die Lösung mit Schwefelwasserstoff behandelt, der entstandene Niederschlag von der Lösung abgetrennt wird und die freien Aminosäuren aus der rückständigen Lösung in kristallisierter Form gewonnen werden.

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