DE3016548A1 - Verfahren zur herabsetzung der thermischen stabilitaet von mikrobiellem mucor-rennin und dessen verwendung zur kaesebereitung - Google Patents

Verfahren zur herabsetzung der thermischen stabilitaet von mikrobiellem mucor-rennin und dessen verwendung zur kaesebereitung

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DE3016548A1 DE19803016548 DE3016548A DE3016548A1 DE 3016548 A1 DE3016548 A1 DE 3016548A1 DE 19803016548 DE19803016548 DE 19803016548 DE 3016548 A DE3016548 A DE 3016548A DE 3016548 A1 DE3016548 A1 DE 3016548A1
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Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER
PAT E N TAN V/ALT E
DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . D I PL-I N G. W. E ITLE · D R. RER. NAT. K. H O FFMAN N ■ D I PL.-1 N G. W. LEH N
DIPL.-ING. K.FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MO N CH EN 81 · TELEFO N (089) 911087 . TELEX 05-29Ä19 (PATHE)
-3-
o/hl
Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind., V.St.A.
Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin und dessen Verwendung
zur Käsebereitung
(Zusatz zu Patent .... (Patentanmeldung P 29 01 542.7-41))
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herabsetzung der Wärmestabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin sowie die Verwendung des auf diese Weise behandelten mikrobiellen Rennins zur Käsebereitung.
Das Hauptpatent 2 901 542 betrifft ein Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin, bei dem man eine wässrige Lösung von mikrobiellem Rennin mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen behandelt, bei denen die WärmeStabilität des mikrobiellen Rennins wesentlich herabgesetzt wird, worauf dann anschließend das restliche Wasserstoffperoxid in der Lösung im wesentlichen zerstört wird. Weiterhin betrifft das Hauptpatent die Verwendung von Mucor-Rennin mit stark herabgesetzter Wärme-
1300 16/OB8S
Stabilität, das nach dem vorstehend genannten Verfahren hergestellt worden ist, zur Käsebereitung.
Die vorliegende Anmeldung betrifft eine Weiterentwicklung des im Hauptpatent geschützten Verfahrens. Es wurde nämlich festgestellt, daß man die thermische Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin nicht nur mit Wasserstoffperoxid gemäß dem Verfahren des Hauptpatentes herabsetzen kann, sondern daß man dies auch dadurch erzielt, daß man Methioninoxidierende Maßnahmen trifft. Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren gemäß dem Hauptpatent 2 901 542, bei dem man die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins anstelle von mit Wasserstoffperoxid mit Methionin-oxidierenden Mitteln - ausgenommen Wasserstoffperoxid - vornimmt.
Farbstoff-sensibilisierte Fotooxidation ist bekannt, z.B. aus Industrial and Engineering Chemistry 5_5, 40 (1963) und wird auch in Biochemica et Biophysica Acta, 154, 1 (1968) als Maßnahme zum Oxidieren von Methioninresten in Substraten wie Ribonuclease A und einer Reihe von Peptiden sowie auch von freien Aminosäuren beschrieben. Bei der Fotooxidation von Ribonuclease A erfolgt jedoch ein erheblicher Verlust von 52 bis 82 % der Aktivität.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei der Fotooxidation von mikrobiellem Rennin kein merklicher Abbau der Enzymaktivität vor der Wärmebehandlung stattfindet, sondern daß die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins wesentlich herabgesetzt wird. Die Fotooxidation wird durchgeführt, indem man eine wässrige Lösung von mikrobiellem Rennin mit Sauerstoff in Gegenwart von Licht und einem Fotosensibilisator behandelt. Die Lichtquelle kann Sonnenlicht, eine Glühbirne, fluoreszierendes Licht, Ultraviolettlicht und dgl. sein. Man kann Sauerstoff alleine oder in Mischung mit anderen Gasen, wie Luft, verwenden. Geeignete Fotosensibilisatoren
1 3 0 0 16 / D S 8 B
sind Methylen-Blau, Bengal-Rot (rose bengal), Oxidations-Reduktionsindikatoren, Mischungen davon und dgl.
Erfindungsgemäß wird eine wässrige Lösung des thermisch stabilen mikrobiellen Rennins Methionin-oxidierenden Maßnahmen unterworfen unter Bedingungen, bei denen eine merkliche Abnahme der Wärmestabilität des Rennins (d.h. eine Zunahme der Wärmelabilität) erfolgt, vorzugsweise auf mindestens 20 % seiner ursprünglichen Stabilität, ausgedrückt als restliche milchgerinnende Aktivität nach der Wärmebehandlung,besonders bevorzugt ist es, wenn die Wärmestabilität auf mindestens den Wert, den Kälber-Rennin aufweist, reduziert wird. Die auf diese Weise behandelte Lösung von mikrobiellem Rennin kann so wie- sie anfällt verwendet werden oder man kann sie konzentrieren' oder weiter reinigen, wie dies bei speziellen Käseherstellungsverfahren erforderlich ist.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß das vorstehend beschriebene Verfahren absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden kann und daß man die Bedingungen, bei denen die Lösung Methionin-oxidierenden Maßnahmen unterworfen wird, in weitem Bereich variieren kann, also z.B. die Konzentration der Materialien, der pH-Wert, die Temperatur und die Kontaktzeit, je nach der Wärmestabilität des nativen mikrobiellen Mucor-Rennins. Die Bedingungen werden jedoch so gewählt, daß die ursprüngliche milchgerinnende Aktivität des mikrobiellen Rennins nicht nachteilig beeinflußt wird.
Bei Anwendung einer Farbstoff-sensibilisierten Fotooxidation als Methionin-oxidierendes Mittel verhalten sich die Fotosensibilisatoren ähnlich wie Katalysatoren, denn sie erleiden keine dauernde Veränderung. Infolgedessen kann man die Konzentration der Fotosensibilisatoren in weitem Bereiche variieren. Die obere Grenzkonzentration hängt von der Löslichkeit des Fotosensibilisators in dem wässrigen System ab.
130016/Οδββ
Die untere Grenze der Konzentration soll ausreichen, die Fotooxidation zu initiieren; eine Konzentration von etwa 0,0025 mMol bis etwa 1,0 mMolan Fotosensibilisator wurde erfolgreich verwendet. Vorzugsweise beträgt die Konzentration etwa 0,025 mMol bis etwa 0,1 mMol.
Der pH-Bereich liegt während der Behandlung vorzugsweise bei 3,0 bis 8,0. Bei pH-Werten oberhalb 8,0 wird das Enzym in unerwünschter Weise inaktiviert und' bei pH-Werten unterhalb 3,0 vermindert sich die Löslichkeit und die Aktivität des Enzyms nimmt ab und die Reaktionszeit zu. ·
Bei Anwendung der Farbstoff-sensibilisierten Fotooxidation als Methionin-oxidierende Maßnahme wird vorzugsweise jeder Rest und jede überschüssige Menge an Fotosensibilisator durch solche Maßnahmen■entfernt, durch welche das mikrobielle Rennin nicht inaktiviert wird. Fotosensibilisatoren wie Methylen-Blau und Bengal-Rot kann man einfach aus der behandelten Renninlösung durch Lösungsmittelextraktion, Dialyse und dgl. entfernen. Fotosensibilisatoren auf festen Trägern, wie Ionenaustauschharzen, sind bekannt. Verwendet man solche gebundenen Fotosensibilisatoren, so kann man sie von dem mikrobiellen Rennin in einfacher Weise abtrennen, indem man den Träger von der Lösung trennt.
Die WärmeStabilität des erfindungsgemäß behandelten mikrobiellen Rennins wird unter Bedingungen bestimmt, wie man sie normalerweise anwendet, um Käsemolkelösungen zu pasteurisieren.
Beispiele
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Behandlung von mikrcbiellem Mucor-Rennin unter Anwendung einer Farbstoff-sensibilisierten Fotooxidation als Methionin-oxidierendes Mittel.
130ÖJ6/ÜSS6
Zwei wässrige Fermentations-Kulturlösungen von mikrobiellem Rennin aus Mucor-miehei (pH 4,85) (in der Tabelle A mit MR-160 bezeichnet), enthaltend .79.680 SU/ml und MR-40 , enthaltend 19.990 SU/ml wurden aus im Handel erhältlichen Materialien hergestellt. Dann wurde eine 0,2 mMol Lösung von Methylen-Blau hergestellt, indem 74,8 mg des Farbstoffs in 1000 ml Wasser gelöst wurden. Die Proben wurden getrennt hergestellt und enthielten 3 ml der wässrigen Brühe und 1 ml des Farbstoffs. Die so hergestellten Testproben (MR-160 oder MR-40) enthielten 59.760 SU/ml bzw. 14.940 SU/ml an Enzym und 0,05 mMol des Farbstoffs. Die Proben wurden in 1,1 χ 10 cm Reagensgläser gegeben und dann im gleichen Abstand (38 cm) in eine Bestrahlungskammer mit durch Fächern gekühlten Glühbirnen gegeben. Die Temperatur wurde nicht konstant gehalten, sondern erhöhte 'sich allmählich aufgrund der Wärme der Glühbirnen von einer Anfangstemperatur von etwa 240C bis zu einer Maximaltemperatur von etwa 37°C während der Bestrahlung. Zur Fotooxidation der Proben wurden die Glühbirnen eingeschaltet und durch die Proben wurde während 5 h langsam ein Sauerstoffstrom geleitet. Zur Herstellung von Proben für die Bestimmung der milchgerinnenden Aktivität nach Beendigung der Bestrahlung wurden die Proben mit 100 ml 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) verdünnt. Die mit MR-16 bezeichnete Probe wurde weiter verdünnt (1:8 V/V) mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5).
Vergleichsproben wurden hergestellt, indem man 3 ml der ursprünglichen Enzymbrühe mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) auf 100 ml verdünnte. Die mit MR-160 bezeichnete Kontrolle wurde weiter verdünnt (1:8 V/V) mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5).
Die milchgerinnende Aktivität wurde in den verdünnten Proben und in den Vergleichsproben bestimmt. Die Wärmestabilität der Versuchsproben und der Vergleichsproben wurde bestimmt unter Anwendung von Pasteurisierungsbedingungen bei 660C während 10 min.
1 3 0 0 1 6 / 0 S S 6
Nach der Wärmebehandlung wurden die Proben durch Eintauchen in ein Eis-Wasserbad gekühlt und die restliche miIchgerinnende Aktivität wurde bestimmt und als Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität vor der Pasteurisierung ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle A zusammengestellt.
Tabelle A
Probe
Kontrolle, MR-160
Versuch, MR-160
Kontrolle, MR- 40
Versuch, MR-40
Prozentsatz der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität vor der Pasteurisierung
100
90,5
100
98,9
Restliche milchgerinnende Aktivität nach der Pasteurisierung
65
80,7
8,7
Die obigen Daten zeigen, daß die fotosensibxlisierte Fotooxidation wirksam ist drastisch die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollproben zu erniedrigen.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die Wirksamkeit einer Farbstoffsensibilisierten Fotooxidation als Methionin-oxidierendes Mittel gezeigt.
Eine wässrige Vorratslösung von mikrobiellem Rennin wurde hergestellt durch Auflösen von 20 mg gereinigtem Mucor-Miehei
mikrobiellem Rennin in 20 ml destilliertem Wasser, wobei man eine Lösung mit einem nicht eingestellten pH von 4,85 erhielt. 20 ml einer 0,2 mMol.Methylen-Blau-Lösung wurde zu der Vorratslösung gegeben. Die so hergestellte Lösunq enthielt 5.000 SU/ml des Rennins und 0,1 mMol des Farbstoffs. 10 ml Aliquote dieser Lösung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben 30 min fotooxidiert. Die milchgerinnende Aktivität der fotooxidierten Proben und der nicht behandelten Kontrolle wurde bestimmt. Die Wärmestabilität der behandelten Proben und der unbehandelten Kontrolle wurde bestimmt unter Anwendung des Pasteurisierungsverfahrens gemäß Beispiel 1. Die milchgerinnenden Aktivitäten, gemessen nach der Pasteurisierung und ausgedrückt als Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität vor der Pasteurisierung wurden gemessen. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle B gezeigt.
Tabelle B
Probe Prozentsatz der Restliche milchursprünglichen gerinnende AktivimiIchgerinnenden tat nach der Aktivität vor der Pasteurisierung
Pasteuri sierung
Kontrolle 100 93
Versuchsprobe 84,6 37
Die Daten in Tabelle B zeigen, daß man durch die Fotooxidation drastisch die Wärmestabilität des Enzyms, ausgedrückt durch die Milchgerinnungsaktivität, im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle, reduzieren kann.
Ein Teil der fotooxidierten Versuchsprobe wurde'in einem Celluloserohr gegen Wasser zur Entfernung des Farbstoffs dialysiert. Die dialysierte Probe wurde dann lyophilisiert.
130016/0588
Die lyophilisierte Probe und das native gereinigte mikrobielle Rennin wurden einer Alkalihydrolyse unterworfen und mit den hydroIysierteη Materialien wurde eine automatische Aminosäureanalyse durchgeführt. Die jeweiligen Aminosäureprofile werden in der Tabelle C gezeigt.
Die Alkalihydrolyse wurde wie folgt vorgenommen: 11 mg der dialysierten Probe und des nativen gereinigten mikrobiellen Rennins wurden jeweils in 1 ml einer 4 η Natriummethoxidlösung, enthaltend 25 mg lösliche Stärke als Antioxidans gelöst, in evakuierten Pheolen eingefüllt und 16h zur Hydrolyse des Enzyms auf 1100C erwärmt. Nach der Hydrolyse wurden die Proben auf 10 ml verdünnt und jeweils 20 μΐ wurden einer automatischen Aminosäureanalyse unterworfen.
Tabelle C nativ Menge (ng)
Aminosäure 0 fotooxidiert
2370,4 151
Methioninsulfoxid 45,6 2029,9
Asparagin s äure 406,1 37,5
Threonin 1455,7 406,2
Serin 22,7 1573,9
Glutaminsäure 1621,9 22,3
Prolin . 1567,5 1674,5
Glycin 608,2 1663,8
Alanin 334,8 642,3
Valin 213,8
Methionin
16/0536
Diese Daten in Tabelle C zeigen, daß man durch die fotosensibilisierte Fotooxidation wirksam einen Teil des Methionin-Restes in dem Enzym zu Methioninsulfoxid oxidieren kann.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird die Behandlung von mikrobiellem Mucor-Rennin durch eine Farbstoff-sensibilisierte Fotooxidation in einem breiten pH-Bereich und mit einer kurzen Kontaktzeit gezeigt.
Eine wässrige Vorratslösung von mikrobiellem Rennin wurde hergestellt, indem man 30 mg gereinigtes Mucor-miehei mikrobielles Rennin in 15 ml destilliertem Wasser löste unter Ausbildung einer 20.000 SU/ml enthaltenden Lösung. Eine 0,2 mMol Lösung von Methylen-Blau wurde hergestellt, indem 74,8 mg des Farbstoffs in 1.000 ml Wasser gelöst wurden. Eine 0,2 mMol Lösung von Bengal-Rot wurde hergestellt durch Auflösung von 203,5 mg des Farbstoffs in 1000 ml Wasser. Dann wurden verschiedene 0,2 M Natriumphosphatpuffer hergestellt mit pH-Werten zwischen 3,0 und 8,0. Die Testproben wurden so hergestellt, daß 1 ml der Enzym-Vorratslösung, 2 ml einer der Farbstofflösungen und 1 ml Wasser (so daß sie einen anfänglichen, nicht eingestellten pH von 4,85 hatten) oder 1 ml einer Pufferlösung unter Einfüllung eines pH in der Testprobe zwischen 3,0 und 8,0 enthielten. Die so hergestellten Testproben enthielten 5.000 SU/ml Enzym und 0,1 mMol des jeweiligen Farbstoffs. Kontrollproben des Enzyms wurden in ähnlicher Weise, aber ohne Puffer oder Farbstoff unter Verwendung einer vergleichbaren Menge Wasser als Ersatz verwendet. Die Proben wurden dann wie in Beispiel 1 angegeben während eines Zeitraums von 15 min fotooxidiert. Nach der Bestrahlung wurden die Proben jeweils in einem mit Nitratcellulose gefüllten
130016/0S86
Rohr gegen Wasser zur Entfernung des Farbstoffs und des Puffers dialysiert. Die Restmaterialien wurden dann auf 50 ml mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) verdünnt. Die Milchgerinnungsaktivität wurde anschließend bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle D gezeigt.
Tabelle D
Behandlungs-pH % der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität
Methylen-Blau Bengal-Rot
3,0 ■ 85,1 73,6
4,85 (H2O) 79,2 nicht bestimmt
5,0 87 63,8
5,5 88,4 57,7
6,0 80,9 74,5
6,5 72,2 75
7,0 70,4 57,1
7,5 49,6 37,3
8,0 11,2 nicht bestimmt
Eine ähnlich behandelte Kontrollprobe ohne Farbstoff und Puffer, hergestellt mit 1 ml der Enzymvorratslösung und 3 ml Wasser behielt 74 % der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität bei.
Ein Vergleich der Daten in Tabelle D zeigt, daß das mikrobielle Rennin über einen breiten pH-Bereich von 3,0 bis 8,0 einer Farbstoff-sensibilisierten Oxidation unterworfen werden kann. Der bevorzugte pH liegt zwischen 3,0 und 7,5.
Die Wärmestabilität des jeweils so behandelten mikrobiellen Rennins wurde nach dem Pasteurisierungsverfahren gemäß Bei-
130016/0838
spiel 1 bestimmt. Die milchgerinnende Aktivität wurde nach der Pasteurisierung gemessen und als Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität vor der Pasteurisierung ausgedrückt. Die Daten sind in Tabelle E enthalten.
Tabelle E Prozentsatz der rest
lichen milchgerinnen
den Wirkung		 100
Behandlungs-pH Pasteurlsierungs-
zeit (min) bei
66°C		 Methylen-Blau Bengal-
Rot		 82
100 _*
3,0 0 87 _*
10 100 100
4,85 (H2O) 0 48 50
10 100 100
5,0 0 69 49
10 100 100
5,5 0 63 48
10 100 100
6,0 0 63 45
10 100 100
6,5 0 60 42
10 100 100
7,0 0 54 28
10 100
7,5 0 61 100
10 85
Kontrolle (kein 100
Farbstoff) 0 94
10
* nicht bestimmt
Die Daten in Tabelle E zeigen deutlich, daß die fotosensibilisierte Fotooxidation auch bei einer sehr kurzen Kontaktzeit ausreicht, um die WärmeStabilität des Enzyms innerhalb eines breiten pH-Bereiches, vorzugsweise zwischen 3,0 und 7,5, zu redu-
zieren· 18Ö018/QS88

Claims (4)

HOFFMANN · EITLE & PARTNER PAT E N TAN 1SVALT E DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197«) · D I PL.-I N G. W. E ITLE · D R. R ER. NAT. K. H O FFMAN N · D I PL.-1 NG. W. LEH N DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MO N C H E N 81 · TE LE FO N (089) 911087 . TE LEX 05-2961? (PATH E) o/hl 33 423 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind., V.St.A. Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin und dessen Verwendung zur Käsebereitung (Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 29 01 542.7-41)) Patentansprüche
1. Weitere Ausbildung des Verfahrens zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin, bei dem man eine wässrige Lösung von mikrobieliem Rennin mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen, bei denen die Wärmestabilität des mikrobielien Rennins wesentlich herabgesetzt wird, behandelt, dadurch gekennzeichnet , daß man anstelle von Wasserstoffperoxid Methionin-oxidierende Maßnahmen, durch welche die thermische Stabilität des mikrobielien Rennins wesentlich herabgesetzt wird, anwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die Methionin-oxidierende Maßnahme darin besteht, daß man eine Farbstoff-sensibilisierte Foto-
130016/OI8S
oxidation durchführt, indem man die wässrige Renninlösung mit Sauerstoff in Gegenwart von Licht und einem Fotosensibilisator behandelt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fotosensibilisator Methylen-Blau oder Bengal-Rot ist.
4. Verwendung von Mucor-Rennin mit stark herabgesetzter Wärmestabilität, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Käsezubereitung.
130016/0588
DE3016548A 1979-09-10 1980-04-29 Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin und dessen Verwendung zur Käsebereitung Expired DE3016548C2 (de)

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