DE2633246A1

DE2633246A1 - Neue poroese materialien kationischen charakters sowie deren herstellung und deren anwendung zur reversiblen fixierung von biologischen makromolekuelen

Info

Publication number: DE2633246A1
Application number: DE19762633246
Authority: DE
Inventors: Michel Tardy; Jean-Louis Tayot
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1975-07-29
Filing date: 1976-07-23
Publication date: 1977-02-17
Also published as: DK340276A; AR220302A1; NO762631L; IE44507B1; JPS5256087A; SU867284A3; NO148250B; SU1268105A3; YU39773B; SE431403B; GB1544867A; IT1064693B; NL176144C; NZ181607A; JPS608865B2; YU183476A; FR2319399A1; DE2633246C2; CH617863A5; DK148617C

Description

Patentanwälte
Dipl. Ing. Hans-Jürgen Müller

Dr. rer. nat. Thomas Berendt Z D O O 4 η Q

D8 München 80 Lucile-Grahn-Stroße 3ß

INSTITUT MERIEUX,
17, rue Bourgelat, Lyon, (Frankreich)

Neue poröse Materialien kationischen Charakters sowie deren Herstellung und deren Anwendung zur reversiblen Fixierung von biologischen Makromolekülen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Material kationischen Charakters, das biologische Makromoleküle, zahlreiche Proteine, Nucleinsäuren und dergleichen in reversibler Weise zu fixieren vermag.

Bis heute ist es nicht möglich gewesen, Trägermaterialien für die Chromatographie durch Ionenaustausch von solchen Molekültypen verfügbar zu machen, die einerseits ausgezeichnete chemische Eigenschaften und andererseits vorzügliche mechanische Eigenschaften aufweisen.

In der Tat sind bereits zahlreiche Typen von Trägermaterialien vorgeschlagen worden, von denen einige sehr gute ΟίΊβ-ν

mische Eigenschaften besitzen und so selektive Trennungen ermöglichen, die aber demgegenüber nur recht mittelmäßige mechanische Eigenschaften aufweisen.

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ORfGiNAL INSPECTED

Umgekehrt sind ferner Trägermaterialien in Vorschlag gebracht worden, die sehr gute mechanische Eigenschaften insbesondere in bezug auf eine Verwendung für präparative oder technische Zwecke in einer Säule aufweisen, doch hat es sich erwiesen, daß diese Träger völlig unzureichende chemische Eigenschaften vor allem gegenüber biologischen Makromolekülen besitzen, da diese Trägerstoffe nur Stellen für eine irreversible Absorption aufweisen.

Im Hinblick darauf, daß die neuzeitliche Arbeitstechnik der Trennung von biologischen Makromolekülen die Anwendung von Trägermaterialien erfordert, die einerseits eine ausgezeichnete chemische Aktivität und andererseits eine große mechanische Festigkeit aufweisen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung anhand umfangreicher Versuchsarbeiten festgestellt, daß es möglich ist, die angestrebten Ergebnisse bei Verwendung eines Materials von einem bestimmten neuartigen Typ zu erzielen.

Die vorliegende Erfindung hat daher als neues technisches Produkt ein Material zum Gegenstand, das biologische Makromoleküle in reversibler Weise zu fixieren vermag, und dieses Material ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem mineralischen Träger, nämlich einem porösen mineralischen Oxid, dessen Oberfläche direkt mit einem aminierten PoIysaccharidpolymeren überzogen ist, besteht.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben anhand ihrer umfangreichen vielfältigen Versuche zeigen können, daß dieser Materialtyp sowohl durch die mechanischen, physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften des porösen mineralischen Trägerstoffes ausgezeichnet ist und zugleich eine neue chemische Oberfläche aufweist, die in ganz besonderer Weise zur chromatographischen Trennung von biologischen Makromolekülen geeignet ist.

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Erfindungsgemäß kann der poröse mineralische Träger aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder einem Titanoxid oder deren synthetischen oder natürlichen Derivaten, wie Gläsern, Silikaten, Kaolin etc. bestehen.

Das aminierte Polysaccharidpolymere ist auf dem porösen mineralischen Träger durch eine Bindung fixiert, wobei dieser Adhäsionsmechanismus nicht einheitlich auf einer Adhäsion elektrostatischer Natur zu beruhen scheint, denn poröse Träger, wie Aluminiumoxid mit nicht-negativer Oberfläche können zugleich mit aminierten Polysaccharidpolymeren überzogen werden und zu erfindungsgemäßen Materialien von ausgezeichneten Eigenschaften führen.

Daraus ergibt sich, daß der Überzug des aminierten PoIysaccharidpolymeren auf dem Träger praktisch irreversibel fixiert ist. Dennoch ist es unter bestimmten Bedingungen, die weiter unten näher erläutert werden, möglich, nach einer gewissen Gebrauchsdauer das poröse mineralische Trägermaterial zu regenerieren und es danach von neuem für eine neue Imprägnierung mittels eines aminierten PoIysaccharidpolymeren zu verwenden.

Der poröse mineralische Träger muß eine genau definierte Porösität aufweisen. Die innere Oberfläche des Trägers muß 100 m /g oder weniger betragen und soll sich nach Möglichkeit auf etwa 5 bis 80 m /g belaufen. Der mittlere Porendurchmesser soll 25 nm oder mehr betragen und nach Möglichkeit zwischen 50 und 1000 nm liegen, wobei die genaueren Bereiche je nach dem beabsichtigten Anwendungszweck ausgewählt werden. Bei größeren Oberflächen oder geringeren Porendurchmessern wird die innere Oberfläche des Trägers für das aminierte Polysaccharidpolymere und

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später für die zu trennenden Makromoleküle unzugänglich. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung besteht der poröse mineralische Träger aus Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und am besten aus einem porösen Siliciumdioxid- Träger anionischen Charakters, der z.B. nach den Verfahrensweisen erhalten wird, die in den FR-PSen 1 473 239, 1 473 240, 1 475 929 und 1 482 867 beschrieben sind. Man verwendet z.B. poröse Siliciumdioxid-Träger, wie sie von der Firma RHONE-POULENC CKIMIE FIME unter den Bezeichnungen SPHEROSILS ICOB 030, XOB 015 und XOC 005 im Handel vertrieben werden, wobei diese Siliciumdioxide Oberflächen von 50 bzw. 25 und 10 m /g aufweisen.

Das aminierte Polysaccharidpolymere, das dazu dient, um die innere Oberfläche des porösen mineralischen Trägers zu imprägnieren und zu überziehen, soll einen ausgesprochen kationischen Charakter aufweisen und gute hydrophile Eigenschaften besitzen. Es soll ein Molekulargewicht von mindestens 10 Dalton, nach Möglichkeit zwischen 10 und 10 Dalton, aufweisen. Es kann eine beliebige Konstitution aufweisen und kann insbesondere ein aminiertes Derivat des Dextrans, der Stärke, der Cellulose, der Agarose oder eines natürlichen oder synthetischen Polymeren aller bekannten Ösen sein mit der Maßgabe, daß es keine anionischen Gruppierungen, wie Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen, schon gar nicht in einer solchen Menge enthält, daß das Polymerisat ins Gewicht fallende negative elektrische Ladungen aufweist, die dazu führen, daß der Träger neben seiner Brauchbarkeit als Trägermaterial auch als Anionenaustauscher wirken könnte.

Die Amin-Funktionen des Polysaccheridpolymeren können primärer, sekundärer oder tertiärer oder gegebenenfalls sogar quaternärer Natur sein. Bevorzugt kommen indessen sekundäre, tertiäre und quaternäre Amin-Funktionen in Frage.

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Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung entspricht das aminierte Polysaccharidpolymere der nachstehenden Formel

in der R einen Dextran-, Stärke-, Cellulose- oder Agarose-Rest bedeutet, η eine ganze Zahl im Wert von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 5,ist, R^ und Rp, die gleich oder verschieden sein können, Reste der Formeln -CEU, -CHp-CH,, -CH₂OH, -CH₂-CH₂OH oder -CH₂-CHOH-CH₃ darstellen, wobei diese Verbindung mittels eines klassischen Quaternisierungsmittels, wie einem Alkyl- oder Hydroxyalkylhalogenid, insbesondere -jodid oder -bromid, oder Dimethylsulfat, quaternisiert sein kann.

Unter den Verbindungen dieses Typs kann man insbesondere anführen die unter den Bezeichnungen DEAE DEXTRAN (Diäthylaminoäthyldextran) vom Molekulargewicht 500 000 und QAE DEXTRAN (quaternisiertes Diäthylaminoäthyldextran) von der Firma PHARMACIA im Handel vertriebenen Produkte, ferner das unter der Bezeichnung DEAE amidon (Diäthylaminoäthylstärke) bekannte Produkt und ebenso die kationischen Stärken, wie sie unter der Bezeichnung CATO von der Firma ROQUETTE NATIONAL im Handel vertrieben werden.

Gemäß einer anderen bevorzugt in Frage kommenden Ausführungsform der Erfindung kann das aminierte Polysaccharidpolymere mit einem Vernetzungsmittel vernetzt werden, und zwar mit einem Vernetzungsmittel, wie dem 1,4-Butandiol-diglycidyl-

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äther oder Epichlorhydrin, Epibromhydrin, einem Diepoxid der Formel

H-R₂-N-R₃-CH CH₂

in der R. einen Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen niedermolekularen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, bedeutet und R₂ und R-, für eine Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen niedermolekularen Alkylenrest stehen, v/ie im Diepoxid der Formel

CH₂ CH - CH₂ -N- CH₂ - CH

Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört auch das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Materials mit dem kationischen Charakter, das biologische Makromoleküle in reversibler Weise zu fixieren vermag.

Das Verfahren kann nach zwei verschiedenen Methoden praktisch durchgeführt werden, nämlich der Imprägnierung in der Säule und der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank (four).

Gemäß der ersten Arbeitsmethode gibt man das poröse mineralische Oxid in eine Chromatographiesäule, indem man das

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trockene und homogene Pulver einfüllt. Man wäscht es dann und homogenisiert es, um alle Luftblasen auszutreiben, indem man eine Säurelösung, z.B. 0,1-n Salzsäure, durchlaufen läßt. Man läßt dann eine Pufferlösung vom p_H 3 bis 12 (z.B. den Puffer TRIS, 0,05-molar, p„ 7) durchlaufen bis zur Gleichgewi chtseinstellung bzw. Equilibrierung.

Man führt danach das aminierte Polysaccharidpolymere in einer kalten oder warmen Lösung in dem vorerwähnten Puffer oder in Wasser, das auf das gleiche p„ eingestellt ist, ein. Der Überschuß des aminierten Polysaccharidpolymeren wird dann durch Eluierung mit dem vorerwähnten Puffer und danach mit der Lösung eines Salzes, z.B. Trinatriumcitrat, eliminiert; die Prüfung darauf, ob das End-Eluat von dem aminierten Polysaccharidpolymeren frei ist, kann mit Hilfe der Elektrophorese in Celluloseacetat und Anfärbung der Flecken mit Ponceaurot oder noch durch Fällung in Gegenwart einer Polyacrylsäure erfolgen.

Das so erhaltene Material ermöglicht es, ungefähr 20 bis 50 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial in reversibler Weise zu fixieren.

Das Material ist durch eine große Stabilität in einem weiten P_H-Bereich (ungefähr 3 bis 12) ausgezeichnet.

Nach der zweiten, als Imprägnierung im beheizten Trockenschrank bezeichneten Methode wird das poröse mineralische Oxid, nachdem es gewogen worden ist, kalt oder warm mit einer wäßrigen Lösung des aminierten Polysaccharidpolymeren bei einem p„, das ohne Unterschied zwischen 3 und 12 liegen kann, imprägniert. Man trocknet dann im Dampftrockenschrank zwischen 50 und 120⁰C, vorzugsweise bei 80⁰C, bis Gewichtskonstanz erreicht ist.

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Das so erhaltene Pulver wird dann homogenisiert und gesiebt, wenn sich dies als nötig erweist, um etwaige Agglomerate zu entfernen. Das so durch Imprägnierung im Trockenschrank erhaltene Material kann nach einer vorangehenden Wäsche mit einer Pufferlösung oder einer 0,05-molaren Citratlösung vom PjT 4 oder einer 0,05-molaren Lösung vom ρττ 6,8 verwendet werden; das nach dieser Methode erhaltene Material vermag ungefähr 40 bis 200 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial in reversibler Weise zu fixieren.

Wie man feststellen kann, erhöht diese Methode der Imprägnierung im Trockenschrank beträchtlich die Kapazität der Fixierung von Proteinen.

Die Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank macht es zugleich möglich, ein Material zu gewinnen, dessen Auskleidung mit dem aminierten Polysaccharidpolymeren praktisch irreversibel fixiert ist.

Dieses Material kann in der Tat mit 0,1-n Salzsäure, mit Sodalösung oder mit 0,1-n Ammoniak gewaschen v/erden, ohne daß das Anionen-Austauschvermögen beeinträchtigt wird, während bei dem nach der Methode der Imprägnierung in der Säule erhaltenen Material durch solche Wäschen das ursprüngliche poröse mineralische Oxid regeneriert wird. Will man das poröse mineralische Oxid aus den Materialien regenerieren, die nach der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank erhalten worden sind, so muß man das Material unter weit schärferen Bedingungen, z.B. mit rauchender Salpetersäure, behandeln.

Hieraus folgt also, daß es bei Anwendung der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank möglich ist, das erfindungsgemäße Ilaterial für eine Vielzahl von Operationen

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zu verwenden, ohne hierdurch seine ausgezeichneten Eigenschaften als Anionenaustauscher zu beeinträchtigen.

Gemäß einer noch anderen Art der praktischen Verwirklichung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es auch möglich, nach der Imprägnierung gemäß einer der oben beschriebenen Methoden und nach einer Trocknung im Dampftrockenschrank zwischen ungefähr 50 und 80 C zwecks Gewinnung eines homogenen Pulvers das erhaltene Produkt dann mit einer Lösung eines Vernetzungsmittels in einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Äthyläther, zu behandeln, wobei man als Vernetzungsmittel beispielsweise irgendeines der oben erwähnten Vernetzungsmittel verwenden kann.

In diesem Fall wird das zu behandelnde Produkt bis zur völligen Verdampfung des Lösungsmittels gerührt, um so eine gleichmäßige Imprägnierung sicherzustellen.

Man hält das Ganze dann ungefähr 15 Stunden lang auf einer Temperatur von 40 bis 120⁰C, vorzugsweise auf etwa 80⁰C. Nach dem etwaigen Sieben wird das Trägermaterial dann trocken auf eine Säule gegeben, erst mit Sodalösung und mit einer Natriumchloridlösung gewaschen und schließlich mit dem gewünschten Chromatographiepuffer equilibriert.

Durch eine solche Vernetzung erhält man so ein Material, das ausgezeichnete Eigenschaften aufweist und das in üblicher Weise mit Sodalösung oder 0,1-n Ammoniak oder 0,1-n Salzsäure gewaschen werden kann, ohne daß hierdurch die Trennqualitäten bzw. die Kapazität zur reversiblen Fixierung der Proteine verändert wird.

Die Kapazität des so erhaltenen Materials beträgt etwa 40 bis 200 mg Proteine pro Gramm Trägermaterial. Für die

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- ίο -

Oberflächen des anfänglichen porösen Trägers, die sich auf ungefähr 10 bis i
tat nahezu konstant.

auf ungefähr 10 bis 80 m /g belaufen, ist diese Kapazi-

Sowohl für die Materialien, die nach dem Verfahren der Imprägnierung in der Säule erhalten wurden, als auch für die Materialien, die nach der Methode der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank gewonnen wurden, ist es gleichermaßen möglich, im vorliegenden Fall das Material mit konzentrierter Salpetersäure derart zu waschen, daß das poröse mineralische Oxid, das als Träger dient, regeneriert wird.

Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört im übrigen auch die Verwendung der oben beschriebenen neuen Materialien zur Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen, vornehmlich von Proteinen.

Allgemein ausgedrückt besteht diese Verwendung in der Ausnutzung der kationischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Materials entweder zur selektiven Fixierung der biologischen Makromoleküle, die man zu isolieren oder zu reinigen wünscht, oder zur selektiven Zurückhaltung von Verunreinigungen oder anderen nicht erwünschten Proteinen.

Die selektive Fixierung von Proteinen ist leicht zu bewerkstelligen durch Regulierung des p_H und der Molarität nach den an sich bekannten Methoden des Betriebes von Ionenaustauschern.

In breitem Sinn ist diese Art der Anwendung dadurch gekennzeichnet, daß man über das Material, das Gegenstand der Erfindung ist, eine Lösung laufen läßt, welche die

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biologischen Makromoleküle, die man zu isolieren oder zu reinigen wünscht, enthält, und hierbei das p_H und die Molarität so einreguliert, daß das genannte Material entweder die biologischen Makromoleküle, die man zu reinigen oder zu isolieren wünscht, oder die nicht erwünschten Verunreinigungen selektiv fixiert.

In dem Fall, in dem das Material die Makromoleküle, die man zu reinigen oder zu isolieren wünscht, fixiert, werden diese dann anschließend mit einer Lösung von zweckentsprechendem Pu und zweckentsprechender Molarität eluiert.

In dem Fall, in dem das Material die Verunreinigungen fixiert, gewinnt man direkt die biologischen Makromoleküle in Lösung. Man eluiert dann mit einer Lösung von zweckentsprechendem Ptt und geeigneter Molarität, um die Verunreinigungen zu eliminieren und so das Material für eine neue Operation zu regenerieren.

Einige erfindungsgemäß mögliche Anwendungen sind nachstehend beispielhaft angeführt:

(a) die Reinigung von T-Globulinen aus menschlichem oder tierischem Blutplasma oder -serum;

(b) die Eliminierung von Hämoglobin im Verfahren der Albumin-Reinigung aus Plazentarblut und die Konzentration der anderen Proteine;

(c) die Konzentration einer verdünnten Lösung von Proteinen in einem alkoholischen Medium und die Eliminierung des Alkohols;

(d) die Konzentration und Reinigung von Albumin in einer Katriumcaprylatlösung;

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(e) die Konzentration und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen.

Diese verschiedenen Anwendungen.des erfindungsgemäßen Materials werden weiter unten in den Beispielen in allen Einzelheiten erläutert.

Das erfindungsgemäße Material findet in gleicher Weise auch Anwendung zur Reinigung von Antikörpern oder Antigenen. In diesem Fall immobilisiert man auf dem erfindungsgemäßen Material Antigene oder Antikörper, und man nutzt das so modifizierte Material zur Reinigung und Konzentration der entsprechenden Antikörper und Antigene aus.

Auf diese Weise ist es möglich zu immobilisieren:

menschliche oder tierischer-, ß- und γ-Globuline und Albumin;

alle Bakterien- und Virus-Antigene, vorausgesetzt, daß sie negative elektrische Ladungen bei p„ 6,8 aufweisen; dies ist der Fall bei den meisten bekannten Proteinen, Polysacchariden und Nucleinsäuren.

Desgleichen kann man hier - ohne damit eine Einschränkung zu verbinden - weiter anführen die Bakterientoxine, das Tetanus-Anatoxin, das mit dem Hepatitisvirus B verbundene Antigen HB. das Grippevirus, das Tollwutvirus, das Herpesvirus, das Masernvirus, das Rötelnvirus, die Adenoviren, die Papovaviren, die Arboviren,' die. Rhino viren, die Picornaviren, die Enteroviren, die Poxviren, die Myxoviren, die Paranyxoviren, die Reoviren, die"Coronaviren oder deren Abbauprodukte und desgleichen deren verschiedene Antigene.

Ebenso wie die erfindungsgemäßen Materialien'die Antigene oder Antikörper immobilisieren können, können diese genauso

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die verschiedenen Enzyme immobilisieren, was zu folgenden Materialien mit enzymatischer Aktivität führt: Pepsin, Trypsin, Chrymotrypsin, Plasmin, Lactico-deshydrogenase, L-Aminoacylase, Invertase, Glucose-isomerase, Amyloglucosidase, Glucose-oxydase, Katalase, Lipase und Urease.

Nach einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung können diese immobilisierten makromolekularen Substanzen es in irreversibler Form sein, wenn man nachträglich eine Vernetzung mit einem Vernetzungsmittel der oben angeführten Art vornimmt.

Diese Vernetzung wird im allgemeinen bei Zimmertemperatur durchgeführt.

Schließlich können die erfindungsgemäßen Materialien weiter dazu verwendet werden., um Moleküle von geringem Molekulargewicht zu immobilisieren, wie gewisse Aminosäuren oder bestimmte Liganden, die Aminfunktlonen besitzen, Alkohole oder Thiole, in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie Glutaraldehyd oder Diepoxyverbindungen, wie sie oben angeführt sind.

Auf diese Weise ist es möglich, z.B. Lysin zu immobilisieren, und das erhaltene Material kann verwendet werden zur Reinigung oder Eliminierung von Plasminogenen oder Plasmin, also von Blutproteinen, die eine starke Affinität zum Lysin besitzen.

Desgleichen ist es möglich, verschiedene Steroide zu immobilisieren und die so modifizierten Materialien dann zum Reinigen ihrer Transport-Proteine zu verwenden. Schließlich ist es auch möglich, verschiedene Zellrezeptoren zu immobilisieren, z.B. Ganglioside, die vorher deacetyliert wor-

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den sind, um die reaktionsfähigsten Aminfunktiorien wieder freizulegen, und diese Materialien dann zur Eliminierung, Neutralisation oder Reinigung ihrer Liganden zu verwenden.

Im folgenden werden einige Beispiele angeführt, welche die Herstellung der erfindungsgemäßen Materialien und auch verschiedene Anwendungen derselben veranschaulichen; sie dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, sollen diese aber in keiner Weise einschränken.

Beispiel 1

10 g Spherosil XO C005 werden in eine Chromatographiesäule gegeben, indem man das trockene und homogene Pulver direkt eingießt, was die Montage der Säule erleichtert. Dann werden 100 ml einer 0,1-n Salzsäurelösung in die Säule eingespeist, und zwar mit Hilfe einer mechanischen Förderpumpe (poape peristaltique) mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 500 ml/Std., um die Säule zu waschen und zu imprägnieren und alle Luftblasen zu vertreiben (wobei es vorteilhaft ist, die Eluierung in aufsteigendem Sinn vorzunehmen). Dann wird ein Puffer vom p_R 3 bis 12 (z.B. TRIS-Puffer, 0,05-molar, p_H 7) auf die Kolonne bis zur Gleichgewichtseinstellung aufgegeben, was durch Messen des ρ_Η und des spezifischen Widerstandes am Ablauf aus der Säule Überwacht wird. Dann werden ungefähr 150 ml einer 1 tfigen DEAE Dextran-Lösung (oder 30 ml einer 5 #igen Lösung) in einem Puffer der vorerwähnten Art oder in Wasser, das auf dieses p_H eingestellt ist, mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 100 ml/ Std. aufgegeben. Hiernach wird der Überschuß an nicht auf der Säule fixiertem DEAE Dextran eluiert, und zwar «it de» vorerwähnten Puffer, dann mit 0,05-molarem Citrat vom pg 4 und mit 0,05-molarem Citrat voe p_H 8 alt «iner Durch«»t*-

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geschwindigkeit von 1000 ml/Std. Schließlich wird die Säule in dem gewünschten Chromatographiepuffer equilibriert. Die Abwesenheit von DEAE Dextran in dem End-Eluat kann durch Elektrophorese in Celluloseacetat und Anfärben des Flecks mit Ponceaurot oder durch Fällung in Gegenwart von Polyacrylsäure überprüft werden. Das so imprägnierte Trägermaterial ist in einem weiten p^-Bereich (ungefähr 3 bis 12) stabil und verhält sich wie ein Anionenaustauscher; es ist besonders zur Reinigung oder Konzentrierung von Proteinen geeignet. In einem adäquaten Puffersystem vermag es 20 bis 50 mg Proteine pro Gramm imprägniertes Trägermaterial in reversibler Weise zu fixieren.

In diesem Beispiel kann das DEAE Dextran mit gleichem Vorteil durch das QAE Dextran ersetzt werden.

Beispiel 2

10 g Spherosil XO B 015 werden abgewogen und mit 20 ml einer wäßrigen Lösung eines aminierten Polysaccharids (z.B. DEAE Dextran) von einer Konzentration von 1 bis 10 %, vorzugsweise 5 bis 8 %, und bei einem p_H imprägniert, das - ohne Unterschied - zwischen 3 und 12 liegen kann. Das Ganze wird dann im Dampftrockenschrank bei 50 bis 120⁰C, vorzugsweise bei 80⁰C, die erforderliche Zeit lang (z.B. 15 Stunden) getrocknet, um Gewichtskonstanz (durch Austreiben des Wassers) zu erzielen. Das erhaltene Pulver wird homogenisiert und erforderlichenfalls gesiebt, um eventuell vorhandene Agglomerate Ki entfernen, und dann in die Säule gegeben.

Nach Füllung der Säule und vorangehenden Wäschen mit den Pufferlösungen 0,1-n Salzsäure oder Citrat, 0,05-molar,

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P_H 4, oder Citrat 0,05-molar, p„ 6,8 oder 0,1-n NaOH wird die Säule in dem Puffer, welcher dem gewünschten Chromatographie-Typ adäquat ist, equilibriert. Die Kapazität für die Fixierung von Proteinen ist diesmal höher, liegt in der Größenordnung von 40 bis 200 mg/g unter den Chromatographiebedingungen.

In diesem Beispiel kann das DEAE Dextran vorteilhafterweise durch ein anderes aminie rtes Polysaccharidpolymeres, z.B. DEAE-Stärke, ersetzt werden.

Beispiel 3

Zu 10 g Spherosil XOB 030, die nach einer der beiden vorerwähnten Methoden durch eine aminierte Polysaccharidpolymeren-Lösung vom p„ 8 bis 13, vorzugsweise 11,5, imprägniert und danach im Dampftrockensehrank zwecks Gewinnung eines homogenen Pulvers getrocknet wurden, werden 20 ml einer 0,02 bis 2 %igen, vorzugsweise 0,15 %igen Lösung von 1,4-Butandiol-diglycidyläther in Äthyläther zugesetzt. Das Ganze wird ständig bei einer Temperatur von 40⁰C gerührt, bis der Äthyläther vollständig verdampft ist und man eine gleichmäßige Imprägnierung durch diese Diepoxyverbindung, die als Vernetzungsmittel wirkt, erzielt hat.

Das Ganze wird dann ungefähr 15 Stunden lang auf einer Temperatur von 40 bis 120⁰C, vorzugsweise auf etwa 80⁰C, gehalten. Nach einem eventuellen Sieben am Schluß wird das Trägermaterial dann trocken in eine Säule gegeben, mit 1 Liter 0,1-n Sodalösung und dann mit 1 Liter molarer NaCl-Lösung gewaschen und schließlich mit dem für die Chromatographie gewünschten Puffer equilibriert.

Die Fixierungskapazität für Proteine liegt zwischen 40 und 200 mg pro Gramm Trägermaterial unter den Chromato-

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graphiebedingungen. Für die Oberflächen des porösen Ausgangsträgers von 10 bis 80 m /g bleibt diese Kapazität nahezu konstant.

Beispiel 4

Direkte Reinigung von V-Qlobulinen aus menschlichem oder tierischem Serum oder Plasma - Schema eines Zyklus über g Trägermaterial, das nach den obigen Beispielen 1. 2 oder 3 hergestellt worden ist

- Equilibrierung der Säule auf z.B. p„ 6,8 (zwischen 6,3 und 8) (PO^-Puffer, 0,01 bis 0,02-molar oder TRIS-HCl-Puffer, 0,05-molar oder NaCl 1 bis 3 g/l) mit einer

Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml/cm /Std.

- Einführung von 50 ml Plasma oder Serum, das vorher gegen den Chromatographiepuffer dialysiert und dann filtriert worden ist, um jede Möglichkeit einer Anhäufung (colmatage) auszuschließen. (Mittlere Durchsatzgeschwindigkeit 50 bis 100 ml/cm²/Std.). Für ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Trägermaterial muß die Serum- oder Plasmamenge pro Zyklus auf 25 ml zurückgeführt werden.

- Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer.

- Sammlung des Peak-Ablaufs, der aus f-Globulinen besteht, die sich bei der Immunoelektrophorese als rein erweisen, in einer Ausbeute von 50 bis 100 % je nach dem verwendeten Puffer. Die Ausbeute ist besser bei p_H~Werten, die niedriger als p^ 6,8 sind oder bei denen die Ionenkräfte am stärksten sind, aber es besteht dabei die Gefahr, daß die Reinheit weniger gut ist. Ein solches r-Globulin-Präparat ist frei von pyrogenen Substanzen und von Antigenen, die mit dem Hepatitisvirus B vergesellschaftet sind (Ag HB ), die gegebenenfalls in den rohen Ausgangs-

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stoffen vorhanden sind.

- Eluierung der auf der Säule zurückgehaltenen anderen Proteine mittels irgendeines Puffers vom p„ 4 oder mittels des Chromatographiepuffers, der mit 10 bis 60 g/l NaCl versetzt worden ist, oder schließlich mittels eines Citratpuffers, 0,05-molar, p_H 4 bis 8. Die Dauer dieses Zyklus beträgt etwa 2 Stunden, und unmittelbar anschließend kann dann ein neuer Zyklus durchgeführt werden, und zwar so leicht, daß mit Hilfe eines recht einfachen Automatismus etwa 10 Zyklen am gleichen Tag durchgeführt werden können bei einem Behandlungs-Durchsatz von nahezu 10 1 Serum oder Plasma pro kg poröses mineralisches Oxid und pro Tag.

Beispiel 5

Eliminierung des Hämoglobins beim Verfahren der Reinigung von Albumin aus Plazentarblut und Konzentration der anderen Proteine

Die Fraktionierung des Plazentarbluts mittels Alkohol nach der Methode von Cohn verläuft über eine Stufe der Fällung der Block-Globuline bei p_H 6,8 und 20 bis 25 % Äthanol. Unter diesen Bedingungen bleiben das Albumin, bestimmte (X1- und <X2-Globuline und das Hämoglobin im wesentlichen in Lösung in der überstehenden Flüssigkeit. Diese wird durch Zentrifugieren in der Kälte gesammelt, mit dem gleichen. Volumen destillierten Wassers verdünnt (um die Alkoholkonzentration zu verringern), auf ein p_H von 6 bis 7 eingestellt und durch Filtrieren über eine CelluloseesterMembran geklärt.

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Schema eines Reinigungszyklus über 50 g Trägermaterial

(Es sind 100 g Trägermaterial erforderlich, wenn es sich um das gemäß Beispiel 1 hergestellte Material handelt.)

- Equilibrierung der Säule im PO^-Puffer, 0,01-molar, oder TRIS-HCl, 0,05-molar, p_H 6 bis 7 (vorzugsweise 6,5), mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml/cm /Std.

- Einführung von 1000 ml der zu reinigenden, vorerwähnten Lösung mit einer mittleren Durchsatzgeschwindigkeit von 100 ml/cm²/Std.

- Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer mit gleicher Durchsatzgeschwindigkeit. Das gereinigte Hämoglobin tritt aus der Säule mit einem zu vernachlässigenden Verdünnungsfaktor aus, da die anderen Proteine, darunter das Albumin, auf der Säule fixiert bleiben.

- Eluierung der auf der Säule fixierten Proteine unter Bedingungen, die den in Beispiel 4 angegebenen entsprechen, wobei der Peak die konzentrierten Proteine enthält und praktisch frei von Hämoglobin ist.

- Die Zyklusdauer beträgt ungefähr 4 Stunden, und unmittelbar anschließend kann dann ein neuer Zyklus durchgeführt werden.

Beispiel 6

Konzentration einer verdünnten Lösung von Proteinen in alkoholischem Medium und Eliminierung des Alkohols

Die Fraktionierung von Proteinen nach der Methode von Cohn ist unvermeidbar begleitet von verschiedenen Stufen der Wiederauflösung von Alkohol-Fällungen. Aus diesem Grunde ist es empfehlenswert, die Fällung stark zu verdünnen, um den Gehalt an Restalkohol, der verblieben ist,

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herabzusetzen. Es ergibt sich so die Notwendigkeit, einerseits den Alkohol zu eliminieren und andererseits die vorhandenen Proteine zu konzentrieren. Dies wird in der Regel durch Konzentration Im Vakuum, Gefriertrocknung oder Dialyse bewerkstelligt,, und da diese beiden letztgenannten Stufen sehr beschwerlich bzw. lästig sind oder die Quelle für den Eintritt von Pyrogenen darstellen, wird hier das folgende Verfahren vorgeschlagen, das außergewöhnlich bequem, schnell und wirtschaftlich durchführbar ist.

Als Beispiel dient eine Albuminlösung von 2 %, die 10 % Alkohol enthält.

Schema eines Reinigungs- und Konzentrierungs-Zyklus auf 1 kg Trägermaterial (hergestellt gemäß Beispiel 2 oder 3; im Falle des Beispiels 1 ist es angezeigt, die Trägermenge, die erforderlich ist, zu verdoppeln); seine Dauer beträgt rund 4 Stunden.

(1) Equilibrierung des Trägers im Phosphatpuffer, 0,01-molar, p„ 7 - Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/cm^z/Std.

(2) Einspeisung der alkoholischen Albuminlösung, deren p_H auf den Wert 7 durch Zugabe von HCl oder NaOH - je nach dem Ausgangs-p_K - eingestellt worden ist. Mittlere Durchsatzgeschwindigkeit JOO ml/cm /Std.

Auf diese Weise ist es möglich, 200 g Albumin auf dieser Säule zu fixieren (etwa 10 1 Lösung/Zyklus), und falls das Albumin auf der Säule schlecht fixiert wird, genügt es, die Ausgangslösung starker mit destilliertem Wasser zu verdünnen, um so die Ionenstärke des Mediums herabzusetzen.

(3) Waschen mit destilliertem Wasser; Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/cm /Std. und Prüfung, ob das Albumin nicht

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₂₁ _ 263324B

austritt, sondern im Gegenteil der Alkohol den Ablauf beendet.

(4) Eluierung des Albumins in einer der folgenden Pufferlösungen: NaCl, 0,1-molar oder Citratpuffer, 0,05-molar, Pu 6,8. Man erhält in der Regel End-Konzentrationen an Albumin von ungefähr 10 bis 2.0 %, die Eliminierung des Alkohols ist vollständig erfolgt und die Ausbeute der Operation beträgt nahezu 100 %. Dieses Verfahren ist auf jedes Protein anwendbar, dessen isoelektrischer Punkt unter 6,5 liegt. Für Proteine, deren isoelektrischer Punkt höher liegt, würde die Methode unter der Voraussetzung anwendbar sein, daß man das p_H des Chromatographiepuffers erhöht. Schließlich ist auch offensichtlich, daß ,jede in diesen Proteinlösungen vorhandene Verunreinigung auf diese Weise eliminiert werden kann, vorausgesetzt, daß sie elektrisch neutral ist (Kohlehydrate und Polysaccharide) oder in gleicher Weise wie der Träger (Kationen) positiv geladen ist. In dem Fall, in dem die Verunreinigungen negativ geladen sind, kann es auf dem Träger zu einer Konkurrenz mit den negativen Proteinen, die man zu fixieren wünscht, kommen. In diesem Fall ist es dann, wenn die Affinität der Verunreinigung zum Träger schwächer als die des Proteins ist und wenn die Lösung hinreichend mit Wasser verdünnt werden kann, um eine Ionenstärke zu erhalten, die mit der Fixierung des Proteins auf dem Träger vereinbar ist, dennoch möglich, sogar die Anionen zu eliminieren. Das nachstehende Beispiel erläutert eine solche Trennung.

Beispiel 7 Konzentrierung und Reinigung von Albumin in einer Lösung

von Natriumcaprvlat

Außergewöhnlich interessante Fraktioniermethoden verwenden

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das Natriumcaprylat zur Koagulierung aller Proteine mit der alleinigen Ausnahme des Albumins, das also in Lösung in Gegenwart des Caprylats bleibt. Als Beispiel wird von einer Lösung ausgegangen, die 15 g/l Albumin und 3 g/l Caprylat enthält.

Schema eines Zyklus auf 1 kg Trägermaterial (hergestellt gemäß den Beispielen 2 oder 3; im Fall des Beispiels 1 muß man die erforderliche Trägermenge verdoppeln).

(1) Equilibrierung des Trägers im Phosphatpuffer, 0,01-molar,

Ptt 6. - Durchsatzgeschwindigkeit 200 ml/cm /Std.

(2) Einführung der Albumin- und Caprylatlösung, die selbst auf p_H 6 eingestellt ist (im Fall zu stark erhöhter Ionenkräfte wird mit Wasser verdünnt). Die mittlere Durchsatzgeschwindigkeit beträgt 100 ml/cm /Std.

Es können ungefähr 8 1 Lösung auf die Säule aufgegeben werden. Es ist leicht, die Fixierung festzustellen und den kontinuierlichen Austritt des Natriumcaprylats zu beobachten (starker Geruch nach Ziege).

(3) Waschen der Säule mit dem Chromatographiepuffer, bis nichts mehr aus der Säule austritt.

(4) Eluierung des Albumins nach der gleichen Methode wie in den vorangehenden Anwendungsbeispielen. Man erhält eine Lösung von 10 bis 20 % Albumin, die - auf 20 % gebracht - zum Schluß weniger als 2,5 g/l Natriumcaprylat enthält. Die Gesamtdauer des Zyklus beträgt ungefähr 4 Stunden.

Es ist offensichtlich, daß diese Methode verallgemeinert werden kann zur Reinigung und Konzentrierung von zahlreichen biologischen Molekülen, die bei bestimmten p_H-Werten negativ geladen sind (Nucleinsäuren, Proteine, anionische

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Polysaccharide, anionische Glykolipoide). Um zu veranschaulichen, daß diese Verallgemeinerung praktisch möglich ist und daß eine solche Säule demgemäß die Passage von Flüssigkeiten mit sehr verschiedenen Polaritäten zuläßt, wird das folgende Anwendungsbeispiel angeführt.

Beispiel 8 Konzentrierung und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen

Die Ganglioside stellen Glykolipoide dar, an denen die Biochemiker derzeit die extrem wichtige physiologische oder pathologische Rolle studieren, die sie auf der Ebene der Zellmembranen, und zwar als Rezeptor und Effektor, spielen. Sie enthalten mehr oder weniger Sialinsäure und sind aufgrund des Gehalts hieran negativ geladen oberhalb eines p_H von ungefähr 3.

Aus ungefähr 1 kg Kalbshirn kann man einen vräßrigen Extrakt von etwa 7 1 erhalten (und zwar nach einem Verfahren, das in einer Arbeit von L. SVENNERHOLM "Gangliosides, isolation« in "Methods in carbohydrate chemistry", Band 6, Herausgeber R.L. Whister und J.N. Bemiller, Acad. Press New York 1972, beschrieben ist.)

Dieser wäßrige Extrakt wird direkt auf eine Säule aufgegeben, die 50 g eines Trägermaterials enthält, das gemäß Beispiel 3 hergestellt und vorher in einem TRIS-HCl-Puffer, 0,05-molar, p_H 6,8, equilibriert worden ist. Die Durchsatzgeschwindigkeit beträgt 200 ml/cm²/Std. Unter diesen Bedingungen werden alle Ganglioside auf der Säule festgehalten. Eine vorangehende Wäsche mit den folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge:

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TRIS-HCl-Puffer, 0,05-mclar, p_H 6,8

0,1-n NaOH

H₂O

Chloroform-Methanol-Wasser im Volumenverhälcnis von 30 : 60 : 25

ermöglicht die Eliminierung der zahlreichen Verunreinigungen.

Die Eluierung der Ganglioside in konzentrierter Form und in gereinigter Form wird dann mit dem Gemisch aus Chloroform, Methanol und 0,1-n HCl im Volumenverhältnis von 30 : 60 : 25 mit der gleichen Durchsatzgeschwindigkeit durchgeführt.

Gleich nach der Elution wird der gesammelte Peak durch Zusatz von 0,1-n NaOH neutralisiert, eingedampft und zur Analyse wieder in einem geeigneten Chromatographiesystem aufgenommen. Die Ausbeute beträgt 100 %. Es ist bemerkenswert festzustellen, daß die Säule ohne ^iede nachteilige Folge von einem organischen Lösungsmittel und dann von einer wäßrigen Lösung und auch umgekehrt durchlaufen werden kann. Dies kann gegebenenfalls für bestimmte Reinigungsoperationen oder zur Aufrechterhai omg von sterilen Bedingungen in der Säule technisch ausgenutzt werden.

Beispiel 9

Verwendung des erfinaungsgemäßen Materials als Träger für das Tetanus-Anatoxin zwecks Reinigung und Konzentrierung

von Antitetanus-Antikörpern

Die in den vorangehenden Anwendungsbeispielen offenbarte erhöhte Kapazität der Fixierung von Proteinen kann mit Vorteil dazu ausgenutzt werden, um das Tetanus-Anatoxin auf einer Säule des porösen mineralischen Trägermaterials

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zu immobilisieren. Beispielsweise werden 10 g Spherosil XOC 005 (spezifische Oberfläche 10 m²/g) mit DEAE Dextran gemäß Beispiel 1 imprägniert und mit einem Phosphatpuffer, 0,01-molar, p_H 6,8, equilibriert. Daneben werden 25 ml Tetanus-Anatoxin (mit einem biologischen Titer von rund 1500 Lf oder Ausflockungseinheiten (Unites floculantes)) mit dem gleichen Puffer auf 250 ml verdünnt und kontinuierlich auf die Säule aufgegeben. Zu Beginn der Passage erfolgt die Fixierung des Tetanus-Anatoxins quantitativ, und es ist keine Spur davon am Säulenausgang mittels der geeigneten immunologischen Methoden nachweisbar bis zu ungefähr 200 ml Eluat. Die letzten 50 ml werden trotz allem eingespeist, um sicher zu sein, daß man einen gleichmäßigen und vollständigen Überzug mit dem Tetanus-Anatoxin erzielt hat. Danach wird die Säule mit dem Chromatographiepuffer gespült. Es ist dann möglich, das Tetanus-Anatoxin definitiv zu immobilisieren, indem man es derart vernetzt, daß es in einem ziemlich großen p_H-Be.reich (p_H 2 bis 12) nicht mehr eluiert werden kann.

Die Vernetzung erfolgt durch ein 2-stündiges ständiges Zirkulierenlassen von 100 ml einer 0,5 %igen Lösung von Glutaraldehyd in einem Phosphatpuffer, 0,01-molar, p_H 6,8,

mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von ungefähr 40 ml/cm / Std. bei Raumtemperatur.

Danach wird die Säule mit den folgenden Puffern nacheinander gespült:

Phosphat, 0,01-molar, Pu 6,8 Glykokoll, 0,2-molar, P_H 8,2

Glykokoll, 0,2-molar, p_u 7,2 (mit und ohne

^H NaCl, 60g/l)

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Citrat, 0,05-molar, P_H 2,8 Schluß-Rücklauf und Konservierung in Glykokoll, 0,2-molar, p„ 7,2.

Die Säule ist dann zum Gebrauch fertig und mit ihr können zahlreiche identische Reinigungszyklen durchgeführt werden. Es sind so mehrere Dutzend von aufeinanderfolgenden Zyklen nit der gleichen Säule durchgeführt worden, wobei alle Eigenschaften derselben beibehalten worden sind.

Schema eines Reinigungszyklus für eine solche Säule von 10 g

Es werden 1,5 1 einer Lösung von'j· -Globulinen oder Seren oder Plasmen, die auf die folgenden Konzentrationen

Glykokoli 15 g/l

WaGl

P_H 7,2

eingestellt ist und einen ilncitetanus-Antikörper-Titer von ungefähr 5 internationalen Einheiten (U.I.) pro ml sufweist, auf die Säule mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 40 ml/om'Vstd. bei der Labortemperatur aufgegeben. Mindestens 3i° der Antitetanus-Antikörper sind am Säulenausgang mittels der zweckentsprechenden immunologischen Methoden erst dann nachweisbar, wenn alle anderen Proteine die Säule durchlaufen haben.

Die Säule wird sodann mit dem Glykokollpuffer, 0,2-molar, P_H 7,2, mit einem UaCT-Gehalt von 60 g/l gespült, danach mit dem gleichen Puffer ohne NaGl-Gehalt gespült, bis das Säulen-Eluat Ultraviolettlicht von 280 na nicht mehr signifikant absorbiert. Jeder Puffer wird ungefähr 15 Minuten mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 200 ml/cm /Std. angewendet.

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Die Eluierung der auf der Anatoxin-Säule fixierten Antitetanus-Antikörper wird dann vermittels Aufgabe eines Trinatriumcitrat-Citronensäure-Puffers, 0,05-molar, p_H 2,8, bei 20⁰C mit einer
Std. durchgeführt.

bei 20 C mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 40 ml/cm t

Das Eluat der Säule wird in einer gekühlten Vorlage gesam= melt und durch ständigen Zusatz von normaler Sodalösung, der von einem p^-Meßgerät gesteuert wird, sofort auf p_H 7 neutralisiert. Sowie der Elutions-Peak eluiert ist (Ablesung der Absorption bei 280 nm), wird die Säule in dem anfänglich benutzten Glykokollpuffer erneut equilibriert, und es kann unmittelbar danach ein neuer Zyklus durchgeführt werden. Die Lösung der gereinigten Antitetanus-Antikörper kann mittels klassischer Methoden (Ultrafiltration, Fällung mit Polyäthylenglykol, Alkohol oder Ammonsulfat) konzentriert werden. Die mittlere Aktivität der Lösungen der so gereinigten Antitetanus-Antikörper beträgt 30 bis 100 inter= nationale Einheiten pro mg Protein. Die Ausbeute an Antitetanus-Antikörpern schwankt zwischen 20 und 100 %_t

Bei genauer Befolgung der Arbeitsvorschrift des Beispiels ist es möglich, verschiedene Antigene oder Antikörper, wie sie in der vorangehenden Beschreibung aufgezählt sind, zu immobilisieren.

Für bestimmte Antigene, deren isoelektrischer Punkt über P_H 6 liegt, ist es empfehlenswert, die Stufe der Fixierung auf der Säule in einem Phosphatpuffer, 0,01-molar, p_H 8, anstatt in einem solchen vom Pu 6,8 durchzuführen. Es kann sogar empfehlenswert sein, die Phosphationen durch Chlorionen zu ersetzen, indem man eine Natriumchloridlösung, 0,01-bis 0,05-molar, beim gleichen p_H von 8 verwendet. Eine

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weitere Lösung des Problems würde darin bestehen, erfindungsgemäße, stark ionisierte, quaternäre Austauscher bei Pu 8 zu verwenden. Dies ist vornehmlich der Fall bei Proteinen mit einer Antikörper-Aktivität vom Typ ß2, >^Λ1 oder Y2, wie sie in den gängigen Tierarten (Ziege, Schaf, Kaninchen, Pferd, Meerschweinchen etc.) oder beim Menschen vorkommen,

Beispiel 10

Zu 10 g Spherosil XOB 015, die mit DEAE Dextran nach der Arbeitsvorschrift eines der Beispiele 1 bis 2 oder 3 imprägniert worden sind, gibt man 30 ml einer 0,1 %igen Lösung von Butandiol-diglycidyläther, verdampft dann das Lösungsmittel innerhalb von 30 Minuten bei 80⁰C und setzt schließlich eine Lösung von Lysin in Wasser vom p„ 11,5 zu (30 ml; 1 %ig). Das Ganze wird dann 15 Stunden auf 80⁰C gehalten. Das erhaltene Material wird in eine Säule gegeben und mit einem Citratpuffer, 0,05-molar, p^ 6,8, gewaschen. Anhand einer Gegenüberstellung mit Vergleichsträgern (die nicht mit einem Kupplungsmittel behandelt worden sind) kann leicht gezeigt werden, daß ein hoher Prozentsatz Lysin definitiv an das DEAE Dextran-imprägnierte Trägermaterial gekuppelt worden ist (zu einer solchen Feststellung werden die Farbreaktionen mit Ninhydrin herangezogen).

Mit Hilfe einer solchen Säule, die aus dem mit Lysin überzogenen Material gebildet wurde, ist es möglich, unter ausgezeichneten Bedingungen die Reinigung oder Isolierung des Plasminogens oder Plasmins praktisch durchzuführen, d.h. von Blutproteinen, die eine große Affinität zum Lysin aufweisen.

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Claims

Patentansprüche

1. Zur Fixierung von biologischen Makromolekülen in reversibler Weise bestimmte neue Materialien kationischen Charakters, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem porösen, mineralischen Träger, nämlich einem mineralischen Oxid, dessen Oberfläche direkt mit einem aminierten Folysaccharidpolymeren überzogen ist, bestehen.

2. Material gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse mineralische Oxid aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder einem Titanoxid oder deren synthetischen oder natürlichen Derivaten, wie Gläsern, Silikaten, Kaolin etc., besteht.

3. Material gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse, mineralische Träger eine innere Oberfläche von 100 m /g oder weniger, vor-

zugsweise von 5 bis 80 m /g aufweist.

4. Material gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Porendurchmesser des Trägers 25 nm oder mehr, vorzugsweise 50 bis 1000 nm, beträgt.

5. Material gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse mineralische Träger aus porösem Siliciumdioxid, das eine innere Oberfläche von 10, 25 oder 50 m²/g aufweist, besteht.

6. Material gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharidpolymere wasserlöslich ist und ein Molekulargewicht von 10 Dalton oder darüber,

5 6
vorzugsweise von 10 bis 10 Dalton, aufweist.

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7. Material gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminfunktion des Polysaccharidpolymeren primärer, sekundärer, tertiärer oder quaternärer Natur, vorzugsweise jedoch sekundärer, tertiärer oder quaternärer Natur ist.

8. Material gemäß einem der Ansprüche 1, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharidpolymere aus einem aminierten synthetischen oder natürlichen Derivat des Dextrans, der Cellulose, der Agarose oder der Stärke besteht.

9. Material gemäß einem der Ansprüche 1 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharidpolymere vorzugsweise der allgemeinen Formel

R __ (cH₂)_n - N^

entspricht, in der R den Rest des Dextrans, der Stärke, der Cellulose oder Agarose bedeutet, η eine ganze Zahl im Wert von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 5, ist und R.. und Rp, die gleich oder verschieden sein können, für Reste der Formeln -CH₃, -CH₂-CH₃, -CH₂OH, -CH₂-CHOH oder -CHp-CHOH-CH, stehen, wobei die genannte Verbindung mittels eines quaternisierenden Mittels, wie einem Alkyl- oder Hydroxyalkylhalogenid oder Dimethylsulfat, quaternisiert sein kann.

10. Material gemäß Anspruch 9_f dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharidpolymere aus dem Diäthyl-

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aminoäthyldextran, dem quaternisierten Diäthylaminoäthyldextran oder der Diäthylaminoäthylstärke besteht.

11. Material gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharidpolymere mit einem Vernetzungsmittel, wie dem 1,4-Butandiol-diglycidyläther, dem Epichlorhydrin, dem Epibromhydrin oder einem Diepoxid der Formel

^R1

CH₂ CH-R₂-N-R₃-CH

I Q 1 I Q

vernetzt ist, in welcher Formel R₁ einen Alkylrest mit" 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen niedermolekularen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen be~ deutet und R₂ und R, für eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einen niedermolekularen Alkylenrest, stehen.

12. Verfahren zur Herstellung eines Materials, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht ist, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine Chromatographiesäule das poröse mineralische Trägermaterial in Pulverform einfüllt, man dann eine Pufferlösung vom p_H 3 bis 12 bis zur Gleichgewichtseinstellung durchlaufen läßt, man danach eine Lösung des aminierten Polysaccharidpolymeren in demselben Puffer einführt und dann sofort wieder mit dem gleichen Puffer eluiert, bis das Eluat vom aminierten Polysaccharidpolymeren frei ist.

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13. Verfahren zur Herstellung eines Materials, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht ist, dadurch gekennzeichnet, daß man den porösen mineralischen Träger mit einer wäßrigen Lösung des aminierten Polysaccharidpolymeren imprägniert, und zwar bei einem zwischen 3 und 12, und ihn dann im Dampftrocken-

schrank bei 50 bis 120⁰C bis zur Gewichtskonstanz trocknet.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des aminierten Polysaccharidpolymeren 1 bis 10 %ig, vorzugsweise 5 bis 8 %ig, ist.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Trocknung im Dampftrockenschrank das trockene Material mit einem Vernetzungsmittel, wie dem 1,4-Butandiol-diglycidyläther oder Epichlorhydrin, behandelt und dann von neuem bei einer Temperatur von ungefähr 40 bis 120⁰C getrocknet wird.

16. Verwendung der Materialien, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht sind, zur Reinigung oder Trennung von biologischen Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß man über das genannte Material eine Lösung, welche die biologischen Makromoleküle, die man zu isolieren oder zu reinigen wünscht, enthält, laufen läßt und hierbei das p_H und die Molarität so einregelt, daß das besagte Material selektiv entweder die biologischen Makromoleküle, die man zu reinigen oder zu isolieren wünscht, oder die unerwünschten Verunreinigungen fixiert.

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17. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man sie zur Reinigung von Y^-Globulinen aus menschlichen oder tierischen Seren oder Plasmen benutzt.

18. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man sie zur Abtrennung vom Hämoglobin beim Verfahren der Reinigung von Albumin aus Plazentarblut und Konzentrierung der anderen Proteine benutzt.

19. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man sie zur Konzentration einer in einem alkoholischen Medium verdünnten Lösung von Proteinen und zur Eliminierung des Alkohols benutzt.

20. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man sie zur Konzentration und Reinigung von Albumin in einer Natriumcaprylatlösung benutzt.

21. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man sie zur Konzentration und Reinigung von Gangliosiden aus wäßrigen Extrakten von Tierhirnen benutzt.

22. Verwendung der Materialien gemäß einem der Ansprüche

1 bis 16 zur Fixierung von makromolekularen Substanzen, wie Antigenen, Antikörpern oder Enzymen.

23. Verwendung der Materialien gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen durch Vernetzung in irreversibler Weise fixiert werden.

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24. Verwendung der Materialien gemäß den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß man das Tetanus-Anatoxin durch Vernetzung mit Glutaraldehyd in irreversibler Weise fixiert.

25. Verwendung der Materialien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Fixierung von Substanzen mit niedrigen Molekulargewichten, wie Aminosäuren, Liganden, Steroiden und Zellrezeptoren, wie Gangliosiden, durch Kupplung mit einem Kupplungsmittel, wie Glutaraldehyd oder einem Diepoxid der Formel

^R1

CH - R₂ - N - R₃ - CH - CH₂

O ' '—Ο—■

in der R₁, R₂ und R^ die im Anspruch 11 angegebenen Bedeutungen haben.

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