DE2709094C2 - Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents

Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung vor» Nukleinsäuren ; Gemischen aus einsträngigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, insbesondere Desoxyribonukleiniren (im folgenden abgekürzt als DNA bezeichnet), ein Verfahren i:ur Herstellung dieses Adsorbens sowie ssen Verwendung.
Die Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene in repititiver Anordnung aus dem Genom karyotischer Zellen ist nicht nur von rein wissenschaftlichem Interesse, sondern im Hinblick auf die Gentechlogie auch von großer praktischer Bedeutung. Möglich waren solche Isolierungen nur dann, wenn sich die senzusammensetzung des Gens oder der Gengruppe mit ihren »Spaccrn« wenigstens 6 bis 7 % von der mitt-
leren Basenzusammensetzung des Gesamtgenoms unterschied. Als Trennverfahren wurden meist Cäsiumionendichtegradientenzentrifugationen mit DNA-basenspezifischen Zusätzen, wie Silber-, Quecksilber- oder Platinionen oder Actinomycin, Netropsin oder 2-(4-Hydroxyphenyl)-5-(5-[l-methylpiperazin-4-yl]-benzimidazoI-2-yl)-benzimidazoi (Farbstoff »Hoechst 33 258«) angewendet. Diese Verfahren haben nur beschränkte Kapazität, sind teuer und zeitraubend.
Die Entwicklung von Materialien zur Affinitätschromatographie von Biopolymeren hat in den vergangenen Jahren die Isolierung einer Vielzahl von Biopolymeren stark vereinfacht oder ihre Reindarstellung überhaupt erst ermöglicht. Bei diesen Verfahren geht man in der Regel von einem Trägermaterial aus, das nach chemischer Aktivierung mit einer Substanz umgesetzt wird, die das zu isolierende Biopolymere möglichst spezifisch bindet.
ίο Aufgrund dieser Spezifität kann das gesuchte Biopolymere im Idealfall selektiv aus einem Gemisch ähnlicher
Verbindungen an das Chromatographiematerial adsorbiert und anschließend unter geeigneten Bedingungen in
reinem Zustand desorbiert werden (P. Cuatrecasas und C. B. Anfinsen, Ann. Rev. Biochem. 40 (1971) 259 bis 278).
Bei den vorhandenen Verfahren zur Auftrennung von Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht, zum
is Beispiel Transfer-Ribonukleinsäuren, wird die Auftrennung in die verschiedenen Spezies an Adscrbentien erreicht, die Ionenaustauschereigenschaften mit lipophilen Wechselwirkungen kombinieren (R. M. Kothari und V. Shankar, Journal of Chromatography 98 (1974) 449 bis 475). Dabei werden im wesentlichen die Wechselwirkungsmöglichkeiten des Trägers mit den seltenen Basen der Nukleinsäuren ausgenützt, die in den verschiedenen Transfer-Ribonukleinsäuren in unterschiedlicher Menge vorhanden sind.
Da die höhermolekularen Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren in der Regel keine seltenen Basen enthalten, können Methoden zu ihrer Auftrennung nur auf den folgenden Unterschiedsmerkmalen aufgebaut werden:
a) Verhältnis von Einzel- zu Doppelstrang
b) Unterschiede in der Basenzusammensetzung
c) Unterschiede in der Basensequenz
d) Unterschiede in den Molekulargewichten
e) Unterschiede in den Tertiärstrukturen
All diese Merkmale werden tatsächlich bei den heute üblichen Fraktioniermethoden genutzt (R. M. Kothari, Chromatog. Rev. 12 (1970) 127 bis 155).
Bei der wirksamsten Methode, der Fraktionierung im Salzgradienten in der Ultrazentrifuge führen Unterschiede gemäß b), c) und e) zu Unterschieden in der Schwebedichte für einzelne DNA-Spezies, die durch Zusatz von basenspezifischen Substanzen noch vergrößert werden können. Die Trennschärfe nimmt mit abnehmendem Molekulargewicht, die Kapazität mit zunehmendem Molekulargewicht ab. Bei der Adsorptionschromatographie an Hydroxyapatit erfolgt die Fraktionierung im wesentlichen gemäß a) und nur in geringerem Ausmaß gemäß b), indem Guanin-Cytosin-rcichere Nukleinsäuren schon bei etwas geringeren Salzkonzentrationen desorbiert werden als die Adenin-Thymin-reicheren Komponenten (W. Pakroppa und W. Müller, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (3) (1974) 699 bis 703).
Ganz analog können doppelsträngige Nukleinsäuren auch an spezifischen Protein-Kieselgur-Adsorbentien (zum Beispiel Methyl-Serum-Albumin-Kieselgur) gemäß Unterschieden der Basenzusammensetzung fraktioniert werden, wobei wieder die Guanin-Cytosin, reicheren DNA-Spezies zuerst eluiert werden (J. D. Manuell und A. D. Hershey, Analytical Biochemistry 1 (1960) 66 bis 77; N. Sueoka und Ts'ai-Ying Cheng, J. Mol. Biol. 4 (1962) 161 bis 172). Die eigentliche Wirkungsweise dieser mehr zufällig entdeckten Adsorbentien ist nicht bekannt. Daher konnte die geringe Trennschärfe dieser Materialien trotz aller Bemühungen bis heute nicht grundsätzlich verbessert werden.
Erst in den letzten Jahren wurden Substanzen gefunden, die mit Nukleinsäuren Komplexe bilden (W. Müller und D.M. Crothers, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 267 bis 277; W. Müller, H. Bünemann und N. Dattagupta, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 279 bis 291 und W. Müller und F. Gautier, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 385 bis 394). Welche Vorteile die Anwendung derartiger gut untersuchter Substanzen bei der Trennung von Nukleinsäuregemischen bringt, konnte bereits an den Beispielen der kombinierten Anwendung von Hydroxyapatit und Ethidiumbromid 2!s basenspezifisehem Zusatz zur Trennung von superhelicäier und nelicäier DNA (W. Pakroppa, W. Goebel und W. Müller, Analytical Biochemistry 67 (1975) 372 bis 383) und von Hydroxyapatit in Kombination mit Phenylneutralrotderivaten als basenspezifischen Komplexbildnern bei der Trennung von doppelsträngigen DNA-Spezies demonstriert werden (W. Pakroppa und W. Müller, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (3)
(1974) 699 bis 703).
Das Auflösungsvermögen dieser zuletzt erwähnten Methoden ist mit dem eines präparativen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten vergleichbar, das heißt DNA-Fraktionen mit Unterschieden im (G + C)-Gehalt (wobei G für Guanin und C für Cytosin stehen) lassen sich voneinander trennen. Trotz hoher Kapazität hat das Verfahren den Nachteil, daß sich DNA-Gemische mit einem mittleren Molekulargewicht der Komponenten von mehr als
M) 20 x 10* nicht mehr gut handhaben lassen und daß der als Adsorbens verwendete spezielle Hydroxyapatit selbst hergestellt werden muß.
Seit längerem ist bekannt, daß sich Nukleinsäure-Gemische im Polyäthyienglykol-Dextran-System unter bestimmten Bedingungen in RNA und einsträngige DNA einerseits und doppelsträngige DN A andererseits auftrennen lassen. Dabei reichert sich die doppelsträngige DNA stets in der (leichteren) Polyäthylenglykolphase
an, das heißt sie besitzt einen höheren Verteilungskoeffizienten als einsträngige Nukleinsäuren. Die Absolutwerte der Verteilungskoeffizienten lassen sich zwar durch Zusätze von Kalium und Lithiumsalzen über rd. 3-4 Zehnerpotenzen variieren, eine Fraktionierung nach der Basenzusammensetzung gelingt in diesen Systemen jedoch nicht.
Aus G. Smets et al., J. of Polymer Science 55 (1961), 767-777 ist ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfpolymeren u. a. mit Acrylamid, bekannt. Dabei werden Farbstoffmoleküle in die Polymere eingebaut, wobei sie selbst irreversibel in die Leukoform übergehen.
Trotz der Fülle der oben genannten Beispiele für die Anwendung von Chromatographiemethoden konnte für Nukleinsäuregemische bislang kein Chromatographiematerial entwickelt werden, das eine ähnlich selektive und programmierbare Auftrennung ermöglicht wie für andere Biopolymere. Eine hochauflösende Fraktionierung von Nukleinsa'uregemischen im Grammaßstab ist aber eine Voraussetzung fur die angesprochene Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene.
Aus W. Müller und F. Gautier, Eur. J. Biochem. 54 (1975) 385 bis 394 sind keine Adsorbentien bekannt, die einen Komplexbildner der Formel II für Nucleinsäuren enthalten. In dieser Literaturstelle wird lediglich über die Wechselwirkung von Verbindungen der Formel II mit Nucleinsäuren berichtet. Daraus läßt sich aber keineswegs herleiten, daß Adsorbentien, die diese Verbindungen kovalent gebunden enthalten, zur basen- und/ oder strukturspezifischen Auftrennung von Nucleinsäuren geeignet sind. Es konnte nicht vorhergesehen werden, ob Verbindungen der Formel II in Träger-fixierler Form noch die gleichen Eigenschaften aufweisen wie in nicht-gebundenem Zustand. Aber selbst, wenn dies der Fall gewesen wäre, konnte nicht erwartet werden, daß sich die Träger-gebundenen Verbindungen für die erfindungsgemäße Auftrennung von Nucleinsäuren eignen würden.
Unter Affinitätsspezifität ist vor allem die Strukturspezifität und die Basenspezifität zu verstehen.
Es hat sich nunmehr gezeigt, daß die genannte Aufgabe mit einem Adsorbens gelöst werden kann, das ein polymeres Trägermaterial aufweist, an das direkt oder über längere Zwischengruppen (Spacer) ein für Nukleinsäuren affiner Rest bzw. eine basen- und/oder strukturspezifische Gruppe insbesondere kovalent gebunden ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Adsorbens für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren auf der Basis eines polymeren Trägermaterials, das dadurch gekennzeichnet ist, daß an das polymere Trägermaterial ein für Nukleinsäuren affiner Rest direkt oder über einen polymeren »Spacer« kovalent gebunden ist.
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft nun ein Adsorbens der definierten Art, das gekennzeichnet ist, durch ein kleinporiges, wenig komprimierbares, polymeres Trägermaterial, auf das ein Copolymeres aus mindestens zwei mischpolymerisierbaren Monomeren aufgepfropft ist, von denen eines den für die Nukleinsäure affinen Rest trägt.
Als für die Nukleinsäure affine Reste können basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbüdner verwendet werden, die in den genannten Literaturstellen beschrieben sind. Insbesondere sind Reste von Farbstoffen der folgenden allgemeinen Formel I und II
35 40
NRJ in weichen allgemeinen Formeln
X für eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom, Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel
N(R1),
45 50 55
60
65
R1 unabhängig voneinander WasserstofTatome oder Methylgruppen, R2 ein WasserstofTatom oder eine Methylgruppe, R3 ein WasserstofTatom oder eine Methylgruppe, R4 ein WasserstofTatom oder eine Methylgruppe und
5 Αθ ein Anion, wie ein Chloranion, ein Perchloratanion oder ein Oxalatanion
bedeuten, geeignet.
Erflndungsgemäß besonders bevorzugte, an das polymere Trägermaterial gebundene basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner sind die Reste der Folgenden Farbstoffe:
1. Diamidinophenyl-indol (DAPI)
NH
2-
(CHj)2N
N(CHj)2
3. Kristallviolett
(CHj)2N
4. Methylgrün
cr
N(CHj)2
+N(CH,)j
2 CIO4
5. Auramin
(CHj)2N N(CH1),
2-(4-Hydroxyphenyl)-5-{5-[l-methylpipcra7.in-4-yl]-bcnz.imidazol-2-yl)-benzimidazol
CHjN^^N-^/ Y"V ^\,NS
Di-tert.butyl-proflavin (CHj)3C
H2N
Di-tert.butyl-aeriflavin (CHj)3C
C(CHj)1
NH2
H2N
(CHj)2N
25
40 «5
SO
55
60
(CHj)2N
(CHj)2N
CH2CH2COOR
N(CHj)2
Η,Ν
(CHj)2N
(CHj)2N H
CH,
NH2 CH,
/γν\
(CHj)2N H NH3
CH3
(CHj)2N NH1
Η,Ν
HjN
25. Thionin H2N
26. Acndinorange Me2N
27. Pyronin G
V NH2
NMe2
Me2N
NMe2
Me2N Me2N
NMe2
NMe2
30
45
NH-CH2-CH2-NH2
I OCH3
Cl
wobei in den obigen Formeln Me für die Methylgruppe steht.
33. Ethidiumbromid
NH2
CH2-CH3
Die erfindungsgemäß bevorzugten basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner sind jedoch Jo Phenylneutralrot der Formel
(CHj)2N
NH2
α H3
und Malachitgrün der Formel
N(CHj)2
Diese Farbstoffe sind an sich bekannt und im Handel erhältlich oder können nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig und beispielsweise in den oben erwähnten Veröffentlichungen von W. Müller und D.M. Crothers (Eur. J. Biochem. 54 (1975) 267 bis 277), W. Müller, H. Bünemann und N. Dattagupta (Eur. J. Biochem. 54 (1975) 279 bis 291) und W. Müller und F. Gautier (Eur. J. Biochem 54 (1975) 385 bis 394) beschrieben sind.
Diese basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner bzw. FarbstofTreste können nach Methoden, die dem Fachmann ohne weiteres geläufig sind, kovalent an das Trägermaterial gebunden werden, beispielsweise durch Veresterung mit an dem Trägermaterial vorhandenen Hydroxylgruppen über in das FarbstofTmolekül eingeführte Carboxylgruppen, durch Amidbildung, durch Urethanbildung oder auch durch Copolymerisation in Abwesenheit und vorzugsweise in Gegenwart von anderen copolymerisierbaren Monomeren übercopolymerisierbare Doppelbindungen, die in das FarbstofTmolekül eingeführt sind, beispielsweise über eine Acrylamidgruppe, wie es für die erfindungsgemiiU bevorzugten basen- und/oder slrukturspezilischen Komplexbildner
IU
Acryl-phenylneutralrot und Acryl-malachitgrün der folgenden Formeln der Fall ist. Diese genannten Bezeichnungen sind Trivialnamen, die exakte Bezeichnung lautet Acryloylaminophenylneutralrot und Acryloylaminomalachitgrün.
CH = CH2
(CHj)2N
N(CHj)2
Diese basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner können von dem Fachmann in an sich bekannter Weise durch Einrühren des Acrylrestes in die genannten FarbstofTmoleküle hergestellt werden. Dies gilt auch für die weiter oben genannten Farbstoffmoleküle.
Die Bezeichnung Acryl-Rest ist in den vorliegenden Fällen gleichbedeutend mit Acryloyl-Rest.
Bevorzugt erfolgt die Herstellung jedoch nach den in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Verfahren. Die Acryloyl-FarbstofTe sind neu.
Erfindungsgemäß verwendet man als polymeres Trägermaterial vorzugsweise ein kleinporiges, wenig komprimierbares polymeres Trägermaterial, wie Poly-bisacrylamid. Diese kleinporigen und wenig komprimierbaren polymeren Trägermaterialien haben sich für die Affinitätschromatographie von hochviskosen Nukleinsäurelösungen als sehr vorteilhaft erwiesen. Weiterhin zeigen diese polymeren Trägermaterialien keine starken Wechselwirkungen mit den affinen Resten bzw. mit den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildnern für Nukleinsäuren, die entweder direkt oder über polymere Spacer an die polymeren Trägermaterialien gebunden werden.
Als vorteilhaft, hat es sich erwiesen, zwischen dem polymeren Trägermaterial und dem basen- und/oder spezifischen Komplexbildner einen längeren Spacer, das heißt eine längere Molekülkette ohne funktioneile Gruppen einzuführen, da hierdurch die Komplexbildung des basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildners mit der helicalen Nukleinsäure durch sterische Hinderung nicht beeinträchtigt wird.
In besonders bevorzugter Weise ist daher bei dem erfindungsgemäüen Adsorbens der für die Nuk'einsäure affine Rest bzw. der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner über ein Copolymeres, das vorzugsweise einen Polymerisationsgrad von 200 bis 300 aufweist, an das polymer: Trägermaterial gebunden. Zur Bildung dieses Copolymeren verwendet man vorzugsweise ein weiteres Monomeres, das mit der für die Polymerisation in den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner eingeführten Gruppe und den an dem polymeren Trägermaterial vorliegenden, copolymcrisierbaren Gruppen «!polymerisierbar ist.
Vorzugsweise verwendet man als dieses weitere Monomere Acrylamid, und pfropft die genannten acrylgruppenhaltigen Farbstoffe auf ein Poly-bisacrylamid auf, das noch freie, copolymerisierbare Doppelbindungen aufweist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der genannten Adsorbentien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zunächst durch Polymerisation oder durch Polykondensation mindestens eines Monomeren, das zusätzlich zu der für die Polymerisation oder die Polykondensation erforderlichen funktionellcn Gruppe eine weitere funktionclle Gruppe aufweist, über die der für die Nukleinsäure affine Rest direkt oder über einen polymeren Spacer gebunden werden kann, in an sich bekannter Weise das polymere Trägermaterial bildet, das polymere Trägermaterial gegebenenfalls zu der gewünschten Teilchengröße zerkleinert und dann den fiir die Nukleinsäure affinen Rest entweder direkt oder durch Copolymerisaiion in Gegenwart mindestens eines weiteren Monomeren als Copolymeres aufpfropft.
10 15 20 25 30 35 40 45
50
55
60
65
Das Aufpfropfen kann in beliebiger Weise, beispielsweise durch Veresterung, durch Amidbildung oder durch Urethanbildung, erfolgen, wozu man übliche Reagenzien und übliche Verfahrensbedingungen anwendet bzw. die für diese Reaktionen geeigneten Gruppen in das polymere Trägermaterial bzw. den für die Nukleinsäure affinen Rest einfuhrt.
S Man kann jedoch auch den für die Nukleinsäure affinen Rest, in den man eine copolymerisierbare Doppelbin- ,
dung eingeführt hat, in Gegenwart eines Überschusses eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren als Copolymeres auf Poly bisacrylamid aufpfropfen, da Polybisacrylamid noch freie, copolymerisierbare Doppelbindungen aufweist. Die Pfropfcopolymerisation kann in Wasser oder irgendeinem inerten organischen Lösungsmittel und in Gegenwart eines üblichen Polymerisationskatalysators durchgeführt werden.
Vorzugsweise verwendet man als copolymerisierbaren, für die Nukleinsäure affinen Rest Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün und als weiteres copolymerisierbares Monomeres Acrylamid, wobei man ein Copolymeres aus diesen Bestandteilen auf Polybisacrylamid aufpfropft. Gemäß einer bevorzugten Arbeitsweise pfropft man ein Copolymeres aus Acrylamid und Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün mit einem Polymerisationsgrad von 200 bis 300 auf. Γ'
is Bei dieser Pfropfcopolymerisation arbeitet man vorzugsweise bei einem Verhältnis von dem eine copolymer!- £ sierbare Doppelbindung aufweisenden, für die Nukleinsäure affinen Rest zu dem weiteren copolymerisierbaren ;| Monomeren von 1: 100 bis etwa 1 :5000 wobei man diese Reaktion vorzugsweise bei einem Verhältnis von ί$ 1 :3000 durchführt. Hierbei hat sich gezeigt, daß das molare Ausgangsverhältnis des weiteren Monomeren zu g dem eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden, für die Nukleinsäure affinen Rest auch in dem ';?
Copolymeren erhalten bleibt. Bei einem mittleren Polymerisationsgrad des Copolymeren von 200 bis 300 kann ;· man davon ausgehen, daß die aufgepfropften Copolymerketten jeweils nur einen für die Nukleinsäure affinen ψ. Rest tragen. Die Copolymeren bilden somit Spacer unterschiedlicher Länge zwischen dem für die Nukleinsäure affinen Rest und dem polymeren Trägermaterial, insbesondere den Poly-bisacrylamid-Teilchen. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Adsorbenticn die gesetzten Anforderungen erfüllen und ohne weiteres synthetisch in einfacher Weise gewonnen werden können. Beispielsweise erhält man das polymere Trägermaterial durch Polymerisation von Bisacrylamid in hochkonzentrierter Lösung. Das Polymerisationsprodukt ist ein spröder, farbloser Festkörper, der sehr leicht zu gut sedimentierenden Scherben zerrieben werden kann, die durch mehrfache Siebung bis zur gewünschten Partikelgröße homogenisiert werden können. Das Quellverhalten in wäßriger Lösung ist auch bei extremen Salzkonzentrationen konstant und von der Durchfluß-
geschwindigkeit bei der Chromatographie praktisch unabhängig. Da diese Teilchen noch eine Vielzahl nicht ,
umgesetzter, polymerisierbarer Doppelbindungen enthalten, können sie, wie oben bereits erläutert wurde, für die weitere Pfropfpolymerisation eingesetzt werden.
So erhält man mit dem Adenin-Thymin-spezifischen Acryl-malachitgrün und mit dem Guanin-Cytosin-spezifischen Acryl-phenylneutralrot mit Acrylamid in Gegenwart dieser Poly-bisacrylamid-Teilchen durch Copolymerisation in wäßriger Lösung die erfindungsgemäß bevorzugten Adsorbentien. Dabei werden 40 bis 50% der gebildeten Copolymeren mit einem mittleren Polymerisationsgrad von ca. 200 unter üblichen Reaktionsbedingungen in Form von Pfropfcopolymeren an die Trägerpartikel aus dem Poly-bisacrylamid gebunden. Nach dem gründlichen Spülen geben die stark gefärbilen Adsorbens-Teilchen keinen Farbstoff mehr ab und können dann direkt für die Affinitätschromatographie von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Üblicherweise wird das Nukleinsäuregemisch in 0,01 m Phosphalpuffer an das Material adsorbiert und mit einem linearen Salzgradienten desorbiert. Die Art des Salzes hängt von der Art der Nukleinsäuren ab. Während für die Desorption von Ribonukleinsäuren, einschließlich der Transfer-Ribonukleinsäuren, Natriumchlorid ausreicht, ist für die basenspezifische Elution von DNA von Acryl-malachilgrünhaltigen Adsorbentien Perchlorat erforderlich.
Es hat sich gezeigt, daß es zur Herstellung des Trägermaterials auch möglich ist, von unlöslichen Materialien mit Hydroxy- bzw. Aminogruppen auszugehen, die in Perlform vorliegen, wie z. B. Aminoalkylsepharose, mikrokristalline Cellulose, vernetztes Hydroxyäthylmethacrylat oder Epoxypropylacrylat. Bei diesen Trägern werden die zur nachträglichen Pfropfung notwendigen Acrylgruppen durch Umsetzung mit Acryloylchlorid eingeführt. Es kann so eine ähnlich hohe Beladung mit Farbstoff erzielt werden wie bei der Pfropfung aus
so Acrylamidscherben.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der genannten Adsorbentien zur Auftrennung von Nukleinsäuren durch Zweiphasen-Affinitätsverteilung, durch Zweiphasenverteilungschromatographie, durch Gelelektrophorese und insbesondere durch Affinitätschromatographie. Mit Vorteil lassen sich diese Adsorbentien für die Auftrennung von Gemischen von einsträrigigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, ins- ; besondere von DNA-Gemischen einsetzen.
Da die erfindungsgemäßen Adsorbentien, die basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner auf der Grundlage von 5-Phenylphenazoniumsalzen tragen, für Guanin-Cytosin-reiche DNA spezifisch wirken und die 2j erfindungsgemäßen Adsorbentien, die basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner auf der Grund- P1 lage von Triphenylmethanfarbstoffen für Adenin-Thymin-reiche DNA spezifisch wirken, lassen sich die ^
gewünschten basen- und/oder strukturspezifischen bzw. sequenzspezifischen Trennungen von Nukleinsäure- ψ
gemischen durchführen. fc
Als vorwiegend strukturspezifische Komplexbildner kommen die zur Intercalation befähigten Verbindungen ρ
in Frage. Unter Intercalation versteht man insbesondere eine spezielle Wechselwirkung von Farbstoffmole- g
külen mit DNA, wobei sich das Farbstoffmolekül zwischen zwei benachbarte Basenpaare der DNA-Doppel- ^ helix schiebt Welche Substanzen von der Struktur her intercalierungsfähig sind, ist dem Fachmann geläufig. Es ζ: handelt sich um pianare, elektronenreiche Chromophore. Es sind vor allem die Reste von planaren poly- j' cyclischen, wie bi-, tri- oder tetracyclischen kondensierten Ringsystemen, welche Heteroatome wie Stickstoff, lit Sauerstoff und Schwefel enthalten können, zu verstehen. iß
12 S
Der Effekt kann erhöht sein, wenn, wie z. B. im Fall des Ethidiumbromids und des 9-(Acryloylaminoäthylamino)-2-methoxy-6-chlor-acridins, eine Aminogruppe am Ringsystem vorhanden ist. die eine Bindung an die Phosphatgruppen der DNA ermöglicht. Es ist für den Fachmann leicht, entsprechend brauchbare Verbindungen einzusetzen, wie beispielsweise Acridine, Benzacridine, Phenanthrene, Phenantridine, Pyridoindole, Naphthaline, Naphthothiophene, Benzothiophene, Thianthrene, Xanthine, Phcnoxanthine, Chinoline, Chinoxaline, Phenanthroline, Phenothiazine, Phenoxazine, Phthalazine usw.
Acridin-Derivate, beispielsweise das 9-(Acryloylamino-äthyl-amino)-2-methoxy-6-chlor-acridin oder Phenanthridin-Derivate, beispielsweise Ethidiumbromid (S-Äthyl^S-diamino-o-phenyl-phenanthridiumbromid) trennen nach ihrer Kupplung an Bisacrylamidpartikel basenunspezifisch doppelsträngige DNA von supercoiled DNA (Elutionsdiagramm Fig. 7). Dies ist sehr wichtig fur eine einfache Abtrennung von Piasmid und Viren-DNAs aus Zellaufschlüssen. Die Säule ersetzt den aufwendigen Ethidiumbromid-Cäsium chlorid-Uradienten. Diese trennung ist auch mit der Acryloylaminophenylneutralrot-Säule möglich, da beide Farbstoffe mit der DNA einen Komplex ähnlicher Struktur (Intercalation-Komplex) bilden. Das Acryloylaminophenylneuirslrct trennt sowohl struktur- als auch basenspezifisch. Jc nach dem anstehenden Trennprobieni ist daher eine Reihe von Variationen bezüglich der Zusammensetzung des Adsorbens möglich.
Da die basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner über eine stabile kovalente Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gebunden sind, können die erfindungsgemäßen Adsorbentien auch bei extremeren pH-Werten eingesetzt werden, mit Detergentien gewaschen und mit Salzlösungen regeneriert werden. Weiterhin ist der Einbau mehrerer verschiedener basen- und/oder strukturspezifischer Komplexbildner oder Monomerer möglich, so daß Adsorbentien gebildet werden können, die zur Auftrennung von Transfer-Ribonukleinsäuren genutzt werden können. Die Kette η lange der aufgepfropften Copolymeren und damit die Länge der Ketten zwischen dem polymeren Trägermaterial und dem basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner kann in üblicher Weise durch Mercaptoäthanol gesteuert werden.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung weiter anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert.
In den Zeichnungen zeigt
Fig. 1 ein Schema für die Herstellung erfindungsgemäß besonders bevorzugter Adsorbentien durch die beanspruchte zweistufige Polymerisation;
Fig. 2 das Eli'tionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten, bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Adsorbens;
Fig. 3 das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten, bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren, das unter Verwendung eines weiteren erfindungsgemäßen Adsorbens erhalten wurde;
Fig. 4 das Elutionsdiagramm eines EcoRI-Hydrolysats von A-Phagen-Desoxyribonukleinsäure, das unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Adsorbens erhalten wurde;
Fig. 5 das Elutionsdiagramm, das unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Adsorbens bei der Trennung eines DNA-RNA-Gemisches aus einem Aufschluß von M.lutsus erhalten wurde; und
F i g. 6 das Elutionsdiagramm eines Gemisches aus vier verschiedenen Transfer-Ribonukleinsäuren aus Hefe, das mit einem erfindungsgemäßen Adsorbens erhalten wurde.
Fig. 7 das Elutionsdiagramm für die Trennung von supercoiled und linearer DNA.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
A) Herstellung des Poly-bisacrylamid-Trägermaterials
Man suspendiert 50 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid in 100 ml Methanol in einem hohen 1-Liter-Polyäthylenbecherglas und versetzt mit 200 ml kochendem, bidestilliertem Wasser. Während des Rührens der Mischung mit dem Magnetrührergeht das Bisacrylamid vollständig in Lösung. Zu der auf 600C abgekühlten und intensiv gerührten Lösung pipetiiert man zunächst 1 rnl Ν,Ν,Ν',Ν-Teirameihyiäihyiendiamin und gibt dann in einem Guß eine Lösung von 0,2 g Ammoniumperoxydisulphat in 5 ml Wasser zu. Sofort nach dem Durchmischen stellt man den Rührer ab. Die Lösung trübt sich nach wenigen Sekunden und erstarrt unter Erhitzen zu einem farblosen Block. Die Polymerisation wird nach etwa 1 Minute abgebrochen, indem der Polymerblock mit einem großen Spatel rasch grob zerkleinert wird. Die Bruchstücke werden in einem 2-Liter-Polyäthylenbecherglas in 11 Methanol suspendiert und zu einem körnigen Brei verrieben. Zur weiteren Homogenisierung der Par- SS tikel reibt man den Brei nacheinander durch Siebe mit abnehmender Maschengröße (1 mm X 1 mm, 0,5 mm x 0,5 mm und 0,25 mm x 0,25 mm). Die entstandenen Scherben läßt man sedimentieren, worauf man den milchig-trüben Überstand abdekantiert. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt, und zwar zunächst mit Methanol, dann mit einer Methanol/Wasser-Mischung, anschließend mit einer l%igen Essigsäurelösung und schließlich erneut mit destilliertem Wasser. Die erhaltenen Polybisacrylamidteilchen werden in wäßriger Lösung gelagert und können jederzeit für die im folgenden beschriebene Pfropfcopolymerisation verwendet werden.
Aus 300 ml der Polymerisationslösung erhält man etwa 300 ml abgesetzte Polybisacrylamidteilchen.
B) Aufpfropfen eines Copolymeren aus Acrylamid und Acryl-phenylneutralrot auf das in der Stufe A erhaltene Polybisacrylamid
Man suspendiert 60 ml der in der Stufe A erhaltenen, abgesetzten Polybisacrylamidteilchen in einer Flasche mit Schraubverschluß in 20 ml destilliertem Wasser. In dieser Suspension löst man 5 g Acrylamid und 10,3 mg
ff Acryl-phenylneutralrot-chlorid, wozu man die Suspension in der Flasche vorsichtig schüttelt, bis sich der Farb-
'■' stofi vollständig gelöst hat. Die Copolymerisation wird dann durch Zugabe von 0,050 ml Mercaptoäthanol zur
H Einstellung des Polymerisationsgrades und I ml einer Natriumperoxidlösung (0,8 g Natriumperoxid in 100 ml
§ 1 m Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5) als Katalysator gestartet. Die gebildete Suspension wird Ι 5 sofort noch während 5 Minuten mit Stickstoff begast und dann unter Luftabschluß bei Raumtemperatur
I gehalten. Nach etwa 30 Minuten hat sich die Reaktionsmischung deutlich erwärmt, und nach ca. 2 Stunden I ist die Polymerisation im wesentlichen beendet. Man läßt noch einige Stunden stehen, bevor man die viskose I Suspension in eine Nutsche überfuhrt. Man saugt die viskose, tiefgefärbte Lösung ab und wäscht die auf der
Ϊ Nutsche zurückbleibenden, stark gefärbten Teilchen gründlich mit Wasser, bis die Waschlösung auch bei Ver-I IO wendung einer l%igen Essigsäurelösung farblos bleibt. Nach einer abschließenden kontinuierlichen Spülung
ί mit einem 0,01 m Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 über Nacht kann man das Material für die
tjs Affinitätschromatographie von Nukleinsäuren verwenden.
Π Die Bestimmung der Ausbeute erfolgt bei Acrylamid durch eine HC-Markierung und bei dem Farbstoff über
: die optische Dichte. Die Ausbeuten sind die folgenden:
I Farbstoff: Einbau in. das Copolymere
ν (gebunden und nicht gebunden) 60,5 %
-] Acrylamid: Einbau in das Copolymere
;■ (gebunden und nicht gebunden) 49,2%
ν Farbstoff: Einbau in das gebundene Copolymere,
[y bezogen auf die Summe 51,0%
$ Acrylamid: Einbau in das gebundene Copolymere,
J$ bezogen auf die Summe 57,0%
p Es ist festzustellen, daß das molare Ausgangsverhältnis von Farbstoff zu Acrylamid (1 : 3000) auch in den
Copolymeren erhalten bleibt. Da der mittlere Polymerisationsgrad des Copolymeren zu 200 bis 300 ermittelt ■■; wurde, kann davon ausgegangen werden, daß die Copolymerketten jeweils nur ein Farbstoffmolekül pro Kette
κ- tragen.
30 Das oben beschriebene Verfahren wird schematisch durch die Fig. 1 erläutert.
,Üj Beispiel 2
H Auftrennung von Nukleinsäuregemischen durch Affinitätschromatographie
R }. an erfindungsgemäßen Adsorbentien
H Wie die in den Fig. 2 bis 6 dargestellten Elutionsdiagramme zeigen, ist die Anwendungsmöglichkeit der
j| erfindungsgemäßen Adsorbentien auf dem Gebiet der Nukleinsäurefraktionierung sehr vielseitig. Je nach der
I Basenspezifität des gebundenen Farbstoffs werden Gemische von doppelsträngigen Nukleinsäuren entspre
chend ihrer Basenzusammensetzung aufgetrennt.
40 So zeigt die Fig. 2 das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 700 000 D mit unterschiedlicher Basenzusammensetzung. Hierzu wurde eine Säule mit den Abmessungen 16 cm x 1,5 cm verwendet, die als Adsorbens auf Polybisacrylamidteilchen aufgepfropfte Acrylmalachitgrün-acrylamid-Copolymere enthält. Die eingesetzte Desoxyribonukleinsäuremenge beträgt ca. 1 mg.
45 Die Fig. 3 zeigt das Elutionsdiagramm einer Mischung von drei gescherten bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 700 000 D, die eine unterschiedliche Basenzusammensetzung aufweisen. Zur Elution von 1 mg der Nukleinsäuremischung wurde eine Säule mit den Abmessungen 15,2 cm x 1,5 cm verwendet, die als Adsorbens Bisacrylamidteiichen enthält, auf die Acrylphenylneutralrot-acrylamid-Copolymere aufgepfropft sind.
so Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Adsorbentien können auch DNA-Fragmente, die durch Einwirkung von Restriktionsendonukleasen gewonnen wurden, fraktioniert werden. Dies ist in der Fig. 4 gezeigt, die das ElutiünSdiägrämfü eines Ecü-RI-Hydroiysais von A-Phagcn-DcSüXyfiböfiükieinsäure Wiedergibt, das in einer Menge von 0,5 mg unter Verwendung einer Säule mit den Abmessungen 15,8 cm x 1,5 cm getrennt wurde, die als Adsorbens Polybisacrylamidteilchen enthält, auf die Acrylmalachitgrün-acrylamid-Copolymere
55 aufgepfropft sind.
Die Bezeichnung der DNA-Fragmente im eingeschobenen Bild einer geielektrophoretischen Trennung für die einzelnen Fraktionen im Vergleich zum Ausgangsmaterial entspricht der Bezeichnung in der Arbeit von Thomas und Davis im J. Mol. Biol. 91, 315-328 (1975).
Auch die Abtrennung von Ribonukleinsäuren von den Desoxyribonukleinsäuren des gleichen Organismus
60 gelingt mit den erfindungsgemäßen Adsorbentien glatt, wie aus der Fig. 5 zu ersehen ist. In dieser Fig. 5 ist das Elutionsdiagramm eines DNA-RNA-Gemisches aus einem Aufschluß von M.luteus (72% G +C) gezeigt, wobei das Gemisch in einer Menge von 1 mg mit Hilfe einer Säule mit den Abmessungen 16,2 cm X 1,5 cm getrennt wurde, welche Säule mit Polybisacrylamidteilchen beschickt ist, auf die Acrylmalachitgrün-Copolymere aufgepfropft sind.
65 Die Fig. 6 zeigt das Elutionsdiagramm für ein Gemisch aus vier verschiedenen, aus Hefe gewonnenen Transfer-Ribonukleinsäuren. Bei dem in einer Menge von 1,5 mg getrennten Gemisch handelt es sich um ein Gemisch aus t-RN A1**, t-RN ALys, t-RN AO|U und t-RN A(ily. Für die Affinitätschromatographie wurde eine Säule
14
mit den Abmessungen 16 cm χ 1,5 cm verwendet, die mit Polybisacrylamidteilchen beschickt wurde, auf die Acrylphenylneutralrot-acrylamid-Copolymere aufgepfropft sind.
Die Fig. 7 zeigt das Eiulionsdiagramm für die Trennung von supcrcoilcd und linearer DNA. Für die Affinitätschromatographie wurden Polybisacrylamidteilchen verwendet, wobei 9-(AcryloylaTiino-äthyl-amino)-2-methoxy-6-chlor-aeridin-Teilchen aufgepfropft sind.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Adsorbentien zur Auftrennung von Nukleinsäuregemischen durch Affinitätschromatographie, wie sie oben beschrieben wurde, verwendet man als Elutionsmittel wäßrige Salz-Konzentrationsgradienten, wozu man als Salze vorzugsweise Alkalimetallsalze, wie Natriumchlorid, Natriumperchlorat, Lithiumperchlorat etc. verwendet. In gewissen Fällen können auch Puffer verwendet werden, beispielsweise Phosphatpuffer, wobei man für Adsorptionsmittel, die als basenspezifischen Komplex· bildner den Rest von Malachitgrün enthalten, einen schwach sauren Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6 verwendet, beispielsweise einen 0,01 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6.
Die fiir die Erzielung optimalen Salzgradienten, ihre Bestandteile, Konzentrationen, pH-Werte und die dafür verwendeten Puffer können jedoch vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden.
Zusammenfassend ist also festzustellen, daß die erfindungsgemäßen Adsorbentien hervorragend geeignet is sind fiir die affinitätsspezifischc Trennung von Nukleinsäuregemischen. Diese Adsorbentien lassen sich in einfacher Weise herstellen und in bezug auf ihre Basenspezifität gezielt einstellen.
Beispiel 3
Herstellung von Acryloylamino-malachitgrün
a) 15,1 g (0,1 Mol) 4-Nitro benzaldehyd und 36,3 g = 38 ml (0,3 Mol) Ν,Ν-Dimethylanilin und 40,5 g Zinkchlorid (wasserfrei) werden gemischt und auf 1000C Badtemperatur erhitzt. Die anfangs leicht bewegliche Mischung wird im Laufe der Reaktionszeit zu einer festen, grünen Masse, die nicht mehr rührbar ist. Nach 5 Stunden Reaktionszeit läßt man abkühlen. Das Produkt wird in 150 ml Aceton aufgenommen, wobei nach einiger Zeit unter Rühren das Produkt gelöst und Zinksalz ausgeschieden wird. Das unlösliche Salz wird abgesaugt, mit Aceton gewaschen und das Filtrat mit so viel Wasser versetzt, bis Kristallisation eintritt. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Wasser, Isopropanol und Äther gewaschen. Ausbeute: 28,7 g (76,6% d. Th.); Fp. 168°C (die Substanz ist lichtempfindlich).
b) 3,75 g (0,01 Mol) der nach 1 a) erhaltenen Nitroverbindung werden in 200 ml Eisessig (99%) und 20 ml Wasser gelöst und mit 4 g Zinkchlorid versetzt. Anschließend werden unter Rühren und Kühlen bei Raumtemperatur (20-300C) 20 g Zinkstaub portionsweise zugegeben. Es wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, danach das überschüssige Zink abgesaugt und mit Eisessig gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 500C eingedampft, der Rückstand in 150 mi Chloroform und 100 ml Wasser gelöst und getrennt, anschließend wird die Chloroform-Phase mit 80 ml 2 n-Natriumcarbonat-Lösung und 100 ml Wasser geschüttelt. Die Chloroform-Phase wird abgetrennt und mit Natriumsulfat getrocknet und filtriert, sodann auf etwa 100 ml im Vakuum bei 500C eingeengt und direkt weiter umgesetzt (schwach violette Lösung).
Ic) Die erhaltene 100 ml Chloroform-Lösung der Aminoverbindung werden mit 50 ml Methanol versetzt. Es werden 10 g Natriumcarbonat (wasserfrei) und eine Spalelspilze 1,3-Dinilrobenzol zugegeben und anschließend unter Rühren und Eiskühlung (0°C-5°C) 1,81 g = 1,65 ml Acryloylchlorid (zweifache Molmenge) tropfenweise zugegeben. Die Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, danach wird das Natriumcarbonat abgesaugt und das Filtrat im Vakuum bei 35-4O0C eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Chloroform und 50 ml Wasser aufgenommen und geschüttelt, die Chloroform-Phase wird abgetrennt, mit 50 ml Wasser nachextrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 35-400C eingedampft. Der ölige, grünliche Rückstand wird mit 20 ml Isopropanol angerieben und zur Kristallisation kühlgestellt. Das Kristallisat wird abgesaugt, mit Isopropanol und Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute über die Stufen 1 b und 1 c: 2,9 g (72,7% d. Th.); Fp. 175°C. C, H, N-Analyse: ber. C 78,2 H 7,27 N 10,52;
gef. C 75,9 H 7,21 N 9,999.
NMR-Spektrum (Hexadeuterodimethylsulfoxid): 5J
CH3-(N-Methyl) S 2,83 PPM, =CH-(Acryl) Q 5,7 PPM, CH2= (Acryl) P 6,3 PPM, aromatische Protonen zwischen 6,5 und 7,5 PPM.
Id) 250 mg (0,001 Mol) Chloranil werden in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,4 g (0,001 Mol) Acryloylverbindung (1 c) versetzt. Die Lösung wird sofort blau und nach ca. 2 Stunden Stehen bei Raumtemperatur tritt Kristallisation ein. Es wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, danach das Kristallisat abgesaugt, mit Tetrahydrofuran und Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird wieder in Wasser aufgenommen, mit HCl neutralisiert und dann mit Essigester ausgeschüttelt. Das saubere Produkt wird durch Zugabe von Natriumchlorid aus der wäßrigen Lösung ausgefallt
Ausbeute: 0,335 g (84,2 % d. Th.). 6S
Im NMR-Spektrum von 1 d) ist im Vergleich zu 1 c) eine Verschiebung des N-Methyl-protonsignals auf 3,3 PPM zu beobachten.
Beispiel 4
Herstellung von Acryloylaminophenylneutralrot
la) 6,9g (0,05 Mol) 4-Nitro-anilin werden in 150 ml Tetrahydrofuran/Chloroform 1 : 1 gelöst, mit einer Spatelspitze 1,3-Dinitrobenzol und 8 ml Triethylamin versetzt. Unter Rühren werden bei 10-20*C langsam 9 ml (0,1 Mol) Acryloylchlorid zugetropft. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei Triäthylammoniumchlorid auskristallisiert. Dann wird im Vakuum bei 50 *€ das Tetrahydrofuran-Chloroform-Gemisch abgedampft, der Rückstand mit Wasser angerieben, abgesaugt und mit
ίο Wasser, Isopropanol und Äther gewaschen. Das Produkt wird im Vakuum bei 50 0C getrocknet
b) 2,5 g Acryloylverbindung 2 a werden in 60 m! Tetrahydrofuran unter Rühren bei 50 *C gelöst und mit 60 ml Eisessig (99%) verdünnt und auf 30 "C abgekühlt Anschließend werden portionsweise 10 g Zinkstaub zugegeben, wobei die Temperatur unter Eiskühlung auf 35-40"C ansteigt Danach wird 10 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt, das überschüssige Zink abgesaugt und mit Eisessig gewaschen.
is Das Filtrat wird im Vakuum bei 45 9C eingedampft. Der ölige Eindampfrückstand ist chromatographisch
praktisch rein und wird so zur nächsten Reaktion eingesetzt.
Ic) Eine Lösung von 4,2g (0,02 Mol) Ν,Ν-DimethyI-p-phenylendiammoniumdichlorid und 2,SSg (0,02 Mol) o-Toluidiniumchlorid in 400 ml H2O werden langsam unter Rühren bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 12 g Natriumchromat (0,04 Mol) in 100 ml Wasser versetzt. Das ausgeschiedene grüne
Produkt wird nach 15 Minuten abgesaugt, dreimal mit Wasser gewaschen, wobei die Waschlösung grün
bleibt, der Niederschlag wird dann sofort weiterverarbeitet, indem er in einer kleineren Menge Wasser „ suspendiert und homogenisiert wird. Die homogene Suspension wird mit Wasser auf 1,6 Liter verdünnt. ·| Nach Zugabe von 1,15 g (0,02 Mol) N-Acryloyl-p-phenylen-dianmoniumacetat in 100 ml Wasser wird $ die Reaktionsmischung mit 130 ml 3 M Natrium-acetat-Lösung auf pH 4,9 gestellt. Anschließend wird die Mischung unter Rühren zum Sieden erhitzt. Die Lösung färbt sich dabei zunächst tiefblau und dann beim Sieden dunkelviolett (zur Vervollständigung der Reaktion 5 Minuten kochen lassen). Anschließend wird die siedend heiße Lösung über eine Nutsche abgesaugt, das Filtrat (ca. 2 1) mit 240 g Natriumchlorid auf 2 m Lösung eingestellt und über Nacht im Kühlraum stehengelassen. Das ausgefallene Kristailisat wird abgesaugt und im Exsikkator getrocknet (es darf nicht mit Wasser gewaschen werden, da die Substanz leicht in Wasser löslich ist).
Ausbeute: 2,4 g Rohprodukt.
Zur weiteren Reinigung werden 1,3 g des Rohprodukts in 25 ml Methanol und 0,1 M Natriumchlorid (4 : 1) gelöst und auf eine Kieselgel 60-Säule (4 x 95 cm) aufgetragen. Es wird dann mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert (Fraktionsvolumen = 20 ml). Fraktionen 22-55 werden vereinigt und im Vakuum auf ca. 15 ml eingeengt. Das Kristailisat wird abgesaugt, mit wenig 0,1 M Natriumchlorid gewaschen und im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute: 0,665 g chromatographisch reiner Farbstoff.
Beispiels
Herstellung von 9-(Acryloylamino-äthylamino)-3-chlor-7-methoxy-acridin
mg 3,9-Dichloro-7-methoxy-acridin werden mit I ml Äthylendiamin und 7,7 g Phenol 30 Min. lang im Ölbad auf 6O0C erhitzt, die Schmelze wird in 200 ml Chloroform und 150 ml Wasser aufgenommen, auf pH 4 mit Essigsäure eingestellt und äquilibriert. Die organische Phase wird 3-4 mal mit 0,1m Natriumacetatpuffer nachextrahiert und dann verworfen.
Die wäßrigen Extrakte werden auf pH 9,5 mit Sodalösung eingestellt, mit Chloroform-n-Butanol (20: 1) extrahiert, die organische Phase über Siliconparier nitriert und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in so 0,1 m Natriumacetatpuffer gelöst, Reste von dimerisiertem Produkt abfiltriert und die Lösung auf pH 10 eingestellt. Nach 1 Std. bei Zimmertemperatur wird das Präzipitat abfiltriert, mit wenig verdünnter Ammoniak-Lösung (40C) gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 50-80% d. Th.
mg der erhaltenen Aminoverbindung werden in 25 ml Chloroform in der Wärme gelöst und nach Abkühlen mit 0,3 ml Acrylchlorid versetzt. Die Lösung färbt sich sofort dunkler. Nach einigen Minuten scheidet sich das Acroylderivat ab. Nach dem Absaugen und Waschen mit etwas Chloroform erhält man 122 mg (50% d. Th.) 9-Acryloylamino-äthylamino)-3-chlor-7-methoxy-acridin in chromatographisch reiner Form.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (16)

Patentansprüche:
1. Adsorbens für die affinitätsspeziflsche Trennung von Nukleinsäuren auf der Basis sines polymeren Trägermaterials, dadurch gekennzeichnet, daß an das polymere Trägermaterial ein basen- und/oder strukturspezifischer Komplexbildner für Nukleinsäuren direkt oder über einen polymeren »Spacer« kovalent gebunden ist.
2. Adsorbens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial kleinporig und wenig komprimierbar ist und daß auf dieses Trägermaterial ein Copolymeres aus mindestens zwei mischpolymerisierbaren Monomeren als polymerer »Spacer« aufgepfropft ist, von denen eines den basen- und/ oder strukturspezifischen Komplexbildner fur Nukleinsäuren trägt.
3. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial ais basen· und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren den Rest eines Farbstoffs der folgenden allgemeinen Formeln 1 oder II trägt
(RAN
(D
(RAN
in welchen allgemeinen Formeln
X fur eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom,
Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel
N(RA
R1 unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Methylgruppen,
R2 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,
R3 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,
R. ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und
A ein Anion, wie ein Chloridanion, ein Perchloratanion oder ein Oxalatanion
bedeuten.
4. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner der folgenden Formel entspricht
(CHj)2N
CH,
5. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner der folgenden Formel entspricht
+N(CH3),Cr
6. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Trägermaterial ein Polymeres oder Copolymeres von Monomeren ist, die neben der zur Bildung des Polymeren oder Copolymeren erforderlichen funkllonellen Gruppe mindestens eine weitere funktioneile Gruppe aufweisen, über die der polymere »Spacer« mit dem basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner fur Nukleinsäuren kovalent gebunden werden kann.
7. Adsorbens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Tiägermaterial ein Poly-bisacrylamid ist, an das der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart eines Überschusses eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren durch Copolymerisation aufgepfropft ist.
8. Adsorbens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der eine freie Doppelbindung tragende basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart von Acrylamid durch Copolymerisation über die freien Doppelbindungen des Poly-bisacrylamids kovalent an dieses polymere Trägermaterial gebunden ist.
9. Verfahren zur Herstellung des Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst durch Polymerisation oder Polykondensation mindestens eines Monomeren, das zusätzlich eine funktioneile Gruppe aufweist, über die der basen- und/oder strukturspezifische Komplexbildner
für Nukleinsäuren direkt oder über einen polymeren »Spacer« gebunden werden kann, in an sich bekannter Weise das polymere Trägermaterial bildet, das polymere Trägermaterial gegebenenfalls auf die gewünschte Teilchengröße zerkleinert und dann den basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren entweder direkt oder durch Copolymerisation in Gegenwart mindestens eines weiteren Monomeren als Copolymeres aufpfropft.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren in Gegenwart eines Überschusses eines weiteren copolymerisierbaren Monomeren als Copolymeres auf Poly-bisacrylamid aufpfropft.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Pfropfpolymerisation in Wasser oder einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines üblichen Folymerisationskatalysators durchfuhrt.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden, basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren Acrylphenyl-neutralrot oder Acryl-malachitgrün und als weiteres copolymerisierbares monomeres Acrylamid verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Copolymeres aus Acrylamid und Acryl-phenylneutralrot oder Acryl-malachitgrün mit einem Polymerisationsgrad von 200 bis 300 aufpfropft.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den eine copolymerisierbare Doppel· bindung aufweisenden basen- und/oder strukturspezifischen Komplexbildner für Nukleinsäuren und das weitere copolymerisierbare Monomere in einem Gewichtsverfoältnis von 1 : 100 bis 1 : 5000 einsetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Verhältnis von etwa 1 : 3000 arbeitet.
16. Verwendung der Adsorbentien gemäß einem der Ansprüche 1 -8 zur Auftrennung von Gemischen einsträngiger und/oder zweisträngiger Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen.
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