WO2001059098A9 - Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren

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WO2001059098A9
WO2001059098A9 PCT/EP2001/001134 EP0101134W WO0159098A9 WO 2001059098 A9 WO2001059098 A9 WO 2001059098A9 EP 0101134 W EP0101134 W EP 0101134W WO 0159098 A9 WO0159098 A9 WO 0159098A9
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binding buffer
peg
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Thomas Kolzau
Heinz Gerhard Koehn
Wilhelm Pluester
Mathias Ulbricht
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Eppendorf Ag
Thomas Kolzau
Heinz Gerhard Koehn
Wilhelm Pluester
Mathias Ulbricht
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the invention relates to a method for the purification of nucleic acids from nucleic acid-containing starting material using a porous membrane.
  • the affinity of nucleic acids for the membranes used is generally determined in connection with a special configuration of the membrane surface certain conditions in the buffer system in which the starting material passes the membrane.
  • nucleic acids are bound to hydrophilic membranes, the binding buffer system being an organic solvent, e.g. Isopropanol, is added in high concentration.
  • organic solvent e.g. Isopropanol
  • the object of the invention is to provide a method for the purification of nucleic acids which can be carried out in a simpler manner than the known method.
  • the invention is intended to cover two variants.
  • any membrane can be used.
  • special membranes are used.
  • the first variant provides that a binding buffer is added to the optionally pre-cleaned starting material, the buffer contains polyethylene glycol (PEG) and / or at least one salt in a concentration such that the final concentration in the mixture of starting material and binding buffer is above the value required for the precipitation of nucleic acids, then the mixture of starting material and binding buffer, for example under vacuum or by means of centrifugation can permeate through the membrane, the nucleic acids being selectively retained on the surface or in the pores (depth filter effect) of the membrane.
  • PEG polyethylene glycol
  • the membrane can then be washed in order to remove any non-specifically bound impurities. If desired, the washing step can then be followed by an elution step in which the bound nucleic acids are detached from the membrane again.
  • PEG is particularly preferably used as a precipitant in a final concentration of more than 6% based on the mixture of binding buffer and starting material.
  • the purification of nucleic acids in the presence of PEG 8000 on silica beads is described by Engelstein et al. in Microbial & Comparative Genomics, Vol. 3, No. 4, 1998.
  • the binding buffer used in this publication contains 20% PEG 8000.
  • the PEG 8000 is intended to replace the chaotropic reagents previously required in connection with purification of nucleic acids on silk carriers. At no point is it indicated or described that the mechanism described here would be possible in connection with other carrier materials than silica and also differently made carriers as beads.
  • EP 0512767 mentioned at the beginning determines in the table shown on page 7 that none in the presence of PEG (10% or 20%) DNA was bound to membranes, which speaks against the results of the applicant.
  • Plastic membranes are usually made of e.g. Polypropylene, polyamide, polyester, polysulfone or PVDF are used.
  • the membranes can preferably have pores with a diameter of 0.2-10 ⁇ m, the yield being able to be optimized by the choice of the pore diameter. As the pore diameter decreases, the membrane retention rate increases. However, smaller pores also clog more quickly, so that the pore diameter should not be chosen too small.
  • the membranes are preferably designed so that both surface filter and depth filter effects occur.
  • the selected binding conditions should basically ensure that the nucleic acid molecule is in a compressed form, since this enables optimized retention on and in the membrane.
  • the membranes used in the purification processes are functionalized with deprotonatable groups, in particular with sulfonic acid, carboxylic acid or phosphoric acid groups.
  • the nucleic acid-containing starting material is allowed to pass through the membrane functionalized in this case in a binding buffer, the binding buffer containing a precipitant for nucleic acids.
  • the membrane can then optionally be washed and the nucleic acids can then be eluted from the membrane. It is provided that the precipitant is present in the mixture of binding buffer and starting material in a concentration which is above the value required for the precipitation of nucleic acids.
  • the nucleic acids precipitate in the presence of the binding buffer. If the binding buffer starting material mixture is then sucked through the membrane, the nucleic acids adhere to the membrane.
  • a precipitant e.g. Salt, PEG or isopropanol are used, to name just a few particularly suitable examples which do not restrict the invention.
  • nucleic acids are bound in the presence of PEG to magnetic microparticles whose surface is functionalized.
  • the method described here is specially tailored to magnetic beads, which require more complicated handling than the membranes used according to the invention.
  • Another disadvantage is that beads require higher elution volumes than membranes.
  • the functionalized groups are bound to polymer chains, one end of which is fixed to the surface of the membrane and the other end of which is free to move.
  • These polymer chains significantly increase the retention properties of membranes for nucleic acids.
  • the polymer chains align differently with the membrane depending on the external environment; If the pH is rather alkaline or neutral and / or the ion concentration is low, the polymer chains protrude from the membrane to a greater or lesser extent. If the pH is reduced and / or the ion concentration is increased, the polymer chains attach to the membrane.
  • the highest retention rate of the membrane for nucleic acids is when the polymer chains protrude from the membrane but are not fully stretched (tentacle structure). Under these conditions that arise when e.g. If there are higher ion concentrations or higher PEG concentrations, the nucleic acid molecule is also in a compressed form, in which it is retained particularly effectively in the tentacle structure.
  • polymer chains e.g. Polyacrylic acid or the like can be used.
  • the membranes preferably have pores with a diameter of 0.2-10 ⁇ m, the yield being able to be optimized by the choice of the pore diameter.
  • the nucleic acids adhering to the membrane can be eluted with buffers of low ion concentration or with water at room temperature.
  • the buffer used is sucked or pressed through the membrane.
  • a possible washing step between binding and elution can be carried out in the same way with e.g. Ethanol or the like.
  • conditions are preferably set in which the polymer chains protrude from the membrane as fully stretched as possible and the Small acid molecule is also in a stretched form. Under these conditions, which arise, for example, when using the elution buffer specified above, a particularly good detachment of the nuclear acid molecule from the membrane is possible.
  • all buffers or mixtures used can be sucked through the membrane under vacuum or e.g. press through by centrifugation.
  • the method is preferably carried out with membranes which are arranged in microtiter filter plates, spin columns or reaction vessels.
  • Example 1 a) Modification of polypropylene membranes
  • a nylon microfiltration membrane (Schleicher & Schüll, nominal pore size 0.45 ⁇ m, membrane thickness 127 ⁇ m) is modified under the same conditions as in a).
  • the surface-modified membranes produced according to Examples 1 a and b were clamped in a 96 microfiltration plate.
  • BP1 binding buffer
  • the cleaning takes place by means of centrifugation steps (3000 rpm) according to the principle: bind-wash-elute.
  • Surface-modified PP with a nominal pore size of 0.45 ⁇ m is used as the base material for this experiment.
  • the semi-quantitative evaluation of 4 ⁇ l eluate is carried out by means of ethidium bromide gel electrophoresis (not shown).
  • Example 3 A pDNA purification is carried out on the principle of alkaline lysis.
  • bacteria from 1.5 ml of bacterial culture are centrifuged and the buffers P1-P3 (P 100 ⁇ l, P2: 300 ⁇ l, P3: 300 ⁇ l) from the “Perfect Prep Plasmid Midi” kit from Eppendorf are added. After centrifugation, the clear lysate is mixed with 700 ⁇ l binding buffer (see Table 1). The sample is worked up under the conditions listed in Example 1.
  • a plasmid preparation is carried out by performing the complete purification procedure using the “Perfect Prep Plasmid Mini” kit from Eppendorf, from the identical 1.5 ml bacterial culture (data not shown).
  • the mixture of clarified lysate and the respective binding buffer (see Table 1) is centrifuged for 30 minutes at 12000 g, room temperature and the supernatant is removed. This is followed by washing twice with 200 ⁇ l 70% ethanol, drying under vacuum, and addition of 30 ⁇ l Tris-HCl, pH 7.5 (data not shown).
  • binding buffer pH 7.4, modified membrane 2.
  • binding buffer pH 4.6 modified membrane 3.
  • binding buffer pH 3.5 modified membrane 4.
  • binding buffer pH 7.4 unmodified membrane 5.
  • binding buffer pH 4.6 unmodified membrane 6.
  • binding buffer pH 3.5 unmodified membrane

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Abstract

Ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, bei dem man das ggf. vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der ein Füllungsmittel in einer Konzentration enthält, dass die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt, den das Ausgangsmaterial enthaltenden Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden, die Membran ggf. wäscht und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran eluiert.

Description

Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsaurehaltigem Ausgangsmaterial unter Verwendung einer porösen Membran.
Es existieren bereits eine ganze Reihe von Verfahren, bei denen nukleinsäurehal- tiges Ausgangsmaterial ggf. nach Vorreinigung durch eine poröse Membran gesaugt oder gedrückt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß die enthaltenen Nukleinsäuren während des Passierens der Membran selektiv an der Membranoberfläche binden.
Die Affinität von Nukleinsäuren zu den eingesetzten Membranen wird in der Regel über eine spezielle Ausgestaltung der Membranoberfläche in Verbindung mit bestimmten Bedingungen in dem Puffersystem, in dem das Ausgangsmaterial die Membran passiert, erreicht.
So ist z.B. aus dem US-Patent 5,438,128 ein Verfahren bekannt geworden, bei dem zur Aufreinigung von Nukleinsäuren spezielle Polymermembranen zum Einsatz kommen, die mit Ionenaustauschergruppen funktionalisiert sind. Zur selektiven Bindung wird das die Nukleinsäuren enthaltene Ausgangsmaterial in einem Puffer mit geringer Ionenkonzentratioin aufgenommen und in diesem Puffer durch die Membran hindurchgesaugt bzw. gedrückt, wobei die selektive Bindung erfolgt.
Ein weiteres bekanntes Verfahren beschreibt die EP 0512767. Bei diesem bekannten Verfahren erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren an hydrophilen Membranen, wobei dem Bindungspuffersystem ein organisches Lösungsmittel, z.B. Isopropanol, in hoher Konzentration zugesetzt ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren zu schaffen, die gegenüber dem bekannten Verfahren in einfacherer Weise durchzuführen ist.
Gelöst wird diese Aufgabe mit Verfahren, das die Merkmale des Anspruchs 1 und des Anspruchs 5 aufweisen.
Die Erfindung soll zwei Varianten abdecken. Bei der ersten Variante können beliebige Membranen zum Einsatz kommen. Bei der zweiten Variante kommen spezielle Membranen zum Einsatz.
Erfindungsgemäß ist bei der ersten Variante vorgesehen, daß man das gegebenenfalls vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der Po- lyethylenglykol (PEG) und/oder mindestens ein Salz in einer Konzentration enthält, daß die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt, dann das Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer z.B. unter Vakuum oder mittels Zentrifugation durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren (Tiefenfilterwirkung) der Membran zurückgehalten werden.
In einem weiteren Schritt kann die Membran dann gewaschen werden, um gegebenenfalls unspezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen. Falls gewünscht, kann sich an den Waschschritt dann ein Elutionsschritt anschließen, bei dem die gebundenen Nukleinsäuren wieder von der Membran abgelöst werden.
Besonders bevorzugt wird als Fällungsmittel PEG in einer Endkonzentration von mehr als 6 % bezogen auf das Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmaterial eingesetzt.
Die Aufreinigung von Nukleinsäuren in Gegenwart PEG 8000 an Silika-Beads wird von Engelstein et al. in Microbial & Comparative Genomics, Vol. 3, No. 4, 1998 beschrieben. Der in dieser Veröffentlichung verwendete Bindungspuffer enthält 20 % PEG 8000. Das PEG 8000 soll bei dieser bekannten Methode die bislang in Verbindung mit Aufreinigungen von Nukleinsäuren an Silkaträgern erforderlichen chaotropen Reagenzien ersetzen. Daß der hier beschriebene Mechanismus in Verbindung mit anderen Trägermaterialien als Silika und auch anders konfektionierten Trägern als Beads möglich wäre, ist an keiner Stelle angedeutet bzw. beschrieben.
Es kommt hinzu, daß die eingangs erwähnte EP 0512767 in der auf Seite 7 gezeigten Tabelle feststellt, daß in Gegenwart von PEG (10 % oder 20 %) keine Bindung von DNA an Membranen erfolgte, was gegen die Ergebnisse der Anmelderin spricht.
Üblicherweise werden Kunststoff membranen aus z.B. Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon oder PVDF eingesetzt.
Die Membranen können bevorzugt Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 μm aufweisen, wobei die Ausbeute über die Wahl des Porendurchmessers optimierbar ist. Bei Abnahme des Porendurchmessers steigt die Rückhalterate der Membran. Allerdings verstopfen kleinere Poren auch schneller, so daß der Porendurchmesser nicht zu klein gewählt werden sollte.
Die Membranen werden bevorzugt so ausgelegt, daß sowohl Oberflächenfilter- wirkung als auch Tiefenfilterwirkung auftritt.
Die gewählten Bindungsbedingungen sollten weiterhin grundsätzlich sicherstellen, daß das Nukleinsäuremolekül in gestauchter Form vorliegt, da so eine optimierte Rückhaltung an und in der Membran möglich ist.
Gemäß der zweiten Variante der Erfindung ist vorgesehen, daß die in den Aufreinigungsverfahren eingesetzten Membranen mit deprotonierbaren Gruppen, insbesondere mit Sulfonsäure-, Carbonsäure oder Phosphorsäure-Gruppen funktionali- siert sind.
Auch bei dieser Variante läßt man das nukleinsäurehaltige Ausgangsmaterial in einem Bindungspuffer durch die in diesem Fall funktionalisierte Membran passieren, wobei der Bindungspuffer ein Fällungsmittel für Nukleinsäuren enthält. Anschließend kann die Membran ggf. gewaschen werden und die Nukleinsäuren können dann von der Membran eluiert werden. Es ist vorgesehen, daß das Fällungsmittel in dem Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmaterial in einer Konzentration vorliegt, die oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Wertes liegt. Bei dieser erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung fallen die Nukleinsäuren in Gegenwart des Bindungspuffers aus. Wird das Bindungspuffer-Ausgangsmaterialgemisch dann durch die Membran gesogen, so bleiben die Nukleinsäuren an der Membran haften.
Als Fällungsmittel können z.B. Salz, PEG oder auch Isopropanol zur Anwendung kommen, um nur eine wenige besonders geeignete, die Erfindung nicht einschränkende Beispiele- zu nennen.
Bei einem weiteren bekannten Verfahren gemäß dem US-Patent 5705628 erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren in Gegenwart von PEG an magnetischen Mikro- partikeln, deren Oberfläche funktionalisiert ist. Das hier beschriebene Verfahren ist speziell auf magnetische Beads abgestimmt, die im Vergleich zu den erfin- dugsgemäß eingesetzten Membranen ein umständlicheres Handling erfordern. Ein weiterer Nachteil ist, daß Beads höhere Elutionsvolumina als Membranen benötigen.
Es hat sich herausgestellt, daß Verfahren mit erfindungsgemäß funktionalisierten Membranen sehr gute Nukleinsäureausbeuten ermöglichen, insbesondere, wenn, wie in einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung vorgesehen, die funktionalisierten Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist und deren anderes Ende frei beweglich ist. Diese Polymerketten erhöhen die Rückhalteeigenschaften von Membranen für Nukleinsäuren erheblich. Die Polymerketten richten sich in Abhängigkeit von den äußeren Umgebungen unterschiedlich zu der Membran aus; Bei eher alkalischem bzw. neutralem pH- Wert und/oder niedriger Ionenkonzentration stehen die Polymerketten mehr oder weniger gestreckt von der Membran ab. Erniedrigt man den pH- Wert und/oder erhöht man die Ionenkonzentration, so legen sich die Polymerketten an die Membran an.
Im vorliegenden Fall hat sich gezeigt, daß die höchste Rückhalterate der Membran für Nukleinsäuren dann vorliegt, wenn die Polymerketten zwar von der Membran abstehen, aber nicht vollständig gestreckt sind (Tentakelstruktur). Unter diesen Bedingungen, die sich einstellen, wenn z.B. höhere lonenkonzentratio- nen oder höhere PEG-Konzentrationen vorliegen, liegt auch das Nukleinsäure- molekül in gestauchter Form vor, in der es besonders effektiv in der Tentakelstruktur zurückgehalten wird.
Als Polymerketten können z.B. Polyacrylsäure oder dergl. eingesetzt werden.
Auch bei dieser Variante weisen die Membranen bevorzugt Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 μm auf, wobei die Ausbeute über die Wahl des Porendurchmessers optimierbar ist.
In beiden Fällen kann die Elution der an der Membran haftenden Nukleinsäuren mit Puffern niedriger Ionenkonzentration bzw. mit Wasser bei Raumtemperatur erfolgen. Zur Elution wird der eingesetzte Puffer durch die Membran gesaugt oder gedrückt. Ein eventueller zwischen Bindung und Elution vorgesehener Waschschritt kann auf gleiche Weise mit z.B. Ethanol oder dergleichen erfolgen.
Zur Elution werden bevorzugt Bedingungen eingestellt, bei denen die Polymerketten möglichst vollständig gestreckt von der Membran abstehen und das Nu- kleinsäuremolekül ebenfalls in gestreckter Form vorliegt. Unter diesen Bedingungen, die sich z.B. bei Verwendung der oben angegebenen Elutionspuffer einstellen, ist eine besonders gute Ablösung des Nuklemsäuremoleküls von der Membran möglich.
Grundsätzlich kann man alle eingesetzten Puffer oder Gemische unter Vakuum durch die Membran saugen oder z.B. mittels Zentrifugation hindurchdrücken.
Bevorzugt wird das Verfahren mit Membranen durchgeführt, die in Mikrotiter- filterplatten, Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen angeordnet sind.
Im folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden.
A: Herstellung funktionalisierter Membranen
Beispiel 1: a) Modifizierung von Polypropylenmembranen
Eine Polypropylen-Mikrofiltrationsmembran (Accurel 2E HF, nominale Porengröße 0.2 μm, Membrandicke 150 μm; Membrana GmbH, Wuppertal oder Versuchsmuster #1333-12A, nominale Porengröße 0.45 μm, Membrandicke 110 μm, 3M, St. Paul, USA) mit einem Durchmesser von d = 80 mm wird unter Schütteln für 2 h mit einer 100 mM Lösung von Benzophenon in Aceton equilibriert. Nachfolgend wird die Membran mit einer 10%igen wässrigen Acrylsäurelösung überschichtet. Anschließend wird für 15 min mit UV-Strahlung (UVA-Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet. Abschließend wird die modifizierte Membran für 24 h bei 60°C mit Wasser extrahiert und getrocknet. b) Modifizierung von Nylonmembranen
Eine Nylon-Mikrofiltrationsmembran (Schleicher&Schüll, nominale Porengröße 0,45 μm, Membrandicke 127 μm) wird unter den gleichen Bedingungen wie bei a) modifiziert.
B: Aufreinigung von Nukleinsäuren
Für die nachfolgenden Aufreinigungen wurden die gemäß Beispiel 1 a und b hergestellten oberflächenmodifizierten Membranen in eine 96er Mikrofiltrations- platte eingespannt.
Beispiel 2:
Zur Bestimmung des Rückhaltevermögens der modifizierten Membranen für pDNA wird 1 μg pDNA mit jeweils 200μl Bindungspuffer (BP) versetzt (BP1: 5mM Tris, pH=7,5; BP2: 4M NaCl, 10% PEG 8000, pH=4,6). Die Aufreimgung erfolgt mittels Zentrifugationsschritte (3000 rpm) nach dem Prinzip: Bind-Wash- Elute. Als Basismaterial für diesen Versuch wird oberflächenmodifiziertes PP mit einer nominalen Porenweite von 0,45 μm eingesetzt. Nach der Inkubation wird 2x mit je 200μl 70% EtOH gewaschen. Die Elution erfolgt mit 30μl Tris-HCl (5 mM, pH=7,5). Abschließend wird ein zweites Mal mit lOOμl eluiert. Die halbquantitative Auswertung von 4μl Eluat erfolgt mittels Ethidiumbromid- Gelelektrophorese (nicht dargestellt).
Während bei Einsatz des Bindungspuffers BP1 keine Bindung an der Membran erfolgte, ließ sich die pDNA bei Verwendung von BP2 nahezu quantitativ an die Membran binden und im ersten Elutionsschritt wieder eluieren.
Beispiel 3: Es wird eine pDNA-Aufreinigung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse durchgefühlt. Hierzu werden Bakterien aus 1,5ml Bakterienkultur abzentriftigiert und mit den Puffern P1-P3 (P IOOμl, P2: 300μl, P3: 300μl) aus dem Kit „Perfect Prep Plasmid Midi,, der Fa. Eppendorf versetzt. Nach Zentrifugation wird das klare Lysat mit jeweils 700μl Bindungspuffer (s. Tabelle 1) versetzt. Die Aufarbeitung der Probe erfolgt unter den im Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen. Zur Kontrolle wird eine Plasmidpräparation unter Durchföhmng der kompletten Auf- reinigungsprozedur mit dem Kit „Perfect Prep Plasmid Mini,, der Fa. Eppendorf, aus der identischen l,5mL Bakterienkultur durchgeführt (Daten nicht dargestellt). Als weitere Kontrolle wird das Gemisch aus geklärtem Lysat und jeweiligem Bindungspuffer (s. Tabelle 1) für 30 Minuten bei 12000g, Raumtemperatur zen- trifugiert und der Überstand entfernt. Danach erfolgt zweimaliges Waschen mit 200 μl 70 % Ethanol, Trocknung unter Vacuum, sowie die Zugabe von 30 μl Tris-HCl, pH 7,5 (Daten nicht dargestellt).
Ausbeute und Reinheit wurden mittels Photometrie und Analyse durch Ethidi- umbromid-Gelelektrophorese bestimmt (Tabelle 1, Fig. 1). Die Tabelle gibt die mittels Photometer ("BioPhotometer" der Fa. Eppendorf) bestimmte Konzentration der eluierten pDNA in ng/μl an.
Tabelle 1:
Figure imgf000011_0001
Die Spuren des in Fig.l gezeigten Gels waren wie folgt belegt:
1.) Bindungspuffer, pH 7,4, modifizierte Membran 2.) Bindungspuffer, pH 4,6 modifizierte Membran 3.) Bindungspuffer, pH 3,5 modifizierte Membran 4.) Bindungspuffer, pH 7,4 unmodifizierte Membran 5.) Bindungspuffer, pH 4,6 unmodifizierte Membran 6.) Bindungspuffer, pH 3,5 unmodifizierte Membran
Das Gel und auch die photometrische Auswertung zeigten übereinstimmend, daß sich bei den modifizierten Membranen pDNA sowohl bei pH 4,6 als pH 7,4 in hoher Konzentration aufreinigen läßt, während bei der unmodifizierten Membran lediglich bei pH 7,4 eine schwache Ausbeute an aufgereinigter pDNA zu verzeichnen ist. Gelelektrophoretische Auftrennung des GFP-Nl Plasmides in einem 0,8% Ethi- diumbromid-Agarosegel.
Fig. 1: Gelelektiophoretische Ausweitung der pDNA- Aufreinigung aus Beisp. 3.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsaurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, bei dem man
- das ggf. vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der PEG und/oder mindestens ein Salz in einer Konzentration enthält, daß die sich einstellende Endkonzentration in dem Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt,
- das Ausgangsmaterial enthaltenden Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden
- die Membran ggf. wäscht
- und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß PEG in einer Endkonzentration von >6% vorliegt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.
5. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsaurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer porösen Membran, die mit deprotonierbaren Gruppen funktionalisiert ist, bei dem man
- das ggf. vorgereinigte Ausgangsmaterial mit einem Bindungspuffer versetzt, der ein Fällungsmittel für Nukleinsäuren enthält
- das Gemisch aus Ausgangsmaterial und Bindungspuffer durch die Membran permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche oder in den Poren der Membran zurückgehalten werden
- die Membran ggf wäscht
- und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran eluiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus Bindungspuffer und Ausgangsmaterial eine Endkonzentration an Fällungsmittel aufweist, die oberhalb des zur Fällung von Nukleinsäuren erforderlichen Werts liegt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fällungsmittel PEG ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß PEG in einer Endkonzentration von >6% vorliegt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit Sulfonsäure-, Carbonsäure oder Phosphorsäure-Gruppen funktionalisiert ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist, und deren anderes Ende frei beweglich ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.
14. Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 μm aufweist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine Dicke < 500 μm aufweist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran zum Einsatz in Mikrotiterplatten Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungs-, Wasch- und/oder Elutionspuffer mittels Vakuum durch die Membran gesaugt werden.
PCT/EP2001/001134 2000-02-11 2001-02-02 Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren WO2001059098A2 (de)

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