DD274676A1

DD274676A1 - Verfahren zur herstellung von festen phasen fuer molekularbiologische nachweis- und trennoperation

Info

Publication number: DD274676A1
Application number: DD31869188A
Authority: DD
Inventors: Hans-Dieter Hunger; Gerhard Behrendt; Gerhard Schmidt; Christina Flachmeier
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-08-04
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1989-12-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von festen Phasen fuer molekularbiologische Nachweis- und Trennoperationen. Die neuartigen festen Phasen koennen in der Molekularbiologie, Mikrobiologie, Genetik, Human- oder Veterinaermedizin, in der Phytopathologie und Virologie angewendet werden. Die erfindungsgemaessen festen Phasen besitzen eine hydrophobierte Oberflaeche, auf der sich ionische Ladungen befinden. Sie weisen eine hohe Bindungskapazitaet fuer Biomolekuele auf, die im Bereich von 20-100 mg/mg feste Phase liegt. Durch Kombination von Hydrophobisierung und ionischer Ladung wird eine selektive Anfaerbung der Biomolekuele bei deutlich verminderter Untergrundfaerbung moeglich.

Description

"Feste Phasen für molekilarbiologische Nachweis- und Trennoperationen und Verfahren zu deren Herstellung"

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft neuartige feste Phasen für molekularbiologische Nachweis- und Trennoperationen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese festen Phasen werden in der Molekularbiologie! Mikrobiologie, Genetik, Human- oder Veterinärmedizin, in der Phytopathologie und Virologie angewendet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik Die Verwendung derivatisierter fester Phasen zu Nachweis- und Trennoperationen ist in der Molekularbiologie sowohl in Form von Säulenfüllmaterial als auch von Flächenträgern weit verbreitet. Bekannt sind Füllmaterialien für Säulen in der HPLC und in der Affinitätschromatographie, Flächenträger für Blotting-Verfahren, Tüpfel-Nachweise und in Transfer-Techniken. In der Regel handelt es sich um Derivate von natürlichen und/oder künstlichen Polymeren mit einer spezifisch mit dem nachzuweisenden oder abzutrennenden Biom^^ekül reagierenden Gruppe. Als bekannte, in großem Maßstab verwendete Produkte seien Diethylaminoethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Nitrocellulose, Phosphorsäuresubstituierte Cellulose, n-Octylcellulose, Phenoxyethylcellulose, Polyamid 6, durch positive Ladungen derivatisiertes PoIy-. amid 6 genannt. Darüber hinaus sind anorganische Stoffe als Trägermatürial, z. B. Kieselgel, Apatit, Aluminiumoxid oder Graphit in der ursprünglichen Form oder in derivatisierter Form, bekannt, Flächenträger werden mit drei unterschiedlichen Oberflächenformen ausgerüstet zur Verfügung gestellt:

1. Flächenträger mit hydrophober Bindungskapazität, z, B. Nitrocellulose-Membranen,

2. Flächenträger mit ionischen Gruppen, z. B. mit positiven Gruppen (Diethylaminoethylcellulose, positive Polyamid 6-Membranen. Träger nach den DD-WP 228 461 oder 237 843) oder mit negativen Ladungen (Carboxymethylcellulose, phosphorsäuresubstituierte Cellulose, Träger nach dem DD-WP 237 844) _t

3. Flächenträger mit reaktive-», zur Ausbildung kovalenter Bindungen befähigter Gruppen, r. B". mit Säurehalogeniden (z. B. DD-VVP 245 785), mit Diazobenzylmethylgruppen oder Aldehydgruppen.

Die bisher bekannten Trägermaterialien, die überwiegend aus Cellulose, Polysacchariden, Stärkederivaten, Dextran oder -derivaten hergestellt werden und damit ein hydrophiles Grundgerüst aufweisen, besitzen nur eine der oben genannten Funktionalitäten. Während bei Säulenfüllmaterialien die Eigenschaften von festen Phasen durch Mischung von zwei oder mehreren Trägermaterialien der Aufgabenstellung angepaßt werden können, ist das bei Flächenträgern nicht möglich. Bisherige Trägermaterialien weisen also bei hydrophilen Polymeren auch hydrophile Eigenschaften, bei hydrophoben Polymeren auch hydrophobe Eigenschaften auf. Ein Trägermaterial, das mindestens zwei der o. g. Eigenschaften in sich vereinigt, steht bisher nicht zur Verfügung und ist bisher nicht beschrieben worden. Für die Steigerung der Empfindlichkeit in molekularbiologischen Nachweis- und Trennoperationen bzw. zur Erhöhung der Trennschärfe ist jedoch oftmals eine Kombination zweier Bindungsprinzipien, z. B. einer hydrophoben Bindung und einer ionischen Bindung, wünschenswert.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, einfach herstellbare feste Phasen für molekularbiologische Nachweis- und Trennoperationen mit erhöhter Abbildungsschärfe und Bindungskapazität zur Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, natürliche und/oder synthetische Polymere derart zu substituieren, daß sie als feste Phasen in molekularbiologischen Nachweis- und Trennoperationen nach mindestens zwei Bindungsprinzipien wirken.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß feste Phasen mit einer chemischen Struktur folgender allgemeiner Formel I,

worin M und Q, die gleich oder verschieden sein können, Gruppierungen wie -O-Alk-, -0-R⁴-, -CONH-R⁵-NHCO-, -C(=NH)-, -O-R⁵-NH-, -CH(OH)-, -C₃N₃R⁶-, =CH-R⁴-CH=,

X O, S, N (n a 2), NH (η = 1),

Z substituierte oder unsubstituierte C₀ .„-Alkyl-,

t-lo

C₂_₁₈-Alkenyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Diaryl-,

Triaryl- oder Polyarylgruppen, η 1 oder 2 Y -SO₃H, -SO₂H, -COOH, -PO₄H₂, -PO₃H, -PO₂H, -BO₃H₂

oder -NR¹R² und N⁺R¹R²R³,

2

R und R , die gleich oder verschieden sein können, substituierte oder unsubstituierte C^.g-Alkyl- oder

Alkenyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen oder 2 R und R bilden zusammen ein heterocyclisches Ringsystem, R³ C^g-Alkylgruppen,

R⁴ C_a_₁₂-Alkenylen-, C^^-Alkylen-, C₂_₁₂-Alkoxy-

alkenyl-, C₂_₁₂-Alkoxyalkylen-, Arylen- oder

C₇_₁₇-Alkoxyarylengruppen, R⁵ C₂_₁₂-Alkylen-, C_4-8-Cycloalkylen-, C₆_₂₀-Alkyl-

cycloalkylen-, Arylen- oder Alkarylengruppen, R Halogen, Alkyl-, Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl-,

Hydroxyl-, Aminoarylalkyl-, Dialkylaminoaryl-,

Dialkylaminoarylalkylgruppen, P ein synthetisches oder natürliches Polymer wie

Cellulose, Stärke, Dextran, Agar-Agar, Polyamid,

Polyester, Polyether, Polyacrylat oder Gemische

davon,

r 0,00001 bis 1 je wiederkehrende Einheit des Polymeren und

s O bis 2 je wiederkehrende Einheit des Polymeren bedeuten, zur Verfügung gestellt werden, und diese festen Phasen O bis 2 negativ oder positiv geladene Gruppierungen oder ein Gemisch aus beiden je wiederkehrende Einheit des Polymeren aufweisen.

überraschend wurde gefunden, daß feste Trägermaterialien für Trenn- und/oder Nachweisoperationen mit hydrophoben organischen Resten und zusätzlich negativen oder positiven Ladungen zu einer Erhöhung der Tpennschärfe bzw. zn schärferen Banden und dots beim Tüpfeln führen und damit die Empfindlichkeit der Nachweise erhöhen.

Bevorzugte Ausführungsvarianten der erfindungogemäßen festen Phasen sind diejenigen, in denen in der allgemeinen Formel I

a) s gleich 0, M ein Triazinylrest, ein Oxyalkylrest, ein stickstof fhaltigor Alkyl- oder Aralkylrest oder ein Isoharnstoffrest und Z substituierte oder unsubstituierte C. _ia-Alkyl~, Cji „o-Alkenyl-, C₇ „,.-Aralkyl-, Aryl-, Dia|ryl- oder höhere

4—lO /-63 *

Alkylgruppen bedeuten, d. h. daß ein aktiviertes synthetisches und/oder natürliches Polymer mit solchen Verbindungen umgesetzt wird,, die die Oberfläche der festen Phasen hydrophob und gegebenenfalls mit schwachen Ladungen ausrüsten;

b) s gleich O, P ein Cellulose-Grundgerüst, M Triazinylreste, bevorzugt S-Triazinylreste, X Stickstoff, Z gleiche oder unterschiedliche C.-C.g-Alkylgruppen, η gleich 2 und r gleich 0,5 bis 0,02 bedeuten, d» h. daß durch Trihalogen-triazine, insbesondere durch 2,4,6-Trihalogen-l,3,5-triazine, aktivierte Cellulose (z. B. nach DO-VVP 245 785) mit sekundären Aminen, die gleiche oder unterschiedliche Alkylgruppen aufweisen, substituiert wird und somit zu hydrophoben Wechselwirkungen befähigt ist und schwach positive Ladungen aufweist;

c) s gleich O₁ P CeIIuIoSe₁ M don 1,3,5-Triazinylrest, X !Stickstoff, Z Cg-Alkylgruppen, η gleich 2 und r gleich 0,5 bis 0,05 bedeuten, d. h» daß durch Trihalogen-s-triazin aktivierte Cellulose mit Ν,Ν-Dioctylamin substituiert iNird und dieser Träger sowohl zu hydrophoben Wechselwirkungen befähigte Gruppen als auch schwach pooitive Ladungen aufweist ;

d) P Cellulose, M ur d Q jeweils einen T'riazinylrest, X Stickstoff bei η ·= 2 bzWt eine NH-Gruppierung bei η = 1, Z eine C₄__ig-Alkyl» oder eine Arylgruppe, Y eine Sulfonsäure« oder Carbonsäuregruppe, η gleich 1 oder 2, r gleich 0,5 bis 0,002 und s gleich 0,5 b.is 0,002 bedeuten, d. h. daß durch Trihalogen-triazine aktivierte Cellulose mit mindestens einer Verbindung mit Säuregruppen und einer zweiten mit hydrophoben Resten substituiert ist und somit sowohl negative Ladungen ali3 auch zu hydrophoben Wechselwirkungen befähigte Gruppen sowie gegebenenfalls schwach positiv wirkende Gruppen aufweist ;

e) P Cellulose, M und Q 1,3,5-Triazinylreste, X eine NH-Gruppierurg, Z Arylgruppen, Y Sulfonsäuregruppen., η = 1 und r bzw. s 0,5 bis 0,05 bedeuten, d. h. daß durch 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine aktivierte Cellulose (z. B. nach DD-WP 245 785) mit Ary!aminosulfonsäuren, z. B. Sulfanilsäure oder Methanilsäure, und Arylaminen substituiert sind und somit starke negative Ladungen, schwache positive Ladungen sowie zur hydrophoben Wechselwirkung befähigte Gruppen aufweisen,-

f) P Cellulose, M und Q jeweils eziien Triazinylrest, X N (bei η =2) oder NH (bei η = 1), Z eine C₂_₁₈-Alkylgruppe, Y eine NR¹R²- oder NR¹R²R³-Gruppierung ,(wobei R¹, R², R³ wie in

definiert sind), η gleich 1 oder 2 und r bzw, s 0,5 bis 0,002 bedeuten, d. h. daß durch Triazinylhalogenide substituierte Cellulose sowohl mit starken als auch schwachen positiven Ladungen als auch zur hydrophoben Wechselwirkung befähigten Gruppen substituiert ist.

Damit werden erfindungsgemäß feste Phasen zur Verfügung gestellt, die über negative und/oder positive Ladungen verfügen und zusätzlich hydrophobisierte Oberflächen aufweisen, wodurch eine schärfere Bindung von Biomolekülen (Fokusierung) und eine Bindung nach unterschiedlichen Mechanismen erfolgt, was besonders beim Nachweis von Proteinen mittels Färbereaktionen oder durch autoradiographische Verfahren von großer Bedeutung ist. Diese Erfindung schließt weiterhin Verfahren zur Herstellung von festen Phasen für molekularbiologische Nachweis- und Trenr »perationen der allgemeinen Formel I₁

Z M-x-(z-H)_n7_r

worin P₁ M, Q, X, Y₁ Z, n, r und s die gleiche Bedeutung aufweisen wie sie weiter oben definiert worden ist, ein, die darin bestehen, natürliche oder synthetische Polymere oder deren Gemische mit anorganischen und/?der organischen Verbindungen in Lösung oder Dispersion zu aktivieren, die aktivierten Polymeren oder Polymerengemische mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II,

H-X-(Z-H)_n II

in der X, Z und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in der allgemeinen Formel I, in Lösung oder Dispersion und nach oder gleichzeitig mit der so erfolgten Hydrophobierung entweder mit einer Verbindung der Formel III,

H-X-(Z-Y)_n III

in der X, Z und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in der allgemeinen Formel I und Y eine Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Phosphorsäure-, Phosphorigoäure-, Phosphinsäuren Borsäure- oder Sulfinsäuregruppe oder ein Salz davon darstellt, in Lösung oder Dispersion oder mit einer Verbindung der Formel IHa,

H-X-(Z-Y)_n IHa

12 +12 3 worin Y eine -NR^-R - oder -N R R R -Gruppierung bedeutet, wo-

12 3

bei R₁R₁R sowie X und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in der allgemeinen Formel I oder mit mindestens je einer Verbindung der allgemeinen Formel III und IHa umzusetzen. Bei der Umsetzung können gegebenenfalls Säurefänger oder Kondensationsmittel anwesend sein, wenn das ^hei dem betreffenden Typ von Reaktion vorteilhaft ist.

Für die Aktivierung von Polymeren sind eine Reihe von Verfahren möglich. Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Aktivierungen bevorzugt, die das Polymere mit reaktiven Gruppen, z. B. Aldehydgruppen, Säurechloridgruppen, Isoharnstoffgruppen, Epoxydgruppen oder Isocyanatgruppen ausrüsten.

Bei einigen dieser Verfahren ist es bei Polymeren mit Hydroxylgruppen vorteilhaft, daraus mit Alkalien, z. B. mit Natriumhydroxid in wäßriger oder alkoholischer Lösung, die Alkalisalze herzustellen, z. B. Natroncellulose, und die so substituierten Polymeren zu aktivieren. Die Aktivierung kann dann z. B. mit Periodsäure unter Bildung von Aldehydgruppen, mit einem Säurehalogenid, z. B. Oxalylchlorid, Sebacylchlorid, A dipoylchlorid oder 2,4,6-Trihalogen-l,3,5-triazinen unter Erhalt mindestens einer Säurehalogenidgruppierung, mit Bromcyan unter Bildung von Isoharnstoffstrukturen, mit Halogenepoxiden, z. B. Epichlorhydrin oder Epibromhydrin, unter Substitution mit Epoxidgruppen oder mit Bisoxiranen, z, B. Diglycidether oder Butandiol-1,4-diglycidether unter Erhalt einer Oxirangruppe oder mit einem Epoxysilan bzw. -siloxan unter Abspaltung der SiIy!gruppe erfolgen. vVerden Poly-

mere mit freien NH- und/oder OH-Gruppen verwundet, so kann die Aktivierung ohne vorherige Umsetzung mit anorganischen Basen mit einem Dialdehyd, z. B. Glutaraldehyd, Bisoxiran, z. B. Butandiol-1,4-diglycidether gegebenenfalls in Gegenwart eines Katalysators wie Bortrifluorid-Etherat, oder mit einem Oiisocyanat, z. B. 4,4'"Diphenylmethandiisocyanat, 2,4-Toluylendiisocyanat, 1,6-Hexan-d.iisocyanat, Isophorondiisocyanat oder 1,4-Cyclohexyldiisocyanat gegebenenfalls in Gegenwart organischer Basen oder me/-tallorganischer Verbindungen ala Katalysator, durchgeführt werden.

Ein bevorzugtes Aktivierungsverfehren ist das in DD-WP 245.785 beschriebene, so daß in dem erfindungsgemäßen Verfahren als aktiviertes Polymer oder Polymerengemisch makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, bestehend aus

- einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5 bis 80 Vol.-%,

- einer makromolekularen Verbindung mit 4,6-Dihalogen-l,3_l5-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1 bis 80 Vol.-%,

- 2,4,6-Trihalogen-l,3,5-triazin in einer Konzentration von 0,5 50 Vol.-JK,

- Metallhalogeniden in einer Konzentration bis zu 20 Vol.-% und

- gegebenenfalls puffernden Substanzen bis zu 5 Vol.-% eingesetzt werden.

Die aktivierten Polymeren oder Polymerengemische können als PuI-.ver, Granulate, Fasern, Gele» Vliese, Gewebe, Folien, Filme, Membranen oder als papierähnliche Formen eingesetzt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, daß das aktivierte Polymer oder Polymerengemisch als makromolekulare Masse nit chemisch aktiven Füllstoffen in papierähnlicher Form eingesetzt wird. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen darin, daß das aktivierte Polymer oder Polymerengemisch mit

a) einer Verbindung der allgemeinen Formel II, in der X eine ^NH-Gruppierung, η gleich 2 und Z gleiche oder voneinander verschiedene C₄__1Q-Alkylgruppen oder substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, insbesondere mit einem Dialkyl- oder Diarylamin, z. B. Ν,Ν-Dioctylamin oder N,N-Diphenylamin, umgesetzt wird;

b) einer Verbindung der allgemeinen Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, worin Y eine Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Borsäure- oder Phosphorsäuregruppe bedeutet und X, Z und η wie in der allgemeinen Formel I definiert sind, umgesetzt wird ;

c) einer Verbindung der allgemeinen Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IHa umgesetzt wird;

d) mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IHa umgesetzt wird.

Als Verbindungen der Formel III zur Umsetzung mit den aktivierten Polymeren oder Polymerengemischen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Sulfonsäuren, z, B. Sulfanilsäure, Metanilsäure, Amino-naphthalinsulfonsäuren, -disulfonsäuren, -trisulfon-.säuren, -hydroxysulfonsäuren, Anilin-2,5-disulfonsäure, Carbonsäuren, z. B. Anthranilsäure, 3-Aminobuttersäure, 6-Aminocapronsäure, Anilin-2,5-dicarbonsäure, Phosphorsäuren und Borsäuren, z. B. m-Aminophenylborsäure, bevorzugt.

Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel IHa sind nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Dialkylamine, Diarylamine, Dialkarylamine sowie deren Quarternisierungsprodukte (wobei die Quarternisierung vor, nach oder gleichzeitig mit der Umsetzung an den aktivierten Polymeren erfolgen kann), z. B. N,N-Dimethylaminopropan-3"amin, Triethylaminoethan-2-ammonium-hydrobromid, l,4-N,N-üimethyl-phenylendiamin.

Die Umsetzung der aktivierten Polymeren oder Polymerengemische nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in organischen Lösungsmitteln wie Kohlenwasserstoffen, z, B. Benzen oder Toluen, Ethern, ζ. B. Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan oder Diethylether, Ketonen, ζ. B. Aceton, Methylethylketon oder Cyclohexanon, Estern, z. B. Essigsäureethylester oder Milchsäureethylester, halogenierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan, Bromoform, 1-Bromethan oder Chlorbenzen, durchgeführt werden. Bevorzugt werden mit Wasser mischbare Lösungsmittel, z. B. Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid oder Acetonitril, die bis zu 50 % Wasser enthalten, es können aber auch höhere Wasserkonzentrationen angewendet werden. Besonders bevorzugt wird ein Gemisch aus Aceton und Wasser. Dabei kann die Reaktion des aktivierten Polymeren oder Polymerengemisches gleichzeitig oder durch Mischung einer wäßrigen Lösung der Verbindung der allgemeinen Formel III und einer Lösung der Verbindung II in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Nach einer weiteren b9vorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Uirvetzung des aktivierten Polymeren in einer

1. Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II in einem organischen Lösungsmittel,

2. Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Fornel III ir: wäßriger Lösung und in einer

3. Stufe mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung der allgemeinen Formel IHa.

Insbesondere wird die Umsetzung des aktivierten Polymeren oder Polymerengemisches mit je einer Verbindung der allgemeinen Formel II, III und IHa gleichzeitig in einem Gemisch aus Wasser und mindestens einem mit V/asser mischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine einfache Methode dar, für molekularbiologische Trenn- oder Nachweisoperationen geeignete feste Phasen mit wertvollen Eigenschaften zu erhalten, denn die Umsetzung wird günstigerweise bei Zimmertemperatur, also oh-

ne zusätzliche Energiezufuhr, innerhalb von 30 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Die durch dieses Verfahren zur Verfügung gestellten festen Phasen weisen folgende wesentliche Eigenschaften auf, die in dieser Kombination bisher nicht bekannt waren:

1. Hydrophobierte Oberfläche der festen Phase, dadurch Schaffung der Möglichkeit der Bindung von Proteinen über hydrophobe Wechselwirkungen bei Erhalt der Aufsaugeigenschaften für Lösungsmittel, ir. ,besondere Wasser;

2. Wesentliche Verbesserung der Banden- oder Punktschärfe ("Fokussierung", "Abbildungsschärfe") ohne diffusen Hof;

3. Auf der Oberfläche befindliche ionische Ladungen und dadurch Verfügbarkeit zur Bindung von Biomolekülen, z. B. von DNS an positiv geladene Oberflächen oder von Proteinen bzw. von Enzymsubstraten (umgesetzten oder nicht umgesetzten) z. B. an negativ geladene Oberflächen;

4. Höhe Bindungskapazität für Biomoleküle im Bereich von 20 bis 100 .ug/mg feste Phase;

5. Einstellbare Festigkeit der Bindung der Biomoleküle an die feste Phase durch Auswahl der entsprechenden Verbindungen, dadurch Wiederverwendbarkeit von Biomolekül und/oder fester Phase bzw. hohe Beweglichkeit des Biomoleküls sowie Einsatz des feste Phase/Biomolekül-Komplexes als Spender in biologischen Reaktionen;

6. Durch Kombination von Hydrophobisierung und ionischer Ladung wird eine selektive Anfärbung der Biomoleküle bei deutlich verminderter Untergrundfärbung möglich.

7. Erst durch die erfindungsgemäßen festen Phasen wird der Nachweis von Biomolekülen mittels enzymmarkierter molekularer Sonden auf der gleichen festen Phase möglich.

Diese vielfältigen neuen Eigenschaften der erfindungsgemäßen festen Phasen stellen sie als Produkte mit einer einzigartigen, neuen Kombination von Eigenschaften heraus, die bisher nicht zugänglich war, und ermöglichen dadurch die Durchführung neuartiger Nachweis- und Trennverfahren sowie eine Verbesserung be-

t ζ,

reits eingeführter Techniken. Die neuen, erfindungsgemäßen festen Phasen, die nach einem einfachen Herstellungsverfahren zugänglich sind, wie es in den folgenden Beispielen näher erläutert wird, weisen gegenüber bekannten Produkten nicht nur die neuen Eigenschaften, sondern darüber hinaus eine erhöhte Bindungskapazität und Abbildungsschärfe auf.

Ausführungsbeispiele Beispiel .1

Cellulose in Form von Filterpapier wird in IO χ 20 cm große Stükke geschnitten. Ein Blatt wird 30 Minuten in 3 η Natronlauge bei Zimmertemperatur umgesetzt. Nach dieser Voraktivierung wird das Papier fast trocken abgepreßt und in eine Lösung von 5 g Cyanurchlorid in 95 ml Dioxan gegeben. In dieser Lösung wird eine Stunde lang aktiviert. Danach wird in Essigsäure/Aceton und in Aceton gewaschen. Nach kurzer Trocknung an der Luft (5 Minuten) wird das aktivierte Blatt in eins Glasschale gegeben und nacheinander mit einer Lösung von 4 g Ν,Ν-Dioctylamin in 56 ml Aceton und 5 g Natriumsulfanilat in 45 ml Wasser (pH-Wert 7,5) unter mäßigem Schütteln versetzt. Dieses Gemisch wird 16 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt und danach mit Methanol und 6 χ 250 ml Wasser je 15 Minuten gewaschen. Anschließend wird an der Luft getrocknet.

Eis wird ein Flächenträger erhalten, der an der Oberfläche hydrophob ist und kein Wasser aufsaugt. Aufgetüpfelte Proteine (ζ. Β. Humanserumalbumin) werden als scharfer Punkt beim radioaktiven Nachweis oder beim Anfärben mit Coomassie-Brillant-Blau und kurzer Entfärbung bei fast weißem Untergrund abgebildet.

Beispiel 2

10 g mikrokristalline Cellulose werden in 200 ml 1 η Natronlauge aufgeschlämmt, mit 8,5 g Pariodsäure versetzt und 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird abgesaugt und bis zum Neutralpunkt mit bidestilliörtein Wasser gewaschen. Danach wird

die voraktivierte Cellulose in 100 ml Tetrahydrofuran unter Rühren aufgeschlämmt und mit einer Lösung von 7,5 ml n-Hexyliirin in 32,5 ml Aceton versetzt. Es wird über Nacht gerührt. Danach wird abgesaugt und mit 5 1 Wasser gewaschen. Anschließend wird getrocknet.

Dieses Produkt wird als Säulenmaterial zur Auftrennung von Oligonucleotiden (18 - 32 mer) verwendet und zeichnet sich durch hohe Bandenschärfe und Bindungskapazität aus.

Beispiel 3

.100 ml einer 10 %igen Dispersion von teilweise hydrolysiertem Polyvinylalkohol in Wasser (mittlerer Teilchendurchmesser 1,5 mm) werden mit 50 ml 3,6 η Natronlauge versetzt und 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Danach werden 12,75 g Epichlorhydrin zugegeben und weitere 12 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Es wird im Vakuum nicht umgesetztes Epichlorhydrin abgezogen, danach 10,0 g Η-Säure zugegeben und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. E3 wird 2 Stunden gerührt. Danach werden 3,9 g Stearylamin in 50 ml Dioxan zugegeben und über Nacht gerührt« Danach läßt man absetzen, und es wird abdekantiert. Das feuchte Material wird in eine Säule gegeben und mit 2 1 bidestilliertem Wasser gewaschen. Die Säule wird zur Trennung von Enzymen verwendet und weist eine sehr gute Trennleästung auf.

Beispiel 4

Der Versuch von Beispiel 3 wird wiederholt, jedoch wird unmittelbar nach Zugabe des Stearylamins auf Glasplatten in 0,8 mm Stärke ausgezogen, koagulieren lassen und bei 45 C getrocknet. Danach wird 6 mal in 0,5 1 Wasser gewaschen. Die Membran wird zum Tüpfeln von Proteinen verwendet und weist eine hohe Pur.ktechärfe auf.

Beispiel 5

5 g Polyvinylalkohol werden in kleinen Anteilen in 100 ml Wasser von 60⁰C eingetragen und klumpenfrei gerührt. Diese Suspension wird auf 30⁰C abgekühlt und unter schnellem Rühren eine Lösung von 3 g 4,4'-Oiphenylmethandiisocyanat und O₁Ol g Dioctylzinn-bis(thioglykolsäure-2-ethylhexylester) zugegeben. Unter weiterer Abkühlung auf Zimmertemperatur wird 15 min gerührt. Danach wird das Produkt mit 100 ml Aceton versetzt und abgesaugt. Es wird 3 χ mit je 100 ml trockenem Aceton gewaschen, in 100 ml Benzen suspendiert und unter Rühren eine Lösung von 1,5 g Dimethylaminopropylamin und 0,25 g Ν,Ν-Oioctylamin in 8,5 nl Benzen zugegeben. Es wird 5 Stunden gerührt. Danach wird abgesaugt und mit Aceton, Methanol und mehrfach mit Wasser gewaschen. Es wird feucht in eine Säule gefüllt und mit 1 1 Wasser und danach mit 250 ml PBS-Puffer gespült.

Beispiel 6

Der Ansatz von Beispiel 5 wird wiederholt, jedoch werden alle Reaktanden gleichzeitig zu der abgekühlten Polyvinylalkohol-Suspension gegeben, zwei Minuten schnell gerührt, auf Glasplatten in einer Stärke von 1,2 mm ausgezogen und bei 6O⁰C getrocknet. Man erhält einen Flächenträger mit einer hohen DNS-Bindungs-

kapazität von über 800 .ug/cm und scharfer Abbildung der Punkte nach dem Tüpfeln im Autondiogramm.

Beispiel 7

Ein aktivierter Celluloseträger nach DD-WP 245.785 wird mit einer Suspension von 1,7 g eines Salzes .jus Sulfanilsäure in 20 ml Wasser und 2,6 g Ν,Ν-Oioctylamin in 30 ml Aceton versetzt und über Nacht geschüttelt. Danach wird mit Methanol und 6 χ mit Wasser gewaschen. Man erhält einen Flächenträger, der ähnliche Eigenschaften wie der in Beispiel 1 aufweist.

Beispiel 8

Der Versuch von Beispiel 7 wird in folgender Form wiederholt:

100 cm Flächenträger nach DD-WP 245.785 werden mit einer Lösung von 2,2 g des Salzes in 150 ml Methanol versetzt und über Nacht leicht geschüttelt. Danach wird wie oben behandelt. Es wird ein ähnliches Produkt wie in Beispiel 1 erhalten,

Beispiel 9

Ein halbsynthetischer Flächenträger aus mikrokristalliner Cellulose, Polyamidfasern und Polyacrylat-Dispersion wird nach dem Verfahren nach DD-VVP 245.785 aktiviert. 200 cm des aktivierten Trägers werden in eine Lösung von 2,2 g des Salzes des N,N-Dioctylamins und der Sulfanilsäure und 0,4 g Ν,Ν-Dimethylaminopropan-3-amin in 100 ml Methanol gegeben und über Nacht leicht bei Zimmertemperatur geschüttelt. Danach wird der Träger aus der Lösung entnommen und mit Methanol, Wasser, Methanol und 6 χ V/asser gründlich gewaschen. Es wird ein Produkt mit Eigenschaften wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel IQ

ρ Ein Stück aktivierter Flächenträger nach DD-WP 245.785 von 50 cm Fläche wurde mit einer vorgebildeten Lösung von 1,7 g Sulfanilsäure in 20 ml Dimethylsulfoxid und 2,6 g Ν,Ν-Dioctylamin versetzt. Dieses Gomisch wurde über Nacht unter Schütteln inkubiert. . Anschließend wurde wie in Beispiel 1 gewaschen ; das Produkt hatte ähnliche Eigenschaften wie in Beispiel 1.

Beispiel 11

Ein Stück nach DD-WP 245.785 aktivierter Flächenträger von 50 cm Fläche wurde in eine 10 %ige Lösung von Natriumsulfanilat vom pH-Wert 7,5 gegeben und 10 Minuten leicht geschüttelt. Danach wird der Flächenträger entnommen, gegebenenfalls gewaschen und über Nacht in 20 ml einer 1 %igen Lösung von Ν,Ν-Dioctylamin unter leichtem Schütteln umgesetzt. Nach Waschung wie in Beispiel 1 wird ein Produkt ähnlich dem von Beispiel 1 erhalten.

Claims

Patentansprüche

worin M und Q₁ die gleich oder verschieden sein können, Gruppierungen wie -O-Alk-, -0-R⁴-, -CONH-R⁵-NHCO-_# -C(=NH)-, ~O-R⁵-NH-, -CH(OH)-, -C₃N₃R⁶-, =CH-R⁴-CH=,

X O, S, N (n = 2), NH (n = 1),

Z substituierte oder unsubstituierte C₂_₁₈-Alkyl-, C₂_₁₈-Alkenyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Diaryl-, Triaryl- oder Polyarylgruppen,

η 1 oder 2,

-SO,H, -SO₀H, -COOH₁ -PO.H„, -ΡΟ,Η, -POJH, B0H oder NR¹R und N⁺R¹R R

2
R und R bilden zusammen ein heterocyclisches Ritig-

-B0,H_o oder -NR^-1R und N¹R^-1R R"

2

R und R ,die gleich oder verschieden sein können, substituierte oder unsubstituierte C„ „_O-Alkvl- oder Alkenyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen oder bilden
system,

R C₁_₁₈-Alkylgruppen,

R⁴ C₁_₁₂-Alkenylen-, C

alkenyl-, C₀ .₀-Alkoxyalkylen-, Arylen- oder

C.- XC. >

C_{7 17}-Alkoxyarylengruppen, /-J./

R C_2-12-Alkylen-, C^g-Cycloalkylen-, Cg_-20-

Alkylcycloalkylen-, Arylen- oder Alkarylengruppen,
R Halogen, Alkyl-, Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl-,

Hydroxyl-, Amirjoarylalkyl-, Dialkylaminoaryl-, DiaIkylaminoarylaIky!gruppen,

P ein synthetisches oder natürliches Polymer
wie Cellulose, Stärke, Dextran, Agar-Agar,
Polyamid, Polyester, Polyether, Polyacrylat oder Gemische davon,
r 0,00001 bis 1 je wiederkehrende Einheit des

Polymeren und

s 0 bis 2 je wiederkehrende Einheit des Polymeren bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß man ein natürliches oder synthetisches Polymer oder deren Gemische mit anorganischen und/oder organischen Verbindungen in Lösung oder Dispersion aktiviert, das aktivierte Polymer oder Polymerengemisch mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II,

H-X-(Z-H)_n II

in der X, Z und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in Formel I, in Lösung oder Dispersion und nach oder gleichzeitig mit der so erfolgten Hydrophobierung entweder mit einer Verbindung der Formel III,

H-X-(Z-Y)_n III

in der X, Z und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in Formol I und Y eine Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Phosphorsäure-, Phosphorigsäure-, Phosphinsäure-, Borsäure- oder Sulfinsäuregruppe ist, in Lösung oder Dispersion oder mit einer Verbindung der Formel IHa in Lösung,

H-X-(Z-Y)_n ' IHa

12 +12 3

worin Y eine -NR R - oder -N RR R -Gruppierung bedeutet, worin

12 3
R , R , R sowie X und η die gleiche Bedeutung aufweisen wie in Formel I, oder mit mindestens je einer Verbindung der allgemeinen Formeln III und IHa umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivierung durch anorganische Stoffe erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivierung mit Periodsäure in Natronlauge durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivierung mit Natronlauge und einem Säurechlorid durchgeführt wird.
5. Vorfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivierung mit einem Säurechlorid, Bromcyan, Glutaraldehyd, einem Bisoxiran,oder einem Oiisocyanat erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das aktivierte Polymer mit einer Verbindung der Formel II, in der X eine -NH-Gruppierung, η gleich 2 und Z gleiche oder verschiedene C.__ia~Alkylgruppen oder substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen sind, umgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß das aktivierte Polymer mit einem Dialkyl- oder Diarylamin umgesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Oialkylamin Dioctylamin ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das aktivierte Polymer mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III, worin Y eine Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Borsäure- oder Phosphorsäuregruppe bedeutet und X, Z und η wie in Formel I definiert sind, umgesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das aktivierte Polymer mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IUa umgesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein aktiviertes Polymer mit einer Verbindung der Formel II und gleichzeitig oder in einer weiteren Stufe mit einer Verbindung der Formel III und gleichzeitig oder in einer weite-

ren Stufe mit einer Verbindung der Formel UIa umgesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung des aktivierten Polymeren oder -gemisches mit dsn Verbindungen der Formel II, III und IHa in einem organischen Lösungsmittel, das bis zu 50 Gew.-% Wasser enthält, durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung des aktivierten Polymeren oder Polymerengemisches gleichzeitig oder durch Mischung einer wäßrigen Lösung der Verbindung der allgemeinen Formel III und einer organischen Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel II erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung des aktivierten Polymeren oder Polymerengemisches in einer ersten Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II in einem organischen Lösungsmittel, in einer zweiten Stufe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III in wäßriger Lösung und in einer dritten Stufe mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung der allgemeinen Formel IHa durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1_{ gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung des aktivierten Polymeren oder Polymerengemisches mit je einer Verbindung der Formeln II, III und IHa gleichzeitig in einem Gemisch aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als aktiviertes Polymer oder Polymerengemisch makromolekulare Massen mit chemisch aktiven Füllstoffen, bestehend aus

- einer makromolekularen Verbindung in einer Konzentration von 5 bis 80 Vol.-%,

- einer makromolekularen Verbindung mit 4,6-Dihalogen-l,3,5-triazin-Gruppierungen in einer Konzentration von 1 bis 80 Vol.-ft,

- 2,4,6-Trihalogen-l,3,5-triazin in einer Konzentration von 0,5 - 50 Vol.-SS,

WfCH

- Metallhalogeniden in einer Konzentration bis zu 20 Vol.-% und

- gegebenenfalls puffernden Substanzen bis zu 5 Vol.-%, eingesetzt werden. ,
17. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die aktivierten Polymere oder Polymerengemische als Pulver, Granulate, Fasern, Gele, Vliese, Gewebe, Folien, Filme, Membranen oder als papierähnliche Formen eingesetzt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 1, 16 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß das aktivierte Polymer oder Polymerengemisch als makromolekulare Masse mit chemisch aktiven Füllstoffen als papierähnliche Form eingesetzt wird.