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Die
Erfindung bezieht sich auf eine funktionalisierte Membran bzw. Matrix
zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
und auf Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, bei denen derartige Membranen/Matrizes zum
Einsatz kommen.
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Gattungsgemäße Membranen
sind z. B. aus dem US-Patent 5438128 bekannt. Die hier beschriebenen
porösen
Polymermembranen, z. B. aus Polypropylen oder Nylon, sind mit Ionenaustauschergruppen
funktionalisiert. Bei geringer Ionenkonzentration binden die funktionalisierten
Membranen ionisierte Nukleinsäuren, während eine
Elution der gebundenen Nukleinsäuren
bei hoher Ionenkonzentration erfolgt.
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Die
bekannten Membranen werden in Verfahren bzw. Kits zur Nukleinsäureaufreinigung
eingesetzt. Üblicherweise
wird dabei zunächst
das ggf. vorgereinigte, die Nukleinsäuren enthaltene Ausgangsmaterial
in einem Bindungspuffer mit niedriger Ionenkonzentration durch die
poröse
Membran gesaugt oder gedrückt.
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Beim
Passieren der Membran werden die Nukleinsäuren selektiv von den Ionenaustauschergruppen an
der Membranoberfläche
gebunden. In einem nächsten
Schritt wird die Membran dann ggf. mit einem Puffer höherer Ionenstärke gewaschen,
um unspezifisch gebundene Verunreinigungen abzutrennen. Die Elution
der gebundenen Nukleinsäuren
erfolgt dann in einem weiteren Schritt mit einem Puffer noch höherer Ionenstärke.
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Nachteilig
an der bekannten Methode ist, dass wegen der hohen Salzkonzentration
das Eluat vor einer weiteren Aufarbeitung in aller Regel weiter
z. B. mittels Ethanolfällung
oder Dialyse aufgereinigt werden muss.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, eine bezüglich ihrer Bindungseigenschaften
für Nukleinsäuren schaltbare
Membran bzw. Matrix für
eine einfachere Aufreinigung von Nukleinsäuren bereitzustellen, sowie
auf die Membran bzw. Matrix abgestimmte Verfahren zur Reinigung
von Nukleinsäuren
anzugeben.
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Diese
Aufgaben werden gemäß der unabhängigen Ansprüche 1, 8,
13 und 16 gelöst.
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Die
erfindungsgemäß zur Aufreinigung
von Nukleinsäuren
eingesetzten Membranen weisen als wesentliches Merkmal auf, dass
ihre Oberfläche
mit deprotonierbaren Gruppen funktionalisiert ist. Solche Membranen
sind von Ulbricht und Riedel in Biomaterials 19 (1998) 1229–1237 in
Verbindung mit der Immobilisierung von Proteinen beschrieben worden.
Die erfindungsgemäße Bestimmung,
nämlich
die Aufreinigung von Nukleinsäuren,
ist seinerzeit nicht erwähnt
oder angedeutet worden.
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Wesentliche
Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten
Membranen ist, dass sie aufgrund der Funktionalisierung mit deprotonierbaren
Gruppen eine Oberflä che
aufweisen, deren Affinität
für Nukleinsäuren variabel
einstellbar (schaltbar) ist. Wie sich gezeigt hat, lassen sich die
Bindungseigenschaften der Membran insbesondere pH-abhängig und/oder
in Abhängigkeit
von der Ionenkonzentration reproduzierbar einstellen.
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Die
Membranen können
dabei z. B. zur Reinigung von Nukleinsäuren aus PCR-Ansätzen aber
auch generell zur Reinigung von mRNA, Gesamt RNA oder DNA, insbesondere
Plasmid-DNA (pDNA) oder genomischer DNA eingesetzt werden.
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Das
US-Patent 5693785 beschreibt den Einsatz von hydroxylierten Silika-Beads
zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.
Allerdings ist bei den meisten hierin beschriebenen Aufarbeitungsprotokollen
der Einsatz eines chaotropen Bindungspuffers erforderlich, um eine
ausreichende Bindung der DNA an den Silika-Beads zu gewährleisten.
In Abwesenheit von chaotropen Bindungspuffern erfolgt eine Bindung
nur, wenn die Oberfläche stark
elektropositiv geladen ist. Die Möglichkeit, die Bindungseigenschaften
der Oberfläche
in Abhängigkeit von
den Umgebungsbedingungen zu beeinflussen, wird an keiner Stelle
angesprochen oder nahegelegt.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Einsatz
von funktionalisierten Membranen erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren bevorzugt
in Abwesenheit von chaotropen Reagenzien Die Elution der gebundenen
Nukleinsäuren ist
unter Niedrigsalzbedingungen und ggf. bei Raumtemperatur möglich, was
die Aufarbeitung wesentlich vereinfacht. Natürlich ist aber auch eine Aufarbeitung
in Gegenwart von chaotropen Reagenzien möglich, falls dies gewünscht ist.
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In
der Praxis hat sich herausgestellt, dass die Membranen bei einem
pH-Wert unterhalb oder im Bereich des pK-Wertes ihrer Oberfläche und/oder
erhöhter
Ionenkonzentration gute Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren aufweisen. Ver schiebt
man den pH-Wert zum alkalischen und/oder erniedrigt man die Ionenkonzentration
des die Membran umgebenden Mediums, so lässt die Affinität der Membran
für Nukleinsäuren nach,
und unter diesen Umständen
ist z. B. die Elution der gebundenen Nukleinsäuren möglich.
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Die
Bedingungen, mit denen die Membranen zur Nukleinsäureaufreinigung
eingesetzt werden können,
lassen sich daher sehr variabel und den unterschiedlichen Anwendungszwecken
angepasst einstellen.
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Ein
weiterer wesentlicher Vorteil ist, dass die Membranen aufgrund ihrer
Funktionalisierung hydrophile Oberflächeneigenschaften aufweisen
und deswegen sehr gut benetzbar sind. Im Hinblick auf die gute Benetzbarkeit
können
die Volumina der eingesetzten Elutionspuffer sehr gering gehalten
werden.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Membranen sind mit Sulfonsäure-,
Carbonsäure-
oder Phosphorsäuregruppen
funktionalisiert. Solche Membranen besitzen besonders exakt schaltbare
Oberflächeneigenschaften,
d. h. ihre Affinität
zu Nukleinsäuren
lässt sich über den
pH-Wert und/oder die Ionenkonzentration des umgebenden Mediums gut
einstellen.
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Zur
Ausbildung der erfindungsgemäßen Membran
mit schaltbaren Oberflächeneigenschaften
genügt es
grundsätzlich,
die deprotonierbaren Gruppen direkt in bzw. an der Membranoberfläche vorzusehen.
Wichtig ist lediglich, dass die Gruppen in Kontakt mit dem umgebenden
Medium gelangen und in Abhängigkeit
von den Bedingungen in dem Medium in neutralem oder deprotoniertem
Zustand vorliegen.
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Bevorzugt
werden die Gruppen jedoch an Polymerketten, insbesondere z. B. Polyacrylsäure, vorgesehen,
deren eines Ende an der Oberfläche
der Membran fixiert ist und deren anderes Ende frei beweglich ist.
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Membranen
in dieser Ausgestaltung können
unterschiedliche Grenzflächenzustände einnehmen.
Bei einem pH-Wert unterhalb oder im Bereich des pK-Wertes der Membranoberfläche bzw.
bei höheren
Ionenkonzentrationen (z. B. > 500
mM) liegen die Polymerketten dicht an der Membran an. In diesem
Zustand können Nukleinsäuremoleküle besonders
effizient an der Membranoberfläche
adsorbieren, wobei vermutlich heterogene Wechselwirkungen, wie van
der Waals-Kräfte
oder hydrophobe aber auch ionische Wechselwirkungen zwischen der
Nukleinsäure
und der Polymerkette sowie den funktionellen Gruppen der Polymerkette
eine Rolle spielen.
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Wird
die Membranumgebung dagegen auf einen neutralen bis alkalischen
pH-Wert und/oder
eine niedrige Ionenkonzentration eingestellt, stehen die Polymerketten
von der Membranoberfläche
ab. In diesem Zustand lassen sich die gebundenen Nukleinsäuren in
besonders einfacher Weise von den Polymerketten eluieren, wobei
sowohl ionische Wechselwirkungen (die funktionellen Gruppen in den
Polymerketten sind negativ geladen und stoßen das ebenfalls negativ geladene
Nukleinsäuremolekül ab) als
auch möglicherweise
rein mechanische Gründe
eine Rolle spielen.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
Membranen sind insbesondere aus Kunststoff hergestellt. Bevorzugte
Materialien sind Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon oder
PVDF. Denkbar ist aber auch, Membranen aus anderen, z. B. anorganischen
Materialien wie z. B. Aluminiumoxid, Titanoxid, Zirconoxid oder
Siliciumdioxid herzustellen.
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Membranen
im erfindungsgemäßen Sinne
sind alle flächigen
Festphasen, die bevorzugt eine Schichtdicke von weniger als 500
Mikrometer aufweisen. Bevorzugt beträgt der Porendurchmesser 0,2
bis 10 Mikrometer.
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Da
die erfindungsgemäßen Membranen
insbesondere in Hochdurchsatz-Applikationen
eingesetzt werden sollen, sieht eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung
vor, dass sie zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten, Spin-Säulen oder
Reaktionsgefäßen konfektioniert
sind.
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Bislang
wurde die Erfindung im Hinblick auf den möglichen Einsatz von Membranen
erläutert.
Die zugrunde liegenden Prinzipien lassen sich aber auch auf andere
zur Trennung von Nukleinsäuren
einsetzbare durchströmbare
Matrizes anwenden.
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Die
Erfindung soll daher zusätzlich
auch den Einsatz solcher zur Aufreinigung von Nukleinsäuren geeigneten
Matrizes abdecken, die mit einer wie oben angesprochenen funktionalisierten
Oberfläche
ausgestattet sind. Die in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Membran
angesprochenen Ausgestaltungen können auch
bei solchen Matrizes Anwendung finden.
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Eine
besonders geeignete Matrix in diesem Zusammenhang wäre z. B.
ein Filter. Geeignet wären
aber auch Vlies, Filz, Fasern oder Sintermaterial. Als Matrix könnten weiterhin
auch entsprechend ausgerüstete
Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäße (Consumables) mit z. B.
Mikrostrukturkanälen
in Frage kommen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Nukleinsäureaufreinigung,
in denen die oben erwähnten
Membranen oder Matrizes Anwendung finden können.
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In
diesem Zusammenhang sind zunächst
in zwei unabhängigen
Ansprüchen
jeweils Verfahrensparameter angegeben, unter denen Nukleinsäuren selektiv
gebunden werden können.
In der nachfolgenden Erläuterung
wird auf Membranen Bezug genommen. Die Ausführungen gelten aber auch sinngemäß für eine durchströmbare Matrix.
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In
einer ersten Variante erreicht man die Nukleinsäurebindung, in dem man eine
Lösung
des die Nukleinsäuren
enthaltenen Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer mit einer
Ionenkonzentration von mehr als 100 mM durch die Membran permeieren
lässt,
wobei man bevorzugt den pH-Wert auf einen Wert unterhalb oder im
Bereich des pK-Werts der Membran- oder Matrixoberfläche einstellt.
Während
des Hindurchtretens werden die Nukleinsäuren selektiv von der Membranoberfläche absorbiert.
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Besonders
bevorzugt wird die Ionenkonzentration des Bindungspuffers auf einen
Wert von > 500 mM eingestellt.
Bei diesen Werten wurde eine reproduzierbare quantitative Ausbeute
beobachtet.
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In
einer weiteren Variante ist es möglich,
dass die Affinität
der Membran/Matrix zu Nukleinsäuren
zudem über
den pH-Wert eingestellt wird. Bei dieser Variante wird ein Bindungspuffer
mit einem pH-Wert gewählt,
der im Bereich oder unterhalb oder im Bereich des pK-Wertes z. B.
der Membranoberfläche
liegt. Auch bei diesen Bedingungen werden die Nukleinsäuren nahezu
quantitativ absorbiert, wenn man eine Lösung des die Nukleinsäuren enthaltenden
Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer mit dem angesprochenen pH-Wert
durch die Membran permeieren lässt.
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Die
dritte Variante schließlich
sieht vor, dass man das Ausgangsmaterial in einen Bindungspuffer
aufnimmt, der ein Fällungsmittel
in einer Konzentration unter halb des Wertes enthält, in der Nukleinsäuren ausfallen.
Als besonders geeignet hat sich hierbei Polyethylenglykol (PEG)
herausgestellt, das dem Bindungspuffer z. B. in einer Konzentration
von 6% (PEG 8000) zugesetzt sein kann. Auch in diesem Fall binden
die Nukleinsäuren
wiederum nahezu quantitativ an der Membranoberfläche.
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In
allen drei angesprochenen Varianten erfolgte eine Adsorption nur,
wenn die Membranen entsprechend funktionalisiert waren. Bei nicht
funktionalisierten Membranen erfolgte keine, bzw. keine nennenswerte Bindung.
Dies spricht dafür,
dass die angesprochenen Umgebungsbedingungen unabhängig voneinander, aber
nur in Verbindung mit der speziellen Membranoberfläche eine
Bindung von Nukleinsäure
favorisieren.
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Selbstverständlich ist
es aber auch möglich,
die einzelnen Parameter miteinander zu verknüpfen, d. h. die Membran zur
Bindung von Nukleinsäuren
auf ein Umgebungsmedium mit hoher Ionenkonzentration und niedrigem
pH-Wert einzustellen etc.
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Der
Bindungspuffer kann separat vorgesehen werden. Genauso gut ist es
aber auch möglich,
ihn mit dem oder einem Lyse-Puffer zu kombinieren.
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Bislang
wurde in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nur über die
selektive Bindung der Nukleinsäuren
an der Membran gesprochen. In den meisten Anwendungsfällen ist
zusätzlich
gewünscht, dass
sich die gebundenen Nukleinsäuren
ggf. nach Waschen wieder in einfacher Weise von der Membran eluieren
lassen. Auch hier hat sich wieder herausgestellt, dass die oben
angesprochenen unabhängigen
Varianten, die eine Bindung der Nukleinsäuren an der Membran favorisieren,
unter umgekehrten Vorzeichen zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren eingesetzt
werden können.
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Im
einfachsten Fall erfolgt eine Elution mit Wasser bei neutralem pH-Wert.
In Gegenwart von Wasser sind die funktionellen Gruppen der Membran
größtenteils
deprotoniert und die Ladungen sowohl der Membran als auch der Nukleinsäuren liegen
in nicht abgeschirmten Zustand vor. Es kommt zu ionischen Abstoßungsreaktionen,
die eine leichte Ablösung
der Nukleinsäuren
von der Membran ermöglichen.
Weist die Membran oder Matrix die oben angesprochenen Polymerketten
auf, an denen die funktionellen Gruppen vorgesehen sind, so tritt
als weiterer Effekt hinzu, dass sich die Ketten von der Membran
abstrecken und die Nukleinsäuren
(zusätzlich
zu den beschriebenen ionischen Wechselwirkungen) rein mechanisch
abstoßen.
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Neben
der Elution mit reinem Wasser sind selbstverständlich auch andere Elutionspuffer
denkbar. Welcher Puffer am ehesten geeignet ist, kann vom Fachmann
ohne großen
Aufwand ermittelt werden. Die generelle Regel ist, dass die Ionenkonzentration
des Elutionspuffers möglichst
niedrig und der pH-Wert möglichst oberhalb
des pK-Wertes der Membranoberfläche
eingestellt wird. Im Zweifelsfall kann man eine höhere Ionenkonzentration
(falls erforderlich) des Elutionspuffers ggf. über einen alkalischeren pH-Wert
ausgleichen und umgekehrt. Eine Optimierung beider Werte ist ohne
größeren Aufwand
möglich.
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Die
erfindungsgemäße Verwendung
von funktionalisierten Membranen bzw. die entsprechenden Verfahren
erlauben eine besonders einfache Aufreinigung von Nukleinsäuren mit
den üblichen
Schritten: Bindung der Nukleinsäuren
an einer Membran, Waschen der Membran und Elution der gebundenen
Nukleinsäuren.
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Alle
Schritte lassen sich in einfacher Weise, unter besonders schonenden
Bedingungen und mit guten Ausbeuten durchführen. Insbesondere kann auf
die im Stand der Technik meist erforderlichen chaotropen Reagenzien
und die üblicher weise
eingesetzten Beads verzichtet werden. Die Elution kann aufgrund
der guten Benetzbarkeit der Membranen und Matrizes mit geringsten
Puffervolumina und z. B. bei Raumtemperatur erfolgen.
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Besonders
geeignet ist die Erfindung z. B. zur Aufarbeitung von Plasmid-DNA
für die
Sequenzierung, um nur ein bevorzugtes Anwendungsfeld zu nennen.
Natürlich
lassen sich auch andere Nukleinsäuren
aus den unterschiedlichsten nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien,
ggf. nach Vorreinigung, aufreinigen.
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Im
folgenden soll die Erfindung anhand einiger Beispiele näher erläutert werden,
die besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele
betreffen.
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A: Herstellung funktionalisierter
Membranen
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Beispiel 1
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a) Modifizierung von Polypropylenmembranen
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Eine
Polypropylen-Mikrofiltrationsmembran (Accurel 2E HF, nominale Porengröße 0,2 μm, Membrandicke
150 μm;
Membrana GmbH, Wuppertal oder Versuchsmuster #1333-12A, nominale
Porengröße 0,45 μm, Membrandicke
110 μm,
3M, St. Paul, USA) mit einem Durchmesser von d = 80 mm wird unter
Schütteln
für 2 h
mit einer 100 mM Lösung
von Benzophenon (BP) in Aceton equilibriert. Nachfolgend wird die
Membran mit einer 10%igen wässrigen
Acrylsäurelösung überschichtet.
Anschließend
wird für
15 min mit UV-Strahlung (UVA-Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet.
Abschließend
wird die modifizierte Membran für
24 h bei 60°C
mit Wasser extrahiert und getrocknet.
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b) Modifizierung von Nylonmembranen
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Eine
Nylon-Mikrofiltrationsmembran (Schleicher & Schüll, nominale Porengröße 0,45 μm, Membrandicke
127 μm;)
wird unter den gleichen Bedingungen wie bei a) modifiziert.
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B: Aufreinigung von Nukleinsäuren
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Für die nachfolgenden
Aufreinigungen wurden die gemäß der Beispiele
1a und b hergestellten oberflächenmodifizierten
Membranen in eine 96er Mikrofiltrationsplatte eingespannt.
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Beispiel 2
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Als
Basismaterial für
diesen Versuch wird oberflächenmodifiziertes
PP (Beispiel 1a) mit einer nominalen Porenweite von 0,45 μm eingesetzt.
Die Aufreinigung erfolgte mittels Zentrifugation bei 3000 rpm, Raumtemperatur
(Eppendorf 5810R; A-2 DWP Rotor) nach dem Prinzip: Bind-Wash-Elute.
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Hierfür wird 1 μg pDNA mit
jeweils 200 μl
der Bindungspuffer 1 (BP1) oder 2 (BP2) versetzt (BP1: 5 mM Tris,
pH = 7,5; BP2: 4 M NaCl, pH = 4,6). Nach der Inkubation wird 2× mit je
200 μl 70%
EtOH gewaschen. Die Elution erfolgt mit 30 μl Tris (5 mM, pH = 7,5). Abschließend wird
ein zweites Mal mit 100 μl
eluiert. Die halbquantitative Auswertung von 4 μl Eluat erfolgte mittels Ethidiumbromid-Gelelektrophorese
(nicht dargestellt).
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Während bei
Einsatz des Bindungspuffers BP1 keine Adsorption an die Membran
erfolgt, lässt
sich die pDNA bei Verwendung von BP2 nahezu quantitativ an die Membran
binden und im ersten Elutionsschritt wieder eluieren.
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Beispiel 3
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Die
Durchführung
des Versuches erfolgt wie im Beispiel 2 beschrieben, wobei die Bindungspuffer
gemäß Tabelle
1 eingesetzt wurden. Die eingesetzte Menge pDNA beträgt 500 ng.
Die halbquantitative Analyse erfolgt über Gelelektrophorese (Ergebnisse
nicht dargestellt)
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Die
Auswertung ist in (Tabelle 1) zusammengefasst und erlaubt eine erste
Einschätzung
der Rückgewinnungsrate
(von – bis
+++)
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Wie
sich aus der Tabelle ergibt, lässt
sich lediglich bei der Acrylsäuremodifizierten
PP-Membran die DNA nahezu quantitativ binden und wieder eluieren.
Die Abhängigkeit
der Bindung vom pH-Wert der Inkubationslösung ist in Tabelle 1 deutlich
zu erkennen. Bei einem Wert unterhalb des pH-Wertes der Membranmodifizierung
findet eine Bindung statt. Bei einem pH-Wert darüber erfolgt keine Bindung.
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Beispiel 4
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Es
wird eine pDNA-Aufreinigung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse
durchgeführt.
Hierzu werden 1,5 ml Bakterienkultur mit den Puffern P1–P3 (P1:
100 μl,
P2: 300 μl,
P3: 300 μl)
aus dem Kit "Perfect
Prep Plasmid Midi" der
Fa. Eppendorf versetzt. Nach Zentrifugation wird das klare Lysat
mit jeweils 700 μl
Bin dungspuffer (s. Tabelle 2) versetzt. Die Aufarbeitung der Probe
erfolgt unter den im Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen. Zur Kontrolle
wird eine Plasmidpräparation
unter Durchführung
der kompletten Aufreinigungsprozedur mit dem Kit "Perfect Prep Plasmid
Mini" der Fa. Eppendorf,
aus der identischen 1,5 ml Bakterienkultur durchgeführt. Als
weitere Kontrolle wird das Gemisch aus geklärtem Lysat und jeweiligem Bindungspuffer
(s. Tabelle 2) für
30 Minuten bei 12000 g, Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand
entfernt. Danach erfolgt zweimaliges Waschen mit 200 μl 70% Ethanol,
Trocknung unter Vakuum, sowie die Zugabe von 30 μl Tris-HCl, pH 7,5.
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Ausbeute
und Reinheit wurden mittels Photometrie und Analyse durch Ethidiumbromid-Gelelektrophorese
bestimmt (Tabelle 2,
1). Die Tabelle gibt die mittels
Photometer (Biophotometer der Fa. Eppendorf) bestimmte Konzentration
der eluierten pDNA in ng/μl
an. Tabelle
2
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Die
Plasmid DNA des GFP-N1 wurde nach Auftrennung im 0,8% Ethidiumbro
mid-Agarosegel analysiert, das als 1 wiedergegeben
ist. Die Spuren des Gels wurden wie folgt belegt:
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Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus, Bindungspuffer
pH 7,4
- 2.) Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus,
Bindungspuffer pH 4,6
- 3.) Bindungspuffer pH 4,6 unmodifizierte Membran
- 4.) Bindungspuffer pH 7,4 unmodifizierte Membran
- 5.) Bindungspuffer pH 4,6 modifizierte Membran
- 6.) Bindungspuffer pH 7,4 modifizierte Membran
- 7.) leer
- 8.) Kontrolle Plasmid Mini Präparation (Eppendorf Perfect
Prep Mini)
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Wie
das Gel (1) deutlich zeigt, lässt sich
nur unter Verwendung der modifzierten Nylon-Membran pDNA aufreinigen.
Die Aufreinigung ist abhängig
vom gewählten
pH-Wert. So konnte eine erfolgreiche pDNA Isolierung nur nach Verwendung
des Bindungspuffers mit pH 4,6 durchgeführt werden, nicht jedoch, wenn
der pH 7,4 beträgt.
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Die
Fällungsprozedur
eines DNA-Bindungspuffergemisches ohne Einsatz einer Membran verlief
erfolglos. Hieraus lässt
sich ableiten, dass die Isolierung auf die Modifizierung der Membran
unter ausgewählten pH
Bedingungen zurückzuführen ist
und nicht auf eine Fällungsreaktion.
