DD281397A5 - Verfahren zur aktivierung von carboxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung von carboxylgruppenhaltigen polymeren Verbindungen. Anwendungsgebiet sind die chemische und pharmazeutische Industrie, die Biotechnologie und die klinische Analytik. Erfindungsgemaesz werden carboxylgruppenhaltige Polymere mit * gegebenenfalls in Gegenwart eines tertiaeren und eines supernucleophilen Amins umgesetzt.{Aktivierung; carboxylgruppenhaltige polymere Verbindungen; Biotechnologie; klinische Analytik; * tertiaere Amine; supernucleophile Amine}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung von carboxylgruppenhaltigen polymer·/! Verbindungen und daraus gebildeten Festkörperoberflächen, die für die Bindung von niedermolekularen Liganden wie Aminen, Aminosäuren und SK-gruppenhaltigen Verbindungen, Protein, Nukleinsäuren und anderen biologischen Materialien in der Biotechnologie, den Biowissenschaften und der Medizin sowie der chemischen und pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden.
Für die Aktivierung carboxylgruppenhaltiger polymerer Verbindungen gibt es im Gegensatz zu dor Vielzahl der in der Literatur für hydroxy Igrupper.haltige Matrices beschriebenen Methoden nur eine geringe Anzahl von Möglichkeiten (P. D. G. Dean, W.S.Johnson, F.A. Middle, Affinity Chromatography, IRL Press, Oxford, 1985; W.H.Scouten, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, New York, 1981).
Für thermisch stabile Polymere, ζ. B. carboxylgruppenhaltige poröse Gläser, wurde die Aktivierung mit Thionylchlorid durchgeführt (H. h. Weetall in Methods in Enzymology 44,134 (1976)). Dabei werden die Carboxylgruppen durch überschüssiges .-'JCI2 in trockenem Chloroform unter Rückfluß bzw. in Gegenwart von Dimethylformamid auch bei niedrigeren Temperaturen in iußerst hydrolyseempfindliche Säurechloridgruppen überführt. Die Lagerung der aktivierte- Trägersoll über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator erfolgen. Die Kopplung von Liganden wird überwiegend in nichtwäßr: ien, aprotischen Lösungsmitteln in Gegenwart tertiärer Amine durchgeführt. Für die Kopplung von Proteinen in wäßrig alkalisc. er Lösung ν rd dabei die Verwendung hoher Proteinmengen vorgeschlagen. Am häufigsten ist der Einsatz von Carbodiimidon, so z. B. von Dicyclohexylcarbodiimid, für die Aktivierung carboxylgruppenhaltige; Polymerer (Carboxymethylagarose, Carboxyacrylamid u. a.) beschrieben JC. R. Lowe, MJ. Harvey, D. B.Craven, P. D.G. Dean, Biochom. J. 133,499 (1973); E. Brown und R. Joyeau, J.Chromatogr 150, 111 [1978]).
Die Hauptschwierigkeiten bei der Anwendung der Carbodiimid-Methode bestehen darin, daß die entstehenden Dialkylharnstoffe wasserunlöslich sind und sich nur sehr schwer abtrennen lassen und daß die durch Umlagerung der O-Acylharnstoffe gebildeten N-Acylha1 istoffe durch Bindung an der Matrix unerwünschte Eigenschaften (z. B. hydrophobe Wechselwirkungen) hervorrufen. Die Kopplung geringer Ligandmengen wird nach dieser Methr Ae nicht empfohlen.
Für carboxylgruppenhaltige Agarose, z. B. succinylierte Aminoalkylagarose, CH-Sepharose ti a., wurde die Veresterung der Carboxylgruppen mit N-Hydroxysuccinimid unter Verwendung von Carbodiimiden zu Aktivestern angewendet (M.Robert-Gero und J.P.Waller, Eur.J. Biochem.3.', 315 [19.'2)). Hierbei werden jedoch auch die schon erwähnten Nachteile des Carbodiirnid-Einsatzes wirksam.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein neues Aktivierungsverfahren für carboxylgruppenhaltige polymere Verbindungen zu entwickeln.
Darlegung des We<>jns der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, carboxylgruppenhaltige polymere Verbindungen so umzusetzen, daß sich reaktive Carbonsäureestergruppen bilden, die befähigt sind, mit Nucleophilen zu reagieren.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daiJ die carboxylgruppenhaltigen polymeren Verbindungen mit N-Chlorcarbonyloxy-önorbornen^.S-dicarboximirl (I = CICOONB) in organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-100°C, gegebenenfalls in Gegenwart von tertiären Aminen umgesetzt werden. Überraschenderweise sind die bei dieser Umsetzung gebildeten Anhydride (II) so instabil, daß sie sich unter CO2-Abspaltung zu den entsprechenden am Träger fixierten reaktiven Carbonsäureestern (III) umsetzen.
l0H
Als carboxylgruppenhaltige Polymere können sowohl natürliche Polymere bzw. deren Derivato, wie z.B. Carboxymethylcellulose, Car boxy rr· athyl-Agarose oder -Sephadex, CH-Sepharose 4 B u. a, als auch synthetische Polymere, wie z. B. Carboxy· Polyacrylamid, Anionenaustauscher von* Typ Wofatit PS oder Wofatit CA 20 (Hersteller: VEB Chemisches Kombinat Bitterfeld) eingesetzt werden.
Die Reaktion des N-Chlorcarbonyloxy-B-norbornen^-dicarboximids mit den carboxylgruppenhaltigen Polymeren wird in organischen Lösungsmitteln wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Pyridin, Acetonitril, Aceton, Chloroform oder aromatischen und aliphatischen Kohlenwasserstoffen u.a. durchgeführt. Alkohole oder andere hydroxylgruppenhaltige Lösungsmittel sind ungeeignet. Gegebenenfalls erfolgt die Umsetzung in Gegenwart von tertiären Aminen, wie z. B. Triethylamin, Pyridin, Ν,Ν-Dimethylanilin usw. als HCI-Fänger. Die zusätzliche Verwendung von supernucleophilen Aminen, wie 4-Dimethylaminopyridin, 4-Pyrrolidinopyridin, N-Methylimidazol, Diazabicyclo [5.4.0]undecen, Diazabicyclo [2.2.2]octan u.a. beschleunigt die Aktivierungsreaktion. Dabei reichen schon Zusätze von kaU'lytischen Mengen aus, um die Aktivierung bei Raumtemperatur innerhalb von 10 bis 30 Minuten abzuschließen. Die Aktivierung carboxylgruppenhaltiger Polymerer mit N-Chlorcarbonyloxy-ö-norbornen^^-dicarboximid durch die erfindungsgemäße Einstufenreaktion führt zu relativ hohen Aktivierungsgraden (bis 400μηιοΙ aktive Estergruppen pro Gramm trockenen Träger). Die Kopplung von niedermolekularen Liganden wie Aminen, Aminosäuren und SH-gruppenhaltigen Verbindungen, Proteinen, Nukleinsäuren und anderen biologischen Materialien kann je nach Bedarf in organischen Lösungsmitteln oder im wäßrigen Medium erfolgen, weil die aktiven Estergruppen relativ stabil sind und nur einer langsamen Hydrolyse unterliegen. In wasserfreien Lösungsmitteln bei 40C sind die aktivierten Träger 1 Jahr ohne Aktivitätsverlust lagerbar. Die Kopplungsfähigkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten aktivierten Träger wurde z.B. durch Kopplung von Glycin, Ovalbumin und Concanavalin A bewiesen.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung soll anhand folgender Beispiele erläutert werden:
Servacel CM 52 wird durch Behandlung mit Wasser-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes und wasserfreiem Aceton entwässert.
1 g entwässertes Servacel CM 52 wird in 13 ml Dioxan aufgenommen, in welchem 16 mMol CICOONB gelöst sind. Die Umsetzung erfolgt bei 70°C unter leichtem Schütieln. Nach 5 Stunden wird die Reaktion durch Absaugen der überstehenden Lösung ü'. er eine Glnsfritte und gründliches Waschen mit Aceton beendet. Der aktivierte Träger enthält 180μΜοΙ Estergruppen/g wasserfreies Material.
Die Bestimmung der Kopplungskapazität erfolgt durch Hydrolyse des aktivierten Trägers mit 0,1 N NU,OH und spektrophetometrische Bestimmung des abgespaltenen N-Hydroxy-ö-no.-bornen^.S-dicarboximids (HONB) bei 270nm (ε = 6,4· 10'ΜοΓ'ατΓ1).
Servacel CM 52 wird wie im Beispiel 1 entwässert.
1 g entwässertes Servacel CM 52 wird in 13 ml wasserfreiem Aceton aufgenommen, in welchem 2,1 mMol CICOONB gelöst sind.
Bei 2-4°C erfolgt innerhalb von 10 Minuten unter leichtem Schütteln die portionsweise Zugabe von 2,6mMoi Triethylamin und 0,2 mMol 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) gelöst in wasserfreiem Aceton. Nach 20 Minuten wird die Reaktion beendet, die überstehende Flüssigkeit wird vom Träger abgesaugt und das aktivierte Material ausgiebig mit Aceton gewaschen.
Die Koppliingskapazität beträgt 145μΜοΙ Estergruppen wasserfreies Material.
Beispi&l 3
Sfirvacxil CM 52 wird wie in Beispiel 1 entwässert.
1 g entwässertes Servacel CM 52 wird in 13 ml wasserfreiem Aceton aufgenommen, in welchem 4,2 mMol CICOONB gelöst sind.
Bei 2°C-4°C erfolgt innerhalb von 10 Minuten, unter leichtem Schütteln, die portionsweise Zugabe von 5,2 mMol Triethylamin und 0,4 mMol DMAP, gelöst in wasserfreiem Aceton.
Nach 20 Minuten Reaktion beträgt die Kopplungskaparität 174mMol Estergruppen pro Gramm wasserfreiem Material.
Nach 18 Stunden wird die Reaktion durch Absaugen des Übersxandes und Waschen mit Aceton beendet.
Die Kopplungskapazität beträgt 32OpMoI Estergruppen/g wasserfreies Material.
Eine Probe des aktivieren Servacel CM 52 stufenweise mit Aceton-Wassor-Gemischer. steigenden Wassergehaltesund mit Wasser behandelt.
Narh Äquilibrieren mit Natriumtetraborat-Puffer pH 8,1 wird der Träger mit Glycin umgesetzt. Die Ermittlung des kovalent gebundenen Glycns wird nach Antoni et al. (Analyt. Biochem. 129 [1933! 60-63) durch Rücktitration des nicht umgesetzten Glycins mit Trinitrobenzolsulfonsäure ermittelt.
Kopplungskapazitöt: 330μΜοΙ Glycin/g trockener Träger.
Whatmancellulose CM 52 wird analog Beispiel 1 entwässert.
1 s entwässerte Whatmancellulose CM 52 wird in 13ml wasserfreiem Aceton aufgenommen, in welchem 2,CmMoI Triethylamin und 0,2 mMol DMAP gelöst sind.
Bei Raumtemperatur erfolgt unter leichtem Schütteln innerhalb von 10 Minuten die portionsweise Zugabe von 2,1 mMol CICOONB, gelöst in wasserfreiem Aceton.
Nach 20 Minuten wird die Reaktion durch Absaugen des Überstandes und Waschen des Trägermaterials mit Aceton beendet.
Die Kopplungskapazität beträgt ΊΟΟμΜοΙ Estergruppen pro Gramm wasserfreies Material.
200mg der aktivierten Whatmancellulose CM 52 werden stufenweise mit Aceton-Wasser-Gemischen steigenden Wassergehaltes und Wasser behandelt.
Das aktivierte Material wird abgesaugt und mit 20mg Concanavalin A, gelöst in 2ml 0,1 M Natriumtetraboratpuffor pH 8,3, zur Reaktion gebracht. Die Kopplungsreaktion wird 16 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt. Nach dem Entfernen von nichtgebundenem Con A durch intensives Waschen mit 0,1 M Natrium-tetraboratpuffer pH 9,3, pH 8,3 und Wasser wird der gebundene Ligand durch 1N NaOH hydrolysiert und die Proteinmenge nach Lowry et al. (J. Biol.Chem. 193,265
(19511) bestimmt.
Die gebundene Con-A-Menge beträgt 38,4 mg/g trockener Träger.
Whatmancellulose CM 52 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, entwässert.
1 ο Whatmanceilulose CM 52 wird in 13ml Pyridin aufgenommen, in welchem 0,2 mMol DMAP gelöst sind. Bei Raumtemperatur erfolgt unier leichtem Schütteln innerhalb von 10 Minuten die portionsweise Zugabe von 2,1 mMol CICOONB, gelöst in wasserfreiem Aceton. Nach 20 Minuten wird die Reaktion, wie in Beispiel 4 beschrieben, beendet.
Die Kopplungskapazität beträgt 54μΜοΙ Estergruppen/g wasserfreies Material.
CM-Sephadex C-25 wird in trockenem Aceton aufgenommen und gründlich gewaschen.
Der Versuch wird gemäß Beispiel 4 durchgeführt.
Die Kopplungskapazität beträgt 30μΜοΙ Estergruppen/g wasserfreies Material.
Wofatit CP wird in trockenem Aceton aufgenommen und gründlich gewaschen.
1 g Wofatit CP wird in 11 ml trocke.ium Aceton aufgenommen, in welchem 14,1 mMol CICOON3 gelöst sind.
Die Umsetzung erfolgt bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
Nach 18 Stunden wird die Reaktion durch Absaugen des Überstandes und gründliches Waschen mit Aceton beendet.
Die Kopplungskapazität beträgt 95,OpMoI Estergruppen/g wasserfreies Material.
An den aktivierten Träger wird Ovalbumin gekoppelt.
Die Kopplungsreaktion und die Bestimmung der gebundenen Proteinmenge wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt.
200 mg aktiviertem Wofatit CP werden 5 mg Ovalbumin, gelöst in 1 ml 0,1 Natrium-tetraboratpuffer pH 8,3, angeboten.
Die gebundene Ovalbuminmenge beträgt 3,5mg pro Gramm trockenes Material. '
Wofatit CA 20 wird in trockenem Aceton aufgenommen und gründlich gewaschen.
Die Aktivierung wird analog Beispiel 7 durchgeführt.
Die Kopplungskapazität beträgt 244,0μΜοΙ Estergruppen/g wasserfreies Material.
Wofatit CA 20 wird in trockenem Aceton aufgenommen und gründlich gewaschen.
Der Versuch wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Anstelle von DMAP wurden 0,2 mMol N-Mehtylimidazol verwendet.
Die Kopplungskapazität beträgt 78,4 μΜοΙ Estergruppen/g wasserfreies Material.
Claims (3)
1. Verfahren zur Aktivierung von carbox/lgruppenhaltigen polymeren Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß earboxylgruppenhaltige Polymere mit N-Chlorcarbonyloxy-B-norbornen^S-dicarboximid gegebenenfalls in Gegenwart eines tertiären Amins und in Gegenwart zusätzlicher katalytischer Mengen eines supernucleopiiilen Amins in wasserfreien organischen Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0-1000C umgesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als supernucleophiles Amin 4-Dimethylaminopyridin, 4-Pyrrolidinopyridin, N-Methylimidazol, Diazabicyclo [5.4.0] undecen, Diazabicyclo (2.2.2.] octan eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel polare organische Verbindungen wie Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Pyridin u.a. oder unpolare Verbindungen wie Benzen, Toluen u. a. oder halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff u. a. bzw. Gemische dieser Lösungsmittel eingesetzt werden.
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|---|---|---|---|
| DD30462087A DD281397A5 (de) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | Verfahren zur aktivierung von carboxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| DE19855173A1 (de) * | 1998-11-30 | 2000-05-31 | Gottschall Instruction Ges Fue | Verfahren zur Herstellung derivatisierter Polymere |
| WO2002018634A2 (de) * | 2000-08-25 | 2002-03-07 | Giesing, Michael | Arrays immobilisierter biomoleküle, deren herstellung und verwendung |
| DE19928236C2 (de) * | 1999-06-21 | 2002-05-16 | Gottschall Instruction Ges Fue | Verfahren zur Herstellung von Kondensationsverbindungen |
-
1987
- 1987-07-03 DD DD30462087A patent/DD281397A5/de not_active IP Right Cessation
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| DE19855173C2 (de) * | 1998-11-30 | 2001-03-15 | Gottschall Instruction Ges Fue | Verfahren zur Herstellung derivatisierter Polymere und Derivate von funktionelle Gruppen aufweisende Polymere sowie Verfahren zur Substratbindung |
| DE19928236C2 (de) * | 1999-06-21 | 2002-05-16 | Gottschall Instruction Ges Fue | Verfahren zur Herstellung von Kondensationsverbindungen |
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| WO2002018634A3 (de) * | 2000-08-25 | 2002-09-26 | Giesing Michael | Arrays immobilisierter biomoleküle, deren herstellung und verwendung |
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