DE69634150T2 - Verfahren zur Immobilisierung von Liganden oder Verbindungen, an die Liganden gebunden sind - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines Liganden oder einer Verbindung, an die ein Ligand gebunden ist, auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger mit einem Aldehydrest.
  • Verfahren zur Immobilisierung eines Liganden auf einem Träger sind in großer Zahl zu Forschungen an einem immobilisierten Enzym und dergleichen untersucht und auch industriell zur Herstellung eines Adsorbens und dergleichen eingesetzt worden. Repräsentative Beispiele für die Verfahren sind die folgenden Verfahren:
    • (1) ein Verfahren zur Erzeugung eines Imidocarbonats durch ein Bromcyan-Aktivierungsverfahren und nachfolgendes Umsetzen mit einer Aminogruppe eines Liganden,
    • (2) ein Verfahren, das als Säureazidderivatverfahren bekannt ist, das Verestern der Carboxylgruppe an einem Träger, Überführen des resultierenden Esters in ein Hydrazid, nachfolgendes Überführen des resultierenden Hydrazids in ein Azid und schließlich Ersetzen der resultierenden Azidgruppe durch eine Aminogruppe eines Liganden umfasst,
    • (3) ein Verfahren, das als Diazoverfahren bekannt ist, das Erzeugen eines Diazoniumsalzes an einem Träger und zur Reaktion Bringen mit einer Aminogruppe eines Liganden umfasst,
    • (4) ein Verfahren, das als Kondensationsreagensverfahren bekannt ist, das Kondensieren einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe an einem Träger mit einer Carboxylgruppe oder Aminogruppe eines Liganden mit einem Kondensationsreagens umfasst,
    • (5) ein Verfahren, das als Alkylierungsverfahren bekannt ist, das Einführen einer Acetylbromidgruppe oder 4,6-Dichlor-s-triazinylgruppe auf einen Träger und zur Reaktion Bringen mit einer Aminogruppe eines Liganden umfasst,
    • (6) ein Verfahren, das als Trägervernetzungsverfahren bekannt ist, das Vernetzen einer Aminogruppe an einem Träger und einer Aminogruppe eines Liganden mit Glutaraldehyd und Reduzieren der resultierenden Verbindung umfasst, und dergleichen (Atsuo Tanaka, Takuo Kawamoto, Gendai Kagaku, S. 24–30, Juli 1992). Ein Verfahren zur Immobilisierung eines Liganden auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger mit einem Aldehydrest basiert auf dem vorstehend erwähnten Verfahren (6). Und dieses Verfahren umfasst das Umsetzen eines Liganden mit einer Aminogruppe zur Erzeugung einer Schiffschen Base und nachfolgendes Reduzieren (eine reduktive Aminierung).
  • Schemata der vorstehend erwähnten Immobilisierungsverfahren (1) bis (6) werden durch die folgenden Reaktionsformeln gezeigt. In den folgenden chemischen Reaktionsformeln ist Z ein Träger und ist E ein Enzym.
  • Verfahren (1)
    Figure 00020001
  • Verfahren (2)
    Figure 00020002
  • Verfahren (3)
    Figure 00020003
  • Verfahren (4)
    Figure 00030001
  • Verfahren (5)
    Figure 00030002
  • Verfahren (6)
    Figure 00030003
  • Jedoch haben diese Verfahren die folgenden Nachteile.
    • (a) Wenn es mehrere funktionelle Gruppen an einem Liganden gibt, die zur Immobilisierung verwendet werden sollen, ist es äußerst schwierig, den Liganden mit einer funktionellen Gruppe, die an einer vorgeschriebenen Position des Liganden vorliegt, zu immobilisieren, da es mehrere immobilisierte Punkte gibt. Weiterhin wird es nicht bevorzugt, dass es viele funktionelle Gruppen in einem Liganden gibt, da die Möglichkeit, dass viele Bindungen an vielen Punkten im Liganden erzeugt werden, hoch wird. Ebenso wird, wenn die Anzahl der funktionellen Gruppen im vorstehend erwähnten Liganden verringert wird, um die Erzeugung von Bindungen an mehrfachen Punkten zu vermeiden, die Reaktionsausbeute gering. Die Verfahren, welche diesen entsprechen, sind die vorstehend erwähnten Verfahren (1), (2), (3), (4), (5) und (6).
    • (b) Es gibt viele konkurrierende Nebenreaktionen und die Reaktionsausbeute ist gering. Die Verfahren, welche diesen entsprechen, sind die vorstehend erwähnten Verfahren (2), (3), (4) und (5).
  • Mit anderen Worten, diese Verfahren weisen erhebliche Begrenzungen bei der Immobilisierung eines Liganden an einer vorgeschriebenen Position auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger auf. Insbesondere wenn ein Peptid oder Protein als ein Ligand verwendet wird, ist es' unmöglich, einen Liganden mit einer vorgeschriebenen Aminogruppe auf dem Träger zu immobilisieren, da ein Peptid oder Protein oft Aminogruppen in einer Seitenkette aufweist (mit anderen Worten, es liegen mehrere Aminogruppen in einem Molekül vor).
  • Andererseits ist als eine Reaktion der organischen Synthesechemie seit langem bekannt, dass eine Thiazolidinstruktur erzeugt wird, wenn eine Aldehydverbindung und ein Derivat von Aminoethanthiol (HSCH2CH2NH2) in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators in einer wässrigen Lösung (Schmolka IR, J. Amer. Chem. Soc., 79, S. 4716 (1957) umgesetzt werden. In den letzten Jahren wurde diese klassische Reaktion untersucht, um sie auf die Erzeugung von Bindungen zwischen Peptiden anzuwenden, und es wurde in jüngster Zeit berichtet, dass Peptide mit dieser Reaktion effizient aneinander gebunden werden können (C. F. Liu, J. P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, S. 6584 (1994), C. Rao und J. P. Tam, J. Am. Chem. Soc., 116, S. 6975 (1994)).
  • Dieses Verfahren führt einen Aldehydrest in den C-Terminus einer von zwei Arten von Peptiden ein und bringt es zur Umsetzung mit dem anderen Peptid (N-terminales Cystein) und die Reaktion wird in einer wässrigen Lösung durchgeführt, in der beide Reaktanten in Wasser gelöst sind. Mit anderen Worten, es kann festgestellt werden, dass eine solche Reaktion lediglich als eine Reaktion in einheitlicher Lösung bekannt ist.
  • Im Allgemeinen lässt sich eine Reaktion zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase äußerst schwierig zum Ablaufen bringen. Wenn beispielsweise eine Dehydratationskondensation zwischen einer terminalen Aminogruppe (-NH2) einer hydrophilen Verbindung M mit einer Aminogruppe, beispielsweise ein Peptid, eine Aminosäure, ein Protein oder ein Derivat davon, und einer terminalen Carboxylgruppe (-COOH) einer hydrophilen Verbindung N mit einer Carboxylgruppe, beispielsweise ein Peptid, eine Aminosäure, ein Protein oder ein Derivat davon, unter Verwendung von DCC (Dicyclohexylcarbodümid) durchgeführt wird, ist die Tatsache bekannt, dass keine Reaktion zwischen der Carboxylgruppe der Verbindung N und DCC abläuft und keine Dehydratationskondensation eintritt, da DCC in Wasser (DCC liegt als Feststoff vor) in einer wässrigen Lösung unlöslich ist. Mit anderen Worten, scheint es ziemlich schwierig, die vorstehend erwähnte Reaktion, die von C. F. Liu et al. und von C. Rao et al. berichtet wurde, auf eine Reaktion zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase anzuwenden. Tatsächlich gibt es noch kein Beispiel dafür, dass die vorstehend erwähnte Reaktion auf eine zweiphasige Reaktion von fest-flüssigen Phasen angewendet wird.
  • Ein Adsorbens wird in Gebieten, wie ein Experiment, Industrie, medizinische Behandlung und Diagnose, zu Zwecken von Analyse, Trennung, Reinigung und Entfernung weit verbreitet eingesetzt. Die grundlegenden Komponenten eines Adsorbens bestehen aus einem so genannten Träger, der ein Feststoff ist, welcher in einem Elutionslösungsmittel unlöslich ist, und einem so genannten Liganden, welcher eine Verbindung mit einer hohen Affinität zu einer Zielsubstanz ist.
  • US-A-4,654,322 betrifft eine unlösliche Zusammensetzung zur Entfernung von Quecksilber aus einem flüssigen Medium, welche einen geeigneten, unlöslichen Träger und einen Cysteinrest umfasst, der kovalent mit dessen Stickstoffatom an der Oberfläche des Trägers fixiert ist.
  • Ein Verfahren, mit dem ein Ligand spezifisch an einer vorgeschriebenen Position eines Liganden mit einer hohen Reaktionseffizienz immobilisiert wird, wodurch eine stabile Bindung erzeugt wird, wird jetzt dringend als ein Verfahren zur Immobilisierung eines Liganden auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger verlangt. Jedoch gibt es derzeit kein solches Verfahren. Nachdem die hier genannten Erfinder das hohe Ausmaß an Schwierigkeiten und den starken Bedarf an der Einführung eines solchen Verfahrens gut kannten, haben sie begonnen, dieses Problem anzugehen.
  • Deshalb ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahren zur Immobilisierung eines Liganden oder einer Verbindung, an die ein Ligand gebunden ist, auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger, welches effizientes und spezifisches Umsetzen des Liganden oder der Verbindung mit dem Träger an einer vorgeschriebenen Position, wodurch eine stabile Bindung mit dem Träger erzeugt wird, umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung einer Verbindung auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger mit einem Aldehydrest, welches das Umsetzen des Trägers mit der Verbindung umfasst, wobei die Verbindung durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist:
    Figure 00060001
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (I) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom keine ungesättigte Bindung aufweist, R4 und R5 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist, oder durch die allgemeine Formel (II):
    Figure 00060002
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1, R2 und R6 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (II) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom keine ungesättigte Bindung aufweist, R4, R5 und R7 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist (Anspruch 1), und wobei die Verbindung (I) oder (II) auf dem Träger immobilisiert wird, wobei eine durch Formel (III)
    Figure 00060003
    bzw. Formel (IV) angegebene cyclische Struktur gebildet wird;
    Figure 00060004
    das Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Umsetzung zur Immobilisierung Bedingungen verwendet, welche Folgendem genügen: 0 < b/a ≤ 100und 1/1000 ≤ A ≤ 10000,wenn A (μmol/g) die Dichte an Aldehydresten des in Lösungsmittel unlöslichen Trägers, a (μmol) die Menge an Aldehydresten in einem Immobilisierungreaktionssystem und b (μmol) die Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung in dem System ist (Anspruch 2); das Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein als der in Lösungsmittel unlösliche Träger verwendete in Lösungsmittel unlösliche Träger durch Einführen eines Epoxyrests in einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger, welcher keinen Aldehydrest aufweist, Ringöffnen des Epoxyrests mit Ammoniak oder einem Amin und anschließendem Bilden eines Aldehydrests daraus durch eine oxidative Reaktion erhalten wird (Anspruch 3); das Verfahren nach Anspruch 1, wobei, nach der Immobilisierung der Verbindung auf dem Träger, die Behandlung unter Bedingungen durchgeführt wird, welche Folgendem genügen: t ≥ –10 × h + 120(250 ≥ t ≥ 20),wenn t (°C) die Behandlungstemperatur und h (Stunde) die Behandlungszeit ist (Anspruch 4).
  • In der vorliegenden Erfindung wird, wenn ein in Lösungsmittel unlöslicher Träger mit einem Aldehydrest mit der vorstehend erwähnten, durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung mit SH oder OH und Aminogruppe (NH) umgesetzt wird, ein Ligand dadurch immobilisiert, dass ausgenutzt wird, dass der Aldehydrest des Trägers spezifisch mit SH- oder OH-Gruppe und Aminogruppe in der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung reagiert, wodurch eine stabile Bindung erzeugt wird.
  • Der in Lösungsmittel unlösliche Träger bedeutet in der vorliegenden Erfindung einen Träger, der sich nicht in einem Lösungsmittel löst, das während einer Reaktion und einer Anwendung eingesetzt wird, und konkrete Beispiele für das Lösungsmittel sind beispielsweise Wasser, Alkohol, DMSO, DMF, NMP (N-Methylpyrrolidon), Dioxan, Aceton, THF (Tetrahydrofuran) und dergleichen.
  • Ferner kann eine Pufferlösung, die durch Zugeben von Essigsäure, Natriumacetat, Zitronensäure, Natriumcitrat, Phosphorsäure, Natriumphosphat, Borsäure, Natriumborat, Natriumchlorid, KCl oder dergleichen zu Wasser erhalten wurde, als ein Lösungsmittel verwendet werden. Diese Lösungsmittel können allein oder als Gemisch von zwei oder mehreren Arten der Lösungsmittel verwendet werden. Konkrete Beispiele für den in Lösungsmittel unlöslichen Träger, wenn Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel, das Wasser enthält, als ein Lösungsmittel verwendet wird, das heißt, konkrete Beispiele für den in Wasser unlöslichen Träger sind ein anorganischer Träger, wie Glaskügelchen oder Silikagel, ein in Wasser unlöslicher Träger, umfassend ein synthetisches Polymer, wie vernetzter Polyvinylalkohol, vernetztes Polyacrylat, vernetztes Polyacrylamid, vernetztes Polystyrol, Polyvinylalkohol, verseiftes Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polymethylmethacrylat, mit Polyacrylsäure gepfropftes Polyethylen oder mit Polyacrylamid gepfropftes Polyethylen, ein organischer Träger, umfassend ein Polysaccharid, wie kristalline Cellulose, vernetzte Cellulose, vernetzte Agarose, vernetztes Dextran oder Chitosan, und ein Verbundträger, der durch eine Kombination der vorstehend erwähnten Träger erhalten wurde, wie ein organisch-organischer Träger oder ein organisch-anorganischer Träger. Diese Träger können allein verwendet werden oder können in einem Gemisch von zwei oder mehreren Arten davon verwendet werden. Darunter wird ein hydrophiler Träger bevorzugt, da die nicht spezifische Adsorption vergleichsweise gering ist und die selektive Adsorption durch einen Liganden gut ist.
  • Der vorstehend erwähnte hydrophile Träger bedeutet einen Träger mit einem Kontaktwinkel von höchstens 60° mit Wasser. Der Kontaktwinkel ist der einer Verbindung, aus der der Träger besteht, welche so erzeugt wurde, dass sie in der Form einer flachen Platte vorliegt. Repräsentative Beispiele für einen solchen hydrophilen Träger sind beispielsweise Träger, umfassend ein Polysaccharid, wie kristalline Cellulose, vernetzte Cellulose, mit Chitosan vernetzte Agarose oder vernetztes Dextran; Polyvinylalkohol, verseiftes Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, mit Polyacrylsäure gepfropftes Polyethylen, mit Polyacrylamid gepfropftes Polyethylen, Glas und/oder dergleichen.
  • Unter diesen hydrophilen Trägern ist ein Träger mit OH-Gruppe in dem Punkt überlegen, dass die nicht spezifische Adsorption gering ist. Insbesondere ist ein poröses Gel, umfassend kristalline Cellulose oder vernetzte Cellulose, wegen der überlegenen Punkte, wie folgt, der am stärksten Bevorzugte, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
    • (1) der Träger aus dem porösen Gel wird wegen einer verhältnismäßig hohen mechanischen Festigkeit und Zähigkeit durch den Vorgang des Rührens und dergleichen kaum zerstört oder erzeugt dadurch fein verteilte Teilchen. Da der Träger weder verdichtet noch verstopft wird, wenn eine Säule damit beladen wird und eine Flüssigkeit mit einer hohen Strömungsgeschwindigkeit durch die Säule geleitet wird, kann eine Flüssigkeit mit einer hohen Strömungsgeschwindigkeit durch die Säule geleitet werden. Ferner verändert sich die Porenstruktur kaum durch Hochdruckdampfsterilisation;
    • (2) der Träger ist hydrophil, da das Gel aus kristalliner Cellulose oder vernetzter Cellulose besteht. Es liegen viele OH-Gruppen vor, die zum Binden eines Liganden verfügbar sind, und die nicht spezifische Adsorption ist auch gering;
    • (3) das Gel weist verhältnismäßig hohe Festigkeit auf, selbst wenn das Volumen seines Porenraums vergrößert wird. Somit wird ein Adsorptionsvermögen, welches dem eines weichen Gels nicht unterlegen ist, erhalten; und dergleichen.
  • Jedoch ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger nicht lediglich darauf begrenzt.
  • Der in Lösungsmittel unlösliche Träger mit einem Aldehydrest, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann erhalten werden, indem ein Aldehydrest in einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger eingeführt wird. Verschiedene Verfahren zum Einführen eines Aldehydrests in einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger sind bislang untersucht worden. Jedes Verfahren zur Einführung kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Nachstehend wird als ein Beispiel ein Verfahren zum Einführen eines Aldehydrests in einen Träger aus Cellulose, der als Ausgangsmaterial verwendet wird, erwähnt.
  • Beispiele für das einfachste Verfahren zur Einführung des Aldehydrests sind (i) ein Verfahren, bei dem der Aldehydrest durch Umsetzung eines Celluloseträgers mit Natriumperiodat zur oxidativen Spaltung des Glucoserings eingeführt wird; (ii) ein Verfahren, bei dem der Aldehydrest durch Umsetzung einer Hydroxylgruppe eines Celluloseträgers mit Epichlorhydrin zur Einführung des Expoxyrests, Umsetzung des so eingeführten Epoxyrests mit einem Amin (z.B. NH3, Ethylendiamin oder dergleichen) zur Einführung der Aminogruppe und Umsetzung der so eingeführten Aminogruppe mit Glutaraldehyd zur Einführung des Aldehydrest durch eine reduktive Aminierung eingeführt wird; und dergleichen. Die hier genannten Erfinder haben ein Verfahren (iii) gefunden, das durch Verbesserung der vorstehenden Verfahren (i) und (ii) erhalten wurde. Beim Verfahren (iii) werden nach der Einführung der Aminogruppe durch das Verfahren (ii) 1 bis 5 Äquivalente eines Oxidationsmittels, wie Natriumperiodat, pro ein Äquivalent Aminogruppe mit der Aminogruppe umgesetzt. Die hier genannten Erfinder verwenden aus den folgenden Gründen vorzugsweise dieses Verfahren.
  • Das heißt, die Verfahren (ii) und (iii) sind dem Verfahren (i) in dem Punkt überlegen, dass keine Nebenreaktion einer Reaktion zur Immobilisierung eines Liganden auftritt, bei der ein Ligand selbst mit einer Aminogruppe in einer Seitenkette immobilisiert wird. Ferner ist das Verfahren (iii) dem Verfahren (ii) in den Punkten überlegen, dass die Reaktionsbedingungen sanft sind und dass die Reaktion auf einfache Weise in kurzer Zeit durchgeführt werden kann.
  • Das Merkmal des Verfahrens (iii) ist, dass der Aldehydrest durch Oxidieren einer terminalen funktionellen Gruppe eingeführt wird:
    Figure 00100001
    wobei R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit einer willkürlichen Anzahl von Kohlenstoffatomen, üblicherweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (konkret eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- oder Aminoethyl-(-CH2CH2-NH2)gruppe oder dergleichen) ist, ein bevorzugter Rest R ist unter den Gesichtspunkten von Durchführung der Reaktion und Reaktivität ein Wasserstoffatom. Diese Reaktion läuft quantitativ ab und endet in kurzer Zeit, etwa 5 Minuten.
  • Ein Schema des Verfahrens (iii) wird unter Verwendung der folgenden chemischen Reaktionsformel gezeigt.
  • Figure 00100002
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung, die mit einem Aldehydrest, der in einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger eingeführt wurde, umgesetzt werden soll, eine Verbindung mit einer vorgeschriebenen chemischen Struktur sein, die als eine Verbindung bekannt ist, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
    Figure 00100003
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (I) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom, das heißt ein an das vorstehend erwähnte Stickstoffatom gebundenes Atom, keine ungesättigte Bindung aufweist, R4 und R5 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist, oder durch die allgemeine Formel (II):
    Figure 00110001
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1, R2 und R6 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (II) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom keine ungesättigte Bindung aufweist, R4, R5 und R7 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist. XH und die Aminogruppe in der allgemeinen Formel (I) oder der allgemeinen Formel (II) können Reaktionspunkte sein und regiospezifisch einen Liganden an einem Träger durch Umsetzung mit einem Aldehydrest an einem Träger immobilisieren.
  • X in der allgemeinen Formel (I) und der allgemeinen Formel (II) ist -S- oder -O-. Wenn X eine dieser Gruppen ist, wird dies unter den Gesichtspunkten der Reaktivität in einer Immobilisierungsreaktion und Stabilität einer Bindung bevorzugt.
  • R1, R2 und R6 in der allgemeinen Formel (I) oder (II) sind wie vorstehend erwähnt, wobei jeder Rest ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist (beispielsweise ist in der gleichen Weise wie im Fall des vorstehend erwähnten Restes R der Alkylrest eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, iso-Propyl- oder iso-Butylgruppe oder dergleichen). Jedoch wird unter dem Gesichtspunkt der sterischen Hinderung während einer Reaktion bevorzugt, dass R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, R2 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist und R6 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist.
  • Ein Peptid oder Protein, dessen N-Terminus Cystein, Threonin oder Serin ist, weist die vorstehend erwähnte, vorgeschriebene chemische Struktur auf.
  • Bei einem Peptid oder Protein mit einer einzigen Kette, dessen N-Terminus Cystein, Threonin oder Serin ist, ergibt, selbst wenn Cystein, Threonin oder Serin an einer anderen Stelle als dem N-Terminus enthalten ist, dies nicht die vorstehend erwähnte, vorgeschriebene chemische Struktur und lediglich der Aminosäurerest am N-Terminus reagiert mit dem Aldehydrest an einem Träger.
  • Das einfachste Beispiel ist der Fall, bei dem lediglich Lysin am N-Terminus von Polylysin durch Cystein, Threonin oder Serin ersetzt wird. In diesem Fall ist es unmöglich, das substituierte Polylysin am N-Terminus mit einem beliebigen der Verfahren (1) bis (6) zu immobilisieren, die im Hintergrund des Fachgebiets beschrieben wurden. Jedoch wird es möglich, es am N-Terminus zu immobilisieren, wenn das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, bei dem der Aldehydrest auf den Träger eingeführt wurde.
  • Selbstverständlich ist es auch möglich, wenn eine als Ligand verwendete Verbindung ein Peptid oder Protein ist, dass sich Regiospezifität ergibt, indem die vorstehend erwähnte, vorgeschriebene chemische Struktur separat darin eingeführt wird. Dieses Verfahren ist auch bei der Immobilisierung eines anderen Liganden als einem Peptid oder Protein wirksam. Dieses Verfahren ist bei der Immobilisierung einer Verbindung mit einer nukleophilen funktionellen Gruppe, wie Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppe, in einer Seitenkette besonders wirksam.
  • Der Grund dafür ist, dass es im Falle der Immobilisierung einer Verbindung mit einer nukleophilen funktionellen Gruppe, wie Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppe, in einer Seitenkette schwierig ist, die Verbindung an einer vorgeschriebenen Position (eines Liganden) unter Verwendung eines üblicherweise bekannten Immobilisierungsverfahrens zu immobilisieren, d.h. ein Immobilisierungsverfahren, bei dem die Verbindung mit einem Epoxy-aktivierten Träger oder einem CNBr-aktivierten Träger umgesetzt wird (selbst wenn er die Verbindung mit einer terminalen funktionellen Gruppe immobilisiert, tritt auch eine Immobilisierungsreaktion an funktionellen Gruppen in einer Seitenkette ein). Im Gegensatz dazu tritt beim erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahren, selbst wenn die vorstehend erwähnte funktionelle Gruppe in einer Seitenkette enthalten ist, die Immobilisierung in einer Seitenkette nicht ein und die Richtung eines Liganden kann in die richtige Anordnung gebracht werden. Die Reaktion zwischen dem vorstehend erwähnten Träger und der erfindungsgemäßen, durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung wird nachstehend gezeigt.
  • Figure 00130001
  • (Durch die allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung)
    Figure 00130002
  • (Durch die allgemeine Formel (II) dargestellte Verbindung)
    Figure 00130003
  • Der Ausdruck „Ligand" bedeutet in dieser Beschreibung einen Liganden, der eine hohe Affinität zu einer Zielsubstanz hat und als ein Adsorbens eingesetzt werden kann, indem er auf einem Träger immobilisiert wird.
  • Demgemäß wird, wenn die Verbindung als Teil eines Liganden eine vorgeschriebene Struktur aufweist, die durch Entfernen der Reste R4 und R5 bzw. R4, R5 und R7 aus der durch die allgemeine Formel (I) bzw. (II) dargestellten Verbindung gegeben ist, die gesamte Verbindung in der allgemeinen Formel (I) oder (II) ein Ligand. Andererseits wird, wenn mindestens einer der Reste R4 und R5 oder mindestens einer der Reste R4, R5 und R7 in der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung als ein Ligand fungiert und andere Teile zur Immobilisierung verwendet werden, welche lediglich Regiospezifität aufweisen; mindestens einer der Reste R4 und R5 oder mindestens einer der Reste R4, R5 und R7 in der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung ein Ligand.
  • Wenn Bedingungen bei der Reaktion eingesetzt werden, bei der der vorstehend erwähnte, in Lösungsmittel unlösliche Träger mit einem Aldehydrest mit der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung umgesetzt wird, welche Folgendem genügen: 0 < b/a ≤ 100und 1/1000≤ A ≤ 10000,wenn A (μmolig) die Dichte an Aldehydresten des in Lösungsmittel unlöslichen Trägers, a (μmol) die Menge an Aldehydresten in einem Immobilisierungreaktionssystem und b (μmol) die Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung in dem System ist; kann die durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellte Verbindung am wirksamsten immobilisiert werden. Diese Bedingungen wurden von den hier genannten Erfindern gefunden.
  • Wenn der vorstehend erwähnte Wert b/a größer als 100 ist, ist es nicht ökonomisch, da die Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung, die nicht reagiert und zurückgewonnen wird, zunimmt. Stärker bevorzugte Bedingungen genügen Folgendem: 0 < b/a ≤ 10, und in fast allen Fällen wird keine Abnahme der Menge der immobilisierten Verbindung beobachtet, selbst wenn der Wert von b/a kleiner wird. Noch stärker bevorzugte Bedingungen genügen Folgendem: 0 < b/a ≤ 3, und diese Bedingungen sind bevorzugt und hochgradig ökonomisch, wenn die durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellte Verbindung teuer ist und die durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellte Verbindung in einer hohen Dichte immobilisiert werden sollte. Überraschenderweise kann eine Immobilisierungsausbeute von mindestens 70% erhalten werden, selbst wenn die Reaktion unter den Bedingungen von b/a = 1 durchgeführt wird (das heißt, eine zu einer Menge an Aldehydrest äquivalente Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung wird verwendet). Ferner wird b/a ≥ 1/1000 unter dem Gesichtspunkt der Immobilisierungsausbeute bevorzugt.
  • Andererseits wird, wenn A kleiner als 1/1000 ist, die Effektivität der Immobilisierung der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung äußerst schlecht, wie hoch auch immer die Konzentration der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung zunehmen mag. Im Gegensatz dazu übersteigt, wenn A größer als 10000 ist, die Menge der immobilisierten Verbindung in der Praxis bei weitem eine notwendige Menge der zu immobilisierenden Verbindung und es wird notwendig, einen Überschuss an Aldehydrest zu deaktivieren (die Aktivität des Aldehydrests verschwindet durch „Versiegeln" des Aldehydrests mit einer passenden Verbindung). Es tritt manchmal ein, dass die Wirksamkeit der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten, immobilisierten Verbindung als ein Ligand aus dem Grund verringert ist, dass das verwendete Deaktivierungsmittel die Verbindung stark beeinflusst.
  • Aus den vorstehend erwähnten Gründen wird 1/1000 ≤ A ≤ 10000 bevorzugt und 1/100 ≤ A ≤ 1000 wird stärker bevorzugt.
  • Außerdem gibt es verschiedene Verfahren zur Messung des Gewichts eines Trägers bei der Berechnung von A. Eine Bedingung kann mit dem folgenden Verfahren 1/1000 ≤ A ≤ 10000 erfüllen. Das heißt, im Falle des Trocknens eines porösen Gels oder dergleichen gibt es ein Verfahren, bei dem ein Lösungsmittel von der Außenseite des Gels auf einem Glasfilter durch Saugtrocknung angesaugt und entfernt wird, und selbst Wasser im Inneren des Gels kann vollständig durch Lyophilisieren oder dergleichen entfernt werden.
  • Andererseits kann bei einem Verfahren zur Immobilisierung der vorstehend erwähnten Verbindung auf einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger eine stabile Bindung erzeugt werden, indem nicht umgesetzter Ligand durch Waschen oder dergleichen nach der Reaktion und dann durch mindestens 10-stündiges Behandeln bei 20°C oder mindestens 30-minütiges Behandeln bei 115°C entfernt wird. Wenn t [°C] die Behandlungstemperatur und h [Stunde] die Behandlungszeit ist, werden diese Bedingungen ausgedrückt durch die numerische Formel: t ≥ –10 × h + 120(250 ≥ t ≥ 20)
  • Wenn die Behandlung bei Bedingungen, die der vorstehend erwähnten Formel genügen, durchgeführt wird, kann nur eine stabile Bindung verbleiben und eine unstabile Bindung kann äußerst leicht weggenommen und entfernt werden. Diese Behandlung ist bei einigen Arten der Verwendung nicht unbedingt erforderlich, aber es ist eine äußerst wirksame Behandlung, um das Eliminieren eines Liganden von einem Adsorbens zu vermeiden. Die Obergrenze für die Behandlungstemperatur t beträgt etwa 250°C unter dem Gesichtspunkt der Festigkeit einer Bindung und stärker bevorzugt etwa 150°C und die Untergrenze beträgt etwa 20°C unter dem Gesichtspunkt der Behandlungszeit.
  • Als eine bevorzugte Ausführungsform des vorstehend erwähnten Immobilisierungsverfahrens wird beispielhaft ein Verfahren veranschaulicht, das Ringöffnen des Epoxyrests, der in einen hydrophilen Träger mit einer vergleichsweise geringen nicht spezifischen Adsorptionseigenschaft und einer guten Selektivität der Adsorption durch einen Liganden (ein Träger, umfassend ein Polysaccharid, wie Cellulose, Agarose, Dextran oder Chitosan oder dergleichen, wird besonders bevorzugt) eingeführt wird, durch Einwirkung von Ammoniak oder eines Amins; Einführen einer Hydroxylgruppe bzw. eines Rests mit einer Aminogruppe an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen und dann Umwandeln der Hydroxylgruppe in einen Aldehydrest durch eine oxidative Reaktion; und Umsetzen der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung mit einem Aldehydrest unter Bedingungen umfasst, die 1/10 ≤ b/a ≤ 10, 1 ≤ A < 500erfüllen, wobei A (μmol/g) die Dichte an Aldehydresten des in Wasser unlöslichen Trägers ist; a (μmol) die Menge an Aldehydresten im Reaktionssystem ist; b (μmol) die Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung im Reaktionssystem ist. Nach der Reaktion kann die Bindung zwischen dem Träger und dem Liganden stabil gemacht werden, indem der so erhaltene Träger etwa 240 bis etwa 20 Minuten bei 80°C bis 130°C behandelt wird.
  • Wenn ein Ligand mit dem vorstehend erwähnten Verfahren immobilisiert wird, ist es möglich, einen Träger herzustellen, auf dem ein Ligand durch eine stabile Bindung immobilisiert ist, indem ein Ligand zur spezifischen und effizienten Reaktion mit einem Aldehydrest eines in Lösungsmittel unlöslichen Trägers an einer vorgeschriebenen Position gebracht wird.
  • Nachstehend wird das erfindungsgemäßen Verfahren mittels der folgenden Beispiele erläutert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt.
  • BEISPIEL 1
  • Nachdem Wasser zu 90 ml CKA3 (hergestellt von CHISSO CORPORATION), das ein poröses hartes Cellulosegel war, gegeben worden war, so dass sich 180 ml Gesamtvolumen des resultierenden Gemischs ergaben, wurde dazu 60 ml 2 M Natriumhydroxid gegeben.
  • Dann wurde die Temperatur des Gemischs auf 40°C angehoben. Nachdem 21 ml Epichlorhydrin dazugegeben worden waren, wurde eine Reaktion eine Stunde bei 40°C unter Rühren durchgeführt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das resultierende Reaktans vollständig mit Wasser gewaschen, so dass sich ein Gel ergab, in das ein Epoxyrest eingeführt war.
  • Nachdem 3 ml 28%iger wässriger Ammoniak und 17 ml Wasser zu 10 g des so erhaltenen Gels, in das ein Epoxyrest eingeführt war, gegeben worden waren, wurde das Gemisch gerührt. Dann wurde das Gemisch 20 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das eine Aminogruppe eingeführt war (10 μmol/g). Nachfolgend wurden dazu 25 ml wässrige Lösung von 10 μmol/ml Natriummetaperiodat gegeben, gefolgt von fünf Minuten Rühren bei Zimmertemperatur. Dann wurde das Gemisch mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das ein Aldehydrest eingeführt war (10 μmol/g). Die Menge an eingeführtem Aldehydrest wurde bestimmt, indem 100 μmol Phenylhydrazin zu 1 g Gel mit eingeführten Aldehydrest gegeben wurde, so dass sich 5 ml Gesamtvolumen des resultierenden Gemischs ergaben, 4 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt wurde und die Extinktion von Phenylhydrazin in der überstehenden Lösung gemessen wurde. Als Kontrolle wurde 1 g Gel (CKA3), in das kein Aldehydrest eingeführt worden war, in der gleichen Weise wie im Vorstehenden behandelt und die Extinktion von Phenylhydrazin in der überstehenden Lösung wurde gemessen.
  • Cystein wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 3,0) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 10 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 3 g des vorstehend erwähnten Gels, in das ein Aldehydrest eingeführt worden war, in 3 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Cystein im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Cystein im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 20% von derjenigen vor der Reaktion.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 1
  • Lysin wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 3,0) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 10 μmol/ml Lysin ergab. Nachdem 3 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 3 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Lysin im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Jedoch gab es keine Änderung der Konzentrationen an Lysin vor und nach der Reaktion.
  • BEISPIEL 2
  • Cystein wurde in 100 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 5,0) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 20 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 3 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 100 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Nach der Immobilisierung von Cystein am Adsorbens wurde das Adsorbens zehn Stunden bei 100°C in 1 N Salzsäure erhitzt. Als Ergebnis der quantitativen Analyse des eliminierten Cysteins betrug die Menge an immobilisiertem Cystein 9,9 μmol/g.
  • Die quantitative Analyse wurde durchgeführt, indem eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumborat, die TNBS (Trinitrobenzolsulfonsäure) (1 μmol/ml) enthielt, zugegeben wurde, nachdem der pH-Wert auf 8,5 bis 9,0 eingestellt worden war, und die Menge an Aminogruppe gemessen wurde.
  • BEISPIEL 3
  • Cystein wurde in einem Gemisch aus 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,0) und N-Methylpyrrolidon im Verhältnis von 1:1 (Vol./Vol.) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 10 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 1 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 3 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden war, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Cystein im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Cystein im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 67% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 4
  • Cystein wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,5) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 5 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 3 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 3 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Cystein im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Cystein im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 2% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 5
  • Nachdem 90 ml CKA3 (hergestellt von CHISSO CORPORATION), das ein poröses starres Cellulosegel war, in Ethanol eingetaucht worden war, wurde Wasser durch Ethanol ersetzt. Ferner wurde Ethanol durch Heptan ersetzt. Nachdem 4 g 20%ige wässrige Lösung von Natriumhydroxid, 12 g Heptan und ein Tropfen Tween 20 (hergestellt von ICI Company) zu 10 ml des so erhaltenen Gels gegeben worden waren, wurde das Gemisch zwei Stunden bei 40°C gerührt. Ferner wurde, nachdem 5 g Epichlorhydrin dazugegeben worden waren, eine Reaktion zwei Stunden bei 40°C unter Rühren durchgeführt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das resultierende Reaktans vollständig mit Wasser gewaschen, so dass sich ein Gel ergab, in das ein Epoxyrest eingeführt war.
  • Nachdem 10 ml 28%iger wässriger Ammoniak und 10 ml Wasser zu 10 g des so erhaltenen Gels, in das ein Epoxyrest eingeführt war, gegeben worden waren, wurde das Gemisch gerührt. Dann wurde das Gemisch 20 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das eine Aminogruppe eingeführt war (100 μmol/g). Nachfolgend wurden dazu 40 ml wässrige Lösung von 40 μmol/ml Natriummetaperiodat gegeben, gefolgt von fünf Minuten Rühren bei Zimmertemperatur. Dann wurde das Gemisch mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das Aldehydreste eingeführt waren (100 μmol/g).
  • Cystein wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,5) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 5 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 1 g des vorstehend erwähnten Gels, in das ein Aldehydrest eingeführt worden war, in 10 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden war, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Cystein im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Cystein im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 2% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 6
  • Nachdem Wasser zu 90 ml CKA3 (hergestellt von CHISSO CORPORATION), das ein poröses starres Cellulosegel war, gegeben worden war, so dass sich 180 ml Gesamtvolumen des Gemischs ergaben, wurde dazu 60 ml 2 M Natriumhydroxid gegeben. Dann wurde die Temperatur des Gemischs auf 40°C angehoben. Nachdem 0,2 ml Epichlorhydrin dazugegeben worden waren, wurde eine Reaktion eine Stunde bei 40°C unter Rühren durchgeführt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das resultierende Reaktans vollständig mit Wasser gewaschen, so dass sich ein Gel ergab, in das ein Epoxyrest eingeführt war.
  • Nachdem 5 ml 28%iger wässriger Ammoniak und 95 ml Wasser zu 50 g des so erhaltenen Gels, in das ein Epoxyrest eingeführt war, gegeben worden waren, wurde das Gemisch gerührt. Dann wurde das Gemisch 20 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das eine Aminogruppe eingeführt war (0,1 μmol/g). Nachfolgend wurden dazu 50 ml wässrige Lösung von 0,5 μmol/ml Natriummetaperiodat gegeben, gefolgt von fünf Minuten Rühren bei Zimmertemperatur. Dann wurde das Gemisch mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen, wodurch sich ein Gel ergab, in das ein Aldehydrest eingeführt war (0,1 μmol/g).
  • Cystein wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,5) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 0,1 μmol/ml Cystein ergab. Nachdem 30 g des vorstehend erwähnten Gels, in das ein Aldehydrest eingeführt worden war, in 15 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zinmeremperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Cystein im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Cystin im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 10% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 7
  • Ein Peptid (vom N-Terminus, Cys-Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu, Molekulargewicht = 1029,1) wurde in 50 mM Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 3,0) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 2 mg/ml des Peptids ergab. Nachdem 0,72 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 1,4 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Peptid im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Peptid im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 2% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 8
  • Acetonitril und Wasser wurden im Verhältnis 1:1 (Vol./Vol.) gemischt und dazu wurde
    Figure 00200001
    gegeben, so dass sich eine Konzentration von 1 μmol/ml der Verbindung ergab. Nachdem 0,72 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 1,4 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen der Verbindung im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration der Verbindung im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 2% von derjenigen vor der Reaktion.
  • BEISPIEL 9
  • Ein Peptid (vom N-Terminus, Ser-(Lys)n-Lys, Molekulargewicht = etwa 10.000) wurde in 100 mM Bernsteinsäure-Natriumhydroxid-Puffer (pH-Wert 4,0) gelöst, so dass sich eine Konzentration von 2 μmol/ml des Peptids ergab. Nachdem 0,72 g Gel mit eingeführtem Aldehydrest, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 1,4 ml der so erhaltenen Lösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 40 Stunden bei 37°C gerührt, wodurch sich ein Adsorbens ergab. Die Konzentrationen an Peptid im Reaktionsgemisch vor und nach der Reaktion wurden gemessen. Die Konzentration an Peptid im Reaktionsgemisch nach der Reaktion betrug 50% von derjenigen vor der Reaktion.
  • Die Menge an Aldehydrest, die Menge an umgesetzter, durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellter Verbindung, das Verhältnis davon und die Menge der immobilisierten, durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung zu 1 g Träger in einem der Beispiele 1 bis 9 und Vergleichsbeispiel 1 sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Figure 00220001
  • BEISPIEL 10
  • Nachdem 68 mg Adsorbens, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, in 400 μl Kochsalzlösung suspendiert worden waren, wurde die Suspension 10 Stunden bei 20°C behandelt und dann damit ein Flüssigkeitsaustausch mit Wasser durchgeführt. Das resultierende Adsorbens wurde sauggetrocknet. Ferner wurde das getrocknete Adsorbens wiederum in 400 μl Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension wurde 65 Stunden bei 25°C gehalten. Die Konzentration an Cystein in der überstehenden Lösung wurde gemessen. Die Menge an Cystein, die aus dem Adsorbens eliminiert wurde, betrug weniger als 1% zu der Menge an immobilisiertem Cystein.
  • BEISPIEL 11
  • Nachdem 68 mg Adsorbens, das in Beispiel 7 hergestellt worden war, in 400 μl Phosphatpuffer/Kochsalzlösung (PBS) suspendiert worden waren, wurde die Suspension 30 Minuten bei 115°C in einem verschlossenen Behälter erhitzt und dann damit eine Flüssigkeitsaustausch mit Kochsalzlösung durchgeführt. Das resultierende Adsorbens wurde sauggetrocknet. Das getrocknete Adsorbens wurde wiederum in 400 μl PBS suspendiert und die Suspension wurde 65 Stunden bei 25°C gehalten. Die Konzentration an Peptid in der überstehenden Lösung wurde gemessen. Die Menge an Peptid, die aus dem Adsorbens eliminiert wurde, betrug weniger als 1% zu der Menge an immobilisiertem Peptid.
  • BEISPIEL 12
  • Nachdem 68 mg Adsorbens, das in Beispiel 9 hergestellt worden war, in 400 μl Wasser suspendiert worden waren, wurde die Suspension 8 Stunden bei 50°C erhitzt und dann damit ein Flüssigkeitsaustausch mit Kochsalzlösung durchgeführt. Das resultierende Adsorbens wurde sauggetrocknet. Das getrocknete Adsorbens wurde wiederum in 400 μl Wasser suspendiert und die Suspension wurde 65 Stunden bei 25°C gehalten. Die Konzentration an Peptid in der überstehenden Lösung wurde gemessen. Die Menge an Peptid, die aus dem Adsorbens eliminiert wurde, betrug weniger als 1% zu der Menge an immobilisiertem Peptid. Die Anteile der eliminierten Liganden in den Beispiele 10 bis 12 sind in Tabelle 2 aufgeführt.
  • Tabelle 2
    Figure 00240001
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren ist ein Immobilisierungsverfahren, das einfach ist, einen Liganden oder eine Verbindung, an die ein Ligand gebunden ist, zur spezifischen und wirksamen Reaktion mit einem Aldehydrest eines in Lösungsmittel unlöslichen Trägers an einer vorgeschriebenen Position bringt und eine stabile Bindung erzeugen kann. Deshalb ist das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren zur Herstellung eines Adsorbens und dergleichen verwendbar.

Claims (4)

  1. Verfahren zur Immobilisierung einer Verbindung auf einem in Lösungsmittel unlöslichen Träger mit einem Aldehydrest, welches das Umsetzen des Trägers mit der Verbindung umfasst, wobei die Verbindung durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist:
    Figure 00250001
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (I) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom keine ungesättigte Bindung aufweist, R4 und R5 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist, oder durch die allgemeine Formel (II):
    Figure 00250002
    wobei X gleich -S- oder -O- ist, R1, R2 und R6 gleich oder verschieden sind und jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, R3 ein Wasserstoffatom oder ein Substituent ist, wobei ein dem in der allgemeinen Formel (II) dargestellten Stickstoffatom benachbartes Atom keine ungesättigte Bindung aufweist, R4, R5 und R7 willkürliche Substituenten sind, mit der Maßgabe, dass nur eine chemische Teilstruktur von HX-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, oder HX-C-C-C-NHR3, wobei X und R3 wie vorstehend definiert sind, in einer Verbindung enthalten ist, und wobei die Verbindung (I) oder (II) auf dem Träger immobilisiert wird, wobei eine durch Formel (III)
    Figure 00260001
    bzw. Formel (IV) angegebene cyclische Struktur gebildet wird.
    Figure 00260002
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Umsetzung zur Immobilisierung Bedingungen verwendet, welche Folgendem genügen: 0 < b/a ≤ 100und 1/1000 ≤ A ≤ 10000,wenn A (μmol/g) die Dichte an Aldehydresten des in Lösungsmittel unlöslichen Trägers, a (μmol) die Menge an Aldehydresten in einem Immobilisierungreaktionssystem und b (μmol) die Menge der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellten Verbindung in dem System ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein als der in Lösungsmittel unlösliche Träger verwendete in Lösungsmittel unlösliche Träger durch Einführen eines Epoxyrests in einen in Lösungsmittel unlöslichen Träger, welcher keinen Aldehydrest aufweist, Ringöffnen des Epoxyrests mit Ammoniak oder einem Amin und anschließendem Bilden eines Aldehydrests davon durch eine oxidative Reaktion erhältlich ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei, nach der Immobilisierung der Verbindung auf dem Träger, die Behandlung unter Bedingungen durchgeführt wird, welche Folgendem genügen: t ≥ –10 × h + 120(250 ≥ t ≥ 20),wenn t (°C) die Behandlungstemperatur und h (Stunde) die Behandlungszeit ist.
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