DE2052212A1

DE2052212A1 - Chemische Bindung einer Aminosäure an einen polymeren Trager

Info

Publication number: DE2052212A1
Application number: DE19702052212
Authority: DE
Inventors: Johannes Jacobus Maastricht Kerkhoffs Pieter Laurens Geleen Dahlmans, (Nieder lande)
Original assignee: Stamicarbon BV
Current assignee: Stamicarbon BV
Priority date: 1969-10-25
Filing date: 1970-10-23
Publication date: 1971-05-13
Also published as: FR2066460A5; US3775378A; GB1321720A; SE364701B; CH562179A5; BE757783A; NL6916122A

Description

Kennzeichen 2220

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STAMICARBON N.V., HEERLEN (die Niederlande) Chemische Bindung einer Aminosäure an einen polymeren Träger

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum chemischen Binden einer Aminosäure oder eines Aminosäurederivats an einen polymeren Träger, Ein solches Verfahren ist etwa für die Synthese von Peptiden nach der Festphasenraethode, auch wohl Merrifield-Methode genannt, von Bedeutung. Gemäss dieser in mehreren Veröffentlichungen beschriebenen Methode (siehe z.B. 'Recent Progress in Hormone Research¹ £3 (1967), Seiten 454-465) wird bei der Herstellung von Peptiden durch stufenweisen Aufbau der Arainosäurekette die Carboxylgruppe der ersten Aminosäure, die in dem zu erzeugenden Peptid am Carboxylende Platz finden soll, an einen polymeren Träger chemisch gebunden. Dabei wird die Aminogruppe der Aminosäure mit einer Schutzgruppe versehen, um zu vermeiden, dass die Aminogruppe eine Reaktion eingeht. Daraufhin wird die Aminoschutzgruppe von der an den Träger gebundenen Aminosäure getrennt und die freie Aminogruppe an die freie Carboxylgruppe der folgenden Aminosäure gebunden, die dazu mit einer Aminoschutzgruppe versehen ist. Nach Trennung der Aminoschutzgruppe erhält man ein Dipeptid, das mit dem Carboxylende an den festen Träger gebunden ist. An die freie Aminogruppe des Dipeptids kann dann wieder eine folgende Aminosäure gebunden werden, so dass man stufenweise die gewünschte Aminosäurekette aufbauen kann. Nachdem die letzte Aminosäure befestigt ist, wird die Bindung mit dem Träger unterbrochen und fällt das gewünschte Peptid als solches an.

Als Träger wird bei diesem Verfahren ein Polymer eingesetzt, das zum Binden der ersten Aminosäure mit freien Chlormethylgruppen versehen ist. Der

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ORIGINAL INSPECTED

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bedeutende Vorteil der Festphasen-Peptidsynthese 1st der, dass man nach der Bindung einer jeden Aminosäure das anfallende unlösliche Festprodukt in einfacher Weise, nämlich durch Filtration, von den Reaktionsteilnehmern und der; Nebenprodukten trennen kann. Ein grosser Nachteil dieser Peptidsynthese ist jedoch, dass maximal nur etwa 20 % der Chlormethylgruppen des Polymeren mit der ersten Aminosäure eine Bindungsreaktion eingehen, so dass bei dem weiteren Aufbau der Aminosäurekette die zu bindende Aminosäure nicht nur an die gewünschte Stelle, sondern auch mehr oder weniger an die noch freien Chlormethylgruppen gebunden wird. Ein weiterer Nachteil ist, dass bei der Bindung der ersten Aminosäure an den festen Träger, was bei etwa 80 C erfolgt, Racemisierung der Aminosäure auftreten kann.

Es wurde nunmehr gefunden, dass beim Einsatz eines polymeren Tragers, der mit Chlorsulfonsauregruppen versehen ist, diese Gruppen nahezu ganz an freie Aminogruppen gebunden werden können und dass sich diese Bindung bei niei^iger Temperatur durchfuhren lasst, so dass keine oder fast keine Racemisierung auftritt. Unter gleichzeitiger Trennung von Chlorwasserstoff kommt dabei eine Bindung zwischen dem Stikstoffatom der Aminogruppe und dem Schwefelatom der an den Trager gebundenen Sulfonsauregruppe zustande.

Est ist schon bekannt (siehe z.B. 'Journal of Amer. Chem. Soc.' 85 (1963) Seite 3045), um statt einer Carboxylgruppe eine Aminogruppe an einen Trager zu binden, allerdings nicht Über eine SuIfongruppe, sondern Über eine Oxycarbonylgruppe. Bei dieser bestehenden Methode hat es sich jedoch als unmöglich herausgestellt, folgende Aminosäuren racemisierungsfrei zu binden, ohne die Bindung mit dem Trager aufzuheben, so dass diese Methode keine praktische Bedeutung hat. Dagegen können, wenn Chlorsulfonsauregruppen an dem polymeren Trager benutzt werden, racemisierungsfreie Methoden zum Binden folgender Aminosäuren angewandt werden, ohne dass die Bindung mit dem Trager aufgehoben wird.

Die Erfindung sieht demnach ein Verfahren zua chemischen Binden einer Aminosäure oder eines Aminosaurederivats an einen polymeren Trager durch Reaktion einer freien Aminogruppe der betreffenden Verbindung mit einer reaktiven Gruppe des polymeren Tragers vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen polymeren Trager mit Chlorsulfonsäure als reaktive Gruppe verwendet.

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Erfindungsgemass lassen sich mehrere Aminosäuren vorzuglich an den polymeren Trager binden. Auch Valin, das infolge räumlicher Behinderung nur sehr schwer nach der bekannten Methode an einen Trager gebunden werden kann, lasst sich erfindungsgem&ss sehr gut an den betreffenden Träger binden.

Es können mehrere polymere Trager mit reaktiven Chlorsulfonsauregruppen eingesetzt werden, und zwar vorzugsweise ein mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrolpolymeres mit reaktiven Chlorsulfonsauregruppen. Solche Trager können hergestellt werden indem man nach Analogie mit der Chlorsulfonierung alkylierter Benzole (siehe Journal of American Chemical Society 1940, Seiten 511 u.f.) Chlorsulfonsäure in der gewünschten Menge auf das Polymere in gequelltem Zustand einwirken lasst. Die Chlorsulfonsaureaenge im Trager lasst sich variieren. Sehr gute Resultate können bei Verwendung von 1-3 raMol Chlorsulfonsäure je Gramm Trager erzielt werden, berechnet nach dem Gesamtgewicht des Trägers.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auf mehrere Weisen, unter Anwendung schon bekannter Methoden, ausgeführt werden, z.B. indem man den polymeren Trager bei Zimmertemperatur in einem Gemisch von Wasser und Dioxan quellen lasst, daraufhin die Aminoverbindung bei konstantem pH-Wert und im Überschuss, bezogen auf die Chlorsulfonsäure im Träger, beigibt, das Gemisch 12-24 Stunden lang bei Zimmertemperatur rUhrt und die feste Phase abfiltriert.

Für die Herstellung von Peptiden unter Anwendung des erfindungsgemassen Verfahrens kann die Aminosäurekette stufenweise aus den verschiedenen Aminosäuren aufgebaut werden. Der Aufbau der Aninosaurekette kann aber auch dadurch beginnen, dass zuerst ein Peptid, etwa ein Dipeptid, Über eine freie Aminogruppe an den Trager gebunden wird, woraufhin die gewünschte Aminosaurekette mit Aminosäuren und/oder Peptiden vervollständigt wird.

Nachdem die gewünschte AminosBurekette aufgebaut worden ist, kann die Bindung mit dem polymeren Trager auf bekannte Weise mit Hilfe eines Reduktionsmittels, wie etwa Phosphoniumjodid oder Natrium in Flussigammoniak, zerbrochen werden. Wenn verlangt, kann dann das restliche Polymere regeneriert und aufs neue benutzt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird in nachstehenden Beispielen erläutert, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschranken.

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Beispiel I

In einen J-1-Kolben, der mit einem Rührer versehen ist, werden 5 Gramm eines polymeren Tragers (Teilchengröße 40 bis 80 μ), 70 ml Dioxan, 30 ml Wasser und 2,5 g tert.-Butylester von L-Leucin eingebracht. Als polymerer Träger wird Polystyrol eingesetzt, vernetzt mit 2 Gew.-% Divinylbenzol, das je Gramm 1,32 mMol Chlorsulfonsäure enthält. Dag Gemisch wird 15 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, wahrend der pH-Wert durch Zusatz von verdünntem Natriumhydroxyd auf 9,5 gehalten wird. Danach wird der Feststoff abfiltriert und gewaschen. Das Waschen erfolgt 3 mal mit einem Wasser-Dioxan-Gemisch, 2 mal mit Dioxan und 2 mal mit Methanol. Das gewaschene Produkt wird in Vakuum getrocknet. Es fallen 5,6 g Produkt an. Eine Stickstoffanalyse (1,44 Gew.-%N) t zeigt, dass je Gramm Produkt 1,03 mMol tert.-Butylester von L-Leucin vorhanden sind. Aus einem Vergleich mit einer Schwefelanalyse (3,4 Gew.-% S) des anfallenden Produkts erhellt, dass 97 % der vorhandenen SuIfonsaure an Aminogruppen gebunden sind.

Beispiel II

In einen J-1-Kolben, der mit einem Rührer versehen ist, werden 5 Gramm eines Trägers wie im Beispiel I erwähnt, 100 ml Tetrahydrofuran, 50 ml Wasser und 3 g tert.-Butylester von L-Phenylalanin eingegeben. Das Gemisch wird 25 Sunden bei Zimmertemperatur gerührt, während der pH-Wert auf 8,5 gehalten wird. Anschliessend wird der Feststoff abfiltriert, und dann einmal mit einem Gemisch von Wasser und Tetrahydrofuran und dreimal mit Tetrahydrofuran gewaschen. Nach dem Trocknen fallen 5,8 g Produkt an, das 1,3 Gew.-% Stickstoff und ™ 3,1 Gew.-% Schwefel enthält. Hieraus ergibt sich, dass 96 % der vorhandenen Sulfonsäure an Aminogruppen gebunden sind.

Beispiel III

In einen $-l-Kolben, der mit einem Rührer versehen ist, werden 15 Gramm eines polymeren Trägers, 120 ml Dioxan, 40 ml Wasser und 9,5 g L-Valin-tert.-Butylester eingegeben. Als polymerer Träger wird derselbe Typ verwendet wie im Beispiel I, jedoch mit 1,74 mMol Chlorsulfonsäure je Gramm. Das Genisch wird 18 Stunden lang bei etwa 0 C gerührt, während der pH-Wert durch Zusatz von verdünnter Lauge auf 9,0 gehalten wird. Anschliessend wird der Feststoff

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abfiltriert, dann 2 mal mit einem Dioxan-Wasser-Gemisch und 3 mal mit Dioxan gewaschen. Danach wird der Feststoff mit Dioxan-Hexan-Gemisehen gewaschen, wobei die Dioxanmenge in den Gemischen allmählig verringert wird. Zum Schluss wird das Produkt mit Hexan gewaschen und in Vakuum getrocknet. Es fallen 18 g Produkt an, das 2,0 % Stickstoff und 4,7 % Schwefel enthalt. Daraus ergibt sich, dass 98 % der vorhandenen Sulfons&ure an Aminogruppen gebunden sind.

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Claims

PATENTANS PROCHE

1. Verfahren zum chemischen Binden einer Aminosäure oder eines Aminosaurederivats an einen polymeren Träger durch Reaktion einer freien Aminogruppe der betreffenden Verbindung mit einer reaktiven Gruppe des Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass ein polymerer Träger Bit Chlorsulfonsäure als reaktive Gruppe eingesetzt wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein polymerer Trager auf Basis von mit Divinylbenzol vernetzte« Polystyrol benutzt wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in dem polymeren Träger 1-3 mMol Chlorsulfonsäure je Gramm Träger verwendet werden, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers.

beschrieben und

derivate an einen

If· Jf. Unter Anwendung eines der vorgenannten Ansprüche anfallende Peptide.

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