JP2000154200A - 化合物の固定化方法 - Google Patents
化合物の固定化方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＳＨ（スルフヒドリル）基含有化合物を溶媒
不溶性担体と反応させて固定化する際に、高い収率でＳ
Ｈ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化でき、また、
固定化されたＳＨ基含有化合物が本来有する活性を高く
保持することができる新規な固定化方法を提供する。 【解決手段】 溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗
酸化剤の存在下に反応させることを特徴とする上記化合
物の固定化方法。
不溶性担体と反応させて固定化する際に、高い収率でＳ
Ｈ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化でき、また、
固定化されたＳＨ基含有化合物が本来有する活性を高く
保持することができる新規な固定化方法を提供する。 【解決手段】 溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗
酸化剤の存在下に反応させることを特徴とする上記化合
物の固定化方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＳＨ（スルフヒド
リル）基を有する化合物を溶媒不溶性担体に固定化する
方法に関する。
リル）基を有する化合物を溶媒不溶性担体に固定化する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】特異的吸着を行わせるためのリガンドと
して化合物を溶媒不溶性担体に固定化する方法は、固定
化酵素、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーをはじめとして数多く研究さ
れ、産業的にも利用されている。
して化合物を溶媒不溶性担体に固定化する方法は、固定
化酵素、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーをはじめとして数多く研究さ
れ、産業的にも利用されている。
【０００３】固定化酵素における固定化方法の代表例と
して、（１）臭化シアン活性化法によりイミドカルボネ
ートを担体上に形成させ、続いてリガンドとなる化合物
のアミノ基と反応させる方法；（２）酸アジド誘導体法
として知られる方法で、担体上のカルボキシル基をエス
テル化、ヒドラジド化、続いてアジド基に変換し、次い
でリガンドとなる化合物のアミノ基で置換する方法；
（３）ジアゾ法として知られる方法で、担体上にジアゾ
ニウム塩を形成させ、リガンドとなる化合物のアミノ基
と反応させる方法；（４）縮合試薬法として知られる方
法で、担体上のアミノ基又はカルボキシル基と、リガン
ドとなる化合物のカルボキシル基又はアミノ基とを縮合
試薬で縮合する方法；（５）アルキル化法として知られ
る方法で、担体上に臭化アセチル基又は４，６−ジクロ
ロ−ｓ−トリアジニル基を導入し、リガンドとなる化合
物のアミノ基と反応させる方法；（６）担体架橋法とし
て知られる方法で、担体上のアミノ基とリガンドとなる
化合物のアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋、還元
する方法；等がある（田中渥夫、川本卓男、「現代化
学」、２４〜３０頁、１９９２年７月）。
して、（１）臭化シアン活性化法によりイミドカルボネ
ートを担体上に形成させ、続いてリガンドとなる化合物
のアミノ基と反応させる方法；（２）酸アジド誘導体法
として知られる方法で、担体上のカルボキシル基をエス
テル化、ヒドラジド化、続いてアジド基に変換し、次い
でリガンドとなる化合物のアミノ基で置換する方法；
（３）ジアゾ法として知られる方法で、担体上にジアゾ
ニウム塩を形成させ、リガンドとなる化合物のアミノ基
と反応させる方法；（４）縮合試薬法として知られる方
法で、担体上のアミノ基又はカルボキシル基と、リガン
ドとなる化合物のカルボキシル基又はアミノ基とを縮合
試薬で縮合する方法；（５）アルキル化法として知られ
る方法で、担体上に臭化アセチル基又は４，６−ジクロ
ロ−ｓ−トリアジニル基を導入し、リガンドとなる化合
物のアミノ基と反応させる方法；（６）担体架橋法とし
て知られる方法で、担体上のアミノ基とリガンドとなる
化合物のアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋、還元
する方法；等がある（田中渥夫、川本卓男、「現代化
学」、２４〜３０頁、１９９２年７月）。
【０００４】しかし、これらの方法は、（ａ）リガンド
となる化合物がＳＨ基を含んでいる場合、固定化の効率
が低下する；及び（ｂ）リガンドとなる化合物が特にＳ
Ｈ基を含むペプチドやタンパク質である場合、これらが
有する本来の活性（酵素活性、結合活性等）が損なわれ
ることがある；という欠点を有している。本発明者ら
は、リガンドとなる化合物としてペプチドやタンパク質
を溶媒不溶性担体に固定化する過程において、化合物が
ＳＨ基を含んでいる場合、上述した（ａ）や（ｂ）のよ
うな現象が起こることを見出した。更に、ペプチドやタ
ンパク質以外の化合物でもＳＨ基が存在すれば同様の現
象が観察された。不活性担体にリガンドとなる化合物を
固定化する場合においてこのような現象が生じること
は、従来、文献に記載がない。
となる化合物がＳＨ基を含んでいる場合、固定化の効率
が低下する；及び（ｂ）リガンドとなる化合物が特にＳ
Ｈ基を含むペプチドやタンパク質である場合、これらが
有する本来の活性（酵素活性、結合活性等）が損なわれ
ることがある；という欠点を有している。本発明者ら
は、リガンドとなる化合物としてペプチドやタンパク質
を溶媒不溶性担体に固定化する過程において、化合物が
ＳＨ基を含んでいる場合、上述した（ａ）や（ｂ）のよ
うな現象が起こることを見出した。更に、ペプチドやタ
ンパク質以外の化合物でもＳＨ基が存在すれば同様の現
象が観察された。不活性担体にリガンドとなる化合物を
固定化する場合においてこのような現象が生じること
は、従来、文献に記載がない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑みて、ＳＨ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化す
る反応において、固定化効率を高め、かつ、ＳＨ基含有
化合物が本来有する特性の低下を抑制することが可能な
固定化方法を提供することを目的とするものである。
鑑みて、ＳＨ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化す
る反応において、固定化効率を高め、かつ、ＳＨ基含有
化合物が本来有する特性の低下を抑制することが可能な
固定化方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するため、種々の反応条件を検討して固定化効率
を高め、かつ、ＳＨ基含有化合物の持つ特性低下を抑制
することが可能な固定化方法を鋭意研究してきた。その
結果、本発明者らは、上述した（ａ）及び（ｂ）の現象
にＳＨ基が重要な因子として関わっていることを見出し
た。また、これらの現象は高ｐＨ（＞７）の水溶液中で
の反応において起こりやすいことなどから、固定化反応
条件下でＳＨ基が酸化を受けるなどしてＳ−Ｓ結合が形
成されることによるものと推定した。
を達成するため、種々の反応条件を検討して固定化効率
を高め、かつ、ＳＨ基含有化合物の持つ特性低下を抑制
することが可能な固定化方法を鋭意研究してきた。その
結果、本発明者らは、上述した（ａ）及び（ｂ）の現象
にＳＨ基が重要な因子として関わっていることを見出し
た。また、これらの現象は高ｐＨ（＞７）の水溶液中で
の反応において起こりやすいことなどから、固定化反応
条件下でＳＨ基が酸化を受けるなどしてＳ−Ｓ結合が形
成されることによるものと推定した。
【０００７】Ｓ−Ｓ結合はリガンドとなる化合物の分子
内で形成される場合もあれば、分子間で形成される場合
も考えられる。リガンドとなる化合物の固定化に利用さ
れるべき反応点（官能基）がＳＨ基の場合はＳ−Ｓ結合
が形成すると反応点が不活性化することになり、また、
反応点がＳＨ基以外の場合はＳ−Ｓ結合の形成によりそ
の反応点が分子内部に隠れることが考えられる。この結
果、固定化の効率の低下が生じるものと推定される。ま
た、Ｓ−Ｓ結合の形成によって、ＳＨ基含有化合物が本
来有する特性の低下をきたすことも予想される。
内で形成される場合もあれば、分子間で形成される場合
も考えられる。リガンドとなる化合物の固定化に利用さ
れるべき反応点（官能基）がＳＨ基の場合はＳ−Ｓ結合
が形成すると反応点が不活性化することになり、また、
反応点がＳＨ基以外の場合はＳ−Ｓ結合の形成によりそ
の反応点が分子内部に隠れることが考えられる。この結
果、固定化の効率の低下が生じるものと推定される。ま
た、Ｓ−Ｓ結合の形成によって、ＳＨ基含有化合物が本
来有する特性の低下をきたすことも予想される。
【０００８】上記経験と推定からＳＨ基がＳ−Ｓ結合を
形成しないようにすることに着目し検討を重ねることに
よって、溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗酸化剤
の存在下に反応させると上記課題を同時に解決できるこ
とを見い出し、本発明を完成させるに至った。すなわ
ち、本発明は、溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗
酸化剤の存在下に反応させる、上記化合物の固定化方法
である。以下に、本発明を詳述する。
形成しないようにすることに着目し検討を重ねることに
よって、溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗酸化剤
の存在下に反応させると上記課題を同時に解決できるこ
とを見い出し、本発明を完成させるに至った。すなわ
ち、本発明は、溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗
酸化剤の存在下に反応させる、上記化合物の固定化方法
である。以下に、本発明を詳述する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において溶媒不溶性担体と
は、用いられる溶媒に溶解しない担体を意味する。本発
明の好適な実施態様においては、溶媒不溶性担体は、溶
媒として水を用いる場合の溶媒不溶性担体、すなわち水
不溶性担体である。上記水不溶性担体としては特に限定
されず、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担
体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合
成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋
アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機
担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有
機−有機、有機−無機等の複合担体等を挙げることがで
きる。
は、用いられる溶媒に溶解しない担体を意味する。本発
明の好適な実施態様においては、溶媒不溶性担体は、溶
媒として水を用いる場合の溶媒不溶性担体、すなわち水
不溶性担体である。上記水不溶性担体としては特に限定
されず、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担
体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合
成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋
アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機
担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有
機−有機、有機−無機等の複合担体等を挙げることがで
きる。
【００１０】また、ＳＨ基含有化合物を溶媒不溶性担体
に固定化したものをクロマトグラフィーや吸着体等に用
いる場合には、溶媒不溶性担体は、親水性担体であるこ
とが好ましい。非特異吸着が比較的少なく、リガンド
（固定化されたＳＨ基含有化合物）による吸着選択性が
良好なためである。ここでいう親水性担体とは、担体を
構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が６
０度以下になる担体を指す。
に固定化したものをクロマトグラフィーや吸着体等に用
いる場合には、溶媒不溶性担体は、親水性担体であるこ
とが好ましい。非特異吸着が比較的少なく、リガンド
（固定化されたＳＨ基含有化合物）による吸着選択性が
良好なためである。ここでいう親水性担体とは、担体を
構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が６
０度以下になる担体を指す。
【００１１】上記親水性担体としては特に限定されず、
例えば、セルロース、酢酸セルロース、キトサン、キチ
ン、アガロース、デキストラン等の多糖類又はその誘導
体；ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重
合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、
ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアク
リル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグ
ラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体を挙げる
ことができる。
例えば、セルロース、酢酸セルロース、キトサン、キチ
ン、アガロース、デキストラン等の多糖類又はその誘導
体；ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重
合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、
ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアク
リル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグ
ラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体を挙げる
ことができる。
【００１２】これら親水性担体の中でも、水酸基を有す
る担体は吸着性能及び選択性の点で優れている。特に、
多孔質セルロース系ゲルは下記の優れた点を有するた
め、ＳＨ基含有化合物が固定化された担体を吸着体に用
いる場合に最も適した担体の１つである。すなわち、 （１）機械的強度が比較的高く強靭であるため、撹拌等
の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少
なく、カラムに充填した場合、液体を高流速で流しても
圧密化や目詰まりを生じないので高流速で流すことが可
能となり、またその細孔構造が高圧蒸気滅菌等によって
変化を受けにくい。 （２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性で
あり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在
し、非特異吸着も少ない。 （３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟
質ゲルに劣らない吸着容量が得られる。ここでいうセル
ロース系ゲルとは、セルロース、酢酸セルロース等の、
主鎖がセルロースで構成されているセルロース誘導体を
意味する。但し、本発明においてはこれらのみに限定さ
れるものではない。
る担体は吸着性能及び選択性の点で優れている。特に、
多孔質セルロース系ゲルは下記の優れた点を有するた
め、ＳＨ基含有化合物が固定化された担体を吸着体に用
いる場合に最も適した担体の１つである。すなわち、 （１）機械的強度が比較的高く強靭であるため、撹拌等
の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少
なく、カラムに充填した場合、液体を高流速で流しても
圧密化や目詰まりを生じないので高流速で流すことが可
能となり、またその細孔構造が高圧蒸気滅菌等によって
変化を受けにくい。 （２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性で
あり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在
し、非特異吸着も少ない。 （３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟
質ゲルに劣らない吸着容量が得られる。ここでいうセル
ロース系ゲルとは、セルロース、酢酸セルロース等の、
主鎖がセルロースで構成されているセルロース誘導体を
意味する。但し、本発明においてはこれらのみに限定さ
れるものではない。
【００１３】本発明においてＳＨ基含有化合物とは、溶
媒不溶性担体に固定化しようとする化合物であって、そ
の分子中に−ＳＨ（スルフヒドリル基）を有しているも
のを意味する。この化合物におけるＳＨ基は、溶解する
溶液条件においては−Ｓ- Ｎａ + 、−Ｓ- Ｋ+ のように
イオン化することもあるし、反応時に−ＳＮａ、−ＳＫ
のような塩の状態で添加することも可能であるが、本発
明においては本質的に同一であるのでこれらを含めてＳ
Ｈ基と表現している。
媒不溶性担体に固定化しようとする化合物であって、そ
の分子中に−ＳＨ（スルフヒドリル基）を有しているも
のを意味する。この化合物におけるＳＨ基は、溶解する
溶液条件においては−Ｓ- Ｎａ + 、−Ｓ- Ｋ+ のように
イオン化することもあるし、反応時に−ＳＮａ、−ＳＫ
のような塩の状態で添加することも可能であるが、本発
明においては本質的に同一であるのでこれらを含めてＳ
Ｈ基と表現している。
【００１４】上記ＳＨ基含有化合物としては特に限定さ
れず、例えば、システイン（Ｃｙｓ）、システインを構
成アミノ酸として含むペプチド又はタンパク質、及び、
チオール化合物（例えば、エタンチオール、アミノエタ
ンチオール、ベンジルチオール、チオフェノール及びこ
れらを側鎖又は末端に有する化合物を含む、ＳＨ基を主
鎖又は側鎖に持つ高、中又は低分子化合物等）等を挙げ
ることができる。上記ＳＨ基含有化合物は、アミノ酸、
ペプチド及びタンパク質からなる群より選択される少な
くとも１種であることが好ましい。
れず、例えば、システイン（Ｃｙｓ）、システインを構
成アミノ酸として含むペプチド又はタンパク質、及び、
チオール化合物（例えば、エタンチオール、アミノエタ
ンチオール、ベンジルチオール、チオフェノール及びこ
れらを側鎖又は末端に有する化合物を含む、ＳＨ基を主
鎖又は側鎖に持つ高、中又は低分子化合物等）等を挙げ
ることができる。上記ＳＨ基含有化合物は、アミノ酸、
ペプチド及びタンパク質からなる群より選択される少な
くとも１種であることが好ましい。
【００１５】上記ＳＨ基含有化合物の分子量について
は、種々検討を重ねたところ、分子量が大きくなると本
発明の効果が低くなることが明らかになった。すなわ
ち、分子量が３万以下のＳＨ基含有化合物については抗
酸化剤を加えた場合とそうでない場合で本発明の効果に
大きな差が見られた。一方、１５万程度の高分子である
タンパク質では本発明の効果の差がより小さいものとな
った。従って、ＳＨ基含有化合物の分子量は、３万以下
であることが好ましい。
は、種々検討を重ねたところ、分子量が大きくなると本
発明の効果が低くなることが明らかになった。すなわ
ち、分子量が３万以下のＳＨ基含有化合物については抗
酸化剤を加えた場合とそうでない場合で本発明の効果に
大きな差が見られた。一方、１５万程度の高分子である
タンパク質では本発明の効果の差がより小さいものとな
った。従って、ＳＨ基含有化合物の分子量は、３万以下
であることが好ましい。
【００１６】本発明において抗酸化剤とは、反応系中に
存在する化合物が酸化されるのを防止又は抑制する作用
を持つ物質を意味するものであり、例えば、酸化を抑制
するか又は自己が酸化されることにより系内の化合物の
酸化を抑制する化合物、溶存酸素を系から追放する作用
を有する物質等がこれに該当する。もちろん、反応溶媒
等の脱気、冷却等により溶存酸素を実質的に低減させる
ことにより類似の効果を得る手段もあるが、操作性や普
遍性を考慮すると、抗酸化剤の添加がより効果的かつ安
定性の高い結果をもたらす。
存在する化合物が酸化されるのを防止又は抑制する作用
を持つ物質を意味するものであり、例えば、酸化を抑制
するか又は自己が酸化されることにより系内の化合物の
酸化を抑制する化合物、溶存酸素を系から追放する作用
を有する物質等がこれに該当する。もちろん、反応溶媒
等の脱気、冷却等により溶存酸素を実質的に低減させる
ことにより類似の効果を得る手段もあるが、操作性や普
遍性を考慮すると、抗酸化剤の添加がより効果的かつ安
定性の高い結果をもたらす。
【００１７】上記抗酸化剤には多種多様な化合物が含ま
れており、その中にはＳＨ基を有する化合物も含まれて
いる。メルカプトエタノールはその代表例であるが、溶
媒不溶性担体がグリシジル基（エポキシ基）を有する時
のように求核反応を受けて固定化反応が進行する場合に
は、抗酸化剤であるメルカプトエタノール自身が反応し
て固定化されることがある。このような場合を考慮する
と、求核反応性を持つ抗酸化剤は汎用性の面で制限を受
ける。もちろん反応によっては充分有用であるが、この
ような危惧なく使用可能である汎用性の高い抗酸化剤が
好ましい。
れており、その中にはＳＨ基を有する化合物も含まれて
いる。メルカプトエタノールはその代表例であるが、溶
媒不溶性担体がグリシジル基（エポキシ基）を有する時
のように求核反応を受けて固定化反応が進行する場合に
は、抗酸化剤であるメルカプトエタノール自身が反応し
て固定化されることがある。このような場合を考慮する
と、求核反応性を持つ抗酸化剤は汎用性の面で制限を受
ける。もちろん反応によっては充分有用であるが、この
ような危惧なく使用可能である汎用性の高い抗酸化剤が
好ましい。
【００１８】本発明においては、上記抗酸化剤は、ピロ
亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリ
ウム、亜硫酸水素ナトリウム、ハイドロサルファイトナ
トリウム及びＬ−アスコルビン酸からなる群より選択さ
れる少なくとも１種であることが好ましい。これらの抗
酸化剤は、大半のＳＨ基含有化合物の溶媒不溶性担体へ
の固定化反応に利用可能である点で優れている。
亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリ
ウム、亜硫酸水素ナトリウム、ハイドロサルファイトナ
トリウム及びＬ−アスコルビン酸からなる群より選択さ
れる少なくとも１種であることが好ましい。これらの抗
酸化剤は、大半のＳＨ基含有化合物の溶媒不溶性担体へ
の固定化反応に利用可能である点で優れている。
【００１９】本発明においては、ＳＨ基含有化合物に対
する抗酸化剤のモル濃度の比が１０００：１以上１：１
０００以下であることが望ましい。これを満たさない場
合には、抗酸化剤の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ
／Ｌ以下であることが望ましい。より好ましくは両条件
を同時に満たすことである。このような場合、抗酸化剤
は抗酸化作用を充分に発揮して、ＳＨ基含有化合物の固
定化率と、固定化後の活性保持率が高くなり有効であ
る。なお、上記のモル濃度は反応系中におけるモル濃度
である。
する抗酸化剤のモル濃度の比が１０００：１以上１：１
０００以下であることが望ましい。これを満たさない場
合には、抗酸化剤の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ
／Ｌ以下であることが望ましい。より好ましくは両条件
を同時に満たすことである。このような場合、抗酸化剤
は抗酸化作用を充分に発揮して、ＳＨ基含有化合物の固
定化率と、固定化後の活性保持率が高くなり有効であ
る。なお、上記のモル濃度は反応系中におけるモル濃度
である。
【００２０】本発明の固定化方法において溶媒不溶性担
体とＳＨ基含有化合物を反応させる場合、溶媒不溶性担
体を何らかの方法で活性化しておく方が効率的な固定化
を行うことができる。本発明の好適な実施態様において
は、溶媒不溶性担体は、グリシジル基（エポキシ基）、
イミドカルボナート基、トシル基、トレシル基、カルボ
キシル基、アミノ基、アジド基及び水酸基からなる群よ
り選択された少なくとも１種の官能基により活性化され
ているものである。このような溶媒不溶性担体とＳＨ基
含有化合物を抗酸化剤の存在下に反応させると、ＳＨ基
含有化合物の固定化率と、固定化後の活性保持率が高く
有効である。
体とＳＨ基含有化合物を反応させる場合、溶媒不溶性担
体を何らかの方法で活性化しておく方が効率的な固定化
を行うことができる。本発明の好適な実施態様において
は、溶媒不溶性担体は、グリシジル基（エポキシ基）、
イミドカルボナート基、トシル基、トレシル基、カルボ
キシル基、アミノ基、アジド基及び水酸基からなる群よ
り選択された少なくとも１種の官能基により活性化され
ているものである。このような溶媒不溶性担体とＳＨ基
含有化合物を抗酸化剤の存在下に反応させると、ＳＨ基
含有化合物の固定化率と、固定化後の活性保持率が高く
有効である。
【００２１】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるもの
ではない。
【００２２】実施例１ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００
０へのアミノエタンチオールの固定化（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ−ＡＥＴ−ａ） （１） Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００のエポキシ活
性化 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００（アマシャムファルマ
シアバイオテク社製）８３ｍｌに水を加え全量を１８６
ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１１３ｍ
ｌを加え４０℃とした。これにエピクロロヒドリン（和
光純薬工業社製）３８ｍｌを加え、４０℃で攪拌下２時
間反応させた。反応終了後、グラスフィルター上で充分
に水洗し、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０
００を得た。
０へのアミノエタンチオールの固定化（Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ−ＡＥＴ−ａ） （１） Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００のエポキシ活
性化 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００（アマシャムファルマ
シアバイオテク社製）８３ｍｌに水を加え全量を１８６
ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１１３ｍ
ｌを加え４０℃とした。これにエピクロロヒドリン（和
光純薬工業社製）３８ｍｌを加え、４０℃で攪拌下２時
間反応させた。反応終了後、グラスフィルター上で充分
に水洗し、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０
００を得た。
【００２３】（２） アミノエタンチオールの固定化及
び固定化量の定量 ２−アミノエタンチオール塩酸塩（和光純薬工業社製）
１．２０ｍｇと亜硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
１５０ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）
１５ｍｌに溶解し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨ１０に再調整し、全量を２５ｍｌとした。
上記エポキシ活性化ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００の５
ｍｌにアミノエタンチオール溶液（全量）を加えて３７
℃で１８時間振盪した後（アミノエタンチオール：亜硫
酸ナトリウム＝１：７６、亜硫酸ナトリウム＝４７．６
ｍｍｏｌ／Ｌ）、グラスフィルター上で充分量の生理食
塩水を用いて洗浄し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−ＡＥＴ−ａ
（０．２０ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。固定化された
アミノエタンチオールの量は、反応前後の上清をＴＮＢ
Ｓ（トリニトロベンゼンスルホン酸）発色法によるアミ
ノ基定量法により測定して算出した。
び固定化量の定量 ２−アミノエタンチオール塩酸塩（和光純薬工業社製）
１．２０ｍｇと亜硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
１５０ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）
１５ｍｌに溶解し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨ１０に再調整し、全量を２５ｍｌとした。
上記エポキシ活性化ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００の５
ｍｌにアミノエタンチオール溶液（全量）を加えて３７
℃で１８時間振盪した後（アミノエタンチオール：亜硫
酸ナトリウム＝１：７６、亜硫酸ナトリウム＝４７．６
ｍｍｏｌ／Ｌ）、グラスフィルター上で充分量の生理食
塩水を用いて洗浄し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−ＡＥＴ−ａ
（０．２０ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。固定化された
アミノエタンチオールの量は、反応前後の上清をＴＮＢ
Ｓ（トリニトロベンゼンスルホン酸）発色法によるアミ
ノ基定量法により測定して算出した。
【００２４】実施例２ トレシルトヨパールへのシステ
インの固定化（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ａ）及び
固定化量の定量 Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製）
０．５０ｍｇとピロ亜硫酸ナトリウム（和光純薬工業社
製）１．０ｍｇをカップリングバッファー（ｐＨ８．
２、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ炭酸緩衝液）４
ｍｌに溶解し、ＡＦ−トレシルトヨパール６５０を乾燥
状態で８００ｍｇ添加して室温で終夜反応させた。０．
５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、ブロックバッフ
ァー（ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液）を添加し室温で２時間反応させた
（システイン：ピロ亜硫酸ナトリウム＝１：１．８９、
ピロ亜硫酸ナトリウム＝１．３ｍｍｏｌ／Ｌ）。さらに
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ａ（０．１１ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）
を得た。固定化されたシステインの量は実施例１と同様
にアミノ基の定量により測定して算出した。
インの固定化（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ａ）及び
固定化量の定量 Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製）
０．５０ｍｇとピロ亜硫酸ナトリウム（和光純薬工業社
製）１．０ｍｇをカップリングバッファー（ｐＨ８．
２、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ炭酸緩衝液）４
ｍｌに溶解し、ＡＦ−トレシルトヨパール６５０を乾燥
状態で８００ｍｇ添加して室温で終夜反応させた。０．
５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、ブロックバッフ
ァー（ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液）を添加し室温で２時間反応させた
（システイン：ピロ亜硫酸ナトリウム＝１：１．８９、
ピロ亜硫酸ナトリウム＝１．３ｍｍｏｌ／Ｌ）。さらに
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ａ（０．１１ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）
を得た。固定化されたシステインの量は実施例１と同様
にアミノ基の定量により測定して算出した。
【００２５】実施例３ ハイドロサルファイトナトリウ
ムを用いた多孔質担体（Ｋａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプ
チド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−
ａ）及びＩｇＧ結合能の評価 （１） ＭＰ４７Ｃペプチドの生産 配列表の配列番号１に示すＭＰ４７Ｃペプチドを得るた
めに、ＭＰ４７ＣペプチドをコードするＤＮＡをｐＵＣ
ＮＴベクター（特開平４−２１２６９２号公報）に５′
側をＮｄｅ Ｉ、３′側をＨｉｎｄ ＩＩＩのそれぞれ
制限酵素サイトを利用して連結できるよう、配列表の配
列番号２で示すように設計して合成した。
ムを用いた多孔質担体（Ｋａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプ
チド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−
ａ）及びＩｇＧ結合能の評価 （１） ＭＰ４７Ｃペプチドの生産 配列表の配列番号１に示すＭＰ４７Ｃペプチドを得るた
めに、ＭＰ４７ＣペプチドをコードするＤＮＡをｐＵＣ
ＮＴベクター（特開平４−２１２６９２号公報）に５′
側をＮｄｅ Ｉ、３′側をＨｉｎｄ ＩＩＩのそれぞれ
制限酵素サイトを利用して連結できるよう、配列表の配
列番号２で示すように設計して合成した。
【００２６】上記配列を有するＤＮＡを、制限酵素Ｎｄ
ｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造社製）消化によっ
て開裂したｐＵＣＮＴベクターと、宝酒造社製ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて手順書
に従って連結し、ｐＵＣＮＴＭＰ４７Ｃベクター（図
１）を作製した。公知の方法で、このｐＵＣＮＴ ＭＰ
４７ＣベクターＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株（フナコシ
販）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を
指標として形質転換体を選択した。
ｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造社製）消化によっ
て開裂したｐＵＣＮＴベクターと、宝酒造社製ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて手順書
に従って連結し、ｐＵＣＮＴＭＰ４７Ｃベクター（図
１）を作製した。公知の方法で、このｐＵＣＮＴ ＭＰ
４７ＣベクターＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株（フナコシ
販）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を
指標として形質転換体を選択した。
【００２７】また、この形質転換体から常法にてプラス
ミドＤＮＡを抽出し、遺伝子配列を解析することによっ
てｐＵＣＮＴ ＭＰ４７Ｃベクターが設計通りのＤＮＡ
配列を有していることを確認した。次に、この形質転換
体を６ＬのＬ−ブロス（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／
Ｌバクトトリプシン、５ｇ／Ｌイーストエキストラク
ト）中で３７℃にて２０時間振盪培養し、菌体を遠心分
離（日立ＲＰＲ９−２ローターを用い４℃で６０００ｒ
ｐｍ、２０分間）にて回収した。ここで得られた沈殿を
３００ｍｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．５）に懸濁した上で、
超音波破砕処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２５０を用い氷中にて
６分間３回）を施し、遠心分離（日立ＲＰＲ１６ロータ
ーを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて上清
を回収した。ここで得られた上清を７０℃、１０分間の
熱処理を行った後、さらに遠心分離（日立ＲＰＲ１６ロ
ーターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて
その上清３００ｍｌを回収した。本上清から高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：Ｗａｔｅｒｓ μ ＢＯＮ
ＤＡＳＰＨＥＲＥ ５ μ Ｃ１８ ３００Ａ、１９．
０ｘ１５０ｍｍ）を用いて４０ｍｌのアセトニトリル溶
液を流速５ｍｌ／分にて流してカラムを活性化した後、
３００ｍｌのサンプルを同流速にて流し、０．１％ＴＦ
Ａ＋６４％アセトニトリル溶液２００ｍｌにてカラムを
洗浄、続いて０．１％ＴＦＡ＋４０％アセトニトリル溶
液２００ｍｌにて目的のＭＰ４７Ｃペプチドを溶出、分
取した。これをエバポレーターにて１００ｍｌに濃縮し
た上で凍結乾燥し、高純度精製標品として１．３ｇを取
得した。
ミドＤＮＡを抽出し、遺伝子配列を解析することによっ
てｐＵＣＮＴ ＭＰ４７Ｃベクターが設計通りのＤＮＡ
配列を有していることを確認した。次に、この形質転換
体を６ＬのＬ−ブロス（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／
Ｌバクトトリプシン、５ｇ／Ｌイーストエキストラク
ト）中で３７℃にて２０時間振盪培養し、菌体を遠心分
離（日立ＲＰＲ９−２ローターを用い４℃で６０００ｒ
ｐｍ、２０分間）にて回収した。ここで得られた沈殿を
３００ｍｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．５）に懸濁した上で、
超音波破砕処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２５０を用い氷中にて
６分間３回）を施し、遠心分離（日立ＲＰＲ１６ロータ
ーを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて上清
を回収した。ここで得られた上清を７０℃、１０分間の
熱処理を行った後、さらに遠心分離（日立ＲＰＲ１６ロ
ーターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて
その上清３００ｍｌを回収した。本上清から高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：Ｗａｔｅｒｓ μ ＢＯＮ
ＤＡＳＰＨＥＲＥ ５ μ Ｃ１８ ３００Ａ、１９．
０ｘ１５０ｍｍ）を用いて４０ｍｌのアセトニトリル溶
液を流速５ｍｌ／分にて流してカラムを活性化した後、
３００ｍｌのサンプルを同流速にて流し、０．１％ＴＦ
Ａ＋６４％アセトニトリル溶液２００ｍｌにてカラムを
洗浄、続いて０．１％ＴＦＡ＋４０％アセトニトリル溶
液２００ｍｌにて目的のＭＰ４７Ｃペプチドを溶出、分
取した。これをエバポレーターにて１００ｍｌに濃縮し
た上で凍結乾燥し、高純度精製標品として１．３ｇを取
得した。
【００２８】（２） セルロースゲルのエポキシ活性化 セルロース系多孔質硬質ゲルであって球状タンパク質の
排除限界分子量５００万以上である当社試作品Ｋａｃ
９０ｍｌに水を加え全量を１８０ｍｌとしたのち、２Ｍ
水酸化ナトリウム６０ｍｌを加え４０℃とした。これに
エピクロルヒドリン２１ｍｌを加え、４０℃で撹拌下１
時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ
活性化セルロースゲルを得た。
排除限界分子量５００万以上である当社試作品Ｋａｃ
９０ｍｌに水を加え全量を１８０ｍｌとしたのち、２Ｍ
水酸化ナトリウム６０ｍｌを加え４０℃とした。これに
エピクロルヒドリン２１ｍｌを加え、４０℃で撹拌下１
時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ
活性化セルロースゲルを得た。
【００２９】（３） ＭＰ４７Ｃペプチドの固定化及び
固定化量の定量 ＭＰ４７Ｃペプチド１０ｍｇとハイドロサルファイトナ
トリウム（和光純薬工業社製）５０μｇを０．０５Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）０．５ｍｌに溶解し、０．
０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に再調
整、全量を１．０ｍｌとした。上記エポキシ活性化セル
ロースゲル１ｍｌにＭＰ４７Ｃ溶液（全量）を加えて３
７℃で１６時間振盪した後（ＭＰ４７Ｃペプチド：ハイ
ドロサルファイトナトリウム＝１：３７２、ハイドロサ
ルファイトナトリウム＝０．５８ｍｍｏｌ／Ｌ）、充分
量のＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液）で洗浄し、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ（８
ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。固定化されたＭＰ４７Ｃ
ペプチドの量は、反応前後の反応溶液のＨＰＬＣ分析で
その面積比から算出した。カラムは、μ−ｂｏｎｄａｓ
ｐｈｅｒｅ Ｃ１８（日本ウォーターズ社製）３．９ｍ
ｍＩＤｘ１５０ｍｍＨを用い、移動相は、（Ａ）：０．
１％ＴＦＡ水溶液、及び、（Ｂ）：８０％アセトニトリ
ル／０．１％ＴＦＡ水溶液を用いて、初期（Ａ）：
（Ｂ）＝９５：５で開始し、（Ｂ）を毎分３％のグラジ
エントで増加させ、１ｍｌ／分の流速で流した。
固定化量の定量 ＭＰ４７Ｃペプチド１０ｍｇとハイドロサルファイトナ
トリウム（和光純薬工業社製）５０μｇを０．０５Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）０．５ｍｌに溶解し、０．
０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に再調
整、全量を１．０ｍｌとした。上記エポキシ活性化セル
ロースゲル１ｍｌにＭＰ４７Ｃ溶液（全量）を加えて３
７℃で１６時間振盪した後（ＭＰ４７Ｃペプチド：ハイ
ドロサルファイトナトリウム＝１：３７２、ハイドロサ
ルファイトナトリウム＝０．５８ｍｍｏｌ／Ｌ）、充分
量のＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液）で洗浄し、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ（８
ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。固定化されたＭＰ４７Ｃ
ペプチドの量は、反応前後の反応溶液のＨＰＬＣ分析で
その面積比から算出した。カラムは、μ−ｂｏｎｄａｓ
ｐｈｅｒｅ Ｃ１８（日本ウォーターズ社製）３．９ｍ
ｍＩＤｘ１５０ｍｍＨを用い、移動相は、（Ａ）：０．
１％ＴＦＡ水溶液、及び、（Ｂ）：８０％アセトニトリ
ル／０．１％ＴＦＡ水溶液を用いて、初期（Ａ）：
（Ｂ）＝９５：５で開始し、（Ｂ）を毎分３％のグラジ
エントで増加させ、１ｍｌ／分の流速で流した。
【００３０】（４） Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇＧ
結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ又はリガンド未固定の担体（Ｋ
ａｃ）１ｍｌをバイアル中に採取し、健常人血清６ｍｌ
を加え、３７℃で２時間振盪した。その後この懸濁液を
５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清中のＩｇＧ濃
度を免疫比濁法（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｍｍ
ｕｎｏ Ａｓｓａｙ）によりシオノギバイオラボラトリ
ーズで測定し、ＩｇＧ吸着率を次式に従って算出した。 吸着率（％）＝｛（Ｉｒ−Ｉｔ）／Ｉｒ｝ｘ１００ Ｉｒ： Ｋａｃ担体上清のＩｇＧ濃度 Ｉｔ： Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ吸着体上清のＩｇＧ濃
度 その結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇＧ吸着率は６
１％であった。
結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ又はリガンド未固定の担体（Ｋ
ａｃ）１ｍｌをバイアル中に採取し、健常人血清６ｍｌ
を加え、３７℃で２時間振盪した。その後この懸濁液を
５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清中のＩｇＧ濃
度を免疫比濁法（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｍｍ
ｕｎｏ Ａｓｓａｙ）によりシオノギバイオラボラトリ
ーズで測定し、ＩｇＧ吸着率を次式に従って算出した。 吸着率（％）＝｛（Ｉｒ−Ｉｔ）／Ｉｒ｝ｘ１００ Ｉｒ： Ｋａｃ担体上清のＩｇＧ濃度 Ｉｔ： Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａ吸着体上清のＩｇＧ濃
度 その結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇＧ吸着率は６
１％であった。
【００３１】実施例４ Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固
定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
の抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化及び固定化
量の定量 Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社製）４ｇを１ｍＭ ＨＣｌ
水溶液少量で１５分間膨潤させ、１ｍＭ ＨＣｌ水溶液
で洗浄し、更にカップリングバッファー（ｐＨ８．０、
０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ）で
洗浄した。カップリングバッファー２ｍｌに抗ヒトＩｇ
Ｇ（Ｆａｂ）抗体（バインディングサイト社製）をパパ
イン消化（ＰＩＥＣＥ社、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａ
ｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）したＦａｂ ２
ｍｇと亜硫酸水素ナトリウム４．２μｇを溶解し、上記
洗浄ゲル０．４ｍｌを添加して２５℃で４時間反応させ
た。カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッフ
ァー（ｐＨ９、１Ｍエタノールアミン−０．５Ｍ塩化ナ
トリウム−０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ）を添加し室温で２
時間反応した（Ｆａｂ：亜硫酸水素ナトリウム＝１：
１、亜硫酸水素ナトリウム＝２０μｍｏｌ／Ｌ）。２種
の後処理バッファー（ｐＨ４．０、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム−０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ８．
０、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ−トリス−塩酸
緩衝液）で交互に３回づつ洗浄し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ−Ｆａｂ−ａ（４．０ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得
た。固定化量はＭｉｃｒｏ ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎ Ａ
ｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社
製）を用いて、反応前後の上清ＡｎｔｉＩｇＧＦａｂ濃
度を測定して算出した。
ｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固
定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
の抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化及び固定化
量の定量 Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社製）４ｇを１ｍＭ ＨＣｌ
水溶液少量で１５分間膨潤させ、１ｍＭ ＨＣｌ水溶液
で洗浄し、更にカップリングバッファー（ｐＨ８．０、
０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ）で
洗浄した。カップリングバッファー２ｍｌに抗ヒトＩｇ
Ｇ（Ｆａｂ）抗体（バインディングサイト社製）をパパ
イン消化（ＰＩＥＣＥ社、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａ
ｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）したＦａｂ ２
ｍｇと亜硫酸水素ナトリウム４．２μｇを溶解し、上記
洗浄ゲル０．４ｍｌを添加して２５℃で４時間反応させ
た。カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッフ
ァー（ｐＨ９、１Ｍエタノールアミン−０．５Ｍ塩化ナ
トリウム−０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ）を添加し室温で２
時間反応した（Ｆａｂ：亜硫酸水素ナトリウム＝１：
１、亜硫酸水素ナトリウム＝２０μｍｏｌ／Ｌ）。２種
の後処理バッファー（ｐＨ４．０、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム−０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ８．
０、０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１Ｍ−トリス−塩酸
緩衝液）で交互に３回づつ洗浄し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ−Ｆａｂ−ａ（４．０ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得
た。固定化量はＭｉｃｒｏ ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎ Ａ
ｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社
製）を用いて、反応前後の上清ＡｎｔｉＩｇＧＦａｂ濃
度を測定して算出した。
【００３２】（２） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ
−ａのＩｇＧ結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ又はリガンド未固
定の担体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）０．２ｍｌをバイ
アル中に採取し、健常人血清０．６ｍｌを加え、３７℃
で２時間振盪した。その後この懸濁液を５０００ｒｐｍ
で１分間遠心分離し、上清中のＩｇＧ濃度を免疫比濁法
（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓ
ａｙ）によりシオノギバイオラボラトリーズで測定し、
ＩｇＧ吸着率を次式に従って算出した。 吸着率（％）＝｛（Ｉｒ−Ｉｔ）／Ｉｒ｝ｘ１００ Ｉｒ： Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ担体上清のＩｇＧ濃度 Ｉｔ： Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ吸着体上
清のＩｇＧ濃度 その結果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇ
Ｇ吸着率は８２％であった。
−ａのＩｇＧ結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ又はリガンド未固
定の担体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）０．２ｍｌをバイ
アル中に採取し、健常人血清０．６ｍｌを加え、３７℃
で２時間振盪した。その後この懸濁液を５０００ｒｐｍ
で１分間遠心分離し、上清中のＩｇＧ濃度を免疫比濁法
（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓ
ａｙ）によりシオノギバイオラボラトリーズで測定し、
ＩｇＧ吸着率を次式に従って算出した。 吸着率（％）＝｛（Ｉｒ−Ｉｔ）／Ｉｒ｝ｘ１００ Ｉｒ： Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ担体上清のＩｇＧ濃度 Ｉｔ： Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａ吸着体上
清のＩｇＧ濃度 その結果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇ
Ｇ吸着率は８２％であった。
【００３３】比較例１ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００
０へのアミノエタンチオールの固定化及び固定化量の定
量（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００−ＡＥＴ−ｂ） 亜硫酸ナトリウムを用いないこと以外は実施例１と全く
同様にＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００へのアミノエタ
ンチオールの固定化を行い、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０
００−ＡＥＴ−ｂ（０．１３ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得
た。
０へのアミノエタンチオールの固定化及び固定化量の定
量（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００−ＡＥＴ−ｂ） 亜硫酸ナトリウムを用いないこと以外は実施例１と全く
同様にＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００へのアミノエタ
ンチオールの固定化を行い、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０
００−ＡＥＴ−ｂ（０．１３ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得
た。
【００３４】比較例２ トレシルトヨパールへのシステ
インの固定化及び固定化量の定量（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
−Ｃｙｓ−ｂ） ピロ亜硫酸ナトリウムを用いないこと以外は実施例２と
全く同様にトレシルトヨパールへのシステインの固定化
を行い、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ｂ（０．０７ｍ
ｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。
インの固定化及び固定化量の定量（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
−Ｃｙｓ−ｂ） ピロ亜硫酸ナトリウムを用いないこと以外は実施例２と
全く同様にトレシルトヨパールへのシステインの固定化
を行い、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｃｙｓ−ｂ（０．０７ｍ
ｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を得た。
【００３５】比較例３−１ 多孔質担体（Ｋａｃ）への
ＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ
−ＭＰ４７Ｃ−ｂ） （１） ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量 ハイドロサルファイトナトリウムを用いないこと以外は
実施例３と全く同様にしてＫａｃへのＭＰ４７Ｃの固定
化を行い、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂ（５ｍｇ／ｍｌ）を
得た。 （２） Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂのＩｇＧ結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａをＫａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂに変
えた以外は実施例３の「Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇ
Ｇ結合能の評価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価
を行った結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ吸着率
は３８％であった。
ＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ
−ＭＰ４７Ｃ−ｂ） （１） ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量 ハイドロサルファイトナトリウムを用いないこと以外は
実施例３と全く同様にしてＫａｃへのＭＰ４７Ｃの固定
化を行い、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂ（５ｍｇ／ｍｌ）を
得た。 （２） Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂのＩｇＧ結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａをＫａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｂに変
えた以外は実施例３の「Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇ
Ｇ結合能の評価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価
を行った結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ吸着率
は３８％であった。
【００３６】比較例３−２ 多孔質担体（Ｋａｃ）への
ＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ
−ＭＰ４７Ｃ−ｃ）及びＩｇＧ結合能の評価 （１） ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量 ＭＰ４７Ｃの量を２０ｍｇに変更したこと以外は比較例
３−１と全く同様にしてＫａｃへのＭＰ４７Ｃの固定化
を行い、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃ（８ｍｇ／ｍｌ）を得
た。 （２） Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａをＫａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃに変
えた以外は実施例３の「Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇ
Ｇ結合能の評価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価
を行った結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ吸着率
は４７％であった。
ＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化（Ｋａｃ
−ＭＰ４７Ｃ−ｃ）及びＩｇＧ結合能の評価 （１） ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量 ＭＰ４７Ｃの量を２０ｍｇに変更したこと以外は比較例
３−１と全く同様にしてＫａｃへのＭＰ４７Ｃの固定化
を行い、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃ（８ｍｇ／ｍｌ）を得
た。 （２） Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ結合能の評価 Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａをＫａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃに変
えた以外は実施例３の「Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ａのＩｇ
Ｇ結合能の評価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価
を行った結果、Ｋａｃ−ＭＰ４７Ｃ−ｃのＩｇＧ吸着率
は４７％であった。
【００３７】比較例４−１ Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）
の固定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
のＦａｂの固定化及び固定化量の定量 亜硫酸水素ナトリウムを用いないことを以外は実施例４
と全く同様にしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ
抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化を行い、Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂ（２．５ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）
を得た。 （２） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂのＩｇＧ
結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａをＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂに変えた以外は実施例４の「Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇＧ結合能の評
価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価を行った結
果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂのＩｇＧ吸着
率は６５％であった。
ｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）
の固定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
のＦａｂの固定化及び固定化量の定量 亜硫酸水素ナトリウムを用いないことを以外は実施例４
と全く同様にしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ
抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化を行い、Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂ（２．５ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）
を得た。 （２） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂのＩｇＧ
結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａをＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂに変えた以外は実施例４の「Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇＧ結合能の評
価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価を行った結
果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｂのＩｇＧ吸着
率は６５％であった。
【００３８】比較例４−２ Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）
の固定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
のＦａｂの固定化及び固定化量の定量 Ｆａｂを３ｍｇに変更したこと以外は比較例４−１と全
く同様にしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体
の一部分（Ｆａｂ）の固定化を行い、Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃ（４．０ ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を
得た。 （２） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃのＩｇＧ
結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａをＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃに変えた以外は実施例４の「Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇＧ結合能の評
価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価を行った結
果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃのＩｇＧ吸着
率は７２％であった。上記実施例と比較例におけるＳＨ
含有化合物の固定化量及び活性を表１にまとめた。
ｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）
の固定化（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃ） （１） Ｔｒｅｓｙｌ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへ
のＦａｂの固定化及び固定化量の定量 Ｆａｂを３ｍｇに変更したこと以外は比較例４−１と全
く同様にしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂへの抗ＩｇＧ抗体
の一部分（Ｆａｂ）の固定化を行い、Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃ（４．０ ｍｇ／ｍｌ−ｇｅｌ）を
得た。 （２） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃのＩｇＧ
結合能の評価 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａをＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃに変えた以外は実施例４の「Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ａのＩｇＧ結合能の評
価」と全く同様にしてＩｇＧ結合能の評価を行った結
果、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｆａｂ−ｃのＩｇＧ吸着
率は７２％であった。上記実施例と比較例におけるＳＨ
含有化合物の固定化量及び活性を表１にまとめた。
【００３９】
【表１】
【００４０】表１から明らかなように、本発明の固定化
方法を用いた実施例では、ＳＨ基含有化合物を高収率で
溶媒不溶性担体に固定化することができ、また、そのＳ
Ｈ基含有化合物が本来有している活性を高く保持するこ
とが可能であった。
方法を用いた実施例では、ＳＨ基含有化合物を高収率で
溶媒不溶性担体に固定化することができ、また、そのＳ
Ｈ基含有化合物が本来有している活性を高く保持するこ
とが可能であった。
【００４１】
【発明の効果】本発明は、上述した構成よりなるので、
高い収率でＳＨ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化
し、かつ、固定化されたＳＨ基含有化合物が本来有する
活性を高く保持することが可能な新規の固定化方法を提
供する。
高い収率でＳＨ基含有化合物を溶媒不溶性担体に固定化
し、かつ、固定化されたＳＨ基含有化合物が本来有する
活性を高く保持することが可能な新規の固定化方法を提
供する。
【００４２】
【配列表】 <110> 鐘淵化学工業株式会社、KANEKA CORPORATION <120> 化合物の固定化方法 <130> TKS-3721 <160> 2 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト MP47C ペプチド <400> 1 Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu 1 5 10 15 Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys 20 25 30 Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Pro 35 40 45 Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys 50 55 <210> 2 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト MP47C ペプチドをコードするDNA <400> 2 cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 gaa acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gaa aaa gca ttt Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe 20 25 30 aaa cag tat gct aac gac aac ggt gtc gac ggt gtt tgg acc tat gac Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp 35 40 45 ccc gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc taagctt Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys 50 55
【００４３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＣＮＴ ＭＰ４７Ｃベクターを示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｄ Ｒ 30/88 30/88 Ｃ // Ｂ０１Ｊ 20/24 Ｂ０１Ｊ 20/24 Ｃ Ｆターム(参考） 4D017 CA14 CB01 DA03 EA01 4G066 AA47D AB06D AB07D AC22C AC26C AC27C AD02B AD07C AD15C AE05C AE19C CA20 CA54 DA10 EA02 FA37 4H006 AA02 AA03 AB81 AC63 AD33 AD40 BA61 BE03 4H045 AA10 AA20 BA60 BA61 CA40 DA75 EA60 FA81
Claims (8)
- 【請求項１】 溶媒不溶性担体とＳＨ基含有化合物を抗
酸化剤の存在下に反応させることを特徴とする前記化合
物の固定化方法。 - 【請求項２】 溶媒不溶性担体は、水不溶性担体である
請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項３】 ＳＨ基含有化合物の分子量は、３万以下
である請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項４】 ＳＨ基含有化合物は、アミノ酸、ペプチ
ド及びタンパク質からなる群より選択される少なくとも
１種である請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項５】 抗酸化剤は、ピロ亜硫酸ナトリウム、二
亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナト
リウム、ハイドロサルファイトナトリウム及びＬ−アス
コルビン酸からなる群より選択される少なくとも１種で
ある請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項６】 ＳＨ基含有化合物に対する抗酸化剤のモ
ル濃度の比が１０００：１以上１：１０００以下である
請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項７】 抗酸化剤のモル濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以
上１ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１記載の固定化方法。 - 【請求項８】 溶媒不溶性担体は、グリシジル基、イミ
ドカルボナート基、トシル基、トレシル基、カルボキシ
ル基、アミノ基、アジド基及び水酸基からなる群より選
択される少なくとも１種の官能基により活性化されてい
るものである請求項１記載の固定化方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10330578A JP2000154200A (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | 化合物の固定化方法 |
| DE69917574T DE69917574T2 (de) | 1998-11-20 | 1999-11-19 | Methode zur Immobilisierung von Verbindungen |
| EP99402873A EP1013669B1 (en) | 1998-11-20 | 1999-11-19 | Method for immobilization of compounds |
| US09/444,305 US6252054B1 (en) | 1998-11-20 | 1999-11-22 | Immobilization of SH group-containing compounds in the presence of a sulfite-containing antioxidant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10330578A JP2000154200A (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | 化合物の固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000154200A true JP2000154200A (ja) | 2000-06-06 |
Family
ID=18234229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10330578A Pending JP2000154200A (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | 化合物の固定化方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6252054B1 (ja) |
| EP (1) | EP1013669B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000154200A (ja) |
| DE (1) | DE69917574T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008513771A (ja) * | 2004-09-22 | 2008-05-01 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィーマトリックスの製造方法 |
| JP2014136688A (ja) * | 2013-01-16 | 2014-07-28 | Japan Health Sciences Foundation | 抗ＴＮＦα抗体親和性ペプチド、ペプチドカラム、及び抗ＴＮＦα抗体親和性ペプチドのスクリーニング方法 |
| WO2020195514A1 (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 株式会社カネカ | チオール基含有化合物の担持方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4882054B2 (ja) | 2000-09-13 | 2012-02-22 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 腹膜透析液およびその調製法 |
| JP4685294B2 (ja) * | 2001-09-18 | 2011-05-18 | 株式会社カネカ | 新規ペプチド、生産方法、新規吸着体、吸着器および吸着方法 |
| CN103447009B (zh) * | 2013-09-26 | 2015-08-19 | 济南大学 | 一种半胱氨酸改性丝瓜络吸附剂的制备及应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2619451A1 (de) * | 1976-05-03 | 1977-11-24 | Bayer Ag | Verfahren zur bindung von hoch- und niedermolekularen liganden an polymere traeger |
| CA1093991A (en) * | 1977-02-17 | 1981-01-20 | Hideo Hirohara | Enzyme immobilization with pullulan gel |
| US5108916A (en) * | 1989-06-05 | 1992-04-28 | Rhone-Poulenc Rorer, S.A. | Process for stereoselectively hydrolyzing, transesterifying or esterifying with immobilized isozyme of lipase from candida rugosa |
| US5824522A (en) * | 1990-12-07 | 1998-10-20 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Recombinant decarbamylases for producing D-α-amino acids |
| DK100592D0 (da) * | 1992-08-10 | 1992-08-10 | Mouritsen & Elsner Aps | Metode til kemisk kobling paa faste faser |
| US5298406A (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes |
| JP3613585B2 (ja) * | 1995-03-01 | 2005-01-26 | 株式会社カネカ | リガンドまたはリガンドが結合している化合物の固定化方法 |
-
1998
- 1998-11-20 JP JP10330578A patent/JP2000154200A/ja active Pending
-
1999
- 1999-11-19 DE DE69917574T patent/DE69917574T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-19 EP EP99402873A patent/EP1013669B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-22 US US09/444,305 patent/US6252054B1/en not_active Expired - Lifetime
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| JP2014136688A (ja) * | 2013-01-16 | 2014-07-28 | Japan Health Sciences Foundation | 抗ＴＮＦα抗体親和性ペプチド、ペプチドカラム、及び抗ＴＮＦα抗体親和性ペプチドのスクリーニング方法 |
| WO2020195514A1 (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 株式会社カネカ | チオール基含有化合物の担持方法 |
| JPWO2020195514A1 (ja) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | ||
| JP7441209B2 (ja) | 2019-03-26 | 2024-02-29 | 株式会社カネカ | チオール基含有化合物の担持方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6252054B1 (en) | 2001-06-26 |
| DE69917574D1 (de) | 2004-07-01 |
| EP1013669A3 (en) | 2002-11-06 |
| EP1013669B1 (en) | 2004-05-26 |
| DE69917574T2 (de) | 2005-06-09 |
| EP1013669A2 (en) | 2000-06-28 |
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