JPS599153B2 - 生物学的活性化合物の製造方法 - Google Patents

生物学的活性化合物の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的に活性な物質および非水溶性高分子
化合物、それらの製造方法、親和性クロマトグラフイー
へのそれらの利用に関する。
近年、担体に結合され生物学的に活性な物質を選択的に
行われるべき反応に用いることを主たる特徴とする新し
い技術が生化学的操作法の中でますます発展してきてい
る。
担体に結合した物質を、ある混合物中に存在する二番目
の物質と特異的にコンプレックスを形成させることによ
り、当該物質を前記混合物から除去でき、そして場合に
より次いで脱着により単離することができる。
担体結合酵素は、物質変換を調製的連続的プロセスとし
て行うことができ、また反応生成物を酵素不含の形で得
ることができるという利点を与える。
生化学的酵素分析においては非水溶性酵素は反複使用可
能な試薬として使用できる。
基質のみならず特異的阻害剤に対しそも親和性を示すと
いう酵素の特徴により、担体結合酵素での親和性クロマ
トグラフイーを用いて酵素阻害剤を取得するのが特に適
切であることが判明した。
一方、非水溶性マトリックスに阻害剤が結合するので、
相当する酵素の調製取得が可能である。
いわゆる免疫吸着剤としては抗原または抗体を非水溶性
マトリックスに結合させ、そして次いで相当する抗体ま
たは抗原の単離が可能となる。
生物学的に活性な物質としては、上記詳述した所に相当
して生体内および試験管内において活性な天然物質およ
び合成物質が挙げられ、またそれらは最も広義において
、酵素、活性化剤、阻害剤、抗原または抗体、ビタミン
およびホルモンとして表わすことができる。
これらの生物学的に活性な物質は、非水溶性系の作用物
質を代表するものでであので、奏効剤（エフエクター）
と呼ぶことができる。
これまで記載されている担体結合奏効剤は、溶液中の相
当する物質よりも本質的に安定である。
担体物質いわゆるマトリックスとしては水性系への不溶
性のほかに可及的に低い非特異的吸着を示すもののみを
用いるのが有利である。
それにはマトリックスと奏効剤の反応相手との間の疎水
性、親水性およびイオン性交換作用を広く妨げる必要が
ある。
奏効剤の反応相手でない物質に対する結合は排除すべき
である。
生物学的に活性な物質に対する担体としてこれまで用い
られたマトリックスは奏効剤を物理的吸着により結合す
るもの（これには例えば活性炭およびガラスビーズなど
が属する）、および奏効剤と共有結合を介して相互に結
合したものに分けることができる。
後者にはビニル系重合体、例えばポリアクリル酸、ポリ
アクリル酸アミドおよびアミノー、カルボキシーまたは
スルホニルー置換ポリスチロール、およびセルロースお
よびその誘導体、および天然および合成のポリペプチド
および蛋白などが挙げられる。
マトリックスと奏効剤との間の交換作用がつりあってい
るため、炭水化物特にセルロース、デキストラン、でん
ぷん、寒天またはそれらの誘導体は水性系におけるマト
リックスとして最も広く用いられているが、これらの天
然物質中にしばしば含まれるカルボキシ基はその非特異
的反応の故に障害として感ぜられる。
その上、これらの物質は相対的に低い熱的および化学的
安定性を示す。
今や、親和性依存反応にマトリックスとして炭水化物を
用いた場合に示される欠点を、マ｝ ＩＪツクスとして
ポリヒドロキシメチレンを用いれば解消できることが見
出された。
すなわち本発明の対象は、生物学的に活性な物質がその
生物学的活性を維持したまま結合した非水溶性ポリ（ヒ
ドロキシメチレン）を特徴とする生物学的に活性な化合
物である。
これらの化合物においては、 （ａ） 担体マトリックスはポリヒドロキシメチレン
であり、 （ｂ） 生物学的に活性な物質は例えば酵素およびそ
れに対する活性化剤または阻害剤、抗原または抗体、他
の血漿蛋白、血液型物質、植物性血球凝集素、抗生物質
、ビタミンまたはホルモン、ペプチドまたはアミノ酸ま
たは合成の奏効剤であり、 （Ｃ） ポリヒド口キシメチレンおよび生物学的に活
性な物質は相互に、直接または介在結合を通して共有結
合している。
本発明によれば、前述したような非水溶性ポリ（ヒドロ
キシメチレン）に共有結合された生物学的に活性な化合
物は次のような態様すなわち（ａ） ポリ（ヒドロキ
シメチレン）を直接かまたは数個の官能基を有する化合
物を介して生物学的に活性な化合物と反応させるか、ま
たは （ｂ） ポリ（ビニレンカーボネート）を多官能性化
合物または例えば合成奏効剤である生物学的に活性な化
合物と反応させ、そして残存するシクロカーボネート基
を加水分解しそして得られる重合体を場合により更に生
物学的に活性の化合物と反応させる ことによって得られる。
ここに数個の官能基を有する化合物または多官能性化合
物とは後にスペーサーまたは架橋試薬として言及される
ものを意味する。
ポリヒド口キシメチレンは連続炭素鎖を有する合成重合
体である。
各炭素原子は水素原子１個と水酸基１個とを有する。
その製法および性質は、特にＪ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓ
ｃｉ ．第５８巻第５３３〜５４３頁（１９６２）およ
び同第２９巻第２５７〜２７４頁（１９５８）に記載さ
れている。
それは塩基性または酸性加水分解によりポリビニレンカ
ーボネートから製造できる。
最も広義において、前記ポリヒドロキシメチレンはポリ
ビニレンカーボネートの誘導体として把握することがで
きる。
ポリヒドロキシメチレンへの奏効剤の結合は、また該奏
効剤を水酸基と共有結合させるのに用いられる方法によ
り達成でき、あるいは、ポリビニレンカーボネートを、
同じく知られているポリビニレンカーボネートの環状カ
ーボネート環の第１級アミン例えばヘキサメチレンジア
ミンとのアミン分解反応を介して、ウレタン結合を通し
てスペーサーまたは奏効剤により置換されたポリピニレ
ンカーボネートとし、その残留環状カーボネート基を次
いで水酸基にけん化することによって達成できる。
生物学的に活性な奏効剤を直接ポリヒド口キシメチレン
と反応させないで、親和性クロマトグラフイーにおいて
アーム（Ａｒｍ）または英文文献の場合のように「スペ
ーサー」として記述される介在部分を通してマトリック
スに共有結合させるのが生成物利用に対し特に有利であ
る。
スペーサー物質は大抵、長さ約１〜２ｎｒｒＬの炭化水
素構造である。
そのスペーサーの２個の末端官能基は各々、マトリック
スとの反応および奏効剤との反応を可能とし、その際マ
トリックスとの反応にはポリヒドロキシメチレンのみな
らずポリビニレンカーボネートも適当な条件下に使用で
きる。
本発明の対象は更に、生物学的に活性な物質を−担体と
共有結合させる方法である。
これには一連の一般に知られた反応を用いることができ
る。
特に簡単には、マ｝ ＩＪックスへの奏効剤の結合は、
ポリヒドロキシメチレンの水酸基をシアンハロゲニド有
利にはプロムシアンで活性化し、次いでアミノ基を含有
する生物学的に活性な奏効剤をこの活性化された基に対
し反応させることにより行われる。
別の方法は、クルチウス（ Ｃｕｒｔｉｕｓ ）のアジ
ド法ヲ変形させて、ポリヒドロキシメチレン例えばポリ
サツカライドをハロゲンカルボン酸例えばクロロ酢酸と
アルカリ性媒体中で反応させ、相当する酸をアルコール
でエステル化し、次いでそのエステルをヒドラジドに導
き、そして最後に、次いで生成するアジドを奏効剤蛋白
のアミン基と反応させ、該蛋白をポリヒド口キシメチレ
ンーマトリックスに結合させるこ゛とからなる。
奏効剤をポリヒドロキシメチレンーマトリックスに結合
する別の可能性は水酸基をプロモアセチルクロリドでア
セチル化し、次いで奏効剤のアミン基をアルキル化する
ことからなる。
同様な反応経過は、例えば担体の水酸基を反応性トリア
ジンと反応させることにより達成でき、その場合トリア
ジンの反応性基の一部をポリヒドロキシメチレン化合物
と反応させ、他を奏効剤のアミン基と反応させる。
ジアゾ化し得る芳香族アミンであって、別の反応性基を
介して担体の水酸基と一方の側で結合することのできる
ものは、別の側で、カップリング能のある活性化された
アミノ酸例えば蛋白奏効剤のチロシンまたはヒスチジン
残基とのカップリングを可能にする。
アリールアミノ基を含有するビニールスルホン誘導体お
よびβ−ヒドロキシェチルスルボンの硫酸半エステルは
担体の水酸基と反応させることができる。
それらは前述のジアゾ化反応による奏効剤の結合を可能
にする。
ポリヒドロキシメチレンの水酸基を少くとも２個の反応
性基を含有する非イオン形成性エポキシド、例えばエピ
ハロヒドリンまたはポリエポキシド例えばエビクロルヒ
ドリンまたはビスエポキシドなどと反応させると特に安
定したエーテル結合が生じる。
ここに例示した担体マトリックスおよび蛋白奏効剤また
は他の奏効剤の間に共有結合をつくる方法の他にも、一
方ではポリヒドロキシメチレンの水酸基を、他方では奏
効剤の所定の基を反応させまたそれによって両者の間に
共有結合をっ《るその他の方法も挙げることができ、す
なわち例えば錯体結合性金属化合物例えばチタン化合物
による既知の反応が挙げられる。
ポリヒド口キシメチレンは、前述のごとく化学的および
熱的に安定であるほか、操作技術的にも有利な性質を有
する点でもすぐれており、それ故天然炭水化物に基づい
たこれまで最適と考えられていた担体物質よりもすぐれ
たものとなる。
ポリヒドロキシメチレンは例えば繊維、糸、箔または球
状粒あるいは、好ましくは粉末材料とすることができ、
従ってそこに結合した奏効剤の使用目的に応じて適切な
形を選ぶことができる。
叫本 奏効剤またはスペーサーの結合に対し
て敏感な表面を製造法により制御できるので、ポリヒド
口キシメチレンは、従来法にょる担体物質よりも更に有
利である。
奏効剤とポリヒドロキシメチレンーマトリックスとの結
合について記載したと同様の反応機構により、例えばス
ペーサーが官能基の一つとしてアミノ基を有している場
合にはそのスペーサー物質ヲマトリックスに結合させる
ことができる。
シかしながら、スペーサーの導入により、奏効剤の結合
のために、付加的に反応可能性を導入することが可能と
なる。
マトリックスに結合したスペーサーカ遊離カルボキシル
基を有する場合にはこのカルボキシル基を例えばカルボ
ジイミド化合物により活性化でき、次いでそれを奏効剤
のアミン基とアミド結合することができる。
カルボキシル基は更に、ウッドヮード氏（ Ｗｏｏｄｗ
ａｒｄ ）により紹介されたインキサゾリウム塩を用い
たアミド結合の形成を可能にする。
マトリックスに結合したスペーサーが有効な遊離アミン
基を有する場合には、アリールアミノ基を含有するビニ
ールスルホン誘導体またはβ−ヒドロキシエチルスルホ
ンの硫酸エステルを用いてスペーサーの延長部にアリー
ルアミノ基を導入でき、それらは次いで既知の方法にょ
りジアゾ化し、そして次に奏効剤の相応に反応性のある
基に結合される。
例えば本発明による生物学的に活性な化合物は、これま
で他の親水性、非水溶性担体に結合した奏効剤について
知られている大抵の用法に適している。
それ故酵素を非水溶性にすることができる。
この不溶性酵素は自動分析器における基質測定およびい
わゆる酵素電極としてますます利用されている。
安定性が高められているので、担体結合酵素列は工業的
な酵素反応の実施に適している。
担体に結合した生物学的に活性な物質は、その特異的吸
着剤としての性質の故に、親和性クロマトグラフィーに
広く応用されている。
担体に結合した天然または合成の酵素阻害剤を用いて酵
素を高度に精製することができ、一方奏効剤としての酵
素は特に、粗抽出液からの天然の酵素阻害剤の取得に著
しく適していることが判明した。
担体に結合した非水溶性抗原は、それに属する抗体の単
離に用いられ、それはこの方法により他の血清成分不含
および他の抗原不含の形で得られる。
例えば血清中の濃度が低いために沈殿できないような沈
殿不可能な抗体も親和性クロマトグラフイーにより単離
でき、また定量的にも測定できる。
親和性（アフィニテイー）クロマトグラフィーにおいて
従来の炭水化物系担体は、それらが酵素的に分解されし
かも本発明の担体に比して熱的および化学的に安定性が
低いという点で不利がある。
熱安定性は担体を滅菌せねばならない場合に重要である
。
炭水化物系担体はまた微生物の攻撃により冒される可能
性がある。
また従来の不溶性ビニル重合体例えば交叉結合された不
溶性ビニルピロリドン重合体は担体として使用すると生
物学的物質を非特異的に吸着してしまう。
こうしたビニル重合体は果汁の清澄化に使用するには推
奨できるがこのことは該物質が非特異的結合性を有する
ことによるものである。
それと逆にポリヒド口キシメチレン自体は生物学的物質
を結合せずそれ故に生物学的物質の所望の特異的結合性
を妨害しない。
本発明を更に詳述するため次に挙げた実施例では、一つ
の方法により製造した担体が、各種の奏効剤の結合に適
していること、および母体であるポリヒドロキシメチレ
ンを適当な置換により各々所望の奏効剤の結合に適合さ
せることができることを示す。
更に、マトリックスに結合した奏効剤をいかにして使用
できるかも例示的に示す。
実施例 １ ポリヒド口キシメチレンー破傷風トキソイド化合物 （ω−アミノーｎ−ヘキシル）一置換ポリヒドロキシメ
チレンからのマトリックスの製造 水９００ｖｒＪｌに懸濁した２０１のポリヒドロキシメ
チレンをジメチルホルムアミド５０ＴｒＬｌ中ＢｒＣＮ
２０１の溶液と混合し、そしてか《はんしながら２Ｎ苛
性ソーダをゆっくり添加することにより１５℃の内温で
６分間１１．５のｐＨ値に保つ。
次いで直ちに沢過し、充分氷水で洗いそして圧搾する。
そのようにして活性化したまだ水で湿っているポリヒド
ロキシメチレンを、水５００ＴＬｌ中ヘキサメチレンジ
アミン２０グの充分かくはんされ室温に保たれ濃塩酸で
ｐＨ８．５に調節した溶液に添加し、水で全量を１１と
し、ｐＨ値を常に８．５〜９．０に制御し、そして更に
５時間室温でかくはんする。
次いで沢過しそして充分水洗する。（ωーアミノーｎ−
ヘキシル）基置換ポリヒドロキシメ′チレンの乾燥試料
は１．９％の窒素含量を有した。
第１級遊離アミン基の証明のためのｓａｎｇｅｒ試薬に
より、強く黄色に着色した生成物が得られる。
担体結合奏効剤の製造（奏効剤：破傷風抗原）実施例１
による担体１０グをｐＨ １０の０．５Ｍりん酸ナトリ
ウム溶液２００ＴｒＬｌに懸濁する。
その懸濁液をかくはんしながら５０℃に加温しそして５
？の１−アミンベンゼン−４−β−ヒドロキシエチルス
ルホン硫酸半エステルと混合する。
２ＭＮａＯＨでｐＨ値を１０に補正した後、その混合物
を１時間５０℃でかくはんする。
次いで沢過器を通して沢過し、そして２ｌの水、２ｌの
アセトンおよび２ｌの０．２ＭＨＣｌで洗浄する。
ポリヒドロキシメチレンに導入されたアリールアミン基
をジアゾ化するために、その沢過器残留物を２００ｍｌ
の０．２ＭＨＣｌに懸濁し、２℃に冷却し、そしてかく
はんしながらＩ Ｍ Ｎａ ＮＯ ２溶液と、ＫＩー
でんぷん紙によりわずかに亜硝酸塩過剰が確認されるま
で混合する。
１０分後沢過器を通して沢過し、そして沢過器残留物を
２℃の水性０．ＯＩＭアミドスルホン酸１７および次い
で２℃の０．２Ｍりん酸ナトリウム２ ０ ０ｍｌ （
ｐＨ ７．５ ）で洗浄する。
カップリングさせるために、そのジアゾニウム基含有生
成物をｐＨ７．５および２℃の０．２Ｍｌｌｌ）ん酸ナ
トリウム中破傷風トキソイド（１２６０Ｌｆ／ｇＮ ）
の溶液１５０ｍｌに懸濁し、ソシテ２０時間５゜Ｃでか
くはんする。
トキソイドの未結合部分は沢過器上でＩＭ ＮａＣ１溶
液１ｌで洗浄除去する。
ポリヒドロキシメチレンー破傷風トキソイド化合物の応
用（破傷風一抗毒素の取得） 実施例１による生成物１０グを、Ｍ／１５りん酸ナトリ
ウムを添加した０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液（ＰＢＳ，
ｐＨ７．２）に懸濁しそして直径３ｃＩＩＬおよび高さ
１０ｃＩｒＬのカラムに導く。
１ ６ ５ ０ ＩＥ破傷風抗毒素／ＴＬｌの破傷風一
馬血清２ｏＴＩ′Ｌｌをカラムにのせ、それを次いで５
０ｏｒｒＬｌのＰＢＳ（ ｐＨ７．２）で洗浄する。
抗体の溶出は０．５Ｍグリシン／ＨＣ １緩衝液（ｐＨ
２．５）を用いて行う。
その溶出液は、２Ｍ ＮａＯＨで中和し次いで遠心分離
した後全部で２４０雫の蛋白を含有しまたマウスでの保
護実験で測定した場合１２３００ＩＥの破傷風一抗毒素
を含有する。
実施例 ２ ポリヒドロキシメチレンーアミノベンズアミジンー化合
物 （ω一カルボキシーｎ−ペンチル）一置換ポリヒドロキ
シメチレンからのマトリックスの製造実施例１に従って
ＢｒＣＮ で活性化された２ｏ１のポリヒドロキシメ
チレンを希苛性ソーダでｐＨ８．５に調節されそして全
量を１１としたε−アミノカプロン酸２５グの水溶液に
添加する。
更に５時間室温およびｐＨ８．５でかくはんしそして沢
過し充分水洗する。
（ω一カルボキシーｎ−ペンチル）一基置換ポリヒドロ
キシメチレンの乾燥試料は０．８６％の窒素含有量であ
った。
担体結合奏効剤の製造（奏効剤：アミノベンズアミジン
） 実施例２により製造した２１のポリヒド口キシメチレン
誘導体を２５ｒｒｔｌの０．１Ｍモルホリノエタンスル
ホン酸に懸濁し、そして１グの１−エチル−３−（ ３
−ジメチルアミンプロピル）一カルポジイミド塩酸塩と
混合する。
ｐＨ調節しながら２ＭＨＣ１を添加することによりｐＨ
値を４．８に調節する。
かくはんしながらその混合物に１１のｍ−アミノベンズ
アミジンを添加する。
その懸濁液をｐＨを調整しながら１時間かくはんし、次
いでその吸着剤を直径１ｃｒｒＬのクロマトグラフイー
カラムに導く。
その吸着剤を、０．５ＭＫＣｌを添加したｐＨ８．０の
０．０５Ｍ｝リスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣ
ｌ緩衝液（ Ｔｒｉｓ −ＫＣＩ ）２００ｍｌで洗う
。
ポリヒドロキシメチレンーアミノベンズアミジン化合物
の応用（トロンビンの取得） 牛からの粗製トロンビン１００■を５ｍｌの０．０ ５
Ｍ Ｔｒｉｓ， ０．５Ｍ ＫＣＩ（ｐＨ ８．０ ）
に溶解しそして前述のごとく調製したカラムにのせる。
次いでそのカラムを２００ｍｌのＴｒｉｓ −ＫＣＩ緩
衝液で洗浄する。
不溶性にされたｍ−アミノベンズアミジンに結合したト
ロンビンをこれより、Ｔｒｉｓ ＫＣＩ緩衝液中０．
０５Ｍｍ−７ミノベンズアミジンの溶液１００ｍｌを用
いて脱離する。
その蛋白含有フラクションを合し、そして１×３０Ｃｒ
ｒＬ力ラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ − ２ ５を通して
Ｔｒｉｓ −ＫＣ １緩衝液中で流下させる。
カラム溶出液の最初の蛋白含有ピークはＣｈａｓｅおよ
びＳ ｈａ ｗの方法（ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８、２２
１２（ １９６９）参照〕によりその活性を測定するこ
とにより出発時活性の７８％であることを見出すことが
できた。
実施例 ３ ″ ポリヒドロキシメチレンーペプシン化合物（ω−アミノ
ーｎ−ヘキシル）一置換ポリヒドロキシメチレンからの
マトリックスの製造 ジメチルホルムアミド／メタノールから再沈殿させたポ
リビニレンカーボネート（これはＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｓｃｉ．、５８、５３４（１９６２）に記載の方法によ
り製造）８．Ｏｆをメタノール１８０ｌ７１ｌ中ヘキサ
メチレンジアミン７．５１の溶液に懸濁し、そして４８
時間室温でかくはんし、ｐ過し、メタノールで洗い、そ
して９６％メタノール３００ＴＬｌ中ナトリウムメチラ
ート１０グの溶液に４日間室温で懸濁し、メタノールお
よび次いで強力に水で洗う。
６個のＣＨ２基のスペーサーを介して第１級アミン基置
換されたポ゜リヒドロキシメチレン吸着剤の乾燥試料は
５．７％の窒素含量を有した。
担体結合奏効剤の製造（奏効剤：ペプシン）実施例３に
より製造した２０グの（ω−アミノーｎ−ヘキシル）一
置換ポリヒドロキシメチレンをｐＨ １０の０．２Ｍり
ん酸ナトリウム４０（Ｊｍｌに懸濁する。
その懸濁液をかくはんしながら４０１ｒＬｌの２５％グ
ルタールジアルデヒド溶液に添加する。
室温で２時間かくはん後ｒ過器を通して沢過し、そして
沢過器残留物をｐＨ４．０の０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液４ｌで洗う。
次いでその反応生成物をｐＨ４．０の０．２Ｍ酢酸ナト
リウム中ペプシン５グ（ Ａｎｓｏｎ 法で測定した
場合全部で５０００００単位を有する）の溶液５００ｍ
ｌに添加し、そして１５時間６℃でかくはんする。
次いで得られる生成物を沢過器上で、ｐＨ４．０および
ＩＭＮａＣｌを添加した５ｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム
／酢酸で洗浄する。
ポリヒド口キシメチレンーペプシン化合物の応用（免疫
グロブリンの蛋白分解的分離） この実施例による吸着剤をｐＨ４．０の０．１Ｍアセテ
ート緩衝液に懸濁しそしてそれについてＡｎｓｏｎ
法による活性測定を行う。
その懸濁液は全部で２１０００単位のペプシンを結合さ
れたこの試験により証明し得る形で含有する。
ヒトー免疫グロプリンＧの蛋白分解的分離を行うため、
ペズシン吸着剤を沢過し、その残留物をｐＨ４．１の生
理学的ＮａＣｌ溶液中ヒト−ＩｇＧ３０ｆの２．５％溶
液に懸濁する。
その分離混合物を２４時間３７℃でかくはんする。
担体結合ペプシンを沢去後、ｒ液を１２５０ｍｌの飽和
硫酸アンモニウム溶液と混合する。
その際生成する沈殿を遠心分離する。
それは、免疫グロブリンのＦ（ａｂ）２−フラグメント
なその抗体活性とともに含有する。
注出物は捨てる。
実施例 ４ ポリヒドロキシメチレンーオキサミン酸化合物の製造 １０グのポリヒドロキシメチレンを実施例１の記載と同
様にしてＢｒＣＮ で活性化し、そして１５０ｍｌの０
． １ Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解した５グのチラミ
ンと、５゜Ｃで６０分間かくはんすることにより反応さ
せる。
チラミンの未結合部分を沢過器上で沢去し、そして沢過
器残留物を、ｐＨ７．０および５℃の０，１Ｍりん酸ナ
トリウム緩衝液１ｌで洗う。
その沢過器残留物を、ジアゾ化されたｐ−アミノフエニ
ルオキサミン酸１．０１の５℃に冷却した溶液１５０ｍ
ｌに懸濁し、そして１５時間５℃でかくはんする。
その吸着剤を涙過器上で、２ｒｒＬＭ ＣａＣｌ２およ
び０．２ｍＭ ＥＤＴＡを添加したｐＨ５．５の０．
０５Ｍ酢酸ナトリウムー酢酸一緩衝液１ｌで洗う。
ポリヒドロキシメチレンーオキサミン酸化合物の応用（
ノイラミニダーゼの取得） 実施例４による吸着剤を前述のアセテート緩衝液に再懸
濁し、そして直径２ｃｒｒＬのクロマトグラフイーカラ
ムに導入する。
このカラムを通して、１ｌのコレラ菌（ Ｖｉｂｒｉｏ
Ｃｈｏｌｅｒａｅ ）培養沢液（ ８ ０ ０ ＩＥ
ノイラミニダーゼ／ｍＡ’）を通す。
該沢液は予め２Ｍ酢酸でｐＨ５．５に調節しまたＣａＣ
１２およびＥＤＴＡと２ｍＭまたは０．２ｍＭの濃度と
なるまで混合しておいた。
未結合蛋白を５００１ｒＬｌのアセテート緩衝液で洗う
。
担体に結合した阻害剤に吸着されたノイラミニダーゼの
溶出はカラムを０． １ Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で
洗いそして活性ノイラミニダーゼ含有フラクションを集
めることにより行われる。
それは使用活性の８６％を含有する。
実施例 ５ （ａ）ホリヒドロキシメチレンとエビクロルヒドリンと
の反応 ５０グのポリヒドロキシメチレンを１１の２Ｎ Ｎａ
ＯＨに懸濁し、２５０ｄのエピク０／Ｌ／ヒドリンと混
合し、そして２時間５５〜６０℃でかくはんする。
″懸濁液ＯｐＨ値はしばらくの後１０〜１１に低下する
。
ＮａＯＨの添加により更に１時間このｐＨ値を維持する
。
２時間の反応時間後固体物質を沢過し、水、アセトンそ
して最後に再び水で洗う。
（ｂ）５（ｌのへキサメチレンジアミンを水１．５ｌに
溶解し、そしてＨＣｌ とｐＨ１０まで混合する。
その溶液に前ｉＱａ）で活性化したポリヒドロキシメチ
レンを添加し、そして５０〜５５゜Ｃで６時間かくはん
する。
次いで生成物を沢取し、そしてヘキサメチレンジアミン
不含となるように水洗する。
（ｃ） 実施例５（ｂ）で得られた生成物を５０１の
１一アミンベンゼン−４−β−ヒドロキシエチルスルホ
ン硫酸エステルと共に５５℃およびｐＨ１０で１時間か
くはんする。
次いで固体物質を沢取し、水、アセトンおよび再び水で
洗う。
（ｄ） 前記５（ｃ）で得られた生成物１０１を沢過
器上で２００ｍｌの０．１ＮＨＣｌで洗い、次いで３０
０ｍｌの０．５ＮＨＣｌに懸濁する。
その懸濁液をかくはんしながら０．ＩＮ ＮａＮ０２
溶液と０〜４℃で、そのジアゾ化の際ＫＩ一でんぷん紙
によりわずかな亜硝酸塩過剰が確認されるまで混合する
。
１０分後沢過器を通して沢過し、そして残留物を氷水お
よび次いでｐＨ７．５、０〜４℃の０．１５Ｍりん酸ナ
｝ ＩＪウム緩衝液テ洗う。
（ｅ） ０． ７ ５ ？のアルブミンをｐＨ７．５
のホスフエート緩衝液２５０ｒ／ｌｌに溶解し、４℃に
冷却し、そして前記５（ｄ）で製造した生成物を添加す
る。
その懸濁液を２０時間４℃でかくはんし、次いで沢取し
そして固体物質をＩＭ ＮａＣｌおよびホスフエート
緩衝化食塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２の１ ／ １
５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ＫＨ２ＰＯ４緩衝液を含有
する０．９％Ｎａ Ｃ １水溶液）で洗う。
沢液および洗液を放射免疫拡散法によりアルブミンにつ
いて検査する。
そのように製造した担体１ノに７５〜のアルブミンが結
合する。
（ｆ） ２．４９のＩｇＭをｐＨ７．５のホスフエー
ト緩衝液２５０ｍｌに溶解しそして４℃に冷却する。
前記５（ｄ）によりジアゾ化された生成物１０グを添加
し、そしてその懸濁液を２０時間４℃でかくはんする。
ｆ過後、固体物質をＩＭ ＮａＣｌ溶液そしてＰＢＳ
で洗う。
このように５（ｆ）により調製された担体１１は２４０
〜のＩｇＭを結合する。
実施例 ６ （ａ）ＩＯＰのＰＨＭを実施例５（ａ）および（ｂ）の
記載と同様にしてエピクロルヒドリンで活性化し、ヘキ
サメチレンジアミンと反応させ、そして後処理する。
（ｂ） そのようにして製造した担体１０グを、水２
００ＴＬｌに懸濁した５１のこはく酸無水物で、１０℃
およびｐＨ６にて４時間サクシノイル化する。
ｐＨ値を２Ｎ ＮａＯＨで調整する。固体物質を水洗
後、生成物を２．５２のＮ−シクロへキシルーＮ’−（
（Ｎ−メチルモルホリノ）一エチル〕一カルポジイミド
−ｐ−４ルエンースルホネートと共にｐＨ５および５℃
で３０分か《はんし、沢取し、速かに氷水で洗う。
（ｃ）ＩｆのＩｇＧを２５０ＴｒＬｌのホスフエート緩
衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、そして６（ｂ）で製造し
た担体と共に２４時間４℃でかくはんする。
沢過後、生成物をＩＭ食塩そしてＰＢＳ で洗う。
担体１グに８５Ｔｎ９のＩｇＧが共有結合する。
実施例 ７ （ａ）２０？の５（ａ）で製造した生成物を２０２のア
ミノカプロン酸と共にｐＨ１０および５０〜５５℃で６
時間かくはんする。
次いで沢取し、水洗する。
（ｂ）１０グの７（ａ）で製造した生成物を２．５１の
ＮーシクロへキシルーＮ’−４（Ｎ−メチルモルホリノ
）一エチル〕一カルポジイミド−ｐ−トルエンスルホネ
ートと混合し、そしてそこへ５分後２１０Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドをｐＨ５で添加する。
２４℃で５時間かくはん後、固体物質を沢取し水洗する
。
（ｃ） ｏ．ｓｙのアルブミンを２００ＴｒＬｌのホ
スフエート緩衝液に溶解し、そして７（ｂ）で製造した
活性化された担体と共に２４時間４℃でかくはんする。
沢過後生成物をＩＭ食塩そしてＰＢＳ で洗浄する。
担体１１に５０〜のアルブミンが共有結合する。
実施例 ８ １０２のＰＨＭを実施例５（ａ）および（ｂ）の記載と
同様にしてエピクロルヒドリンにより活性化し、ヘキサ
メチレンジアミンと反応させそして後処理する。
（ａ） そのようにして製造した担体１０グを水１０
０ｍｌに懸濁し、そして５００１１ｌｌの２５％グルタ
ールジアルデヒドと反応させる。
１時間かくはん後、固体物質を沢取し、水またはＰＢＳ
で洗う。
（ｂ） ０． ５ Ｐのアルブミンを２００ｍｌの，
ｌ−， ス７ｍ−ト緩衝液に溶解し、そして８（ａ）で
製造した担体と共に２０時間４℃でかくはんする。
沢過後生成物をＩＭ食塩そしてＰＢＳ で洗浄する。
実施例 ９ エピクロルヒドリンで活性化されたポリヒドロキシメチ
レンの直接反応 （ａ）ＩＯＳ’のポリヒドロキシメチレンを５０ｍｌの
エビクロルヒドリンにより実施例５（ａ）の記載と同様
にして活性化する。
沢過後生成物を速かに水、アセトン、水および最後にＰ
ＢＳで洗浄する。
（ｂ） ０．５？のアルブミンを２００ｍｌのＰＢＳ
に溶解し、そして９（ａ）で製造された生成物と共に６
０時間４℃でかくはんする。
沢過後、担体に結合した蛋白をＩＭ食塩そしてＰＢＳで
洗浄する。
そのように製造した担体１１は４５ｍ９のアルブミンを
結合する。
実施例 １０ １０ノの水不溶性ポリヒド口キシメチレンをｐＨ ９．
５ （ ０． １ ５ ｍ重炭酸ナトリウム／ＮａｏＨ
緩衝液）において３日間２５℃において３Ｃｌのジエチ
レングリコールジグリシジルエーテルと共に攪拌し、生
成物を吸引ろ過し、充分洗浄し、２００ＴＬｌの０．
１ ５ ｍりん酸塩緩衝液（ｐＨ８）中の０．５ｆの人
アルブミンに添加し、次に６０時間１０℃において攪拌
する。
ろ過後、担体結合蛋白をＩＭの食塩溶液およびＰＢＳ
を用いて洗浄する。
こうして得られた担体１グぱ３５■の結合アルブミンを
含有する。
実施例 １１ １０１のポリヒドロキシメチレンを、実施例１０に記載
のごとく、３０グのグリシジルトリス−（グリシジルエ
ーテル）と反応させ、２００ｍｌの０．１５７７１りん
酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中の０．５１の免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）に添加し次いで６０時間４℃において攪
拌する。
ろ過後、生成物をＩＭ食塩溶液およびＰＢＳ を用いて
洗浄する。
得られた蛋白樹脂は５０ｍ９の結合ＩｇＧを含有する。
以下に本発明により開示された新規な技術的事項を要約
して示す。
■．非水溶性ポリ（ヒドロキシメチレン）に生物学的に
活性な物質がその生物学的活性を維持しつつ化学的に結
合されていることを特徴と−Ｊ”−ル生物学的に活性な
化合物。
２．前記非水溶液ポリ（ヒドロキシメチレン）が生物学
的に活性な物質に対する担体マトリックスの機能を有す
る前記第１項の化合物。
３．前記生物学的に活性な物質が、複数個の官能基を有
スる化合物を介して前記ポリ（ヒドロキシメチレン）に
結合されている前記第１または２項の化合物。
４．前記生物学的に活性な物質が酵素およびそれに対す
る活性剤、および阻害剤、抗原または抗体、血漿蛋白、
血液型物質、植物性血球凝集素、抗生物質、ビタミンま
たはホルモン、ペプチトまたはアミノ酸または合成によ
り製造した奏効剤である前記第１〜３項の化合物。
５．ポリ（ヒドロキシメチレン）を、直接かまたは数個
の官能基を有する化合物を介して、生物学的に活性な物
質と反応させるか、またはポリ（ビニレンカーボネート
）を多官能性化合物または合成の奏効剤と反応させ、残
留環状カーボネート基を加水分解しそして場合によりそ
の重合体を生物学的に活性な化合物と更に反応させるこ
とを特徴とする、生物学的に活性な化合物の製造方法。
６．前記第１〜４項による生物学的に活性な化合物を含
有する剤。
７．前記第１〜４項による生物学的に活性な化合物の、
親和性クロマトグラフィーへの、抗体取得への、または
酵素反応実施への使用。
８．ポリビニレンヵーボネートを反応性第１級アミン基
を有する奏効剤と反応させ、次いで未反応環状カーボネ
ート基をけん化することを特徴とする前記第５項の方法
。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ポリ（ヒドロキシメチレン）を直接かまたは数個の
    官能基を有する化合物を介して生物学的に活性な物質と
    反応させるか、またはポリ（ビニレンカーボネート）を
    多官能性化合物と反応させ次に残存する環状カーボネー
    ト基を加水分解しさらに得られる重合体を生物学的に活
    性な物質と反応させるか、またはポリ（ビニレンカーボ
    ネート）を生物学的に活性な物質と反応させ次に残存す
    る環状カーボネート基を加水分解することを特徴とする
    、生物学的に活性な物質がその生物学的活性を維持しつ
    つ非水溶性ポリ（ヒドロキシメチレン）に共有結合され
    ている生物学的に活性な化合物の製造方法。
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