NO144672B - Biologisk aktivt materiale og fremgangsmaate til dets fremstilling - Google Patents

Description

I de siste år har det mer og mer funnet an- . vendelse en ny teknikk innen de biokjemiske arbeidsmetoder, hvis primære trekk består i å anvende affiniteten av bærerbundne, biologisk aktive stoffer til reaksjoner som skal gjennomføres selektivt.

Over en spesifikk kompleksdannelse av det bærerbundne stoff med et annet som foreligger i en blanding, kan angjeldende stoff fjernes fra blandingen og eventuelt deretter isoleres ved desorbsjon.

Bærerbundne enzymer byr den fordel å gjennom-føre stoffomdannelser i preparative, kontinuerlige prosesser og å oppnå reaksjonsproduktene enzymfrie. I den biokjemiske enzymatiske analytikk står vannuoppløselige enzymer som flere ganger anvendbare reagenser til disposisjon.

På grunn av enzymenes egenskap til å ha affini-teter ikke bare overfor substratene, men også overfor de spesifikke inhibitorer har utvinningen av enzyminhibitorer ved hjelp av affinitetskromatografi på bærerbundne enzymer vist seg spesielt gunstige. På den annen side muliggjør bindingen av inhibitorer til vannoppløselige matriser den preparative utvinning av de tilsvarende enzymer..

Som såkalte immunadsorbentier bindes antigener eller antilegemer på vannuoppløselige matriser og muliggjør deretter isoleringen av de tilsvarende antilegemer resp. antigener.

Som biologisk aktive stoffer forstås tilsvarende til de foregående anførsler in vivo og in vitro virksomme naturlige og kunstig fremstilte stoffer, som i videste betyd-ning kan betegnes som enzymer, aktivatorer, inhibitorer, antigener eller antilegemer, vitaminer og hormoner. Disse biologisk aktive stoffer kan nevnes effektorer, da de danner virkningsprinsippene i de vannuoppløselige systemer.

De fleste av de hittil omtalte bærerbundne effektorer er vesentlig mer stabile enn de tilsvarende stoffer i oppløsning.

Som bærermaterialer, såkalte matriser, er det fordelaktig bare å anvende slike stoffer som ved siden av uoppløseligheten i vandige systemer har lavest mulig uspesi-fikk adsorbsjon. Hertil må hydrofob, hydrofil og ionisk vekselvirkning mellom matrise og reaksjonsdeltageren .sterkt undertrykkes av effektoren. Med stoffer som ikke er reak-sjonsdeltagere av effektoren bør en binding være utelukket.-De hittil anvendte matriser som bærer for . biologisk aktive stoffer kan oppdeles i de som binder effektorene ved fysikalsk adsorbsjon, dertil hører aktivkull og glassperler og de som med effektoren over en kovalent binding er sammenknyttet med hverandre. Sistnevnte innbefatter vinylpolymere, f.eks. polyakrylsyre, polyakrylsyreamider og amino-, karboksy- eller suifonyl-substituert polystyren, videre cellulose og dens derivater og endelig naturlige og syntetiske polypeptider og proteiner. På grunn av den utlignede vekselvirkning mellom matrise og effektor har anvendelsen av kullhydrater, spesielt cellulose av dekstran, stivelse, agar resp. deres derivater funnet den høyeste ut-bredelse som matrise i vandige systemer, enskjønt også de i disse naturstoffer hyppig inneholder karboksylgrupper på grunn av deres uspesifikke reaksjon er funnet forstyrrende. Dessuten har disse stoffer en relativt liten termisk og kje-misk stabilitet.

Det er nå funnet at de ulemper som kullhydrat-derivatene har som matriser ved affinitetsavhengige reaksjoner kan overvinnes, når det som matrise anvendes polyhydroksymetylen.

Oppfinnelsen vedrører biologisk aktivt materiale til anvendelse i affinitetsreaksjoner, idet materialet, er karakterisert ved at det består av

A) en biologisk aktiv forbindelse som ved en kovalent binding eller over en bro dannet av en eller flere minst bifunksjonelle organiske forbindelser er bundet sammen med B) vannuoppløselig poly(hydroksymetylen). Polyhydroksymetylen er en syntetisk polymer med en gjennomgående karbonkjede. Hvert karbonatom har et hydrogenatom og en hydroksylgruppe. Dets fremstilling og dets egenskaper er blant annet omtalt av N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., volum 58, 533-543 (1962) og G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., volum 29, 257-274 (1958). Det er fremstillbart ved basisk eller sur hydrolyse av polyvinylenkarbonat. I videste forstand er polyhydroksymetylen å oppfatte som derivat av polyvinylenkarbonat. Bindingen av effektorene til polyhydroksymetylenet kan på den ene side oppnås ved forholdsregler som kommer til anvendelse ved den kovalente sammenknytning av effektorer med hydroksylgruppen, på den annen side ved omsetning av polyvinylenkarbonatet over den eventuelt kjente aminolytiske reaksjon av en cyklokarbonat-ring av polyvinylenkarbonatet med et primært amin, f.eks. ved hexametylendiamin til et over en uretanbinding med en "spacer" eller effektor substituert polyvinylenkarbonat, hvis resterende cyklokarbonatgrupper deretter forsåpes til hydroksylgrupper.

Det er for anvendelsen av produktene spesielt fordelaktig ikke å omsette de biologisk aktive effektorer direkte med polhydroksymetylen, men over en i affinitets-kromatografien som arm eller i engelsk sprog som "spacer" betegnet mellomledd å binde kovalent til matrisen.

Spacer-stoffene er for det meste hydrokarbon-skjeletter av lengde rundt 1-2 nm. To funksjonelle ende-grupper av spaceren muliggjør omsetningen såvel med matrisen som også med effektoren, idet det ved omsetning med matrisen under egnede betingelser er anvendbart såvel polyhydroksymetylen som også polyvinylenkarbonat.

Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåter til fremstilling av det ovennevnte biologisk aktivt vannuoppløse-lige produkt, idet fremgangsmåten.er karakterisert ved: A) at poly(hydroksymetylen) bindes kovalent direkte eller over en eller- flere bifunksjonelle organiske forbindelser til et bioiogisk aktivt stoff,

eller

B) at poly(vinylenkarbonat) omsettes med et biologisk aktivt stoff og de resterende cyklokarbonatgrupper hydrolyseres eller C) at poly(vinylenkarbonat) omsettes med en bi-funksjonell organisk forbindelse, de resterende cyklokarbonatgrupper hydrolyseres og at man til den polymere binder kovalent en biologisk aktiv forbindelse.

Tilsvarende reaksjonsforløp er .eksempelvis å oppnå ved omsetning av hydroksylgruppene av bæreren med reaktive triaziner, idet en del av triazinets reaktive grupper trer i reaksjon med polyhydroksymetylenforbindelsen, en annen med effektorens aminogruppe.

Diazoterbare aromatiske aminer, som over en ytterligere reaktiv gruppe kan tre i forbindelse med hydroksylgruppen og bæreren på den ene side muliggjør på den annen side kobling med dertil egnede aktiverte aminosyrer, eksempelvis tyrosin eller histidinresten av proteineffektoren.

Arylaminogruppeholdige vinylsulfonderivater og svovelsyrehalvestere av 6-hvdroksyetylsulfoner kan bringes til reaksjon med hydroksylgruppen av bæreren. De muliggjør binding av effektoren etter den tidliqere omtalte diazote-ringsreaksjon.

En spesiell stabil eterbinding oppstår ved omsetning av polyhydroksymetylenets hydroksylgrupper med ikke ionedannende epoksyder, som minst inneholder 2 reaktive grupper, som epihalohydriner eller polyepoksyder, eksempelvis epiklorhydrin eller bisepoksyd.

Ved siden av de her eksempelvis anførte fremgangsmåter til fremstilling av den kovalente forbindelse mellom bærematriks og proteineffektoren eller andre effektorer lar det seg dessuten oppregnet ytterligere metoder som fører til reaksjon på den ene side av hydroksylgruppen av polyhydroksymetylenet, på den annen side bestemte grupperinger av effektoren oq derved danner den kovalente forbindelse mellom beg<q>e, således den kjente omsetning over kompleksdannende metallforbindelser, f.eks. titanforbindelser.

Polyhydroksymetylenet utmerker seg ved siden av den nevnte kjemiske og termiske stabilitet ved fordelaktige forarbeidelsestekniske egenskaper oq fører dermed til en overlegenhet i forhold til de hittil som optimalt ansette bærematrikser på basis av naturlige kullhvdrafcer. Polyhydrok-symetylener er f.eks. fremstillbare i form av fibre, tråder,' folier eller sfæriske partikler eller fortrinnsvis som pul-verisert materiale, således at det alt etter anvendelsesfor-målet av effektoren som skal 'bindes dertil kan velges den mest egnede form.

Ved den produksjonstekniske styrbare størrelse

av den for binding av effektoren resp. spaceren tilgjengelige overflate viste det seg et ytterligere fortrinn av polyhydroksymetylenet i forhold til bærematerialene ifølge teknikkens stand.

Etter de analoge reaksjonsmekanismer slik de er omtalt ror binding av effektoren med polyhydroksymetylen-matriksen lar også spacer-stoffet seg binde til matriksen, når f.eks. spaceren, som en av de funksjonelle grupper har en aminogruppe. Innføring av en spacer byr imidlertid også

den mulighet for effektorens binding i tillegg å innføre reak-sjonsmuligheter. I tilfellet at den til matriksen bundne spacer har en fri karboksylgruppe er denne karboksylgruppe eksempelvis aktiverbar ved karbodiimid-forbindelser, som deretter formår å inngå en amidbinding med aminogruppen hos effektoren. Karboksylgruppene tillater videre dannelsen av amidbindinger ved hjelp av de av Woodward innførte isoksazo-liumsalter.

Har den til matriksen bundne spacer en disponer-bar, fri aminogruppe, så er det med arylaminogruppeholdige vinylsulfonderivater eller svovelsyreestere av Ø-hydroksy-etylsulfoner mulig innføring av arylaminogrupper i forlengel-sen av spaceren som deretter diazoteres etter kjente metoder og endelig forbindes med tilsvarende reaktive grupper av effektoren: f.eks.

De ifølge oppfinnelsen biologisk aktive forbindelser egner seg for de fleste anvendelsesfremgangsmåter som tidligere var kjent for andre til hydrofile, vannuoppløselige bærere bundne effektorer. Følgelig kan enzymer gjøres vann-uoppløselige. De uoppløselige enzymer anvendes i økende grad til bestemmelse av substrater i analyseautomater og som såkalte enzymelektroder. På grunn av den økende stabilitet egner en rekke av bærerbundne enzymer seg for gjennomføring av teknisk enzymatisk omsetning.

Bærerbundne biologisk aktive stoffer har på grunn av deres egenskaper som spesifikke adsorbentier funnet en bred anvendelse i affinitetskromatografi. Med hjelp av bærerbundne, naturlige eller syntetiske enzyminhibitorer lykkes høyrensning av enzymer, mens enzymene ble funnet godt egnet som effektorer, spesielt til utvinning av naturlige enzyminhibitorer fra råekstrakter. Bærerbundne vannuoppløse-lige antigener anvendes til isolering av de tilhørende antilegemer som.på denne måte fåes fritt for andre serumbestand-deler og fritt for andre antigener. Affinitetskromatografisk kan det heller ikke isoleres utfellbare antilegemer samt slike som på grunn av deres lave konsentrasjon ikke er utfellbare 1 serum og heller ikke bestemmes kvantitativt.

I de for nærmere forklaring av oppfinnelsen nedenfor oppførte eksempler er det påvist at en etter en eneste fremgangsmåte fremstilt bærer egner seg for binding av de forskjelligste effektorer og at grunnlegemet polyhydroksymetylen kan gjøres egnet ved egnet substitusjon til binding av enhver ønsket effektor.

Videre vises det eksempelvis hvorledes det kan anvendes matriksbundne effektorer.

Eksempel 1

Polyhydroksymetylen- tetanustoksoid- forbindelse.

Fremstilling av matriks av ( ai- amino- n- hexyl)- substituert polyhydroksymetylen. 20 g polyhydroksymetylen, suspendert i 9 00 ml vann blandes med en oppløsning av 20 g BrCN i 50 ml dimetyl-formamid og holdes under omrøring ved langsom tildrypning av 2 N natronlut ved en indre temperatur på 15°C i 6 minutter ved en pH-verdi på 11,5. Deretter frasuges med en gang, vaskes godt med isvann og avpresses. Det således, aktiverte, ennu vannfuktige polyhydroksymetylen settes til en godt om-rørt, ved værelsetemperatur holdt, med konsentrert HC1 på

pH 8,5 innstilt oppløsning av 20 g hexametylehdiamin i 500 ml ^0, oppfylles med vann til et samlet volum på 1 liter, pH-verdien innreguleres stadig mellom 8,5-9,0 og omrøres ennu

5 timer ved værelsetemperatur. Deretter frasuges og utvaskes godt med vann. En tørket prøve av det med (w-amino-n-hexyl)-grupper substituert polyhydroksymetylen hadde et nitrogeninnhold på 1,9%. Med Sangers reagens til påvisning av primære frie aminogrupper fremkom intenst gulfarvede produkter.

Fremstilling av den bærerbundne effektor

Effektor: Tetanus-antigen.

10 g av bæreren ifølge Eks. 1 suspenderes i 200 ml av en 0,5 molar natriumfosfatoppløsning av pH 10. Suspensjonen oppvarmes under omrøring til 50°C og blandes med 5 g l-aminobenzen-4-f3-hydroksyetylsulf onsvovelsyrehalvester. Etter korreksjon av pH-verdien til 10 med 2 molar NaOH om-røres blandingen en time ved 50°C. Deretter frafUtreres over en nutsch og vaskes med 2 liter vann, 2 liter aceton og 2 liter 0,2 molar HC1. For diazoterin av de i polyhydroksymetylenet innførte arylaminogrupper suspenderes filterresiduet i 200 ml 0,2 molar HC1, avkjøles til 2°C og blandes under omrøring så lenge med 1 molar NaN02, inntil det med KJ-stivelsespapir er å fastslå et lite nitritoverskudd. Etter 10

minutter frafiltreres over en nutsch og filterresiduet vaskes med 1 liter av en vandig 0,01 molar amidosulfonsyre av 2°C og deretter med 200 ml 0,2 molar natriumfosfat pH 7,5 av 2°C. Til kobling suspenderes det diazoniumgruppeholdige produkt i

150 ml av en oppløsning av 2 g tetanus-toksoid med 1260 Lf/mg N i 0,2 molar natriumfosfat pH 7,5 og 2°C og omrøres 20 timer ved 5°C. Ikke-bundne deler av toksoidet utvaskes med 1 liter 1 molar NaCl-oppløsning på en nutsch.

Anvendelse av forbindelsen polyhydroksymetylen- tetanustoksoid. Utvinning av tetanus- antitoksin.

10 g av produktet ifølge Eks. 1 suspenderes i

150 ml 0,15 molar NaCl-oppløsning med en tilsetning av M/15 natriumfosfat ("PBS") pH 7,2 og overføres i en søyle av 3 cm diameter og 10 cm høyde. 20 ml tetanus-hesteserum med 1650. IE tetanus-antitoksin/ml påføres på søylen, som deretter vaskes med 500 ml PBS pH 7,2. Elueringen av antilegemet foregår med 0,5 molar glycin/HCl-puffer pH 2,5. Eluatet inneholder etter nøytralisering med 2 molar NaOH og etterfølgende

sentrifugering tilsammen 240 mg protein, og slik det ble fast-slått på beskyttelsesforsøk på mus, 12.300 IE tetanus-antitoksin.

Produktet anvendes til reaksjon med tetanus-antilegemer.

Eksempel 2

Polyhydroksymetylen- aminobenzamidin- forbindelse

Fremstilling av matriksen av ( gj- karboksy- n- pentyl)- substituert polyhydroksymetylen. 20 g polyhydroksymetylen, aktivert ifølge eks. 1 med BrCN, has til en med fortynnet natronlut på pH 8,5 innstilt og til et samlet volum på 1 liter oppfylt, vandig opp-løsning av 25 g e-aminokapronsyre. Det omrøres ennu i 5 timer ved værelsetemperatur og pH 8,5 og frasuges og utvaskes godt med vann. En tørket prøve av det med (w-karboksy-n-pentyl)-grupper substituerte polyhydroksymetylen hadde et nitrogeninnhold på 0,86%.

Fremstilling av den bærerbundne effektor

Effektor: Aminobenzamidin.

2 g av et polyhydroksymetylenderivat fremstilt ifølge eks. 2, suspenderes i 25 ml 0,1 molar morfolinetansul-fonsyre og blandes med 1 g l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid . HC1. Ved tilsetning av 2 molar HC1 under pH-kontroll innstilles pH-verdien på 4,8. Under omrøring settes til blandingen 1 g m-aminobenzamidin. Suspensjonen omrøres under pH-korreksjon i 1 time og adsorbenset overføres deretter i en kromatografisøyle med 1 cm diameter. Adsorbenset spyles med 200 ml 0,0 5 molar trishydroksymetylaminometan-HCl-puffer, pH 8,0 med en tilsetning av 0,5 molar KC1 (tris-KCl).

Anvendelse av forbindelsen polyhydroksymetylen- aminobenzamidin. Utvinning av trombin.

100 mg rå-trombin fra storfe oppløses i 5 ml

0,05 molar tris, 0,5 molar KC1 pH 8,0 påføres på søylen prepa-

rert som ovenfor. Søylen spyles deretter med 200 ml tris-KCl-puffer. Det til det uoppløseliggjorte m-aminobenzamidin bundne trombin avspaltes fra dette med 100 ml av en oppløsning av 0,05 molar m-aminobenzamidin i tris-KCl-puffer. De proteinholdige fraksjoner forenes og påføres over en 1 x 30 cm søyle "Sephadex" G-25 i tris-KCl-puffer. I den første proteinholdige topp av søyleeluatet kunne det ved bestemmelse av aktiviteten ifølge Chase og Shaw, Biochem. 8, 1969, side 2212, finnes 78% av utgangsaktiviteten.

Produktet anvendes til adsorbsjon av trombin.

Eksempel 3

Polyhydroksymetylen- pepsin- forbindelse.

Fremstilling av matriksen av ( cj- amino- n- hexyl)- substituert polyhydroksymetylen.

8,0 g fra dimetylformamid/metanol gjenutfelt polyvinylenkarbonat, fremstilt ifølge N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer, Sei., volum 58, side 534 (1962), suspenderes ved værelsetemperatur i en oppløsning av 7,5 g hexametylendiamin 1 180 ml metanol og omrøres 48 timer ved værelsetemperatur, frasuges, utvakses med metanol og suspenderes i en oppløsning av 10 g natriummetylat i 300 ml 96%-ig metanol i 4 dager ved værelsetemperatur, utvaskes med metanol og deretter meget godt med vann. En tørket prøve av det over en spacer av 6 CI^-grupper med primære aminogrupper substituerte polyhydroksy-metylenadsorbens hadde et nitrogeninnhold på 5,7%.

Fremstilling av den bærerbundne effektor

Effektor: Pepsin.

20 g (io-amino-n-hexyl)-substituert polyhydroksymetylen, fremstilt ifølge eks. 3, suspenderes i 400 ml 0,2 molar natriumfosfat pH 10. Til suspensjonen settes under om-røring 40 ml av en 25%-ig glutardialdehydoppløsning. Etter 2 timers omrøring ved værelsetemperatur frafiltreres over en nutsch og filterresiduet vaskes med 4 liter 0,2 molar natrium-acetatpuffer pH 4,0. Deretter has reaksjonsproduktet i 500 ml av en oppløsning av 5 g pepsin med tilsammen 500.000 enheter, bestemt ifølge Anson, i 0,2 molar natriumacetat pH 4,0 og omrøres 15 timer ved 6°C. Det deretter dannede produkt utvaskes på en nutsch med 5 liter 0,1 molar natriumacetat/eddiksyre pH 4,0 og en tilsetning av 1 molar NaCl.

Anvendelse av forbindelsen polyhydroksymetylen- pepsin. Proteolytisk spaltning av immunglobuliner.

Adsorbenset ifølge foreliggende eksempel suspenderes i 0,1 molar acetatpuffer pH 4,0 og herav gjennomføres en aktivitetsbestemmelse ifølge Anson. Suspensjonen inneholder tilsammen 21.000 enheter pepsin i bundet, og med denne prøve påvisbar form. Til proteolytisk spaltning av human-immunglobulin G frafiltreres pepsinadsorbenset og residuet suspenderes i en 2,5%-ig oppløsning av 30 g human IgG i fysio-logisk NaCl-oppløsning pH 4,1. Spalteblandingen omrøres 24 timer ved 37°C. Etter frafiltrering av det bærerbundne pepsin blandes filtratet med 1250 ml mettet ammoniumsulfat-oppløsning. Den derved dannede utfelling frasentrifugeres; det inneholder F(ab)2-fragmentet av immunglobulin med dets antilegemeaktivitet. Avstøpet kasseres.

Produktet anvendes til proteolytisk spaltning av immunglobuliner.

Eksempel 4

Fremstilling av forbindelsen polyhydroksymetylen- oksaminsyre. 10 g polyhydroksymetylen aktiveres som omtalt i eks. 1 med BrCN og omsettes med 5 g tyramin, oppløst i 150 ml 0,1 molar natriumhydrogenkarbonat ved 5°C ved 60 minutters lang omrøring. Den ikke bundne mengde av tyraminet frafiltreres på en nutsch og filterresiduet utvaskes.med 1 liter 0,1 molar natriumfosfatpuffer pH 7,0 og 5°C. Filterresiduet suspenderes i 150 ml av en til 5°C avkjølet oppløsning av 1,0 g diazotert p-aminofenyloksaminsyre og omrøres 15 timer ved 5°C. Adsorbenset vaskes på en nutsch med 1 liter 0,05 molar natriumacetat-eddiksyre-puffer pH 5,5 med en tilsetning av 2 mM CaCl2 og 0,2 mM EDTA.

Anvendelsen av forbindelsen polyhydroksymetylen- oksaminsyre. Utvinning av neuraminidase.

Adsorbenset ifølge Eks. 4 resuspenderes i ovennevnte acetatpuffer og overføres til en kromatografisøyle av 2 cm diameter. Gjennom denne søyle føres 1 liter av et kulturfiltrat av Vibrio Cholerae med 800 IE neuraminidase/ml, som på forhånd med "2 molar eddiksyre var innstilt på 5,5 og som var blitt blandes med CaC^ og EDTA til en konsentrasjon på 2 mM resp. 0,2 mM. De ikke bundne proteiner utvaskes med 500 ml acetatpuffer.

Elueringen av den på den bærerbundne inhibitor adsorberte neuraminidase foregår ved vasking av søylen med 0,1 molar natriumhydrogenkarbonat-oppløsning og oppsamling av de aktive neuraminidaseholdige fraksjoner. De inneholder 86% av den anvendte aktivitet.

Eksempel 5

a) Omsetning av polyhydroksymetylen med epiklorhydrin.

50 g polyhydroksymetylen suspenderes i 1 liter

2 N NaOH, blandes med 250 ml epiklorhydrin og omrøres i 2 timer ved 55-60°C. Suspensjonens pH-verdi synker etter kort tid til 10-11. Ved tilsetning av NaOH holdes ennu denne pH-verdi i 1 time. Etter 2 timers reaksjonstid frasuges faststoffet, vaskes med vann, aceton og til slutt igjen med vann. b) 50 g hexametylendiamin oppløses i 1,5 liter vann og blandes med HCl til pH 10. Til oppløsningen has det under punkt 5a) aktiverte polyhydroksymetylen og omrøres i 6 timer ved 50-55°C. Deretter frasuges produktet og vaskes med vann, fritt for hexametylendiamin. c) Det under eks. 5b) dannede produkt omrøres med 50 g l-aminobenzen-4-Ø-hydroksyetylsulfonsvovelsyreester ved 55°C og pH 10 en time. Deretter frafiltreres det faste stoff, vaskes med vann, aceton og igjen med vann. d) 10 g av det under punkt 5c) dannede produkt vaskes på en nutsch med 200 ml 0,1 N HCl og suspenderes deretter i 300 ml 0,5 N HCl. Suspensjonen blandes under omrørings med 0,1 N NaNC^-oppløsning ved 0-4°C, inntil diazotering er det med KJ-stivelsespapir å fastslå et lite nitrit-overskudd. Etter 10 minutter frafiltreres over en nutsch og residuet vaskes med isvann og deretter med 0,15 molar natriumfosfatpuffer pH 7,5 av 0-4°C.

e) 0,75 g albumin oppløses i 250 ml fosfatpuffer pH 7,5, avkjøles til 4°C og tilsettes det under punkt-5d)

fremstilte produkt. Suspensjonen omrøres deretter i 20 timer ved 4°C, filtreres deretter og faststoffet vaskes med 1 molar NaCl og fosfatpufret koksaltoppløsning (PBS) (vandig 0,9%-ig NaCl-oppløsning med et innhold av 1/15 mol N<a>2HPO^-K<H>2P<0>4<->puffer av pH 7,2).

Filtrat og vaskelut undersøkes etter metoden radial immundiffusjon på albumin. Det bindes 75 mg albumin til 1 g av den således fremstilte bærer.

f) 2,4 g IgM oppløses i 250 ml fosfatpuffer pH 7,5 og avkjøles til 4°C. 10 g av det ifølge punkt 5d) diazoterte

produkt tilsettes og suspensjonen omrøres i 20 timer ved 4°C. Etter filtrering vaskes det faste stoff med 1 molar NaCl-oppløsning og med PBS. 1 g av den ifølge punkt 5f) fremstilte bærer binder 240 ml IgM.

Produktet benyttes til antilegeme-antigen-reaksjoner .

Eksempel 6

a) 10 g polyhydroksymetylen aktiveres som omtalt i eks. 5a) og b) med epiklorhydrin, omsettes med hexametylendiamin og opparbeides. b) 10 g av den således fremstilte bærer succinoy-leres 4 timer ved 10°C og pH 6 med 5 g ravsyreanhydrid, som

er suspendert i 20 0 ml vann. pH-verdien innreguleres med 2N NaOH. Etter vasking av det faste stoff med vann omrøres produktet med 2,5 g N-cyklohexyl-N'-(-(N-metylmorfolino)-etyl)-karbodiimid-p-toluen-sulfonat ved pH 5 og 5°C i 30 minutter, frafiltreres og vaskes hurtig med isvann.

c) lg IgG oppløses i 250 ml fosfat-puffer pH 7,5

og omrøres med dén under punkt 6f) fremstilte bærer i 24 timer

ved 4°C. Etter filtrering vaskes produktet med 1 molar koksalt og med PBS.

På 1 g av bæreren bindes 85 mg IgG kovalent.

Produktet benyttes til antilegeme-antigen-reaksjoner .

Eksempel 7

a) 20 g av det under punkt 5a) fremstilte produkt omrøres med 20 g aminokapronsyre ved pH 10 og 50-55°C i

6 timer. Deretter suges det fra og vaskes med vann.

b) 10 g av det under punkt 7a) fremstilte produkt blandes med 2,5 g N-cyklohexyl-N'- ((N-metylmorfolino)-etyl)-karbodiimid-p-toluen-sulfonat og hertil has etter 5 minutter 2 g N-hydroksysukksinimid ved pH 5. Etter 5 timers omrøring ved 24°C frafiltreres det faste stoff og vaskes med vann. c) 0,5 g albumin oppløses i 200 ml fosfatpuffer og omrøres med den under punkt 7b) fremstilte aktiverte bærer i 24 timer ved 4°C. Etter filtrering vaskes produktet med 1 molar kokesalt og med PBS.

Til 1 g av bæreren bindes 50 mg albumin kovalent. Produktet benyttes til antilegeme-antigen reaksjoner.

Eksempel 8

10 g polyhydroksymetylen aktiveres som i Eks. 5a) og b) med epiklorhydrin, omsettes med hexametylendiamin og opparbeides. a) 10 g av den således fremstilte bærer suspenderes i 100 ml vann og omsettes med 500 ml 25%-ig glutardialdehyd.

Etter 1 times omrøring frafiltreres det faste stoff og vaskes med vann resp. PBS.

b) 0,5 g albumin oppløses i 200 ml fosfat-puffer og omrøres med den under punkt 8a) fremstilte bærer i 20 timer

ved 4°C. Etter filtrering vaskes produktet med 1 molar koksalt og med PBS.

Produktet benyttes til antilegeme-antigen-reaksjoner.

Eksempel 9

Direkte omsetning av med epiklorhydrin aktivert polyhydroksymetylen.

a) 10 g polyhydroksymetylen aktiveres med 50 ml epiklorhydrin som omtalt i Eks. 5a). Etter filterering

vaskes produktet hurtig med vann, aceton, vann og til slutt med PBS. b) 0,5 g albumin oppløses i 200 ml PBS og omrøres med det under punkt 9a) fremstilte produkt i 60 timer ved 4°C.

Etter filtrering vaskes det bærerbundne protein med 1 molar koksalt og med PBS. 1 g av den således fremstilte bærer binder 4 5 mg albumin.

Produktet benyttes til antilegeme-antigen-reaksjoner.

Eksempel 10

10 g vannuoppløselig polyhydroksymetylen omrøres ved pH 9,5 (0,15 m Na-bikarbonat/NaOH-puffer) i 3 dager ved 25°G med 30 g dietylenglykoldiglycidyleter, produktet frasuges, vaskes godt og has til 0,5 g humanalbumin i 200 ml 0,15 molar fosfatpuffer pH 8 og omrøres 60 timer ved 10°C. Etter filtrering vaskes det bærerbundne protein med 1 molar koksaltoppløsning og PBS.

1 g av den således fremstilte bærer inneholder

35 mg bundet albumin.

Eksempel 11

10 g polyhydroksymetylen omsettes som angitt i Eks. 10 med 30 g glycidyltris-(glycidyleter), has til 0,5 g immunglobulin g (IgG) i 200 ml 0,15 molar fosfatpuffer pH 7,5 og omrøres 60 timer ved 4°C. Etter filtrering vaskes produktet med 1 molar koksaltoppløsning og med PBS. 1 g av den således fremstilte proteinharpiks inneholder 50 mg bundet IgG.

Claims (2)

1. Biologisk aktivt materiale til anvendelse i affinitetsreaksjoner, karakterisert ved at det består av: A) en biologisk aktiv forbindelse som ved en kovalent binding eller over en bro dannet av en eller flere minst bifunksjonelle organiske forbindelser er bundet sammen med B) vannuoppløselig poly(hydroksymetylen).

2. Fremgangsmåte til fremstilling av et biologisk aktivt vannoppløselig materiale ifølge krav 1, karakterisert vedA) at poly(hydroksymetylen) bindes kovalent direkte eller over en eller flere bifunksjonelle organiske forbindelser til et biologisk aktivt stoff eller B) at poly(vinylenkarbonat) omsettes med et biologisk aktivt stoff og de resterende cyklokarbonatgrupper hydrolyseres eller C) at poly(vinylenkarbonat) omsettes med en bi-funks jonell organisk forbindelse, de resterende cyklokarbonatgrupper hydrolyseres og at man til den polymere binder kovalent en biologisk aktiv forbindelse.