CH630410A5 - Process for preparing a biological substance which is bound to a poly(hydroxymethylene) support matrix - Google Patents

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CH630410A5
CH630410A5 CH575075A CH575075A CH630410A5 CH 630410 A5 CH630410 A5 CH 630410A5 CH 575075 A CH575075 A CH 575075A CH 575075 A CH575075 A CH 575075A CH 630410 A5 CH630410 A5 CH 630410A5
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poly
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer an Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix gebundenen, biologisch aktiven Substanz und deren Verwendung bei der Affinitätschromatographie. The invention relates to a method for producing a biologically active substance bound to a poly (hydroxymethylene) support matrix and its use in affinity chromatography.

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzuführenden Reaktionen einzusetzen. In recent years, a new technique within biochemical working methods has become more and more popular, the primary feature of which is the use of the affinity of carrier-bound, biologically active substances for reactions to be carried out selectively.

Über eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und gegebenenfalls anschliessend durch Desorption isoliert werden. By means of a specific complex formation of the carrier-bound substance with a second substance which is present in a mixture, the substance in question can be removed from the mixture and, if appropriate, subsequently isolated by desorption.

Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, Stoffumwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten. In der biochemischen, enzymatischen Analytik stehen wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfügung. Carrier-bound enzymes offer the advantage of carrying out substance conversions in preparative, continuous processes and of maintaining the reaction products free of enzymes. In biochemical, enzymatic analysis, water-insoluble enzymes are available as reusable reagents.

Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitätschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunlösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme. Because of the property of the enzymes to have affinities not only towards the substrates but also towards the specific inhibitors, the extraction of enzyme inhibitors with the aid of affinity chromatography on carrier-bound enzymes has proven to be particularly favorable. On the other hand, the binding of inhibitors to water-insoluble matrices allows the preparation of the corresponding enzymes.

Als sogenannte Immunadsorbentien werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene. As so-called immunoadsorbents, antigens or antibodies are bound to water-insoluble matrices and then allow the isolation of the corresponding antibodies or antigens.

Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine, und Hormone bezeichnet werden können. Diese biologisch aktiven Substanzen können, da sie die Wirkprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, Effektoren genannt werden. Biologically active substances are understood to be natural and artificially produced substances which are active in vivo and in vitro and which in the broadest sense can be referred to as enzymes, activators, inhibitors, antigens or antibodies, vitamins and hormones. These biologically active substances can be called effectors because they are the active principles of water-insoluble systems.

Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Effektoren sind wesentlich stablier als die entsprechenden Substanzen in Lösung. Most of the carrier-bound effectors described so far are much more stable than the corresponding substances in solution.

Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft nur solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wässrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktionspartner des Effektors weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, die kein Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein. As support materials, so-called matrices, it is advantageous to use only those substances which, in addition to being insoluble in aqueous systems, have the lowest possible non-specific adsorption. For this, hydrophobic, hydrophilic and ionic interactions between the matrix and the reaction partner of the effector have to be largely prevented. Binding should be excluded with substances that are not a reaction partner of the effector.

Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören Aktivkohle und Glasperlen, und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung mit einander verknüpft sind. Die Letztgenannten schliessen Vinylpolymeren, z.B. Polyacrylsäuren, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfonyl-substituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und schliesslich natürliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechselwirkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere der Zellulose, des Dextrans, der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlinge, als Matrize in wässrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxyl-gruppen wegen ihrer unspezifischen Reaktion als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ geringe thermische und chemische Stabilität auf. The matrices previously used as carriers for biologically active substances can be divided into those that bind the effectors through physical adsorption, including activated carbon and glass beads, and those that are linked to the effectors via a covalent bond. The latter include vinyl polymers, e.g. Polyacrylic acids, polyacrylic acid amides and amino-, carboxy- or sulfonyl-substituted polystyrene, furthermore cellulose and its descendants and finally natural and synthetic polypeptides and proteins. Because of the balanced interaction between the matrix and the effector, the use of carbohydrates, in particular cellulose, dextran, starch, agar and its derivatives, has been most widely used as a matrix in aqueous systems, even if the carboxyls frequently contained in these natural products groups are perceived as disturbing because of their non-specific reaction. In addition, these substances have a relatively low thermal and chemical stability.

Es wurde nun gefunden, dass die Nachteile, die die Koh-lenhydratderivate als Matrizen bei affinitätsabhängigen Reaktionen aufweisen, überwunden werden können, wenn als Matrize Polyhydroxymethylen verwendet wird. It has now been found that the disadvantages which the carbohydrate derivatives have as templates in affinity-dependent reactions can be overcome if polyhydroxymethylene is used as the template.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Verbindungen, das in Patentanspruch 1 definiert ist. Die erhaltenen Verbindungen sind gekennzeichnet durch ein wasserunlösliches Poly(hydro-xymethylen), an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebunden ist. In diesen Verbindungen a) ist die Trägermatrix Polyhydroxymethylen; The invention accordingly relates to a method for producing biologically active compounds, which is defined in claim 1. The compounds obtained are characterized by a water-insoluble poly (hydro-xymethylene) to which a biologically active substance is bound while maintaining its biological activity. In these compounds a) the carrier matrix is polyhydroxymethylene;

b) sind die biologisch aktiven Substanzen Stoffe, wie Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, andere Plasmaproteine, Blutgruppensubstanzen, Phythämagglutinine, Antibiotika, Vitamine oder Hormone, Peptide oder Aminosäuren oder synthetisch hergestellte Effektoren; b) the biologically active substances are substances such as enzymes, activators, inhibitors, antigens or antibodies, other plasma proteins, blood group substances, phythaemagglutinins, antibiotics, vitamins or hormones, peptides or amino acids or synthetically produced effectors;

c) sind Polyhydroxymethylen und die biologisch aktiven Substanzen kovalent miteinander direkt oder über eine Zwischenverbindung verknüpft. c) polyhydroxymethylene and the biologically active substances are covalently linked to one another directly or via an intermediate compound.

Polyhydroxymethylen ist ein synthetisches Polymeres mit einer durchgehenden Kohlenstoff-Kette. Jedes Kohlenstoffatom trägt ein Wasserstoffatom und eine Hydroxylgruppe. Seine Herstellung und seine Eigenschaften sind unter anderem beschrieben von N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58,533-543 (1962) und G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., Vol. 29,257-274 (1958). Es ist durch basische oder saure Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat herstellbar. Im weiteren Sinne ist das Polyhydroxymethylen als Derivat des Polyvinylencarbonats aufzufassen. Die Bindung der Effektoren an das Polyhydroxymethylen kann einerseits durch die Massnahme erreicht werden, die bei der kovalenten Verknüpfung der Effektoren mit der Hydroxylgruppe zum Einsatz kommen, andererseits durch Umsetzung des Poly vi-nylcarbonats über die ebenfalls bekannte aminolytische Reaktion eines Zyklocarbonatringes des Polyvinylcarbonats Polyhydroxymethylene is a synthetic polymer with a continuous carbon chain. Each carbon atom carries a hydrogen atom and a hydroxyl group. Its manufacture and properties are described by N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58, 533-543 (1962) and G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., Vol. 29, 257-274 (1958). It can be produced from polyvinylene carbonate by basic or acid hydrolysis. In a broader sense, polyhydroxymethylene is a derivative of polyvinylene carbonate. The binding of the effectors to the polyhydroxymethylene can be achieved on the one hand by the measure used in the covalent linking of the effectors with the hydroxyl group, on the other hand by reacting the polyvinyl carbonate via the likewise known aminolytic reaction of a cyclocarbonate ring of the polyvinyl carbonate

2 2nd

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 630410 3 630410

mit einem primären Amin, z.B. mit Hexamethylendiamin, zu Zyklocarbonatgruppen anschliessend zu Hydroxylgruppen einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder verseift werden: with a primary amine, e.g. with hexamethylenediamine, to cyclocarbonate groups then to hydroxyl groups one via a urethane bond with a spacer or saponified:

Effektor substituierten Polyvinylencarbonat, dessen restliche Effector substituted polyvinylene carbonate, the rest of which

+ R-NH, + R-NH,

Polyvinylencarbonat Polyvinylene carbonate

—(jH (jH- - (jH (jH-

0 0 0 0

\c^ \ c ^

0 0

—CH— —CH—

I I.

OH OH

n-1 n-1

r î r î

Verseifung Saponification

C = 0 C = 0

I I.

f|IH R f | IH R

-CH- -CH-

I I.

OH OH

-CH- -CH-

OH OH

-CH- -CH-

I I.

OH n-1 OH n-1

C=0 C = 0

I I.

NH NH

I I.

R R

Es ist für die Anwendung der Produkte besonders vorteilhaft, die biologisch aktiven Effektoren nicht direkt mit dem Polyhydroxymethylen umzusetzen, sondern über ein in der Affinitätschromatographie als Arm oder wie im englischen Schrifttum als «Spacer» bezeichnetes Zwischenglied an die Matrix kovalent zu binden. For the use of the products, it is particularly advantageous not to implement the biologically active effectors directly with the polyhydroxymethylene, but rather to covalently bind them to the matrix via an intermediate member, referred to in arm affinity chromatography or as "spacer" in English literature.

Die Spacer-Substanzen sind meist Kohlenwasserstoffgerüste der Länge um 1-2 nm. Zwei fuktionelle Endgruppen des Spacers erlauben jeweils die Umsetzung sowohl mit der Matrix als auch mit dem Effektor, wobei bei der Umsetzung mit der Matrix sowohl Polyhydroxymethylen als auch Polyvinylencarbonat unter geeigneten Bedingungen einsetzbar sind. The spacer substances are mostly hydrocarbon skeletons with a length of around 1-2 nm. Two functional end groups of the spacer each allow the reaction with both the matrix and the effector, with both polyhydroxymethylene and polyvinylene carbonate being usable under suitable conditions in the reaction with the matrix are.

Besonders einfach erfolgt die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen. The linking of the effector to the matrix is particularly simple after activation of the hydroxyl groups of polyhydroxymethylene by means of cyanogen halides, advantageously with cyanogen bromide and a subsequent reaction of the biologically active effectors containing amino groups via these activated groups.

Eine weitere Verfahrensvariante beruht darauf, dass in einer Abwandlung der Azid-Methode von Curtius Polyhydroxymethylen wie Polysaccharide mit einer Halogencarbonsäure wie Cloressigsäure im alkalischen Milieu umgesetzt, die entsprechende Säure mit Alkohol verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und schliesslich das in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der Polyhydroxymethylen-Matrix verknüpft wird. A further process variant is based on the fact that in a modification of the Curtius azide method, polyhydroxymethylene such as polysaccharides are reacted with a halocarboxylic acid such as chloroacetic acid in an alkaline medium, the corresponding acid is esterified with alcohol, then the ester is converted into the hydrazide and finally the resultant Azide is linked to the amino group of the effector protein with the polyhydroxymethylene matrix.

Eine andere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyhydroxymethylen-Matrix besteht in der Acylie-rung der Hydroxylgruppen mit Bromazetylbromid, gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppe des Effektors. Another possibility for linking the effector to a polyhydroxymethylene matrix is to acylate the hydroxyl groups with bromoacetyl bromide, followed by alkylation of the amino group of the effector.

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazinen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazins mit der Polyhydroxymethylenverbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt. Similar reaction processes can be achieved, for example, by reacting the hydroxyl groups of the support with reactive triazines, with some of the reactive groups of the triazine reacting with the polyhydroxymethylene compound and others with amino groups of the effector.

Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin oder Histidinre-sten des Proteineffektors. Diazotizable aromatic amines, which on the one hand can connect to the hydroxyl groups of the support via a further reactive group, on the other hand allow coupling with enabled, activated amino acids, for example the tyrosine or histidine residues of the protein detector.

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von ß-Hydroxyäthylsulfonen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion. Arylamino group-containing vinylsulfone derivatives and sulfuric acid half esters of β-hydroxyethylsulfones can be reacted with the hydroxyl groups of the support. They enable the binding of the effector after the above-described diazotization reaction.

Eine besonders stabile Ätherbindung entsteht bei der Umsetzung der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens mit nicht ionenbildenden Epoxiden, die mindenstens 2 reaktive Gruppen enthalten, wie die Epihalohydrine oder die Polyepoxide, beispielsweise Epichlorhydrin oder Bisepoxid. A particularly stable ether bond arises when the hydroxyl groups of polyhydroxymethylene are reacted with non-ion-forming epoxides which contain at least 2 reactive groups, such as the epihalohydrins or the polyepoxides, for example epichlorohydrin or bisepoxide.

Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem Proteineffektor oder anderen Effektoren, Hessen sich noch weitere Methoden aufzählen, die zur Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylens, andererseits bestimmter Gruppierungen des Effektors führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen, so die bekannte Umsetzung über komplexbildende Metallverbindungen, z.B. Titanverbindungen. In addition to the methods for producing the covalent connection between the carrier matrix and the protein effector or other effectors, which are mentioned here as examples, there are other methods which lead to the reaction of the hydroxyl groups of the polyhydroxymethylene on the one hand, and certain groups of the effector on the other hand and thereby the covalent connection between the two produce, so the known implementation of complex-forming metal compounds, for example Titanium compounds.

Das Polyhydroxymethylen zeichnet sich neben der erwähnten chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führt damit zu einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydraten. Polyhydroxymethylen ist z.B. in Form von Fasern, Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln oder vorzugsweise pulverisiertem Material herstellbar, so dass je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form gewählt werden kann. In addition to the chemical and thermal stability mentioned, the polyhydroxymethylene is distinguished by advantageous processing properties and thus leads to a superiority over the carrier matrices based on natural carbohydrates which have so far been found to be optimal. Polyhydroxymethylene is e.g. Can be produced in the form of fibers, threads, foils or spherical particles or preferably pulverized material, so that the most suitable shape can be selected depending on the application of the effector to be bound to it.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Grösse der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug des Polyhydroxymethylens gegenüber den Trägermaterialien des Standes der Technik. The size of the surface accessible for the binding of the effectors or the spacers, which can be controlled in terms of production technology, shows a further advantage of polyhydroxymethylene over the carrier materials of the prior art.

Nach den analogen Reaktionsmechanismen, wie sie für die Bindung des Effektors mit der Polyhydroxymethylen-Matrix beschrieben sind, lassen sich auch die Spacersubstanzen an die Matrix binden, wenn z.B. die Spacer als eine der funktionellen Gruppen eine Aminogruppe tragen. Die Einführung eines Spacers bietet jedoch auch die Möglichkeit, für die Bindung des Effektors zusätzlich Reaktionsmöglichkeiten einzuführen. Im Falle, dass der an die Matrix gebundene Spacer According to the analogous reaction mechanisms as described for the binding of the effector with the polyhydroxymethylene matrix, the spacer substances can also be bound to the matrix if e.g. the spacers carry an amino group as one of the functional groups. However, the introduction of a spacer also offers the possibility of introducing additional reaction options for binding the effector. In the event that the spacer bound to the matrix

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eine freie Carboxylgruppe trägt, ist diese Carboxylgruppe beispielsweise durch Carbodiimid-Verbindungen aktivierbar, die sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des Effektors einzugehen vermag. Carboxylgruppen lassen ferner die Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten Isoxazoliumsalzen zu. bears a free carboxyl group, this carboxyl group can be activated, for example, by carbodiimide compounds, which can then form an amide bond with amino groups of the effector. Carboxyl groups also allow the formation of amide bonds using the isoxazolium salts introduced by Woodward.

Besitzt der an die Matrix gebundene Spacer eine verfügbare, freie Aminogruppe, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von ß-Hydroxyäthylsulfonen die Einführung von Arylaminogruppen in der Verlängerung des Spacers möglich, die s sodann nach bekannten Methoden diazotiert und anschliessend mit entsprechend reaktiven Gruppen des Effektors verbunden werden: If the spacer bound to the matrix has an available, free amino group, arylamino group-containing vinylsulfone derivatives or sulfuric acid esters of β-hydroxyethylsulfones allow the introduction of arylamino groups in the extension of the spacer, which is then diazotized using known methods and then with correspondingly reactive groups Effectors are connected:

z.B. e.g.

Ah Ah

OH OH

/\ / \

0 NH- (CH2) 6-NH-CH2-CH2-S0; 0 NH- (CH2) 6-NH-CH2-CH2-S0;

r\_ r \ _

NH, NH,

Die erfindungsgemäss hergestellten biologisch aktiven Verbindungen eignen sich für die meisten Anwendungsver- 20 fahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als söge- 25 nannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen. The biologically active compounds produced according to the invention are suitable for most application processes which have hitherto been known for other effectors bound to hydrophilic, water-insoluble carriers. Accordingly, enzymes can be made water-insoluble. The insoluble enzymes are increasingly used for the determination of substrates in automatic analyzers and as so-called enzyme electrodes. Because of the increased stability, a number of carrier-bound enzymes are suitable for carrying out technical enzymatic reactions.

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben 38 wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbenzien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbeson- 3S dere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von 40 anderen Antigenen erhalten werden. Affinitätschromatogra-phisch können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden. 45 Carrier-bound, biologically active substances 38 have found widespread use in affinity chromatography because of their property as specific adsorbents. With the help of carrier-bound natural or synthetic enzyme inhibitors, the enzymes can be highly purified, while the enzymes have been found to be particularly suitable as effectors, particularly for obtaining natural enzyme inhibitors from crude extracts. Carrier-bound water-insoluble antigens are used to isolate the associated antibodies, which are thus obtained free of other serum components and free of 40 other antigens. Affinity chromatography can also be used to isolate and quantitate antibodies that cannot be precipitated and those that cannot be precipitated due to their low concentration in the serum. 45

In den zur Erläuterung der Erfindung nachstehend aufgeführten Beispielen ist aufgezeigt, dass ein nach einem einzigen Verfahren hergestellter Träger sich für die Bindung der verschiedensten Effektoren eignet, und dass der Grundkörper Polyhydroxymethylen durch geeignete Substitution so zur Bindung jedes gewünschten Effektors geeignet gemacht werden kann. The examples given below to explain the invention show that a carrier produced by a single process is suitable for binding a wide variety of effectors, and that the base body polyhydroxymethylene can be made suitable for binding any desired effector by suitable substitution.

Ferner wird beispielhaft aufgezeigt, wie die matrixgebundenen Effektoren eingesetzt werden können. It also shows an example of how the matrix-bound effectors can be used.

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Beispiel 1 example 1

Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid-Verbindung Polyhydroxymethylene tetanus toxoid compound

Herstellung der Matrix aus ((O-Amino-n-hexyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen 60 Preparation of the matrix from ((O-amino-n-hexyl) -substituted polyhydroxymethylene 60

20 g Polyhydroxymethylen, suspendiert in 900 ml Wasser, werden mit einer Lösung von 20 g BrCN in 50 ml Dimethyl-formamid versetzt und unter Rühren durch langsames Zutropfen von 2 n Natronlauge bei einer Innentemperatur von 15 °C 6 Minuten lang bei einem pH-Wert von 11,5 65 20 g of polyhydroxymethylene, suspended in 900 ml of water, are mixed with a solution of 20 g of BrCN in 50 ml of dimethylformamide and, while stirring, slowly adding 2N sodium hydroxide solution at an internal temperature of 15 ° C. for 6 minutes at a pH from 11.5 65

gehalten. Dann wird sofort aubgesaugt, gut mit Eiswasser ausgewaschen und abgepresst. Das so aktivierte, noch wasserfeuchte Polyhydroxymethylen wird zu einer gut gerührten, held. Then it is immediately sucked off, washed well with ice water and pressed. The activated, still water-moist polyhydroxymethylene turns into a well-stirred,

bei Raumtemperatur gehaltenen, mitkonc. HCl auf pH 8,5 eingestellten Lösung von 20 g Hexamethylendiamin in 500 ml H2O zugegeben, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllt, der pH-Wert ständig zwischen 8,5-9,0 einreguliert und noch 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (ro-Amino-n-hexyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 1,9%. mit Sanger's Reagens zum Nachweis von primären freien Aminogruppen werden intensiv gelb gefärbte Produkte erhalten. kept at room temperature, with conc. HCl adjusted to pH 8.5 solution of 20 g of hexamethylenediamine in 500 ml of H2O, made up to a total volume of 1 liter with water, the pH was constantly adjusted between 8.5-9.0 and stirred for a further 5 hours at room temperature . Then it is suctioned off and washed well with water. A dried sample of the polyhydroxymethylene substituted with (ro-amino-n-hexyl) groups had a nitrogen content of 1.9%. with Sanger's reagent for the detection of primary free amino groups, products colored intensely yellow are obtained.

Herstellung des trägergebundenen Effektors Manufacture of the carrier-bound effector

Effektor: Tetanus-Antigen Effector: tetanus antigen

10 g des Trägers nach Beispiel 1 werden in 200 ml einer 0,5 M Natriumphosphatlösung von pH 10 suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 50 °C erwärmt und mit 5 g l-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäurehalb-ester versetzt. Nach Korrektur des ph-Wertes auf 10 mit 2 M NaOH wird der Ansatz eine Stunde bei 50 °C gerührt. Anschliessend wird über eine Nutsche abfiltriert und mit 21 Wasser, 21 Aceton und 210,2 M HCl gewaschen. Zur Diazo-tierung der in das Polyhydroxymethylen eingeführten Aryl-amingruppen wird der Filterrückstand in 200 ml 0,2 M HCl suspendiert, auf 2 °C abgekühlt und unter Rühren so lange mit 1 M NaNCh-Lösung versetzt, bis mit KJ-Stärke-Papier ein geringer Nitritüberschuss festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter einer wässrigen 0,01 M Amidosulfonsäure von 2 °C und anschliessend mit 200 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 7,5 von 2 °C gewaschen. 10 g of the carrier according to Example 1 are suspended in 200 ml of a 0.5 M sodium phosphate solution of pH 10. The suspension is heated to 50 ° C. with stirring and 5 g of half-ester of l-aminobenzene-4-β-hydroxyethylsulfonate. After correcting the pH to 10 with 2 M NaOH, the mixture is stirred at 50 ° C. for one hour. It is then filtered off through a suction filter and washed with 21 water, 21 acetone and 210.2 M HCl. To diazo the arylamine groups introduced into the polyhydroxymethylene, the filter residue is suspended in 200 ml of 0.2 M HCl, cooled to 2 ° C. and mixed with 1 M NaNCh solution with stirring until KJ starch paper a slight excess of nitrite can be found. After 10 minutes, the mixture is filtered through a suction filter and the filter residue is washed with 1 liter of an aqueous 0.01 M amidosulfonic acid at 2 ° C. and then with 200 ml of 0.2 M sodium phosphate pH 7.5 at 2 ° C.

Zur Kupplung wird das Diazoniumgruppen enthaltende Produkt in 150 ml einer Lösung von 2 g Tetanus-Toxoid mit 1260 Lf/mg N in 0,2 M Natriumphosphat pH 7,5 und 2 °C suspendiert und 20 Stunden bei 5 °C gerührt. Nicht gebundene Anteile des Toxoids werden mit 1 Liter 1 M NaCl-Lösung auf einer Nutsche ausgewaschen. For coupling, the product containing diazonium groups is suspended in 150 ml of a solution of 2 g of tetanus toxoid with 1260 Lf / mg N in 0.2 M sodium phosphate pH 7.5 and 2 ° C. and stirred at 5 ° C. for 20 hours. Unbound portions of the toxoid are washed out with 1 liter of 1 M NaCl solution on a suction filter.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid Application of the compound polyhydroxymethylene-tetanus toxoid

Gewinnung von Tetanus-Antitoxin Obtaining tetanus antitoxin

10 g des Produktes nach Beispiel 1 werden in 150 ml 0,15 M NaCl-Lösung, mit einem Zusatz von M/15 Natriumphosphat («PBS») pH 7,2 suspendiert und in eine Säule von 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe überführt. 20 ml Tetanus-Pferdeserum mit 1650 IE Tetanus-Antitoxin/ml werden auf die Säule aufgetragen, die anschliessend mit 500 ml PBS pH 7,2 gewaschen wird. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 0,5 M Glycin/HCl-Puffer pH 2,5. Das Eluat enthält nach Neutralisation mit 2 M NaOH und nachfolgendem Zentrifu- 10 g of the product according to Example 1 are suspended in 150 ml of 0.15 M NaCl solution, with the addition of M / 15 sodium phosphate (“PBS”) pH 7.2 and transferred to a column of 3 cm in diameter and 10 cm in height . 20 ml of tetanus horse serum with 1650 IU tetanus antitoxin / ml are applied to the column, which is then washed with 500 ml of PBS pH 7.2. The antibodies are eluted with 0.5 M glycine / HCl buffer pH 2.5. After neutralization with 2 M NaOH and subsequent centrifugation, the eluate contains

5 5

630 410 630 410

gieren insgesamt 240 mg Protein und, wie in einem Schutzversuch an Mäusen ermittelt wird, 12.300 IE Tetanus-Antitoxin. a total of 240 mg protein and, as determined in a protective experiment on mice, 12,300 IU tetanus antitoxin.

Beispiel 2 Example 2

Polyhydroxymethylen-Aminobenzamidin-Verbindung Polyhydroxymethylene aminobenzamidine compound

Herstellung der Matrix aus (w-Carboxy-n-pentyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen Preparation of the matrix from (w-carboxy-n-pentyl) -substituted polyhydroxymethylene

20 g Polyhydroxymethylen, nach Beispiel 1 mit BrCN aktiviert, wird zu einer mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,5 eingestellten und auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllten, wässrigen Lösung von 25 g e-Aminocapronsäure gegeben. Es wird noch 5 Stunden bei Raumtemperatur und pH 8,5 gerührt und abgesaugt und mit Wasser gut ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (co-Carboxy-n-pentyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 0,86%. 20 g of polyhydroxymethylene, activated according to Example 1 with BrCN, is added to an aqueous solution of 25 g of e-aminocaproic acid which has been adjusted to pH 8.5 with dilute sodium hydroxide solution and made up to a total volume of 1 liter. The mixture is stirred for 5 hours at room temperature and pH 8.5 and suction filtered and washed well with water. A dried sample of the polyhydroxymethylene substituted with (co-carboxy-n-pentyl) groups had a nitrogen content of 0.86%.

Herstellung des trägergebundenen Effektors Manufacture of the carrier-bound effector

Effektor: Aminobenzamidin Effector: aminobenzamidine

2 g eines Polyhydroxymethylenderivats, hergestellt nach Beispiel 2, werden in 25 ml 0,1 M Morpholinoäthansulfon-säure suspendiert und mit 1 g l-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid • HCl versetzt. Durch Zugabe von 2 M HCl unter pH-Kontrole wird der pH-Wert auf 4,8 eingestellt. Unter Rühren wird dem Ansatz 1 g m-Aminobenzamidin zugesetzt. Die Suspension wird unter pH-Korrektur 1 Stunde gerührt und das Adsorbens anschliessend in eine Chromatographie-Säule mit 1 cm Durchmesser überführt. Das Adsorbens wird mit 200 ml 0,05 M Trishydroxymethylaminome-than-HCl-Puffer pH 8,0 mit einem Zusatz von 0,5 M KCl (Tris-KCl) gespült. 2 g of a polyhydroxymethylene derivative, prepared according to Example 2, are suspended in 25 ml of 0.1 M morpholinoethanesulfonic acid and 1 g of l-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide • HCl is added. The pH is adjusted to 4.8 by adding 2 M HCl under pH control. 1 g of m-aminobenzamidine is added to the batch with stirring. The suspension is stirred under pH correction for 1 hour and the adsorbent is then transferred to a chromatography column with a diameter of 1 cm. The adsorbent is rinsed with 200 ml of 0.05 M trishydroxymethylaminomethane-HCl buffer pH 8.0 with the addition of 0.5 M KCl (Tris-KCl).

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Ami-nobenzamidin Gewinnung von Thrombin Application of the compound polyhydroxymethylene-ami-nobenzamidin production of thrombin

100 mg Roh-Thrombin vom Rind werden in 5 ml 0,05 M Tris, 0,5 M KCl pH 8,0 gelöst und auf die wie oben präparierte Säule aufgetragen. Die Säule wird anschliessend mit 200 ml Tris-KCl-Puffer gespült. Das an das unlöslich gemachte m-Aminobenzamidin gebundene Thrombin wird von diesem mit 100 ml einer Lösung von 0,05 M m-Aminobenzamidin in Tris-KCl-Puffer abgespalten. 100 mg raw bovine thrombin are dissolved in 5 ml 0.05 M Tris, 0.5 M KCl pH 8.0 and applied to the column prepared as above. The column is then rinsed with 200 ml of Tris-KCl buffer. The thrombin bound to the insolubilized m-aminobenzamidine is split off from it with 100 ml of a solution of 0.05 M m-aminobenzamidine in Tris-KCl buffer.

Die Protein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und über eine 1 x 30 cm Säule Sephadex G-25 in Tris-KCl-Puffer laufen lassen. In dem ersten, das Protein enthaltenden Peak des Säuleneluates konnten durch Bestimmen der Aktivität nach Chase und Shaw, Biochem. 8,1969, S. 2212,78% der Ausgangsaktivität gefunden werden. The protein-containing fractions are pooled and run over a 1 x 30 cm column of Sephadex G-25 in Tris-KCl buffer. In the first, the protein-containing peak of the column eluate could be determined by the activity according to Chase and Shaw, Biochem. 8,1969, p. 2212.78% of the starting activity can be found.

Beispiel 3 Example 3

Polyhydroxymethylen-Pepsin-Verbindung Polyhydroxymethylene pepsin compound

Herstellung der Matrix aus (cû-Amino-n-hexyl)-substitu-iertem Polyhydroxymethylen: Preparation of the matrix from (cû-amino-n-hexyl) -substituted polyhydroxymethylene:

8,0 g aus Dimethylformamid/Methanol umgefälltes Polyvinylencarbonat, hergestellt nach N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58, p. 534(1962), wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 7,5 g Hexamethylendiamin in 180 ml Methanol suspendiert und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt, mit Methanol ausgewaschen und in einer Lösung von 10 g Natriummethylat in 300 ml 96%igem Methanol 4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen. Eine getrockente Probe des über einen Spacer von 6 CH2-Gruppen mit primären Aminogruppen substituierten Polyhydroxymethylen-Adsorbens hatte einen Stickstoffge-halt von 5,7%. 8.0 g of polyvinylene carbonate reprecipitated from dimethylformamide / methanol, prepared according to N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58, p. 534 (1962), is suspended at room temperature in a solution of 7.5 g of hexamethylenediamine in 180 ml of methanol and stirred for 48 hours at room temperature, suction filtered, washed out with methanol and in a solution of 10 g of sodium methylate in 300 ml of 96% methanol 4 Suspended for days at room temperature, washed out with methanol and then very intensively with water. A dry sample of the polyhydroxymethylene adsorbent substituted by a spacer of 6 CH2 groups with primary amino groups had a nitrogen content of 5.7%.

Herstellung des trägergebundenen Effektors Manufacture of the carrier-bound effector

Effektor: Pepsin Effector: pepsin

20 g (co-Amino-n-hexyl)-substituiertes Polyhydroxymethylen, hergestellt nach Beispiel 3, werden in 400 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 10 suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 40 ml einer 25%igen Glutardialdehyd-lösung zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird über eine Nutsche abfiltiert und der Filterrückstand mit 4 Liter 0,2 M Natriumazetatpuffer pH 4,0 gewaschen. Anschliessend wird das Reaktionsprodukt in 500 ml einer Lösung von 5 g Pepsin mit insgesamt 500 000 Einheiten, bestimmt nach Anson, in 0,2 M Natriumazetat pH 4,0 gegeben und 15 Stunden bei 6°C gerührt. Das danach erhaltene Produkt wird auf einer Nutsche mit 5 Liter 0,1 M Natriumazetat/Essigsäure pH 4,0 und einem Zusatz von 1 M NaCl ausgewaschen. 20 g (co-amino-n-hexyl) -substituted polyhydroxymethylene, prepared according to Example 3, are suspended in 400 ml of 0.2 M sodium phosphate pH 10. 40 ml of a 25% glutardialdehyde solution are added to the suspension with stirring. After stirring for 2 hours at room temperature, the filter is filtered off and the filter residue is washed with 4 liters of 0.2 M sodium acetate buffer pH 4.0. The reaction product is then poured into 500 ml of a solution of 5 g of pepsin with a total of 500,000 units, determined according to Anson, in 0.2 M sodium acetate pH 4.0 and stirred at 6 ° C. for 15 hours. The product obtained afterwards is washed out on a suction filter with 5 liters of 0.1 M sodium acetate / acetic acid pH 4.0 and an addition of 1 M NaCl.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen- Pepsin Application of the compound polyhydroxymethylene pepsin

Proteolytische Spaltung von Immunglobulinen Proteolytic cleavage of immunoglobulins

Das Adsorbens nach vorliegendem Beispiel wird in 0,1 M Acetatpuffer pH 4,0 suspendiert und davon eine Aktivitätsbestimmung nach Anson durchgeführt. Die Suspension enthält insgesamt 21 000 Einheiten Pepsin in gebundener und mit diesem Test nachweisbarer Form. Zur proteolytischen Spaltung von Human-Immunglobulin G wird das Pepsin-Adsorbens abfiltriert und der Rückstand in einer 2,5%igen Lösung von 30 g Human IgG in physiologischer NaCl-Lösung pH 4,1 suspendiert. Der Spaltansatz wird 24 Stunden bei 37 °C gerührt. Nach Abfiltrieren des trägergebundenen Pepsins wird das Filtrat mit 1250 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das dabei entstehende Präzipitat wird abzentrifugiert; es enthält das F(ab)2-Fragment des Immunoglobulins mit dessen Antikörperaktivität. Der Abguss wird verworfen. The adsorbent according to the present example is suspended in 0.1 M acetate buffer pH 4.0 and an Anson activity determination thereof is carried out. The suspension contains a total of 21,000 units of pepsin in a bound form that can be detected with this test. For the proteolytic cleavage of human immunoglobulin G, the pepsin adsorbent is filtered off and the residue is suspended in a 2.5% solution of 30 g human IgG in physiological NaCl solution pH 4.1. The gap batch is stirred at 37 ° C. for 24 hours. After filtering off the carrier-bound pepsin, the filtrate is mixed with 1250 ml of saturated ammonium sulfate solution. The resulting precipitate is centrifuged off; it contains the F (ab) 2 fragment of the immunoglobulin with its antibody activity. The cast is discarded.

Beispiel 4 Example 4

Herstellung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Oxaminsäure Preparation of the compound polyhydroxymethylene oxamic acid

10 g Polyhydroxymethylen werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit BrCN aktiviert und mit 5 g Tyramin, gelöst in 150 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, bei 5 °C durch 60 Minuten langes Rühren umgesetzt. Die nicht gebundenen Anteile des Tyramins werden auf einer Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und 5 °C ausgewaschen. Der Filterrückstand wird in 150 ml einer auf 5 °C abgekühlten Lösung von 1,0 g diazotierter p-Aminophenyloxaminsäure suspendiert und 15 Stunden bei 5 °C gerührt. Das Adsorbens wird auf einer Nutsche mit 1 Liter 0,05 M Natriumacetat-Essigsäure-Puffer pH 5,5 mit einem Zusatz von 2 mM CaCk und 0,2 mM EDTA gewaschen. 10 g of polyhydroxymethylene are activated with BrCN as described in Example 1 and reacted with 5 g of tyramine, dissolved in 150 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate, at 5 ° C. by stirring for 60 minutes. The unbound portions of the tyramine are filtered off on a suction filter and the filter residue is washed out with 1 liter of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 and 5 ° C. The filter residue is suspended in 150 ml of a solution of 1.0 g of diazotized p-aminophenyloxamic acid cooled to 5 ° C. and stirred at 5 ° C. for 15 hours. The adsorbent is washed on a suction filter with 1 liter of 0.05 M sodium acetate-acetic acid buffer pH 5.5 with the addition of 2 mM CaCk and 0.2 mM EDTA.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Oxaminsäure Application of the compound polyhydroxymethylene oxamic acid

Gewinnung von Neuraminidase Obtaining neuraminidase

Das Adsorbens nach Beispiel 4 wird im oben genannten Acetatpuffer resuspendiert und in eine Chromatographie-Säule von 2 cm Durchmesser überführt. Durch diese Säule wird 1 Liter eines Kulturfiltrates von Vibrio Cholerae mit 800 IE Neuraminidase/ml geleitet, das vorher mit 2 M Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und das mit CaCk und EDTA bis zu einer Konzentration von 2 mM bzw. 0,2 mM versetzt worden war. Die nicht gebundenen Proteine werden mit 500 ml Acetatpuffer ausgewaschen. The adsorbent according to Example 4 is resuspended in the above-mentioned acetate buffer and transferred to a chromatography column of 2 cm in diameter. 1 liter of a culture filtrate from Vibrio Cholerae with 800 IU neuraminidase / ml is passed through this column, which was previously adjusted to pH 5.5 with 2 M acetic acid and with CaCk and EDTA to a concentration of 2 mM and 0.2 mM, respectively had been transferred. The unbound proteins are washed out with 500 ml acetate buffer.

Die Elution der an den trägergebundenen Inhibitor adsorbierten Neuraminidase erfolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Sammeln der The neuraminidase adsorbed on the carrier-bound inhibitor is eluted by washing the column with 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution and collecting the

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10 10th

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20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

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50 50

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60 60

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aktive Neuraminidase enthaltenden Fraktionen. Sie enthalten 86% der eingesetzten Aktivität. fractions containing active neuraminidase. They contain 86% of the activity used.

Beispiel 5 Example 5

a) Umsetzung von Polyhydroxymethylen mit Epichlorhy-drin a) Implementation of polyhydroxymethylene with epichlorohydrin

50 g Polyhydroxymethylen werden in 112 n NaOH suspendiert, mit 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60°C gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf 10-11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Std. dieser PH-Wert gehalten. Nach 2 Std. Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluss wieder mit Wasser gewaschen. 50 g of polyhydroxymethylene are suspended in 112 N NaOH, 250 ml of epichlorohydrin are added and the mixture is stirred at 55-60 ° C. for 2 hours. The pH of the suspension drops to 10-11 after a short time. This pH is maintained for a further 1 hour by adding NaOH. After a reaction time of 2 hours, the solid is filtered off with suction, washed with water, acetone and finally with water.

b) 50 g hexamethylendiamin werden in 1,51 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Lösung wird das unter 5a) aktivierte Polyhydroxymethylen gegeben und bei 50-55°C 6 Std. gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen. b) 50 g of hexamethylenediamine are dissolved in 1.51 water and mixed with HCl to pH 10. The polyhydroxymethylene activated under 5a) is added to the solution and the mixture is stirred at 50-55 ° C. for 6 hours. The product is then filtered off and washed with water free of hexamethylene diamine.

c) Das unter Beispiel 5b) erhaltene Produkt wird mit 50 g l-Amonobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55°C und pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschliessend wird der Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Aceton und wieder mit Wasser gewaschen. c) The product obtained in Example 5b) is stirred with 50 g of 1-ammonium benzene-4-β-hydroxyethylsulfonic acid at 55 ° C and pH 10 for one hour. The solid is then filtered off, washed with water, acetone and again with water.

d) 10g des unter 5c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit 200 ml 0,1 n HCl gewaschen und danach in 300 ml 0,5 n HCl suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren mit 0,1 n NaN02-Lösung bei 0-4°C versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapier ein geringer Nitrit-Überschuss festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand mit Eiswasser und anschliessend mit 0,15 M Natrium-phosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4°gewaschen. d) 10 g of the product obtained under 5c) are washed on a suction filter with 200 ml of 0.1 N HCl and then suspended in 300 ml of 0.5 N HCl. The suspension is mixed with 0.1 N NaNO 2 solution at 0-4 ° C. with stirring until a slight excess of nitrite is found in the diazotization with KJ starch paper. After 10 minutes, the mixture is filtered through a suction filter and the residue is washed with ice water and then with 0.15 M sodium phosphate buffer pH 7.5 at 0-4 °.

e) 0,75 g Albumin werden in 250 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst, auf 4°C abgekühlt und das unter 5 d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4°C gerührt, danach abfiltriert und der Feststoff mit e) 0.75 g of albumin are dissolved in 250 ml of pH 7.5 phosphate buffer, cooled to 4 ° C. and the product prepared under 5 d) is added. The suspension is stirred at 4 ° C for 20 hours, then filtered off and the solid with

1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wässrige 0,9%ige NaCl-Lösung mit einem Gehalt an 1 /15 Mol Na2HP04-KH2P04-Puffer vom pH 7,2) gewaschen. 1 M NaCl and phosphate buffered saline (PBS) (aqueous 0.9% NaCl solution containing 1/15 mol Na2HP04-KH2P04 buffer, pH 7.2).

Filtrat und Waschlaugen werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht. Es werden 75 mg Albumin an 1 g des so hergestellten Trägers gebunden. Filtrate and wash liquors are examined for albumin using the radial immunodiffusion method. 75 mg of albumin are bound to 1 g of the carrier thus produced.

f) 2,4 g IgM werden in 250 ml Phosphatpuffer pH 7,5 gelöst und auf 4°C abgekühlt. 10 g des nach 5 d) diazotierten Produktes werden zugegeben und die Suspension 20 Std. bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird der Feststoff mit f) 2.4 g of IgM are dissolved in 250 ml of pH 7.5 phosphate buffer and cooled to 4 ° C. 10 g of the product diazotized after 5 d) are added and the suspension is stirred at 4 ° C. for 20 hours. After filtration, the solid becomes

1 M NaCl-Lösung und mit PBS gewaschen. 1 M NaCl solution and washed with PBS.

1 g des nach5 f) hergestellten Trägers binden 240 mg IgM. 1 g of the carrier prepared according to 5 f) bind 240 mg of IgM.

Beispiel 6 Example 6

a) 10g PH M werden wie in Beispiel 5 a)b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet. a) 10 g of PH M are activated as described in Example 5 a) b) with epichlorohydrin, reacted with hexamethylenediamine and worked up.

b) 10g des so hergestellten Trägers werden bei 10°C und pH 6 mit 5 g Bernsteinsäureanhydrid, die in 200 ml Wasser suspendiert sind, 4 Std. succinoyliert. Der pH-Wert wird mit b) 10 g of the carrier thus prepared are succinoylated for 4 hours at 10 ° C. and pH 6 with 5 g of succinic anhydride, which are suspended in 200 ml of water. The pH is with

2 n NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes mit Wasser wird das Produkt mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-(-[N-methylmorpholino]-äthyl)-carbondiimid-p-toluol-sul-fonat bei pH 5 und 5°C 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen. 2 n NaOH regulated. After washing the solid with water, the product with 30 g of N-cyclohexyl-N '- (- [N-methylmorpholino] ethyl) -carbondiimide-p-toluenesulfonate at pH 5 and 5 ° C. 30 Stirred for min., Filtered off and washed quickly with ice water.

c) 1 g IgG werden in 250 ml Phospaht-Puffer pH 7,5 gelöst «nd mit dem unter 6 f) hergestellten Träger 24 Stunden bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Koch- c) 1 g of IgG is dissolved in 250 ml of phosphate buffer pH 7.5 and stirred with the carrier prepared under 6 f) at 4 ° C. for 24 hours. After filtration, the product is washed with 1 M cooking

und mit PBS gewaschen. and washed with PBS.

An 1 ? des Trägers werden 85 mg IgG kovalent gebunden. At 1? of the carrier 85 mg IgG are covalently bound.

Beispiel 7 Example 7

a) 20 g des unter 5a) hergestellten Produktes werden mit 20 g Aminocapronsäure bei pH 10 und 50-55°C 6 Std. gerührt. Danach wird es abgesaugt und mit Wasser gewa- a) 20 g of the product produced under 5a) are stirred with 20 g of aminocaproic acid at pH 10 and 50-55 ° C. for 6 hours. Then it is suctioned off and washed with water.

s sehen. s see.

b) 10 g des unter 7 a) hergestellten Produktes werden mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-([N-methylmorpholino]-äthyl)-car-bodiimid-p-toluol-sulfonat versetzt und dazu nach 5 Min. 2 g N-Hydroxysuccinimid bei pH 5 zugegeben. Nach 5 Std. b) 10 g of the product produced under 7 a) are mixed with 2.5 g of N-cyclohexyl-N '- ([N-methylmorpholino] ethyl) -car-bodiimide-p-toluenesulfonate and added after 5 minutes. 2 g of N-hydroxysuccinimide added at pH 5. After 5 hours

io Rühren bei 24°C wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Stirring at 24 ° C., the solid is filtered off and washed with water.

c) 0,5 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Puffer gelöst und mit dem unter 7 b) hergestellten aktivierten Träger c) 0.5 g of albumin are dissolved in 200 ml of phosphate buffer and with the activated carrier prepared under 7 b)

24 Std. bei 4°C. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M ls Kochsalz und mit PBS gewaschen. 24 hours at 4 ° C. After filtration, the product is washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

An 1 g des Trägers werden 50 mg Albumin kovalent gebunden. 50 mg of albumin are covalently bound to 1 g of the carrier.

2o Beispiel 8 2o Example 8

10 g PHM werden wie in Beispiel 5 a)b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet. 10 g of PHM are activated as described in Example 5 a) b) with epichlorohydrin, reacted with hexamethylenediamine and worked up.

a) 10 g des so hergestellten Trägers werden in 100 ml 25 Wasser suspendiert und mit 500 ml 25%igem Glutardial- a) 10 g of the carrier thus prepared are suspended in 100 ml of 25 water and mixed with 500 ml of 25% glutardial

dehyd umgesetzt. Nach 1 Std. Rühren wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser bzw. PBS gewaschen. implemented dehyd. After stirring for 1 hour, the solid is filtered off and washed with water or PBS.

b) 0,5 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Puffer gelöst und mit dem unter 8 a) hergestellten Träger 20 Std. bei 4°C b) 0.5 g of albumin are dissolved in 200 ml of phosphate buffer and 20 hours at 4 ° C. with the carrier prepared under 8 a)

so gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen. so touched. After filtration, the product is washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

Beispiel 9 Example 9

Direkte Umsetzung von mit Epichlorhydrin aktiviertem 35 Polyhydroxymethylen a) 10 g Polyhydroxymethylen werden mit 50 ml Epichlorhydrin wie in Beispiel 5 a) beschrieben aktiviert. Nach Filtration wird das Produkt schnell mit Wasser, Aceton, Wasser und zum Schluss mit PBS gewaschen. Direct reaction of 35 polyhydroxymethylene a) activated with epichlorohydrin a) 10 g of polyhydroxymethylene are activated with 50 ml epichlorohydrin as described in Example 5 a). After filtration, the product is quickly washed with water, acetone, water and finally with PBS.

40 b) 0,5 g Albumin werden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter 9 a) hergestellten Produkt 60 Std. bie 4°C gerührt. Nach Filtration wird das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen. 40 b) 0.5 g of albumin are dissolved in 200 ml of PBS and stirred with the product prepared under 9 a) for 60 hours at 4 ° C. After filtration, the carrier-bound protein is washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

45 45

1 g des so hergestellten Trägers binden 45 mg Albumin. 1 g of the carrier thus produced bind 45 mg of albumin.

Beispiel 10 Example 10

10 g wasserunlösliches Polyhydroxymethylen werden bei so pH 9,5 (0,15 m Na-Bicarbonat/NaOH-Puffer) 3 Tage bei 25°C mit 30 g Diäthylenglykoldiglycidyläther gerührt, das Produkt abgesaugt, gut ausgewaschen und zu 0,5 g Humanalbumin in 200 ml 0,15 m Phospaht-Puffer pH 8 gegeben und 60 Stunden bei 10°C gerührt. Nach Filtration wird das träger-55 gebundene Protein mit 1 M Kochsalzlösung und «PBS» gewaschen. 10 g of water-insoluble polyhydroxymethylene are stirred at pH 9.5 (0.15 m Na bicarbonate / NaOH buffer) for 3 days at 25 ° C. with 30 g of diethylene glycol diglycidyl ether, the product is filtered off with suction, washed well and 0.5 g of human albumin in 200 ml of 0.15 M phosphate buffer pH 8 were added and the mixture was stirred at 10 ° C. for 60 hours. After filtration, the carrier-55 bound protein is washed with 1 M saline and «PBS».

1 g des so hergestellten Trägers enthält 35 mg gebundenes Albumin. 1 g of the carrier thus prepared contains 35 mg bound albumin.

60 60

Beispiel 11 Example 11

10 g Polyhydroxymethylen werden, wie im Beispiel 10 beschrieben, mit 30 g Glycidyltris-(Glycidyläther) umgesetzt, zu 0,5 g Immunglobulin G (IgG) in 200 ml 0,15 m Phospaht-Puffer pH 7,5 gegeben und 60 Stunden bei 4°C gerührt. Nach 65 Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalzlösung und mit «PBS» gewaschen. 10 g of polyhydroxymethylene are, as described in Example 10, reacted with 30 g of glycidyl tris (glycidyl ether), added to 0.5 g of immunoglobulin G (IgG) in 200 ml of 0.15 M phosphate buffer pH 7.5 and at 60 hours 4 ° C stirred. After 65 filtration, the product is washed with 1 M saline and with «PBS».

1 g des so hergestellten Proteinharzes enthält 50 mg gebundenes IgG. 1 g of the protein resin thus prepared contains 50 mg bound IgG.

Claims (3)

630410 PATENTANSPRÜCHE630410 PATENT CLAIMS 1. Verfahren zur Herstellung einer, an einer Poly(hydroxy-methylen)-Trägermatrix gebundenen, biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologisch aktive Substanz direkt oder nach Umsetzung mit einer Kupplungskomponente kovalent an Poly(hydroxymethylen) oder Poly(vinylencarbonat) bindet, wobei die Kupplungskomponente mindestens eine zur Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Poly(hydroxymethylen) oder Poly(vinylencarbonat) befähigte funktionelle Gruppe und mindestens eine zur Bildung einer kovalenten Bindung mit der biologisch aktiven Substanz befähigte funktionelle Gruppe aufweist, und bei der Verwendung von Poly(vinylencarbonat) die restlichen Car-bonatgruppen hydrolysiert, wobei die Hydrolyse für den Fall, dass die biologisch aktive Substanz über eine Kupplungskomponente an die Trägermatrix gebunden wird, vor der Bindung der biologisch aktiven Substanz an die Trägermatrix vorgenommen wird. 1. A process for producing a biologically active substance bound to a poly (hydroxymethylene) support matrix, characterized in that the biologically active substance is covalently attached to poly (hydroxymethylene) or poly (vinylene carbonate) directly or after reaction with a coupling component. binds, wherein the coupling component has at least one functional group capable of forming a covalent bond with the poly (hydroxymethylene) or poly (vinyl carbonate) and at least one functional group capable of forming a covalent bond with the biologically active substance, and when using poly (vinylene carbonate) hydrolyzes the remaining carbonate groups, the hydrolysis being carried out in the event that the biologically active substance is bound to the carrier matrix via a coupling component, before the biologically active substance is bound to the carrier matrix. 2. An einer Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix gebundene biologisch aktive Substanz, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1. 2. Biologically active substance bound to a poly (hydroxymethylene) carrier matrix, produced by the process according to claim 1. 3. Verwendung einer an einer Poly(hydroxymethylen)-Trägermatrix chemisch gebundenen, biologisch aktiven Substanz bei der Affinitätschromatographie. 3. Use of a biologically active substance chemically bound to a poly (hydroxymethylene) support matrix in affinity chromatography.
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