DE2421789C3

DE2421789C3 - Biologically active products and processes for their manufacture

Info

Publication number: DE2421789C3
Application number: DE19742421789
Authority: DE
Inventors: Rudolf 3550 Marburg; Huemer Heinrich Dr. 6231 Schwalbach Schmidtberger
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Filing date: 1974-05-06
Publication date: 1977-05-26

Description

bifunktionellen organischen Verbindung umsetzt, die restlichen Cyclocarbonatgruppen 2s hydrolisiert und daß man an das Polymere eine biologisch aktive Verbindung kovalent bindet.converts bifunctional organic compound, the remaining cyclocarbonate groups 2s hydrolyzed and that a biologically active compound is covalently bonded to the polymer.

3. Verwendung eines biologisch aktiven Produktes gemäß Anspruch 1 zur Affinitätschromatographie, zur Gewinnung von Antikörpern oder zur Durchführung von Enzymreaktionen.3. Use of a biologically active product according to claim 1 for affinity chromatography, to obtain antibodies or to carry out enzyme reactions.

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebundenen, biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzuführenden Reaktionen einzusetzen.In the past few years, a new technique has emerged within the more biochemical working methods and more enforced, whose primary characteristic is the affinity of carrier-bound, biological to use active substances for selective reactions.

Über eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und gegebenenfalls anschließend durch Desorption isoliert werden.Via a specific complex formation of the carrier-bound substance with a second, which in one If a mixture is present, the substance in question can be removed from the mixture and, if necessary, subsequently can be isolated by desorption.

Trägei gebundene Enzyme bieten den Vorteil, Stoff iimwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzymfrei zu erhalten.Inertly bound enzymes have the advantage of converting substances to carry out in preparative, continuous processes and the reaction products to get enzyme-free.

In der biochemischen, enzymatischen Analytik stehen wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfugung. Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber des Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufweiswn, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Affinitätschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunlösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme. doIn biochemical, enzymatic analysis, water-insoluble enzymes are considered to be reusable Reagents available. Due to the property of the enzymes, affinities not only towards the Substrates, but also against the specific inhibitors, the production of Enzyme inhibitors with the aid of affinity chromatography on carrier-bound enzymes are particularly favorable proven. On the other hand, the binding of inhibitors to water-insoluble matrices allows preparative matrices Obtaining the appropriate enzymes. do

Als sogenannte Immunadsorbentien werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene.Antigens or antibodies are attached to water-insoluble matrices as so-called immune adsorbents bound and then allow the isolation of the corresponding antibodies or antigens.

Als biologisch aktive Substanzen werden entspre- (15 chend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine und Hormone bezeichnet werden können. Diese biologisch aktiven Substanzen können, da sie die Wirkungsprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, Effektoren genannt werden.Biologically active substances (15 According to the preceding statements, natural and artificially produced in vivo and in vitro effective Substances understood in the broadest sense as enzymes, activators, inhibitors, antigens or antibodies, Vitamins and hormones can be designated. These biologically active substances can, as they are the Represent the principles of action of the water-insoluble systems, called effectors.

Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Effektoren sind wesentlich stabiler als die entsprechenden Substanzen in Lösung.Most of the carrier-bounds described so far Effectors are much more stable than the corresponding substances in solution.

Als TrägermateriaJien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft nur solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wäßrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktionspartner des Effektors weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, die kein Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein.As carrier materials, so-called matrices, it is advantageous to use only those substances which, in addition to the Insolubility in aqueous systems have the lowest possible unspecific adsorption. In addition must have hydrophobic, hydrophilic and ionic interactions between the template and the reactant of the effector are largely prevented. With substances that are not a reaction partner of the effector a bond should be excluded.

Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören Aktivkohle und Glasperlen, und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung miteinander verknüpft sind. Die Letztgenannten schließen Vinylpolymerem, z. B. PoIyacrylsäuren, Polyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder Sulfonyl-substituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und schließlich natürliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein. Wegen der ausgeglichenen Wechselwirkung zui sehen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere der Zellulose, des Dextrans, der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlinge, als Matrize in wäßrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxylgruppen wegen ihrer unspezifischen Reaktion als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ geringe thermische und chemische Stabilität auf.The matrices used so far as carriers for biologically active substances can be subdivided in those that bind the effectors through physical adsorption, this includes activated carbon and Glass beads, and those that are linked to the effectors via a covalent bond. the The latter include vinyl polymers, e.g. B. polyacrylic acids, polyacrylic acid amides and amino, carboxy or sulfonyl-substituted polystyrene, furthermore cellulose and its derivatives and finally natural and synthetic polypeptides and proteins. Because of the balanced interaction zui see matrix and effector has the use of carbohydrates, especially cellulose, dextran, starch, agar or its derivatives, as a matrix in aqueous systems, is the highest Found widespread, albeit because of the carboxyl groups often contained in these natural substances their unspecific reaction are perceived as annoying. In addition, these substances have a relative low thermal and chemical stability.

Es wurde nun gefunden, daß die Nachteile, die die Kohlenhydratderivate als Matrizen bei affinitätsabhängigen Reaktionen aufweisen, überwunden werden können, wenn als Matrize Polyhydroxymethylen verwendet wird.It has now been found that the disadvantages that the carbohydrate derivatives as matrices in affinity-dependent Have reactions that can be overcome if polyhydroxymethylene is used as a template will.

Gegenstand der Erfindung sind demnach biologisch aktive wasserunlösliche Produkte, gekennzeichnet durch ein wasserunlösliches Poly(hydroxymethylen), an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität kovalent entweder direkt oder über eine oder mehrere bifunktionelle organische Verbindungen gebunden ist.The invention accordingly relates to biologically active, water-insoluble products by a water-insoluble poly (hydroxymethylene) to which a biologically active substance is preserved their biological activity covalently either directly or via one or more bifunctional organic Connections is bound.

In diesen Verbindungen ist die Trägermatrix Polyhydroxymethylen und die biologisch aktiven Substanzen beispielsweise Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine oder Hormone oder auch synthetisch hergestellte Effektoren.In these compounds the carrier matrix is polyhydroxymethylene and the biologically active substances, for example enzymes, activators, inhibitors, antigens or antibodies, vitamins or hormones or synthetically produced effectors.

Polyhydroxymethylen ist ein synthetisches Polymeres mit einer durchgehenden Kohlenstoff-Kette. Jedes Kohlenstoffatom trägt ein Wassersioffatom und eine Hydroxylgruppe. Seine Herstellung und seine Eigenschaften sind unter anderem beschrieben von N. D. Field, J. R. S c h a e f g e η , J. Polymer Sei., Vol. 58, 533-543 (1962) und G. Smets, K. Hayaschi, J. Polymer Sei., Vol. 29, 257-274 (1958). Es ist durch basische oder saure Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat herstellbar. Im weiteren Sinne ist das Polyhydroxymethylen als Derivat des Polyvinylencarbonats aufzufassen. Die Bindung der Effektoren an das Polyhydroxymethylen kann einerseits durch die Maßnahme erreichtPolyhydroxymethylene is a synthetic polymer with a continuous carbon chain. Each Carbon atom carries a hydrogen atom and a hydroxyl group. Its manufacture and its properties are described, inter alia, by N. D. Field, J. R. S c h a e f g e η, J. Polymer Sci., Vol. 58, 533-543 (1962) and G. Smets, K. Hayaschi, J. Polymer Sci., Vol. 29, 257-274 (1958). It's through basic or acidic hydrolysis can be produced from polyvinylene carbonate. In a broader sense, this is polyhydroxymethylene to be understood as a derivative of polyvinylene carbonate. The binding of the effectors to the polyhydroxymethylene can be achieved on the one hand by the measure

die bei der kovalenten Verknüpfung derthose involved in the covalent linkage of the

Ffktoren mit der Hydroxylgruppe zum EinsatzFfctors with the hydroxyl group are used

men andererseits durch Umsetzung des Polyviny-men on the other hand by conversion of the polyvinyl

' honats über die ebenfalls bekannte aminolytische'honats about the well-known aminolytic

^nCktion eines Zylindercarbonatringes des Polyvinylen- ^nC ction of a cylinder carbonate ring made of polyvinyl

CH
0CH
0

CH
OCH
O

+ R-NH₁ + R-NH ₁

Il οIl ο

PolyvinylencarbonatPolyvinylene carbonate

Verseifung carbonats mit einem primären Amin, z. B. mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder Effektor substituierten Polyvinylencarbonat, dessen restliche Zyklocarbonatgruppen anschließend zu Hydroxylgruppen verseift werden:Saponification of carbonate with a primary amine, e.g. B. with hexamethylenediamine, to a polyvinylene carbonate substituted via a urethane bond with a spacer or effector, the remaining cyclocarbonate groups of which are then saponified to hydroxyl groups:

~ y ~ y CH
1
OCH
1
O — CH^;
I - CH ^;
I. μ—cnμ-cn OHOH CH
O
/CH
O
/ CH-
j
OHCH-
j
OH OHOH ...... \ /
C
(I\ /
C.
(I. Il
O Il
O CH
i CH
i — CH-
I - CH-
I. OHOH j
Oj
O -CH
O-CH
O C=C = I
N?
I I.
N?
I. I
R I.
R.

NHNH

Fs ist für die Anwendung der Produkte besondersFS is special for using the products

rteilhift die biologisch aktiven Effektoren nichtrteilhift the biologically active effectors

irckt mit dem Polyhydroxy methylen umzusetzen,ircks to react with the polyhydroxymethylene,

ndern über ein in der Affinitätschromatographie alsChange over a in affinity chromatography as

Arm oder wie im englischen Schriiuum als »Spacer«Arm or as in the English script as "spacer"

bezeichnetes Zwischenglied an die Matrix kovalent zudesignated link to the matrix covalently

^DieSpacer-Substanzen sind meist Kohlenwasserstoffe der Länge um 1 - 2 nm. Zwei funktioneile Endgrupdes Spacers erlauben jeweils die Umsetzung sowohl mit der Matrix als auch mit dem Effektor, wobei bei der Umsetzung mit der Matrix sowohl Polyhydroxymethy- |_en als auch Polyvinylencarbonat unter geeigneten Redineungen einsetzbar sind.^ The spacer substances are mostly hydrocarbons with a length of 1 - 2 nm. Two functional end groups of the spacer allow the implementation both with the matrix and with the effector, whereby both polyhydroxymethy- | _en as well as polyvinylene carbonate can be used with suitable reductions.

Gegenstand der Erfindung sit ferner ein Verfahren Herstellung eines biologisch aktiven, wasserunlöslichen Produktes der oben gegebenen Definition. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnetThe invention also relates to a method for producing a biologically active, water-insoluble one Product of the definition given above. The procedure is characterized by this

A) daß man Poly(hydroxylmethylen) kovalent direkt oder über eine oder mehrere bifunktionelle organische Verbindungen an eine biologisch aktive Substanz bindet, oderA) that one poly (hydroxylmethylene) covalently directly or via one or more bifunctional binds organic compounds to a biologically active substance, or

B) daß man Polyvinylencarbonat) mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt und die restlichen Cyclocarbonatgruppen hydrolysiert, oderB) that you polyvinylene carbonate) with a biological converts active substance and hydrolyzes the remaining cyclocarbonate groups, or

Q daß man Poly(vinylencarbonat) mit einer bifunktionellen organischen Verbindung umsetzt, die restlichen Cyclocarbonatgruppen hydrolysiert und daß man an das Polymere eine biologisch aktive Verbindung kovalent bindet.Q that you can poly (vinylene carbonate) with a bifunctional organic compound reacts, hydrolyzed the remaining cyclocarbonate groups and that a biologically active compound is covalently attached to the polymer.

Für die Durchführung dieses Verfahrens steht eine Reihe von allgemein bekannten Reaktionen /urA number of well-known reactions are available for carrying out this process

^VeBe"cmders einfach erfolgt die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymeihylens mittels Cvanhalogeniden. vorteilhaft mit B'omcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Am nogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über d.csc aWiviprien Grunnen. ^In addition, the effector is simply linked to the matrix after activation of the hydroxyl groups of the polyhydroxymethylene by means of vanhalides, advantageously with bomcyan, and a subsequent reaction of the biologically active effectors containing amino groups via d.csc aWiviprien Grunnen.

Ein weiteres Verfahren beruht darauf, daß in einer Abwandlung der Azid-Methode von Curtinus, \o Polyhydroxymethylen wie Polysaccharide mit Chloressigsäure im alkalischen Millieu umgesetzt, die entsprechende Säure mit Alkohol verestert, danach der Ester in das Hydrazid überführt und anschließend das in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der Polyhydroxy methylen-Matrix verknüpft wird.Another method based on the fact that, as implemented in a modification of the azide method of Curtinus, \ o polyhydroxymethylene polysaccharides with chloroacetic acid in an alkaline milieu, esterifying the corresponding acid with alcohol, then transferred to the ester into the hydrazide, and then the resulting in the sequence Azide is linked to the amino group of the effector protein with the polyhydroxy methylene matrix.

Eine andere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyhydroxymethylen-Matrix besteht in der Acylierung der Hydroxylgruppen mit Bromazetylbromid, gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppe des Effektors.There is another possibility of linking the effector with a polyhydroxymethylene matrix in the acylation of the hydroxyl groups with bromoacetyl bromide, followed by the alkylation of the Amino group of the effector.

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Trianinen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazins mit der Polyhydroxymethylenverbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.Similar reaction courses are, for example, by reacting the hydroxyl groups of the carrier with to achieve reactive trianines, some of the reactive groups of the triazine with the polyhydroxymethylene compound, another reacts with amino groups of the effector.

Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin oder Histidinresten des Proteineffektors.Diazotizable aromatic amines which have a further reactive group with the hydroxyl groups of the Carrier on the one hand can connect, on the other hand, allow the coupling to do so enabled, activated amino acids, for example the tyrosine or histidine residues of the protein effector.

Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von jS-Hydroxyäthylsulfonen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht werden. Sie ermöglichen die Bindung des Effektors nach der vorgeschriebenen Diazotierungsreaktion.Vinyl sulfone derivatives containing arylamino groups and sulfuric acid half esters of iS-hydroxyethyl sulfones can be reacted with the hydroxyl groups of the carrier. They make that possible Binding of the effector after the prescribed diazotization reaction.

do Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem l'roteineffektor oder anderen Effektoren, ließen sich noch weitere Methoden aufzählen, die /ur Reaktion einerseits der Hydroxyli,i gruppen des Polyhydroxymeihylens. andererseits bestimmter Gruppierungen des Effektors fuhren und dadurch die kovalente Verbindung /wischen beiden herstellen.do In addition to the procedures listed here as an example for the production of the covalent connection between the carrier matrix and the protein effector or other effectors, further methods could be enumerated, the / ur reaction on the one hand of the hydroxyli, i groups of polyhydroxymethylene. on the other hand, certain groups of the effector lead and thereby creating the covalent connection / between the two.

Das Polyhydroxymethylen zeichnet sich neben der erwähnten chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führt damit zu einer Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natütlichen Kohlenhydraten. Polyhydroxymethylen ist z. B. in Form von Fasern. Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln hersteÜDar, so daß je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form herstellbar ist.In addition to the chemical and thermal stability mentioned, the polyhydroxymethylene is characterized by advantageous processing properties and thus leads to a superiority over the so far as optimally found carrier matrices on the Based on natural carbohydrates. Polyhydroxymethylene is e.g. B. in the form of fibers. Threads, foils or spherical particles hersteÜDar, so that depending on the application of the to be bound Effector the most suitable form can be produced.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Größe der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug des Polyhydroxymethylens gegenüber den 1 rägermaterialien des Standes der Technik.Due to the controllable size for the binding of the effectors or the spacers accessible surface shows a further advantage of polyhydroxymethylene over the 1 carrier materials of the state of the art.

Nach den analogen Reaktionsmechanismen, wie sie für die Bindung des Effektors mit der Polyhydroxymethylen-Matrix beschrieben sind, lassen sich auch die Spacersubstanzen an die Matrix binden, wenn 7. B. die Spacer als eine der funktionellen Gruppen eine Aminogruppe tragen. Die Einführung eines Spacer·, bietet jedoch auch die Möglichkeit, für die Bindung des Effektors zusätzliche Reaktionsmöglichkeiten einzuführen. Im Falle, daß der an die Matrix gebundene Spacer eine freie Carboxylgruppe trägt, ist diese Carboxylgruppe beispielsweise durch Carbodiimid-Verbindungen aktivierbar, die sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des Effektors einzugehen vermag. Carboxylgruppen lassen feiner die Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten Isoxazoliumsalzer. zu.According to the reaction mechanisms analogous to those described for the binding of the effector to the polyhydroxymethylene matrix, the spacer substances can also be bound to the matrix if , for example, the spacers carry an amino group as one of the functional groups. The introduction of a spacer, however, also offers the possibility of introducing additional reaction possibilities for the binding of the effector. In the event that the spacer bound to the matrix carries a free carboxyl group, this carboxyl group can be activated, for example, by carbodiimide compounds, which are then able to form an amide bond with amino groups of the effector. Carboxyl groups allow the formation of amide bonds with the help of the isoxazolium salts introduced by Woodward. to.

Besitzt der an die Matrix gebundene Spacer eine verfügbare, freie Aminogruppe, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von /J-Hydroxyäthylsulfonen die Einführung von Arylaminogruppen in der Verlängerung des Spacers möglich, die sodann nach bekannter Methoden diazotiert und anschließend mit entsprechend reaktiven Gruppen des Effektors verbunden werden:If the spacer bound to the matrix has an available, free amino group, it is with arylamino groups containing vinyl sulfone derivatives or sulfuric acid esters of / I-Hydroxyäthylsulfonen the Introduction of arylamino groups in the extension of the spacer is possible, which then according to known Methods diazotized and then connected to appropriately reactive groups of the effector will:

OH „ O OHOH "O OH

/ \
O NH—(CH₂)_h-NH—CH₂-CH,-SO₂-/ \
O NH— (CH ₂ ) _h -NH — CH ₂ -CH, -SO ₂ -

V-NH,V-NH,

Die erfindungsgemäßen biologisch aktiven Verbindungen eignen sich I r die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für anojre an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmumg von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet. Wegen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen.The biologically active compounds according to the invention are suitable for most application methods, the previously for anojre to hydrophilic, water-insoluble Carrier-bound effectors have become known. It can therefore make enzymes insoluble in water be made. The insoluble enzymes are increasingly used to determine substrates in Automatic analyzers and used as so-called enzyme electrodes. Suitable because of the increased stability a number of carrier-bound enzymes for the implementation of technical enzymatic conversions.

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbenzien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren ais Pohextrakten hervor- >o ragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von anderen Antigenen erhalten werden. Affinitätschromatographisch können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und mich quantitativ bestimmt werden.Carrier-bound, biologically active substances have, because of their property as specific adsorbents found wide application in affinity chromatography. With the help of carrier-bound natural or synthetic enzyme inhibitors succeed in the high purification of enzymes, while the Enzymes as effectors, especially for the production of natural enzyme inhibitors as Po extracts were found to be extremely suitable. Carrier-bound water-insoluble antigens are used to isolate the associated antibodies are used, which in this way are free from other serum components and free from other antigens can be obtained. Antibodies which cannot be precipitated can also be used by affinity chromatography as well as those that cannot be precipitated because of their low concentration in the serum, isolated and me can be quantified.

In den zur Erläuterung der Erfindung nachstehend «> aufgeführten Beispielen ist aufgezeigt, daß ein nach einem einzigen Verfahren hergestellter Träger sich für die Bindung der verschiedensten Effektoren eignet, und daß der Grundkörper Polyhydrowmethylen durch geeignete Substitution zur Bindung jedes gewünschten ικ Effektors geeignet gemacht werden kann.In the explanation of the invention referred to as «> examples listed, it is indicated that an established by a single process carrier is suitable for binding of various effectors, and that the base body Polyhydrowmethylen can be made suitable by appropriate substitution for binding any desired ικ effector.

Ferner wird beispielhaft aufgezeigt, wie die matrixgehnndeneii IHektoren eingesetzt werden können.It is also shown by way of example how the matrix behavior Iectors can be used.

Beispiel 1
PolyhydiOxymethylen-Tetanustoxoid-Produktexample 1
PolyhydiOxymethylene Tetanus Toxoid Product

Herstellung der Matrix aus (ω-Amino-n-hexyl)-substituiertem PolyhydroxymethylenProduction of the matrix from (ω-amino-n-hexyl) -substituted Polyhydroxymethylene

20 g Polyhydroxymethylen, suspendiert in 900 ml Wasser, werden mit einer Lösung von 20 g BrCN in 50 ml Dimethylformamid versetzt und unter Rühren durch langsames Zutropfen von 2-n-Natronlauge bei einer lnnentemperatur von 15°C 6 Minuten lang bei einem pH-Wert von 11,5 gehalten. Dann wird sofort abgesaugt, gut mit Eiswasser ausgewaschen und abgepreßt. Das so aktivierte, noch wasserfeuchte Polyhydroxymethylen wird zu einer gut gerührten, bei Raumtemperatur gehaltenen, mit konc. HCl auf pH 8,5 eingestellten Lösung von 20 g Hexamethylendiamin in 500 ml H2O zugegeben mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllt, der pH-Wert ständig zwischen 8,5 und 9,0 einreguliert und noch 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird abgesaugt und gut mit Wasser ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (co-Amino-n-hexyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 1,9%. Mit Sangers Reagens zum Nachweis von primären freien Aminogruppen werden intensiv gelb gefärbte Produkte erhalten.20 g of polyhydroxymethylene suspended in 900 ml of water are mixed with a solution of 20 g of BrCN in 50 ml of dimethylformamide are added and 2N sodium hydroxide solution is slowly added dropwise while stirring an internal temperature of 15 ° C for 6 minutes at a pH of 11.5. Then immediately Sucked off, washed out well with ice water and pressed. The activated, still water-damp Polyhydroxymethylene is added to a well-stirred, kept at room temperature, with conc. HCl to pH 8.5 adjusted solution of 20 g of hexamethylenediamine in 500 ml of H2O added with water to a total volume filled up from 1 liter, the pH value constantly regulated between 8.5 and 9.0 and another 5 hours stirred for a long time at room temperature. Then it is suctioned off and washed out well with water. A dried one Sample of the one substituted with (co-amino-n-hexyl) groups Polyhydroxymethylene had a nitrogen content of 1.9%. With Sanger's reagent for the detection of primary free amino groups, intensely yellow colored products are obtained.

Herstellung des trägergebundenen Effektors
Effektor: Tetanus-AntigenManufacture of the carrier-bound effector
Effector: tetanus antigen

10 g des Trägers nach Beispiel 1 werden in 200 ml einer 0,5 M Natriumphosphatlösung von pH 10 suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 50°C erwärmt und mit 5 g i-Aminobenzol^-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäurehalbester versetzt. Nach Korrektur des pH-Wertes auf 10 mit 2 M NaOH wird der Ansatz eine Stunde bei 50⁰C gerührt. Anschließend wird über10 g of the carrier according to Example 1 are suspended in 200 ml of a 0.5 M sodium phosphate solution of pH 10. The suspension is heated to 50 ° C. with stirring and mixed with 5 g of i-aminobenzene ^ -ß-hydroxyethylsulfonosulfuric acid half-ester. After the pH value has been corrected to 10 with 2 M NaOH, the batch is ^{stirred at 50 °} C. for one hour. Then over

eine Nutsche abfiltriert und mit 2 1 Wasser, 2 L Aceton und 2 L 0,2 M HCl gewaschen. Zur Diazotierung der in das Polyhydroxymethylen eingeführten Arylamingruppen wird der Filterrückstand in 200 ml 0,2 M HCl suspendiert, auf 2⁰C abgekühlt und unter Rühren so s lange mit 1 M NsNCh-Lösung versetzt, bis mit KJ-Stärke -Papier ein geringer Nitritüberschuß festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrüc,'<stand mit 1 Liter einer wäßrigen 0.01 M Amidosulfonsäure von 2°C und anschließend mit 200 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 7.5 von 2°C gewaschen. Zur Kupplung wird das Diazoniumgruppen enthaltende Produkt in 150 ml einer Lösung von 2 g Tetanus-Toxoid mit 1260 Lf/mg N in 0.2 M Natriumphosphat pH 7,5 und 2°C suspendiert und 20 Stunden bei 5°C gerührt. Nicht gebundene Anteile des Toxoids werden mit 1 Liter 1 M NaCl-Lösung auf einer Nutsche ausgewaschen.filtered off a suction filter and washed with 2 liters of water, 2 liters of acetone and 2 liters of 0.2 M HCl. For diazotization of the imported into the polyhydroxymethylene arylamine the filter residue in 200 ml 0.2 M HCl is suspended, cooled to 2 ⁰ C and with stirring, so s long with 1 M NsNCh solution was added until with KI-starch -paper a slight excess of nitrite is to be determined. After 10 minutes, it is filtered off on a suction filter and the filter residue is washed with 1 liter of an aqueous 0.01 M sulfamic acid at 2 ° C. and then with 200 ml of 0.2 M sodium phosphate pH 7.5 at 2 ° C. For coupling, the product containing diazonium groups is suspended in 150 ml of a solution of 2 g tetanus toxoid with 1260 Lf / mg N in 0.2 M sodium phosphate pH 7.5 and 2 ° C. and stirred at 5 ° C. for 20 hours. Unbound parts of the toxoid are washed out with 1 liter of 1 M NaCl solution on a suction filter.

Anwendung des
Polyhydroxymethylen-Tcianustoxoid-ProduktcsApplication of the
Polyhydroxymethylene Tcianus Toxoid Productscs

Gewinnung von Tetanus-AntitoxinObtaining Tetanus Antitoxin

10 g des Produktes nach Beispiel 1 werden in 150 ml 0.15 M NaCl-Lösung mit einem Zusatz von M/15 Natriumphosphat, (»PBS«) pH 7.2 suspendiert und in eine Säule von 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe überführt. 20 ml Tetanus-Pferdeserum mit 1650IE Tetanus-Antitoxin/ml werden auf die Säule aufgetragen, die anschließend mit 500 ml PBS pH 7.2 gewaschen wird. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 0.5 M Glycin/HCl-Puffer pH 2,5. Das Eluat enthält nach Neutralisation mit 2 M NaOH und nachfolgendem Zentrifugieren insgesamt 240 mg Protein und. wie in einem Schutzversuch an Mäusen ermittelt wird. 12 300 IETetanus-Antitoxin.10 g of the product according to Example 1 are dissolved in 150 ml of 0.15 M NaCl solution with an addition of M / 15 Sodium phosphate, ("PBS") pH 7.2 suspended and placed in a column 3 cm in diameter and 10 cm in height convicted. 20 ml of tetanus horse serum with 1650 IU tetanus antitoxin / ml are applied to the column, which is then washed with 500 ml of PBS pH 7.2. The antibodies are eluted with 0.5 M. Glycine / HCl buffer pH 2.5. The eluate contains after Neutralization with 2 M NaOH and subsequent centrifugation a total of 240 mg protein and. as in a protection experiment on mice is determined. 12 300 IETetanus antitoxin.

Beispiel 2
Polyhydroxymethyien-Aminobenzamidin-ProduktExample 2
Polyhydroxymethylene Aminobenzamidine Product

Herstellung der Matrix ausMaking the matrix from

((»-Carboxy-n-pentyO-substit.iicrtcm((»-Carboxy-n-pentyO-substit.iicrtcm

PolyhydroxymethylenPolyhydroxymethylene

4040

20 g Polyhydroxymethylen. nach Beispiel 1 mit BrCN aktiv isicrt. wird zu einer mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,5 eingestellten und auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllten, wäßrigen Lösung von 25 g ε-Aminocapronsäure gegeben. Es wird nach 5 Stunden bei Raumtemperatur und pH 8.5 gerührt und abgesaugt und mit Wasser gut ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (ü)-Carboxy-n-pentyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 0.86%. 20 g polyhydroxymethylene. isicrt active according to example 1 with BrCN. is added to an aqueous solution of 25 g of ε-aminocaproic acid adjusted to pH 8.5 with dilute sodium hydroxide solution and made up to a total volume of 1 liter. After 5 hours at room temperature and pH 8.5, it is stirred and filtered off with suction and washed out well with water. A dried sample of the polyhydroxymethylene substituted with (ü) -carboxy-n-pentyl) groups had a nitrogen content of 0.86%.

Herstellung des trägergebundenen EffektorsManufacture of the carrier-bound effector Effektor: AminobenzamidinEffector: aminobenzamidine

2 g eines Polyhydroxymethylenderivats. hergestellt nach Beispiel Z werden in 25 ml 0.1 M Morpholino- äthansulfonsäure suspendiert und mit 1 g l-Athyl-3-(3-dimethylaminopropyi)-carbodiimid · HCl versetzt Durch Zugabe von 2 M HCl unter pH-Kontrolle wird der pH-Wert auf 4.8 eingestellt Unter Rühren wird dem Ansatz 1 g m-Aminobenzamidin zugesetzt Die Suspension wird unter pH-Korrektur 1 Stunde gerührt und das Adsorbens anschließend in eine Chromatographie-Säule mit 1 cm Durchmesser überführt Das Adsorbens wird mit 200 ml 0.05 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer pH 8,0 mit einem Zusatz von 0,5 M KCl (Tris-KCI) gespült 2 g of a polyhydroxymethylene derivative. prepared according to Example Z are suspended in 25 ml of 0.1 M morpholinoethanesulphonic acid and treated with 1 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyi) -carbodiimide · HCl. The pH is increased by adding 2 M HCl under pH control 4.8 set While stirring, 1 g of m-aminobenzamidine is added to the batch. The suspension is stirred for 1 hour with pH correction and the adsorbent is then transferred to a chromatography column with a diameter of 1 cm. The adsorbent is mixed with 200 ml of 0.05 M trishydroxymethylaminomethane HCl buffer pH 8.0 rinsed with an addition of 0.5 M KCl (Tris-KCl)

Anwendung des
Polyhydroxymethylen-Aminobenzamidin-ProduktsApplication of the
Polyhydroxymethylene aminobenzamidine product

Gewinnung von ThrombinObtaining thrombin

100 mg Roh-Thrombin vom Rind werden in 5 ml 0,05 M Tris, 0,5 M KCI pH 8,0 gelöst und auf die wie oben präparierte Säule aufgetragen. Die Säule wird anschließend mit 200 ml Tris-KCl-Puffer gespült. Das an das unlöslich gemachte m-Aminobenzamidin gebundene Thrombin wird von diesem mit 100 ml einer Lösung von 0.05 M m-Aminobenzamidin in Tris-KCI-Puffci abgespalten.100 mg of crude bovine thrombin are dissolved in 5 ml of 0.05 M Tris, 0.5 M KCI pH 8.0 and adjusted to the like applied column prepared above. The column is then rinsed with 200 ml of Tris-KCl buffer. That on the insolubilized m-aminobenzamidine bound thrombin is from this with 100 ml of a solution cleaved from 0.05 M m-aminobenzamidine in Tris-KCI-Puffci.

Die Protein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und über eine 1 χ 30 cm Säule mit mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran mit einem Fraktionierungsbereich für lineare und globuläre Moleküle von Molekulargewichten zwischen 100 und 5000 in Tris-KCl-Puffer laufen lassen. In dem ersten, das Protein enthaltenden Peak des Säuleneluates konnten durch Bestimmen der Aktivität nach Chase und S h a w . Biochem. 8, 1969. s. 2212. 78% der Ausgangsaktivität gefunden werden.The protein-containing fractions are combined and passed through a 1 × 30 cm column with Epichlorohydrin cross-linked dextran with a fractionation range for linear and globular molecules of Run molecular weights between 100 and 5000 in Tris-KCl buffer. In the first, the protein containing peak of the column eluate could be determined by determining the activity according to Chase and S h a w. Biochem. 8, 1969. pp. 2212. 78% of the initial activity is found.

Beispiel 3
Polyhydroxymethylen-Pepsin-ProduktExample 3
Polyhydroxymethylene pepsin product

8.0 g aus Dimethylformamid/Methanol umgefälltes Polyvinylencarbonat, hergestellt nach N. D. Field. ]. R. Scha ef gen, J. Polymer Sei., Vol. 58, p. 543 (1962). wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 7,5 g Hexamethylendiamin in 180 ml Methanol suspendiert und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt, mit Methanol ausgewaschen und in einer Lösung von 10 g Natriummethylat in 300 ml 96%igem Methanoi8.0 g of polyvinylene carbonate reprecipitated from dimethylformamide / methanol, manufactured according to N.D. Field. ]. R. Scha ef gen, J. Polymer Sci., Vol. 58, p. 543 (1962). is at room temperature in a solution of 7.5 g Hexamethylenediamine suspended in 180 ml of methanol and stirred for 48 hours at room temperature, filtered off with suction, Washed out with methanol and in a solution of 10 g of sodium methylate in 300 ml of 96% methanoi

4 Tage bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des über einen Spacer von 6 CH2-Gruppen mit primären Aminogruppen substituierten Polyhydroxymethylen-Adsorbens hatte einen Stickstoffgehalt von 5,7%.Suspended for 4 days at room temperature, washed out with methanol and then very intensively with water. One dried sample of the one substituted with primary amino groups via a spacer of 6 CH2 groups Polyhydroxymethylene adsorbent had a nitrogen content of 5.7%.

Herstellung des trägergebundenen Effektors
Effektor: PepsinManufacture of the carrier-bound effector
Effector: pepsin

20 g (co-Amino-n-hexyl)-substituiertes Polyhydroxymethylen. hergestellt nach Beispiel 3. werden in 400 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 10 suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 40 ml einer 25%igen Glutardialdehydlösung zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 4 Liter 0.2 M Natriumazetatpuffer pH 4,0 gewaschen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt in 500 ml einer Lösung vor 20 g (co-amino-n-hexyl) -substituted polyhydroxymethylene. prepared according to Example 3 are suspended in 400 ml of 0.2 M sodium phosphate pH 10. 40 ml of a 25% strength glutaraldehyde solution are added to the suspension with stirring. After stirring for 2 hours at room temperature, it is filtered off through a suction filter and the filter residue is washed with 4 liters of 0.2 M sodium acetate buffer pH 4.0. The reaction product is then prepared in 500 ml of a solution

5 g Pepsin mit insgesamt 500 000 Einheiten, bestimmi nach A η s ο η. in 0,2 M Natriumazetat pH 4,0 gegeber und 15 Stunden bei 6° C gerührt Das danach erhaltene Produkt wird auf einer Nutsche mit 5 Liter 0.1 M Natriumazetat/Essigsäure pH 4,0 und einem Zusatz vor 1 M NaCl ausgewaschen.5 g of pepsin with a total of 500,000 units, determi after A η s ο η. in 0.2 M sodium acetate pH 4.0 given and stirred for 15 hours at 6 ° C. The product obtained thereafter is on a suction filter with 5 liters of 0.1 M Sodium acetate / acetic acid pH 4.0 and an additive Washed out 1 M NaCl.

Anwendung des Pv lyhydroxymethylen-Pepsin-ProduktesApplication of the Pv lyhydroxymethylene pepsin product

Proteolytische Spaltung von ImmunglobinenProteolytic cleavage of immunoglobins

Das Adsorbens nach vorliegendem Beispiel wird ii 0.1 M Acetatpuffer pH 4.0 suspendiert und davon ein<The adsorbent according to the present example is suspended in 0.1 M acetate buffer pH 4.0 and a <

Aktivitätsbestimmumg nach Ans on durchgeführt. Die Suspension enthält insgesamt 21 000 Einheiten Pepsin in gebundener und mit diesem Test nachweisbarer Form. Zur proteolytischen Spaltung von Human-Immunglobulin G wird das Pepsin-Adsorbens abfiltriert und der Rückstand in einer 2,5%igen Lösung von 30 g Human IgG in physiologischer NaCl-Lösung pH 4,1 suspendiert. Der Spaltansatz wird 24 Stunden bei 37⁰C gerührt. Nach Abfiltrieren des trägergebundenen Pepsins wird das Filtrat mit 1250 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Das dabei entstehende Präzipitat wird abzentrifugiert; es enthält das F(ab)rFragment des Immunglobulins mit dessen Antikörperaktivität. Der Abguß wird verworfen.Activity determination carried out according to Ans on. The suspension contains a total of 21,000 units of pepsin in bound form that can be detected with this test. For the proteolytic cleavage of human immunoglobulin G, the pepsin adsorbent is filtered off and the residue is suspended in a 2.5% solution of 30 g of human IgG in physiological NaCl solution pH 4.1. The cleavage mixture is stirred for 24 hours at 37 ⁰ C. After the carrier-bound pepsin has been filtered off, 1250 ml of saturated ammonium sulfate solution are added to the filtrate. The resulting precipitate is centrifuged off; it contains the F (ab) r fragment of the immunoglobulin with its antibody activity. The cast is discarded.

Example 4

Herstellung des
Polyhydroxymethylen-Oxaminsäure-ProduktesManufacture of the
Polyhydroxymethylene oxamic acid product

10 g Polyhydroxymethylen werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit BrCN aktiviert und mit 5 g Tyramin. gelöst in 150 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat. bei 5"C durch 60 Minuten langes Rühren umgesetzt. Die nicht gebundenen Anteile des Tyramins werden auf einer Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter 0.1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und 5"C ausgewaschen. Der Filterrückstand wird in 150 ml einer auf 5°C abgekühlten Lösung von 1.0 g diazotierter p-Aminophenyloxaminsäure suspendiert und 15 Stunden bei 5⁰C gerührt. Das Adsorbens wird auf einer Nutsche mit 1 Liter 0,05 M Natriumacetat-Essigsäure-Puffer pH 5,5 mit einem Zusatz von 2 mM CaCI₂ und 0,2 mM EDTA gewaschen.10 g of polyhydroxymethylene are activated with BrCN as described in Example 1 and with 5 g of tyramine. dissolved in 150 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate. at 5 "C by stirring for 60 minutes. The unbound fractions of the tyramine are filtered off on a suction filter and the filter residue is washed out with 1 liter of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 and 5" C. The filter residue is dissolved in 150 ml of a cooled 5 ° C solution of 1.0 g diazotized p-Aminophenyloxaminsäure and stirred for 15 hours at 5 ⁰ C. The adsorbent is washed on a suction filter with 1 liter of 0.05 M sodium acetate-acetic acid buffer pH 5.5 with an addition of 2 mM CaCl ₂ and 0.2 mM EDTA.

Anwendung des
Polyhydroxy methylen-Oxaminsäure-ProduktesApplication of the
Polyhydroxy methylene oxamic acid product

Gewinnung von NeuraminidaseObtaining Neuraminidase

Das Adsorbens nach Beispiel 4 wird im oben genannten Acetatpuffer resuspendiert und in eine Chromatographie-Säule von 2 cm Durchmesser überführt. Durch diese Säule wird 1 Liter eines Kulturfiltrates von Vibrio Cholerae mit 800 IE Neuraminidase/ml geleitet, das vorher mit 2 M Essigsäure auf pH 5.5 eingestellt und das mit CaCb und EDTA bis zu einer Konzentration von 2 mM bzw. 0,2 mM versetzt worden war. Die nicht gebundenen Proteine werden mit 500 ml Acetatpuffer ausgewaschen.The adsorbent according to Example 4 is resuspended in the above-mentioned acetate buffer and transferred to a Chromatography column of 2 cm diameter transferred. 1 liter of a culture filtrate is passed through this column passed by Vibrio Cholerae with 800 IU neuraminidase / ml, which was previously adjusted to pH 5.5 with 2 M acetic acid set and this was mixed with CaCb and EDTA up to a concentration of 2 mM and 0.2 mM, respectively was. The unbound proteins are washed out with 500 ml acetate buffer.

Die Elution der an der trägergebundenen Inhibitor adsorbierten Neuraminidase erfolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Sammeln der aktive Neuraminidase enthaltenden Fraktionen. Sie enthalten 86% der eingesetzten Aktivität. The neuraminidase adsorbed on the carrier-bound inhibitor is eluted by washing the column with 0.1 M sodium hydrogen carbonate solution and collecting the fractions containing active neuraminidase. They contain 86% of the activity used.

Beispiel 5Example 5

Herstellung des Polyhydroxymethylen-Trypsin-ProduktesManufacture of the Polyhydroxymethylene trypsin product

10 g Polyfliydroxymethyien), suspendiert in 200 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonat-Natriumcarbonat-Lösung pH 11. werden bei 5°C unter Rühren mit einer Lösung von 5 g Bromcyan in 10 ml Dimethylformamid versetzt Unter weiterem Rühren wird der pH-Wert der Suspension durch Zugabe von 4 M Natronlauge 15 Minuten auf pH 11 gehalten. Anschließend wird das Polyihydroxymethylen) über eine Glasfritte abfiltriert und der Filterrückstand mit 500 ml 0,1 M Natriumchloridlösung von 5°C gewaschen. Der Filterrückstand wird dann in 100 ml einer Lösung von 500 mg Trypsin vom Rind, mit insgesamt 1000 Einheiten, in 0,1 M Natriumchlorid und einem Zusatz von 0,01 M Calciumchlorid s suspendiert. Nach 15stündigem Rühren bei 5⁰C wird über eine Glasfritte abfiltriert, der Rückstand zuerst mit 500 ml 0,5 M Natriumchloridlösung, dann mit 500 ml 0,1 M Tris(hydroxymethyl)amino-methan-HCl pH 8,0 + 0,01 M Calciumchlorid gewaschen. 10 g of polyhydroxymethylene), suspended in 200 ml of 0.1 M sodium hydrogen carbonate-sodium carbonate solution pH 11, a solution of 5 g of cyanogen bromide in 10 ml of dimethylformamide is added at 5 ° C. with stirring maintained at pH 11 for 15 minutes by adding 4 M sodium hydroxide solution. The polyhydroxymethylene is then filtered off through a glass frit and the filter residue is washed with 500 ml of 0.1 M sodium chloride solution at 5 ° C. The filter residue is then suspended in 100 ml of a solution of 500 mg bovine trypsin, with a total of 1000 units, in 0.1 M sodium chloride and an addition of 0.01 M calcium chloride. After stirring for 15 hours at 5 ⁰ C, the residue first with 500 ml of 0.5 M sodium chloride solution and then with 500 ml of 0.1 M Tris (hydroxymethyl) amino-methane-HCl pH 8.0 + 0.01 is filtered off over a glass frit, M calcium chloride washed.

ίο In den vereinigten Waschflüssigkeiten konnten noch 4 Prozent der eingesetzten Trypsin-Aktivität nachgewiesen werden.ίο In the combined washing liquids could still 4 percent of the trypsin activity used can be detected.

Bei Anwendung des niedermolekularen Substrates rv-N-benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid konnten 78 Pro-/.ent, bei Anwendung des hochmolekularen Substrates Casein 28 Prozent der eingesetzten Trypsin-Aktivität an das Adsorbens gebunden wiedergefunden werden.When using the low molecular weight substrate rv-N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide, 78 Pro - /. Ent, when using the high-molecular substrate casein, 28 percent of the trypsin activity used be found bound to the adsorbent.

Example 6

:o a) Umsetzung von Poly(hydroxymethylen) mit Epichlorhydrin: 50 g Poly(hydroxymethylen) werden in 1 1 2-n-NaOH suspendiert, mit 250 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 Stunden bei 55-60⁰C gerührt. Der pH-Wert der Suspension sinkt nach kurzer Zeit auf: oa) reacting poly (hydroxymethylene) with epichlorohydrin: 50 g poly (hydroxymethylene) are suspended in 1 1 of 2-n-NaOH, 250 ml of epichlorohydrin and stirred for 2 hours at 55-60 ⁰ C. The pH of the suspension drops after a short time

as 10-11. Durch Zugabe von NaOH wird noch 1 Std.as 10-11. By adding NaOH, another 1 hour

dieser pH-Wert gehalten. Nach 2 Std. Reaktionszeit wird der Feststoff abgesaugt, mit Wasser, Aceton und zum Schluß wieder mit Wasser gewaschen.this pH was maintained. After a reaction time of 2 hours, the solid is filtered off with suction, with water, acetone and finally washed again with water.

b) 50 g Hexamethylendiamin werden in 1.5 1 Wasser gelöst und mit HCl bis pH 10 versetzt. Zu der Lösung wird das unter 6a) aktivierte Poly(hydroxymethylen) gegeben und bei 50-55⁰C 6 Std. gerührt. Danach wird das Produkt abgesaugt und mit Wasser frei von Hexamethylendiamin gewaschen.b) 50 g of hexamethylenediamine are dissolved in 1.5 1 of water and mixed with HCl to pH 10. Under 6a) activated poly (hydroxymethylene) is added to the solution and at 50-55 ⁰ C for 6 h. Stirred. The product is then filtered off with suction and washed free of hexamethylenediamine with water.

c) Das unter Beispiel 6b) erhaltene Produkt wird mit 50 g i-Aminobenzol-4-fMiydroxyäthylsulfonschwefelsäureester bei 55°C und pH 10 eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Feststoff abfiltriert, mit Wasser. Aceton und wieder mit Wasser gewaschen.c) The product obtained under Example 6b) is treated with 50 g of i-aminobenzene-4-hydroxyethylsulfonic acid ester stirred at 55 ° C and pH 10 for one hour. The solid is then filtered off with water. Acetone and washed again with water.

d) 10 g des unter 6c) erhaltenen Produktes werden auf einer Nutsche mit 200 ml 0,1 η HCl gewaschen und danach in 300 ml 0,5 η HCI suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren mit 0,1 η NaNO₂-Lösung bei 0-4⁰C versetzt, bis bei der Diazotierung mit KJ-Stärkepapierd) 10 g of the product obtained under 6c) are washed on a suction filter with 200 ml of 0.1 η HCl and then suspended in 300 ml of 0.5 η HCl. The suspension is heated under stirring with 0.1 η NaNO ₂ solution at 0-4 ⁰ C. was added until in the diazotization with KI-starch paper

4s ein geringer Nitrit-Überschuß festzustellen ist. Nach 10 Min. wird über eine Nutsche abfiltriert und der Rückstand mit Eiswasscr und anschließend mit 0,15 M 4s a slight excess of nitrite can be determined. After 10 min. Is filtered off over a suction filter and the residue Eiswasscr and then treated with 0.15 M

Natriumphosphat-Puffer pH 7,5 von 0-4° gewaschen.Sodium phosphate buffer pH 7.5 washed from 0-4 °.

e) 0.75 g Albumin werden in 250 ml Phosphatpuffere) 0.75 g of albumin are dissolved in 250 ml of phosphate buffer

pH 7.5 gelöst, auf 4°C abgekühlt und das unter 6d) hergestellte Produkt zugegeben. Die Suspension wird 20 Stunden bei 4° C gerührt, danach abfiltriert und der Feststoff mit 1 M NaCl und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (wäßrige 0,9%ige NaCl-Lösung Dissolved pH 7.5, cooled to 4 ° C. and added the product prepared under 6d). The suspension is stirred for 20 hours at 4 ° C., then filtered off and the solid is washed with 1 M NaCl and phosphate-buffered saline (PBS) (aqueous 0.9% NaCl solution

mit einem Gehalt an 1/15MoI Na₂HPO«-KH₂PO₄-Puffer vom pH 7,2) gewaschen.with a content of 1/15 mol Na ₂ HPO «-KH ₂ PO ₄ buffer of pH 7.2).

Filtrat und Waschlaugen werden nach der Methode der radialen Immundiffusion auf Albumin untersucht Es werden 75 mg Albumin an 1 g des so hergestelltenThe filtrate and wash liquors are examined for albumin using the radial immunodiffusion method 75 mg of albumin are added to 1 g of the produced in this way

Trägers gebunden.Carrier tied.

0 2.4 g IgM werden in 250 ml Phosphatpuffer pH 7.5 gelöst und auf 4° C abgekühlt 10 g des nach 6d) diazotierten Produktes werden zugegeben und die Suspension 20 Std bei 4° C gerührt Nach Filtration wird0 2.4 g IgM are dissolved in 250 ml phosphate buffer pH 7.5 dissolved and cooled to 4 ° C. 10 g of the product diazotized according to 6d) are added and the The suspension is stirred at 4 ° C. for 20 hours. After filtration, the mixture is stirred

der Feststoff mit l M NaCl-Lösung und mit PBS gewascheathe solid was washed with 1 M NaCl solution and with PBS a

1 g des nach 6f) hergestellten Trägers binden 240 mg IgM.1 g of the carrier prepared according to 6f) binds 240 mg of IgM.

Example 7

a) 10 g Poly(hydroxymethyicn) werden wie in Beispiel 6a) und 6b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und s aufgearbeitet.a) 10 g of poly (hydroxymethyicn) are as in example 6a) and 6b) described activated with epichlorohydrin, reacted with hexamethylenediamine and s worked up.

b) 10 g des so hergestellten Trägers werden bei 10⁰C und PH 6 mit 5 g Bernsteinsäureanhydrid, die in 200 ml Wasser suspendiert sind, 4 Std. succinoyliert. Der pH-Wert wird mit 2-n-NaOH einreguliert. Nach der Waschung des Feststoffes mit Wasser wird das Produkt mit 2,5 g N-Cyclohexyl-N'-(-[N-methylmorpholino]-äthyl)-carbodiimid-p-toluol-suifonat bei pH 5 und 5°C 30 Min. gerührt, abfiltriert und schnell mit Eiswasser gewaschen.b) 10 g of the carrier produced in this way are ^{succinoylated for 4 hours at 10 °} C. and pH 6 with 5 g of succinic anhydride suspended in 200 ml of water. The pH is regulated with 2N NaOH. After washing the solid with water, the product is treated with 2.5 g of N-cyclohexyl-N '- (- [N-methylmorpholino] ethyl) -carbodiimide-p-toluene sulfonate at pH 5 and 5 ° C. for 30 min. stirred, filtered off and washed quickly with ice water.

c) 1 g IgG wird in 250 ml Phosphat-Puffer pH 7,5 gelöst und mit dem unter 6f) hergestellten Träger 24 Stunden bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.c) 1 g of IgG is dissolved in 250 ml of phosphate buffer pH 7.5 and mixed with the carrier prepared under 6f) Stirred at 4 ° C. for 24 hours. After filtration it becomes Product washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

An 1 g des Trägers werden 85 mg Ig kovalent gebunden.85 mg Ig are covalently bound to 1 g of the carrier.

Example 8

a) 20 g des unter 6a) hergestellten Produktes werden mit 20 g Aminocapronsäure bei pH 10 und 50-55⁰C 6 Std. gerührt. Danach wird es abgesaugt und mit Wasser gewaschen.a) 20 g of the product prepared under 6a) are stirred with 20 g of aminocaproic acid at pH 10 and 50-55 ⁰ C for 6 h.. Then it is suctioned off and washed with water.

b) 10 g des unter 7a) hergestellten Produktes werden mit 1,5 g N-Cyclohexyl-N'-(N-methylmorpholino)-äthyl)-carbodiimid-p-toluol-sulfonat versetzt und dazu nach 5 Min. 2 g N-Hydroxysuccinimid bei pH 5 zugegeben. Nach 5 Std. Rühren bei 24°C wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser gewaschen.b) 10 g of the product prepared under 7a) are mixed with 1.5 g of N-cyclohexyl-N '- (N-methylmorpholino) -ethyl) -carbodiimide-p-toluene sulfonate and after 5 minutes 2 g of N-hydroxysuccinimide at pH 5 are added. After 5 hours of stirring at 24 ° C, the Filtered off solid and washed with water.

c) 0,5 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Pufferc) 0.5 g of albumin are dissolved in 200 ml of phosphate buffer

gelöst und mit dem unter 7b) hergestellten aktivierten Träger 24 Std. bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.dissolved and stirred with the activated carrier prepared under 7b) for 24 hours at 4 ° C. After filtration it becomes Product washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

An 1 g des Trägers werden 50 mg Albumin kovalent gebunden.50 mg of albumin are covalently bound to 1 g of the carrier.

Example 9

10 g Poly(hydroxymethylcn) werden wie in Beispiel 6a) b) beschrieben mit Epichlorhydrin aktiviert, mit Hexamethylendiamin umgesetzt und aufgearbeitet.10 g of poly (hydroxymethylcn) are activated with epichlorohydrin as described in Example 6a) b), with Hexamethylenediamine reacted and worked up.

a) 10 g des so hergestellten Trägers werden in 100 ml Wasser suspendiert und mit 500 ml 25%igem Glutardialdehyd umgesetzt. Nach 1 Std. Rühren wird der Feststoff abfiltriert und mit Wasser bzw. PBS gewaschen. a) 10 g of the carrier produced in this way are in 100 ml Suspended water and reacted with 500 ml of 25% glutaraldehyde. After stirring for 1 hour, the The solid is filtered off and washed with water or PBS.

b) 95 g Albumin werden in 200 ml Phosphat-Puffer gelöst und mit dem unter 8a) hergestellten Träger 20 Std. bei 4°C gerührt. Nach Filtration wird das Produkt mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.b) 95 g of albumin are dissolved in 200 ml of phosphate buffer and combined with the carrier prepared under 8a) Stirred at 4 ° C. for 20 hours. After filtration, the product is washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

Beispiel 10Example 10

Direkte Umsetzung von mit Epichlorhydrin
aktiviertem Poly(hydroxymethylen) mit AlbuminDirect implementation of with epichlorohydrin
activated poly (hydroxymethylene) with albumin

a) 10 g Poly(hydroxymethylen) werden mit 50 ml Epichlorhydrin wie in Beispiel 6a) beschrieben aktiviert. Nach Filtration wird das Produkt schnell mit Wasser. Aceton, Wasser und zum Schluß mit PBS gewaschen.a) 10 g of poly (hydroxymethylene) are mixed with 50 ml Epichlorohydrin activated as described in Example 6a). After filtration, the product is quickly washed up with water. Acetone, water and finally washed with PBS.

b) 0,5 g Albumin werden in 200 ml PBS gelöst und mit dem unter 9a) hergestellten Produkt 60 Std. bei 4° C gerührt. Nach Filtration wird das trägergebundene Protein mit 1 M Kochsalz und mit PBS gewaschen.b) 0.5 g of albumin are dissolved in 200 ml of PBS and mixed with the product prepared under 9a) for 60 hours at 4 ° C touched. After filtration, the carrier-bound protein is washed with 1 M sodium chloride and with PBS.

1 g des so hergestellten Trägers binden 45 mg Albumin.1 g of the carrier produced in this way binds 45 mg of albumin.

Claims

Patent claims:

1. Biologically active water-insoluble product, characterized by a water-insoluble poly (hydroxymethylene) to which a biologically active substance is covalently bound, directly or via one or more bifunctional organic compounds, while maintaining its biological activity. ^

2. A method for producing a biologically active water-insoluble product according to claim 1, characterized in that

A) that one poly (hydroxymethylene) covalently directly or via one or more bifunctional ■ * binds organic compounds to a biologically active substance, or

B) that poly (vinylene carbonate) is reacted with a biologically active substance and the remaining cyclocarbonate groups hydrolyzed, or

C) that you poly (vinylene carbonate) with a