DE2421789A1 - Biologisch aktive verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

BEHRINGiWERKS" AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)

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Aktenzeichen: ^Hoe 74/b ^f0D8 - Ma 187

Dr. Li/Fo

Datum: 29. April 1974

Biologisch aktive Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen von biologisch aktiven Substanzen und wasserunlöslichen hochmolekularen Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung bei der Affinitätschromatographie.

In den letzten Jahren hat sich eine neue Technik innerhalb der biochemischen Arbeitsmethoden mehr und mehr durchgesetzt, deren primäres/Merkmal darin besteht, die Affinität von trägergebun-denen,- biologisch aktiven Substanzen zu selektiv durchzuführenden Reaktionen einzusetzen.

Über eine spezifische Komplexbildung der trägergebundenen Substanz mit einer zweiten, die in einem Gemisch vorliegt, kann die betreffende Substanz aus dem Gemisch entfernt und gegebenenfalls anschliessend durch Desorption isoliert werden.

Trägergebundene Enzyme bieten den Vorteil, StoffUmwandlungen in präparativen, kontinuierlichen Prozessen durchzuführen und die Reaktionsprodukte enzyinfrei zu erhalten.

In der biochemischen, enzymatisehen Analytik stehen wasserunlösliche Enzyme als mehrfach verwendbare Reagenzien zur Verfugung.

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₀ ■ Ha IB?

Aufgrund der Eigenschaft der Enzyme, Affinitäten nicht nur gegenüber den Substraten, sondern auch gegenüber den spezifischen Inhibitoren aufzuweisen, hat sich die Gewinnung von Enzyminhibitoren mit Hilfe der Äffinitätschromatographie an trägergebundenen Enzymen besonders günstig erwiesen. Andererseits erlaubt die Bindung von Inhibitoren an wasserunlösliche Matrizen die präparative Gewinnung der entsprechenden Enzyme. - · . .

Als sogenannte Immunadsorbentien werden Antigene oder Antikörper an wasserunlösliche Matrizen gebunden und erlauben danach die Isolierung der korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene.

Als biologisch aktive Substanzen werden entsprechend den vorhergehenden Ausführungen in vivo und in vitro wirksame natürliche und künstlich hergestellte Stoffe verstanden, die im weitesten Sinne als Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine und Hormone bezeichnet werden können. Diese biologisch aktiven Substanzen können, da sie die Wirkprinzipien der wasserunlöslichen Systeme darstellen, Effektoren genannt werden.

Die meisten der bisher beschriebenen trägergebundenen Effektoren sind wesentlich stabiler als die entsprechenden Substanzen in Lösung.

Als Trägermaterialien, sogenannte Matrizen, sind vorteilhaft nur solche Stoffe einzusetzen, die neben der Unlöslichkeit in wäßrigen Systemen eine möglichst niedrige unspezifische Adsorption aufweisen. Dazu müssen hydrophobe, hydrophile und ionische Wechselwirkungen zwischen Matrize und dem Reaktionspartner des Effektors weitgehend unterbunden werden. Mit Substanzen, die kein Reaktionspartner des Effektors sind, sollte eine Bindung ausgeschlossen sein.

Die bislang verwendeten Matrizen als Träger für biologisch aktive Substanzen können unterteilt werden in diejenigen, die die Effektoren durch physikalische Adsorption binden, dazu gehören Aktivkohle und Glasperlen, und diejenigen, die mit den Effektoren über eine kovalente Bindung mit einander verknüpft sind. Die Letztge-

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·· . - 3 - · Ma

nannten schließen Vinylpolymeren, z.B. Polyacrylsäuren, PoIyacrylsäureamide und Amino-, Carboxy- oder SuIfonyl-substituiertes Polystyrol, ferner die Zellulose und ihre Abkömmlinge und ; schließlich na-türliche und synthetische Polypeptide und Proteine ein, Wogen der ausgeglichenen Wechsel*/irkung zwischen Matrize und Effektor hat die Verwendung von Kohlenhydraten, insbesondere

'der Zellulose, des Dextrans, der Stärke, des Agars bzw. deren Abkömmlinge, als Matrize in -wäßrigen Systemen die höchste Verbreitung gefunden, wenn auch die in diesen Naturstoffen häufig enthaltenen Carboxylgruppen wegen ihrer unspezifischen Reaktion als störend empfunden werden. Daneben weisen diese Stoffe eine relativ gex-inge thermische und chemische Stabilität auf,

.1Ss wurde nun gefunden; daß die Nachteile, die die Kohlenhydratderivate als Matrizen bei äffinitätsabhängigen Reaktionen aufweisen, üb er wunde ix werden können, -wenn als Matrize Polyhydroxy« methylen ν er -w endet, wird,, _ " Gegenstand der Erfindung sind demnach biologisch aktive Verbindungen, gekennzeichnet durch ein wasserunlösliches Poly— (hydroxyme thy Ilen), an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität gebunden ist. In diesen Verbindungen .

a) ist die Trägermatrix Polyhydroxymethylen,

b) sind die biologisch aktiven Substanzen Stoffe,. Enzyme, Aktivatoren, Inhibitoren, Antigene oder Antikörper, Vitamine oder Hormone oder synthetisch hergestellte Effektoren, .

c) sind Polyhydroxymethylen und die biologisch aktiven Substanzen kovalent miteinander direkt oder über eine Zwischenverbindung verknüpft.

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Polyhydroxymethylen ist ein synthetisches Polymeres mit einer durchgehenden Kohlenstoff-Kette, Jedes Kohlenstoffatom ti-ägt ein Wasserstoffatom und eine Hydroxylgruppe. Seine Herstellung und seine Eigenschaften sind unter anderem beschrieben von N.D. Field, J.R. Schaefgen, J.Polymer Sei., Vol. 58, 533-543 (1962) und G. Sinets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., Vol. 29, 257-274 (1958). Es ist durch basische, oder saure Hydrolyse aus Polyvinylencarbonat herstellbar. Im weiteren Sinne ist das Polyhydroxymethylen als Derivat des Polyvinylencarbonats aufzufassen. Die Bindung der Effektoren an das Polyhydroxymethylen kann einerseits durch die Maßnahme erreicht werden, die bei der kovalenten Verknüpfung der Effektoren mit der Hydroxylgruppe zum Einsatz kommen, andererseits durch Umsetzung des Polyvinylencarbonats über die ebenfalls bekannte aniinolytische Reaktion eines Zyklocarbonatringes des Polyvinylencarbonats mit-einem primären Amin, z.B. mit Hexamethylendiamin, zu einem über eine Urethanbindung mit einem Spacer oder Effektor substituierten Polyvinylencarbonat, dessen restliche Zyklocarbonatgruppen anschliessend zu Hydroxylgruppen verseift werden:

-CH—CH

Il
0

+ R-

CH

H-

— CH

OH 0

C = O

Verseifung

n-1 ·

NH R

Polyvinylencarbonat

CII- CH - CH- CH

H OH

OH O I

_Λ C = O n-1 ,

NH I R

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Es "ist für die Anwendung der Produkte besonders vorteilhaft, die biologisch aktiven Effektoren nicht direkt mit dem Polyhydroxymethylon umzusetzen, sondern über ein in der Äffinitätschromatographie als Arm oder wie im englischen Schrifttum als "Spacer" bezeichnetes Zwischenglied an die Matrix kovalent zu· binden.

.Die Spacer-Substanzen sind meist Kohlenwasserstoffe der Längo um 1-2 nm. Zwei funktioneile Endgruppen des Spacers erlauben je~ veils die Umsetzung sowohl mit der Matrix als auch mit dem Effektor, wobei bei der Umsetzung mit der Matrix sowohl Polyhydroxyniethylen als auch Polyvinylencarbonat unter geeigneten Bedingungen einsetzbar sind.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur kovalenten Verbindung der biologisch aktiven Substanzen mit dem Träger.

Hierzu steht eine Reihe von allgemein bekannten Reaktionen zur Verfügung:

• ·

Besonders einfach erfolgt die Verknüpfung des Effektors an die Matrix nach einer Aktivierung der Hydroxylgruppen des Polyh .ydroxymethylens mittels Cyanhalogeniden, vorteilhaft mit Bromcyan und einer nachfolgenden Umsetzung der Aminogruppen enthaltenden biologisch aktiven Effektoren über diese aktivierten Gruppen. . .

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.Ein weiteres Verfahren beruht darauf,, daß in.einer Abwandlung . dei' Azid-Methode von Curtius,' Po lyhydr oxyme thy len wie Polysaccharide mit Chloressigsäure im alkalischen Milieu ' umgesetzt, die entsprechende Säure mit Alkohol verestert, danach der Ester in"das Hydrazid überführt und schließlich das. in der Folge resultierende Azid mit der Aminogruppe des Effektorproteins mit der Polyhydroxymethylen-Matrix verknüpft wird.

•Eine andere Möglichkeit zur Verknüpfung des Effektors mit einer Polyhydroxymethylen-Matrix besteht in der Acylierung der Hydroxylgruppen mit Bromazetylbromid, gefolgt von der Alkylierung der Aminogruppe des Effektors. -

Ähnliche Reaktionsverläufe sind beispielsweise durch Umsetzung der Hydroxylgruppen des Trägers mit reaktiven Triazinen zu erreichen, wobei ein Teil der reaktiven Gruppen des Triazine mit der Polyhydroxymethylenverbindung, ein anderer mit Aminogruppen des Effektors in Reaktion tritt.

Diazotierbare aromatische Amine, die über eine weitere reaktive Gruppe mit den Hydroxylgruppen des Trägers einerseits in Verbindung treten können, erlauben auf der anderen Seite die Kupplung mit dazu befähigten, aktivierten Aminosäuren, beispielsweise den Tyrosin oder Histidinresten des Proteineffektors.

Arylaminogruppen enthaltende Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von ß-Hydroxyäthylsu3fönen können mit den Hydroxylgruppen des Trägers zur Reaktion gebracht v/erden. Sie ermög-. liehen die Bindung des Effektors nach der vorbeschriebenen Diazotierungsreaktion. _%.

Neben den hier beispielhaft angeführten Verfahren zur Herstellung der kovalenten Verbindung zwischen der Trägermatrix und dem

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Proteineff elctor odor anderen Effektoren, ließen sich noch weitere Methoden aufzählen,'die zur Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyhydroxymethylene, andererseits bestimmter Gruppierungen des Effektors führen und dadurch die kovalente Verbindung zwischen beiden herstellen.

Das Polyhydroxymethylen zeichnet sich neben der erwähnten chemischen und thermischen Stabilität durch vorteilhafte verarbeitungstechnische Eigenschaften aus und führt damit zu einer 'Überlegenheit gegenüber den bisher als optimal gefundenen Trägermatrizen auf der Basis von natürlichen Kohlenhydraten·, Polyhydroxymethylon ist/in*Form von Pasern, Fäden, Folien oder sphärischen Partikeln herstellbar, so daß je nach dem Anwendungszweck des daran zu bindenden Effektors die geeignetste Form herstellbar ist.

Durch die produktionstechnisch lenkbare Größe der für die Bindung der Effektoren bzw. der Spacer zugänglichen Oberfläche zeigt sich ein weiterer Vorzug des Polyhydroxymethylene gegenüber den Trägermaterialien des Standes der Technik,

Nach den analogen Reaktionsmechanismen, wie sie für die Bindung des Effektors mit der Polyhydroxyciethylen-Matrix beschrieben sind, lassen sich auch die Spacersubstanzen an die Matrix binden, wenn z.B. die Spacer als eine dex- funktionellen Gruppen eine Aminogruppe tragen. Die Einführung eines Spacers bietet jedoch auch die Möglichkeit, für die Bindung des Effektors zusätzlich Rsak-'tionsmöglichkeiten einzuführen. Im Falle, daß der an die Matrix gebundene Spacer eine' freie Carboxylgruppe trägt, ist diese Carboxylgruppe beispielsweise durch Carbodiimid-Verbindungen aktivierbar, die sodann eine Amidbindung mit Aminogruppen des Effektors einzugehen vermag. Carboxylgruppen lassen ferner die Ausbildung von Amidbindungen mit Hilfe der von Woodward eingeführten Isoxazoliurasalzen zu. · ■ .

Besitzt der an die Matrix gebundene Spacer eine verfügbare, freie Aminogruppe, so ist mit Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder Schwefelsäureestern von ß-Hydroxyathylsulfoiien die Einführung von Arylaminogruppen in der Verlängerung des Spacers möglich, die sodann nach bekannten Methoden diazotiert

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und anschließend mit entsprechend reaktiven Gruppen des Effekters verbunden worden:

OH

O OH

NH-(CHp)^-NH-

Die erfindungsgemässen biologisch aktiven Verbindungen eignen sich für die meisten Anwendungsverfahren, die bisher für andere an hydrophile, wasserunlösliche Träger gebundene Effektoren bekannt geworden sind. Es können demnach Enzyme wasserunlöslich gemacht werden. Die unlöslichen Enzyme werden zunehmend zur Bestimmung von Substraten in Analysenautomaten und als sogenannte Enzymelektroden verwendet. ¥egen der erhöhten Stabilität eignet sich eine Reihe trägergebundener Enzyme für die Durchführung technisch enzymatischer Umsetzungen.

Trägergebundene, biologisch aktive Substanzen haben wegen ihrer Eigenschaft als spezifische Adsorbenzien eine breite Anwendung in der Affinitätschromatographie gefunden. Mit Hilfe von trägergebundenen natürlichen oder synthetischen Enzyminhibitoren gelingt die Hochreinigung von Enzymen, während die Enzyme als Effektoren insbesondere zur Gewinnung natürlicher Enzyminhibitoren aus Rohextrakten hervorragend geeignet gefunden wurden. Trägergebundene wasserunlösliche Antigene werden zur Isolierung der zugehörigen Antikörper verwendet, die auf diese Weise frei von anderen Serumbestandteilen und frei von anderen Antigenen erhalten werden. Äffxnitatschromatographisch können auch nicht präzipitierbare Antikörper sowie solche, die wegen ihrer geringen Konzentration im Serum nicht fällbar sind, isoliert und auch quantitativ bestimmt werden.

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In den zur Erläuterung der Erfindung nachstehend aufgeführten Beispielen ist aufgezeigt, dass ein nach einem einzigen Verfahren hergestellter Träger sich für die Bindung der verschiedensten Effektoren eignet, und dass der Grundkörper Polyhydroxymethylen durch geeignete Substitution zur Bindung jedes gewünschten Effektors geeignet gemacht werden kann.

Ferner wird beispielhaft aufgezeigt, wie die matrixgebundenen Effektoren eingesetzt werden können.

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Beispiel 1 / Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid-Verbindung

Herstellung der Matrix aus (&) —Amino-n-hexyl)-substituiertem Polyhydroxymethylen;

20 g Polyhydroxymethylen, suspendiert in 900 ml i/asser, werden mit einer Lösung von 20 g BrCN" in 50 ml Dimethylformamid versetzt und unter Rühren durch langsames Zutropfen von 2 η Natronlauge bei einer Innentemperatur von 15 C 6 Minuten lang bei einem pH-Wert von 11,5 gehalten. Dann wird sofort abgesaugt, gut mit Eiswasser ausgewaschen und abgepreßt. Das so aktivierte, noch wasserfeuchte Polyhydroxymethylen v/ird zu einer gut gerührten, bei Raumtemperatur gehaltenen, mit lconc. HCl auf pH 8,5 eingestellten Lösung von 20 g Hexamethylendiamin in 500 ml Η£θ' zugegeben, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllt, der pH-Wert ständig zwischea 8,5-9*0 einreguliert und noch 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann v/ird abgesaugt und gut mit T/asser ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit ((J-Amino-n-hexyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen. Stickstoffgehalt von 1,9^. Mit Sanger 's Reagens zum Nachweis von primären freien Aminogruppen werden intensiv gelb gefärbte Produkte erhalten.

Herstellung des trägergebundenen Effektors Effektor: Tetanus-Antigen - . -

10 g des Trägers nach Beispiel 1 werden in 200 ml einer 0,5 M Natriumphosphatlösung von pH 10 suspendiert« Die Suspension wird unter Rühren auf 50°C erwärmt und mit 5 S i-Aminobonzol-k-ßhydroxyäthyisulfonschwefelsäurehälbester versetzt. Nach Korrektur des pH-¥ertes auf 10 mit 2 M NaOH wird der Ansatz eine Stunde bei 50⁰C gerührt. Anschließend wird über eine Kutsche abfiltriert und mit 2 1 Fasser, 2 1 Aceton und 2 1 0,2 M HCl gewaschen« Zur Diazotierung der in das Polyhydroxymethylen eingeführten Arylamingruppen wird der Filterrückstand in 200 ml

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0,2 M HCJ. suspendiert, auf 2 C abgekühlt und unter Rühren so lange mit 1 M NaN0₂-Lösung versetzt, bis mit KJ-Stärke-Papier ein geringer Nitritüberschuß festzustellen ist. Nach 10 Min." wird über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter einer wäßrigen 0,01 M Amidosulfonsäure von 2°C und anschließend mit 200 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 7i5 von 2°C gewaschen. Zur Kupplung wird das Diasoniumgruppen enthältende Produkt in 150 ml einer Lösung von 2 g Tetanus-Toxoid mit 1260 Lf/mg N in 0,2 M Natriumphosphat pH 7>5 und 2 C suspendiert und 20 Stunden bei 5°C gerührt. Nicht gebundene Anteile des Toxoids werden mit 1 Liter 1 M NaCl-Lösung auf einer Nutsche ausgewaschen.

Anwendung- der Verbindung Polyhydroxymethylen-Tetanustoxoid"

Gewinnung von Tetanus-Antitoxin

10 g des Produktes nach Beispiel 1 werden in 150 ml 0,15 M NaCl-Lb"sung, mit einem Zusatz von M/15 Natriumphosphat, (PBS; pH J,2 suspendiert und in- eine Säule von 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe überführt. 20 ml Tetanus-Pferdeserum mit I65O IE Tetanus-Antitoxin/ml werden auf die Säule aufgetragen, die anschließend mit 500 ml PBS pH 7,2 gewaschen wird. Die Elution der Antikörper erfolgt mit 0,5 M Glycin/HCl-Puffer pH 2,5. Das Eluat enthält nach Neutralisation mit 2 M NaOH und nachfolgendem Zentrifugie-. ren insgesamt 2^0 mg Protein und, wie in einem Schutzversuch anMäusen ermittelt wird, 12.300 IE Tetanus-Antitoxin.

Beispiel 2 / PoIyhydroxymethylen-Aminobenzamidin--Verbindung

Herstellung der Matrix aus (& -Carboxy-n-pentyl)-substituierteTn Polyhydroxymethylen;

20 g. Polyhydroxymethylen, nach Beispiel'mit BrCN-aktiviert, wird zu einer mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,5 eingestellten und auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter aufgefüllten, wäßrigen Lösung

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von 25 g C-Aminccapronsäure gegeben. Es wird noch 5 Stunden bei Raumtemperatur und pH 8,5 gerührt und abgesaugt und mit !fässer g.ut ausgewaschen. Eine getrocknete Probe des mit (£/ -Carboxy-upentyl)-Gruppen substituierten Polyhydroxymethylens hatte einen Stickstoffgehalt von 0,8650.

■Herstellung· des Irägergebundenen Effektors ... Effektor: Aminobenzamidin

2 g eines Polyhydroxymethylenderivats, hergestellt nach Beispiel 2, werden in 25 ml O,1 M Morpholinoäthansulfonsäure suspendiert und mit 1 g i-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid · HCl •versetzt. Durch Zugabe von 2 M HCl unter pH-Kontrolle wird der ■pH-Wert auf 4,8 eingestellt. Unter Rühren wird dem Ansatz 1 g m—Aminobenzamidin zugesetzt. Die Suspension wird unter pH—Korrektur 1 Stunde gerührt und das Adsorbens anschließend in eine Chromatographie-Säule mit 1 cm Durchmesser überführt. Das Adsorbens wird mit 200 ml 0,05 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl--Puffer pH 8,0 mit einem Zusatz: von 0,5 M KCl (Tris-KCl) gespült.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymethylen-Aminobenzamidiri Gewinnung von Thrcnbin

100 mg Roh-Thrombin vom'Rind werden in 5 ml 0,05 M Tris, 0,5 M KCl pH 8,0 gelöst und auf die wie oben präparierte Säule aufgetragen. Die Säule wird anschließend mit 200 ml Tris-KCl-Puffer gespült. Das an das unlöslich gemachte m-Aminobenzamidin gebundene Thrombin wird von diesem mit 100 ml einer "Lösung von 0,05 M m-Auiinobenzamidiii in Tris~KCl-Puffer abgespalten-. Die Protein.enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und über eine 1 χ 30 cm Säule Sephadex G-25 in Tris-KCl-Puffer laufen lassen. In dem ersten, das Protein enthaltenden Peak des Säuleneluatos konnten durch Bestimmen der Aktivität nach Chase und Shaw, Biochem.. 8_, I969, S. 2212, 78$ der Ausgangsaktivität gefunden worden, . .

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Beispiel 3 / Polyhydroxymethylen-Pepsin--Verbindung

Herstellung· der Matrix aus foj-Amino~n-hexyl)-substituiertem Polyhydroxymethylen;

8,0 g aus Dirnethylformamid/Methano1 umgefälltes Polyvinylencarbonat, hergestellt nach N.D. -Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Vol. 58, p. 534 (1962), wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 7i5 g Hexamethylendiamin in I80 ml Methanol suspendiert und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, abgesaugt, mit Methanol ausgewaschen und in einer Lösung von 10 g Natriumtuethylat in 300 ml 96$igeni Methanol 4 Tago bei Raumtemperatur suspendiert, mit Methanol und dann sehr intensiv mit Wasser ausgewaschen.. ..Eine getrocknete.Probe des. über einen Spacer .von 6 CHp-Gruppen mit primären Aminogruppen substituierten Polyhydroxymethylen-Aduorbens hatte einen Stickstoffgehalt von 5*7$.

Herstellung· des trägergebundenen Effektors Effektor: Pepsin

20 g (&-Amino-n-hexyl)~substitüiertes Polyhydroxymethylen·, hergestellt nach Beispiel 3* werden in 400 ml 0,2 M Natriumphosphat pH 10 suspendiert. Der Suspension werden unter Rühren 40 ml einer 25^igen Glutardiajldehydlösung zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wix-d über eine Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit '4 Liter 0,2. M Natriumazetatp^ffer pH 4,0 gewaschen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt in 500 ml einer Lösung von 5 g Pepsin mit insgesamt 500.000 Einheiten,bestimmt nach Anson, in 0,2 M Natriumazetat pH 4,0 gegeben und 15 Stunden bei 6⁰C gerührt. Das danach erhaltene Produkt v?ird auf einer Nutsche mit 5 Liter 0,1 M Natriumazetat/Essigsäure pH 4,0 und einem Zusatz von 1 M NaCl ausgewaschen.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxymothylen-Popsin Proteolytische Spaltung von Itnruunglobulinen · .

Das Adsorbens nach vor·liegendem Beispiel wird in 0,1 M Acetat-

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puffer pll 4,0 suspendiert und davon eine Aktivitätsbes'tzmmung nach Anson durchgeführt. Die Suspension enthält insgesamt 21.000 Einheiton Pepsin in gebundener und mit diesem Test nachweisbarer Form. .Zur proteolytischen Spaltung von Human-Imiiiunglobulin G wird das Pepsin-Adsorbens -abfiltriert und der Rückstand in einer 2,5/oigen Lösung von 30 g Human IgG in physiologischer NaCl-Lösung pH. 4,1 suspendiert. Der Spaltansatz wird 24 Siunden bei 37°C gerührt. Nach Abfiltrieren des trägergebundenen Pepsins wird das Filtrat mit 1250 ml gesättigter Animoniumsulfatlösung versetzt. Das dabei entstehende Präzipitat wird abzentrifugiertί es enthält das F(ab)₂-Fragment des Immunglobulins mit dessen Antikörperaktivität. Der Abguß wird verworfen. .

Beispiel 4 / Herstellung der Verbindung Polyhydroxyinethylen-Oxaminsäure .-.-..

10 g Polyhydroxyrnethylen werden wie in Beispiel 1.beschrieben mit BrCN aktiviert und mit 5 S Tyramin, gelöst in 150 mi 0,1 M -Natriuiahydrogencarbonat, bei 5°C durch 6o Minuten langes Rühren umgesetzt. Die nicht gebundenen Anteile des Tyramins 'werden auf einer Nutsche abfiltriert und der Filterrückstand mit 1 Liter 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7,0 und 5°C ausgewaschen. Der Filterrückstand wird in 150 ml einer auf 5°C abgekühlten Lösung von 1,0 g diazotierter p—Aminophenyloxaminsäure suspendiert und 15 Stunden bei 5 C gerührt. Das Adsorbens wird auf einer Nutsche mit 1 Liter 0,05 M Natriumacotat-Essigsäure-Puffer pH 5,5 mit einem Zusatz von 2 mM CaCl₂ und 0,2 mM EDTA gewaschen.

Anwendung der Verbindung Polyhydroxyinethylen-Oxaminsäure Gewinnung von Neuraminidase

Das Adsorbens nach Beispiel k wird im oben genannten Acetatpuffer

resuspendiert und in eine Chromatographie-Säule von 2 cm Durchmesser überführt. Durch diese Säule wird 1 Liter eines Kulturfiltrates von Vibrio Cholerao mit 800 IE Neuraininidase/rnl geleitet, das vorher mit 2 M Essigsäure auf pH 5_t5 oingestellt und das mit CaCIp und EDTA bis zu einer Konzentration von 2 mM bzw. 0,2 mM

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;'■·.. '■■-'-■ ' _ -]'p _ · ■ Ma 187 ' versetzt worden war. Die nicht gebundenen Proteine werden mit 500 ml Acetatpuffer ausgewaschen. - ' . . . ·

Die- Elution der an den trägergebundenen Inhibitor adsorbierten Neuraminidase erfolgt durch Waschen der Säule mit 0,1 M Natrxurahydrogencarbonat-Lösung und Sammeln der aktive Neuraminidase enthaltenden Fraktionen. Sie enthalten 86^ der eingesetzten Aktivität.

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Claims (7)

Ma 187 - 16 Patentansprüche

1. Biologisch aktive Verbindung, gekennzeichnet durch ein wasserunlösliches Poly(hydroxymethylen), an das eine biologisch aktive Substanz unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität chemisch gebunden ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche Poly(hydroxymethylen) die Funktion einer Trägermatrix für die biologisch aktive Substanz hat.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktive "Substanz über eine bifunktionelle organische Verbindung an das Poly(hydroxymethylen) gebunden ist.

4. Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biologisch aktive Substanz ein Enzym, Vitamin, Hormon, Antigen, Antikörper, Aktivator, Inhibitor oder ein synthetischer Effektor ist.

5· Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass man Poly(hydroxymethylen) direkt oder über eine oder mehrere bifunktionelle organische Verbindungen mit einer biologisch aktiven Substanz umsetzt oder Poly(vinylencarbonat) mit einer bifunktionellen organischen Verbindung oder einem synthetischen Effektor umsetzt, die restlichen Cyclocarbonatgruppen hydrolysiert und gegebenenfalls das Polymere mit einer biologisch aktiven Verbindung weiter umsetzt.

6. Mittel enthaltend eine biologisch aktive Verbindung gemäss Ansprüchen 1 bis 4.

7. Verwendung einer biologisch aktiven Verbindung gemäss Ansprüchen 1 bis 4 zur Affinitätschromatographie, zur Gewinnung von Antikörpern oder zur Durchführung von Enzymreaktionen.

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