SE444947B - Biologiskt aktiva foreningar bestaende av en vattenoloslig hydrofil berarpolymer och en biologiskt aktiv substans, vilka er bundna till varandra - Google Patents

Description

7805544-9 2 andra sidan tillåter bindningen av inhibitorer på vattenolösliga matri- ser preparativ utvinning av motsvarande enzymer.

Antigener eller antikroppar binds till vattenolösliga matriser som s.k. immunadsorbenter och möjliggör därpå isolering av motsvarande antikroppar resp. antigener. .

Med biologiskt aktiva substanser menas i enlighet med vad som angetts ovan naturliga och på konstgjord väg framställda ämnen som är aktiva in vivo och in vitro och som i vidaste bemärkelse kan betecknas som enzymer, aktivatorer, inhibitorer, antigener eller antikroppar, vitaminer och hormoner. Dessa biologiskt aktiva substanser kan, efter- som de utgör de vattenolösliga systemens aktiva principer, betecknas som effektorer. _ _ De flesta hittills beskrivna bärarbundna effektorerna är avsevärt stabilare än motsvarande substanser i lösning.

Som bärarmaterial, s.k. matriser, används lämpligen endast sådana ämnen, som förutom olöslighet i vattenhaltiga system uppvisar en om möjligt låg ospecifik adsorption. För detta ändamål måste hydrofoba, hydrofila och joniska växelverkningar mellan matris och effektorns reaktionsdeltagare så långt möjligt undertryckas. Med substanser, vilka icke utgör någon reaktionsdeltagare till effektorn, bör varje bindning vara utesluten.

De hittills använda matriserna som bärare för biologiskt aktiva substanser kan uppdelas i sådana, som binder effektorerna genom fysika- lisk adsorption, till vilka hör aktivt kol och glaspärlor, och sådana, som tillsammans med effektorerna via en kovalent bindning är förbundna med varandra. Sistnämnda innefattar vinylpolymerer, t.ex. polyakryl- syror, polyakrylsyraamider och amino-, karboxi- eller sulfonylsubstitue- rad polystyren, vidare cellulosa och derivat därav samt slutligen naturliga och syntetiska polypeptider och proteiner. På grund av den utjämnande växelverkan mellan matris och effektor har kolhydrat, i synnerhet cellulosa, dextran, stärkelse, agar eller derivat därav, fått den största användningen som matris i vattenhaltiga system, även om de ! i dylika, i naturen förekommande ämnen ofta ingående karboxylgrupperna befunnits vara störande på grund av deras ospecifika reaktion. Därutöva uppvisar dessa ämnen en relativt ringa termisk och kemisk stabilitet.

Det har nu befunnits, att de nackdelar, som kolhydratderivaten uppvisar i egenskap av matriser i fråga om affinitetsberoende reaktio- ner, kan övervinnas, om man som matris använder polyhydroximetylen. 7805544-9 Uppfinningen avser sålunda biologiskt aktiva föreningar, vilka kännetecknas av ett vattenolösligt poly(hydroximetylen), till vilken är bunden en biologiskt aktiv substans under bibehållande av den biolo- giska aktiviteten. I dessa föreningar _ a) utgör bärarmatrisen polyhydroximetylen, h) utgör de biologiskt aktiva substanserna ämnen såsom enzymer, aktiva- torer, inhibitorer, antigener eller antikroppar, andra plasmaprotei- ner, blodgruppssubstanser, fyfimemæxflutininer, antibiotika, vitaminer eller hormoner, peptider eller aminosyror eller syntetiskt fram- ställda effektorer, c) är polyhydroximetylen och de biologiskt aktiva substanserna direkt bundna med varandra kovalent eller via en mellanbindning.

Polyhydroximetylen är en syntetisk polymer med en genomgående kolkedja. Varje kolatom uppbär en väteatom och en hydroxylgrupp. Fram- ställningen och egenskaperna finns bl.a. beskrivna av N D Field, J R Schaefgen, J. Polymer Sci., Vol. 58, sid 533 - 543 (1962) och G Smets, K Hayashi, J. Polymer Sci., Vol. 29, sid 257 - 274 (1958).

Det kan framstälhs genom basisk eller sur hydrolys av polyvinylenkarbo- nat. I vidare bemärkelse är polyhydroximetylen att betrakta som deri- vat av polyvinylenkarbonat. Bindningen av effektorerna till polyhydroxi metylen kan uppnås dels genom de åtgärder, som vidtas vid kovalent bind- ning av effektorerna med hydroxylgruppen, dels genom omsättning av poly- vinylenkarbonat via den likaledes kända aminolytiska reaktionen mellan en cyklokarbonatring hos polyvinylenkarbonatet och en primär amin, t.ex. hexametylendiamin, till ett via en uretanbindning med en s.k. spacer eller effektor substituerat polyvinylenkarbonat, vars kvarvaran- de cyklokarbonatgrupper därpå förtvålas till hydroxylgrupper: ----- ~?H-?H- ----- --- en-en cH-cH----- + R-NH ' ' Q\C/O 2 --à Q\C/p OH 9 förtvålning ll ll C ° in n n-1 , " , R polyvinylenkarbonat CH-CH -cH-cH------ I l I I OH OH oH o I c = 0 _1 I NH R 7805544-9 För användningen av produkterna är det synnerligen lämpligt att omsätta de biologiskt aktiva effektorerna icke direkt med polyhydroxi? metylen, utan att binda dem kovalent till matrisen via en inom affini- tetskromatografin som arm eller - liksom i engelska språket - som "spacer" betecknar mellanliggande länkdel.

Spaoer~substanserna är i de flesta fall.kolväteskelett med läng- den 1 f 2 nm. Två funktionella ändgrupper i spacer-substansen tillåter i varje särskilt fall omsättning såväl med.matrisen som med effektorn, varvid vid omsättningen med matrisen såväl polyhydroximetylen som polyvinylenkarbonat kan användas under lämpliga betingelser.

Föreliggande uppfinning avser vidare förfaranden för kovalent bindning av de biologiskt aktiva substanserna med bäraren.

För detta ändamål står en serie allmänt kända reaktioner till förfogande: I På ett synnerligen enkelt sätt sker effektorns bindning till matrisen efter aktivering av polyhydroximetienets hydroxylgrupper med hjälp av cyanhalogenider, lämpligen med bromcyan, och en efterföljande omsättning av de amingrupphaltiga, biologiskt aktiva effëktorerna via dessa aktiverade grupper, .

Ett ytterligare förfarandeêï baserat på att man vid en modifi- kation av azid-metoden av Curtius omsätter polyhydroximetylen liksom polysackarider med en halogenkarbonsyra såsom klorättiksyra i alkalisk miljö, förestrar motsvarande syra med alkohol, därpå överför estern till hydraziden och därpå slutligen förbinder effektorproteinet med polyhydroximetylenmatrisen genom en bindning mellan den erhållna aziden och effektorproteinets aminogrupp.

En annan möjlighet att förbinda effektorn med en polyhydroxi- metylenmatris består i att acylera hydroxylgrupperna med bromacetyl- bromid, varpå effektorns amingrupp alkyleras. I Liknande reaktionsförlopp kan uppnås exempelvis genom omsättning av bärarens hydroxylgrupper med reaktiva triaziner, varvid en del av triazinets reaktiva grupper bringas till omsättning med polyhydroximety- lenfönningen, en annan med effektorns aminogrupper.

Diazoterbara aromatiska aminer, vilka via en ytterligare reaktiv grupp kan förbindas dels med bärarens hydroxylgrupper, möjliggör å andra sidan koppling med härför benägna, aktiverade aminosyror, exem- pelvis tyrosin eller histidinresten i proteineffektorn.

Arylaminogrupphaltiga vinylsulfonderivat och svavelsyrahalvestrar avyß-hydroxietylsulfoner kan bringas att reagera med bärarens hydroxyl- 7805544-9 grupper. De möjliggör, att effektorn bindes enligt den förut beskrivna diazoteringsreaktionen. ' En synnerligen stabil eterbindning uppstår vid omsättning av polyhydroximetylenets hydroxylgrupper med icke jonbildande epoxider, vilka innehåller minst 2 reaktiva grupper, såsom epihalohydrinerna eller polyepoxiderna, exempelvis epiklorhydrin eller bisepoxid.

Förutom de hittills som exempel angivna förfarandena för fram-' ställning av den kovalenta bindningen mellan bärarmatrisen och protein- effektorn eller andra effektorer, kan ytterligare metoder uppräknas, vilka leder till omsättning dels av polyhydroximetylenets hydroxylgrup- per, dels bestämda grupperingar i effektorn och därigenom åstadkommer den kovalenta bindningen mellan båda, sålunda den kända omsättningen via komplexbildande metallföreningar, t.ex. titanföreningar.

Polyhydroximetylen utmärker sig förutom den angivna kemiska och termiska stabiliteten för lämpliga bearbetningstekniska egenskaper och leder sålunda till en överlägsenhet jämfört med de hittflls som opti- mala ansedda bärarmatriserna på grundval av naturliga kolhydrat. Poly- hydroximetylen kan t.ex. framställas i form av fibrer, trådar, folier eller sfäriska partiklar eller företrädesvis pulvriserat material, så att den lämpligaste formen kan väljas i beroende på användningsända- målet för den effekter som skall bindas.

Genom den produktionstekniskt sett styrningsbara storleken på den för bindningen av effektorerna resp. spacer-substanserna tillgängliga ytan erhålles en ytterligare fördel hos polyhydroximetylenet jämfört med bärarmaterialen enligt teknikens ståndpunkt.

Enligt de analoga reaktionsmekanismerna, t.ex. de för bindning av effektorn med polyhydroximetylenmatrisen beskrivna, kan även spacer- substanserna bindas till matrisen, om t.ex. spaeer-substanserna uppbär en aminogrupp som en av de funktionella grupperna. Införandet av en spacer erbjuder emellertid även möjlighet att införa extra reaktions- flöjligheter för effektorns bindning. I det fall, att den till matri- sen bundna spacer-substansen uppvisar en fri karboxylgrupp, kan denna karboxylgrupp aktiveras exempelvis genom karbodiimidföreningar, vilka därpå kan ingå en amidbindning med effektorns aminogrupper. Karboxyl- grupper tillåter vidare utbildning av amidbindningar med hjälp av enligt Woodward införda isoxazoliumsalter. I Om den till matrisen bundna spacer-substansen uppvisar en förfog- bar, fri aminogrupp, så blir det möjligt att med hjälp av arylamingrupp- haltiga vinylsulfonderivat eller svavelsyraestrar av jßhydroxietylsul- g 7soS544-9: foner införa arylaminogrupper i spacer-substansens förlängning, vilka _därpå diazoteras enligt kända metoder och slutligen förbindas med effektorns motsvarande reaktiva grupper: t.ex.

OH n-o- nå' \NH- (C112) ö-NH-cnz-cnz-so2--@>~NH2 De biologiskt aktiva föreningarna enligt uppfinningen lämpar sig för de flesta användningsförfaranden, vilka hittills blivit kända för andra till hydrofila, vattenolösliga bärare bundna effektorerr Man kan sålunda vattenolösliggöra enzymer. De olösliga enzymerna används i ökande utsträckning för bestämning av substrat i analysautomater och s.k. enzymelektroder. På grund av den ökande stabiliteten lämpar sig en serie bärarbundna enzymer för genomförande av tekniskt enzymatiska omsättningar.

Bärarbundna, biologiskt aktiva substanser har på grund av sina egenskaper fått stor användning som specifika adsorbenter inom affini- tetskromatografin. Med hjälp av bärarbundna naturliga eller syntetiska enzyminhibitorer är det möjligt att höggradigt rena enzymer, medan enzymerna befunnits vara synnerligen lämpliga som effektorer, i synner- het för att utvinna naturliga enzyminhibitorer ur râextrakt. Bärar- bdndna, vattenolösliga antigener används för isolering av tillhörande antikroppar, vilka erhålles på detta sätt fria från andra serumbestånds- delar och fria från andra antigener. Även icke precipiterbara anti- kroppar samt dylika, som pâ grund av sin ringa koncentration i serum icke kan fällas, kan isoleras affinitetskromatografiskt och även bestämmas kvantitativt.

I de för förklaring av uppfinningen nedan angivna exemplen har påvisats, att en enligt ett enda förfarande framställdlärare lämpar sig för bindning av de mest olika effektorer och att grundsubstansen polyhydroximetylen kan göras lämplig för att binda varje önskad effek- tor genom lämplig substitution.

Vidare har exempelvis påvisats, hur de matrisbundna effektorerna kan användas.

Exempel 1 Polyhydroximetylen-tetanustoxoid-förening Framställning av matrisen ur GU-amino-n-hexyl)-substituerat polyhydroxi- metylen: _ _ g polyhydroximetylen, suspenderat i 900 ml vatten, försättes 7805544-9 med en lösning av 20 g BrCN i 50 ml dimetylformamid och hålles genom långsam tilldroppning av 2-n natronlut under omrörning vid en innetem- peratur av 15oC i 6 min vid ett pH-värde av 11,5. Därefter avsuges genast, uttvättas med isvatten och avpressas, Det sålunda aktiverade, fortfarande vattenfuktiga polyhydroximetylenet sättes till en väl om- rörd vid rumstemperatur hållen, med konc. HCl på pH 8,5 inställd lös- ning av 20 g hexametylendiamin i 500 ml H20, spädes till en totalvolym av 1 liter med vatten, pH-värdet inregleras ständigt mellan 8,5 och 9,0 och omröres ytterligare 5 h vid rumstemperatur. Därefter avsuges och uttvättas väl med vatten. Ett torrt prov av det med (akamino-ne hexyl)-grupper substituerade polyhydroximetylenet hade en kvävehalt av 1,9 %. Med Sangers reagens för pâvisande av primära fria aminogrupper erhålles intensivt gult färgade produkter.

Framställning av den bärarbundna effektorn Effekter: Tetanus-antigen. g av bäraren enligt exempel 1 suspenderas i 200 ml av en 0,5 M natriumfosfatlösning med pH 10. Suspensionen värmes under omrör- ning till SOOC och försättes med 5 g 1-aminobensen-4-ß~hydroxietyl- sulfonsvavelsyrahalvester. Efter korrigering av pH-värdet till 10 med 2 M Na0H omröres blandningen en timme vid 50°C. Därefter avfiltreras över en nutsch och tvättas med 2 l vatten, 2 l aceton och 2 1 0,2 M HCl. För diazoteringen av de i polyhydroximetylenet införda arylamino- grupperna suspenderas filteråterstoden i 200 ml 0,2 M HCl, nedkyles till 200 och försättes under omrörning så länge med 1 M NaNO2-lösning, tills ett ringa nitritöverskott kan fastställas med KJ-stärkelsepapper.

Efter 10 min frånfiltreras över en nutsch och filteråterstoden tvättas med 1 liter av en vattenhaltig 0,01 M amidosulfonsyra med ZOC och därpå med 200 ml 0,2 M natriumfosfat, pH 7,5 med 2°C. För koppling suspen- deras produkten innehållande diazoniumgrupper i 150 ml av en lösning av 2 g tetanustoxoid med 1260 Lf/mg N i 0,2 M natriumfosfat pH 7,5 och 2OC samt omröres 20 h vid SCC. Icke bundna delar av toxoiden uttvättas på en nutsch med 1 liter 1 M NaCl-lösning.

Användningen av föreningen polyhydroximetylen-tetanustoxoid Utvinning av tetanus-antitoxin g av produkten enligt exempel 1 suspenderas i 150 ml 0,15 M NaCl-lösning med en tillsats av M/15 natriumfosfat ("PBS") pH 7,2 och överföres i en pelare med 3 cm diameter och 10 cm höjd. 20 ml tetanus- hästserum med 1650 IE tetanus-antitoxin/ml anbringas på pelaren, som 7805544-9 _ 8 2 därpå tvättas med 500 ml PBS pH 7,2. Elueringen av antikropparna sker med 0,5 M glycin/HC1-buffert pH 2,5. Eluatet innehåller efter neutra- lisation med 2 M NaOH och efterföljande centrifugering totalt 240 mg protein och, såsom fastställdes genom ett skyddsförsök på möss, 12.300 IE tetanus-antitoxin.

Exempel 2 _ _ Polyhydroximetylen-aminobensamidinförening Framställning av matrisen ur G0-karboxi-n-pentvl)-substituerat polyhydroximetylen_ 2 .p.20 g polyhydroximetylen, aktiverat enligt exempel 1 med BrCN, sättes till en med utspädd natronlut på pH 8,5 inställd och till en totalvolym av 1 liter utspädd, vattenhaltig lösning av 25 g É-amino- kapronsyra. Det hela omröres ytterligare 5 h vid rumstemperatur och pH 8,5 samt avsuges och tvättas väl med vatten. Ett torrt prov av det med Qxßkarboxi-n-pentyl)fgrupper substituerade polyhydroximetylenet hade en kvävehalt av 0,86 %.

Framställning av den bärarbundna effektorn Effektor: Aminobensamidin 2 g av ett polyhydroximetylenderivat, framställt enligt exempel 2, suspenderas i 25 ml 0,1 M morfolinoetansulfonsyra och försättes med 1 g 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid - HC1. Genom tillsats av 2 M HC1 under pH-kontroll inställes pH-värdet på 4,8. Blandningen försättes under omrörning med 1 g m-aminobensamidin. Suspensionen om- röres under pH-korrigering 1 h och adsorbenten överföres i en kromato- grafipelare med 1 cm diameter. Adsorbenten sköljes med 200 ml 0,05 M trishydroximetylaminometan-HC1-buffert pH 8,0 med en tillsats av 0,5 M Kcl (tris-Kcl) . ' Användningen av föreningen polyhydroximetylen-aminobensamidin Utvinning av trombin '100_mg råtrombin från nötkreatur löses i 5 ml 0,05 M tris, 0,5 M KCl pH 8,0 och anbringas på den ovan preparerade pelaren. Pelaren sköljes därpå med 200 ml tris-KCl-buffert." Det till det olösliggjorda m-aminobensamidinet bundna trombinet avspjälkas från detta med hjälp av 100 ml av en lösning av 0,05 M m-aminobensamidin i tris-KCl-buffer.

De proteinhaltiga fraktionerna förenas och får rinna över en 1 x 30 cm pelare Sephadex G-25 i tris-KCl-buffer. I den första protein- haltiga spetsen av pelareluatet kunde 78 % av utgângsaktiviteten åter- finnas genom bestämning avaktiviteten enligt Chase och Shaw, Biochem. §, 1969, sid 2212. 780554439 Exempel 3 Polyhydroximetylen-pepsin-förening Framställning av matrisen ur (Q}amino-n~hexyl)~substituerat polyhydroximetylenz _ 8,0 g ur dimetylformamid/metanol omfällt polyvinylenkarbonat, framställt enligt N D Field, J R Schaefgen, 0. Polymer Sci., Vol. 58, sid 534 (1962), suspenderas vid rumstemperatur i en lösning av 7,5 g hexametylendiamin i 180 ml metanol och omröres 48 h vid rumstemperatur, avsuges, uttvättas med metanol och-suspenderas i en lösning av 10 g natriummetylat i 300 ml 96-procentig metanol 4 dagar vid rumstemperatur, uttvättas med metanol och därefter mycket intensivt med vatten. Ett torrt prov av den via en spacer-substans med 6 CH2-grupper med primära aminogrupper substituerade polyhydroximetylenadsorbenten hade en kväve- halt av 5,7 %.

Framställning av den bärarbundna effektorn Effekter: Pepsin g (akamino-n-hexyl)-substituerat polyhydroximetylen, fram- ställt enligt exempel 3, suspenderas i 400 ml 0,2 M natriumfosfat pH 10. Suspensionen tillsättes under omrörning 40 ml av en 25-procentig glutardialdehydlösning. Efter omrörning 2 h vid rumstemperatur frân- filtreras via en nutsch och filteråterstoden tvättas med 4 l 0,2 M natriumacetatbuffer pH 4,0. Därpå sättes reaktionsprodukten till 500 ml av en lösning av 5 g pepsin med totalt 500 000 enheter, bestämt enligt Anson, i 0,2 M natriumacetat pH 4,0 och blandningen omröres 15 h vid 6°C. Den därefter erhållna produkten uttvättas på en nutsch med l 0,1 M natriumacetat/ättiksyra pH 4,0 och en tillsats av 1 M NaCl.

Användning av föreningen polyhydroximetylen-pepsin Proteolytisk spjälkning av immunglobuliner Adsorbenten enligt föreliggande exempel suspenderas i 0,1 M acetatbuffer pH 4,0 och en aktivitetsmätning därav genomföres enligt Anson. Suspensionen innehåller totalt 21 000 enheter pepsin i bunden och med detta test påvisbar form. För proteolytisk spjälkning av human-immunglobulin G frånfiltreras pepsinadsorbenten och återstoden suspenderas i en 2,5-procentig lösning av 30 g human IgG i fysiologisk NaCl-lösning pH 4,1. Den genom spjälkning erhållna blandningen omröres 24 h vid 37°C. Efter frånfiltrering av det bärarbundna pepsinet för-du sättes filtratet med 1250 ml mättad ammoniumsulfatlösning. Det därvid bildade precipitatet avfiltreras; det innehåller F(ab)2-fragmentet av immunglobulinet med dess antikroppsaktivitet. föverstâende vätska 7805544-9 1 10 kastas bort, Exemgel 4 7 Framställning av föreningen polyhydroximetylenoxaminsyra g polvhydroximetylen aktiveras såsom beskrivits i exempel 1 med BrCN och omsättes med 5 g tyramin, löst i 150 ml 0,1 M natriumväte- karbonat, vid 5°C genom 60 min varande omrörning. -De icke bundna de- larna av tyraminet avfiltreras på en nutsch och filteråterstoden ut- tvättas med 1 liter 0,1 M natriumfosfatbuffer PH 7,0 och 5°c. Filter- återstoden suspenderas i 150 ml av en till 5°C nedkyld lösning av 1,0 g diazoterad p-aminofenyloxaminsyra och det'hela omröres 15 h vid 5°C.

Adsorbenten tvättas på en nutsch med 1 liter 0,05 M natriumacetat- ättiksyra-buffer pH 5,5 med en tillsats av 2 mM CaCl2 och 0,2 mM EDTA.

Användning av polyhydroximetylenoxaminsyra Utvinning av neuraminidas 7 Adsorbenten enligt exempel 4 âtersuspenderas i den ovan angivna 'acetatbufferten och överföres till en kromatografipelare med 2 cm dia- meter. Genom denna pelare ledes 1 liter av ett kulturfiltrat av Vibrio Cholerae med 800 IE neuraminidas/ml, som tidigare inställts på pH 5,5 med 2 M ättiksyra och som försatts med CaCl2-och EDTA till en koncentration av 2 mM eller 0,2 mM. De icke bundna proteinerna tvättas med 500 ml acetatbuffert. _ ' _ ' 7 Elueringen av det till den bärarbundna inhibitorn adsorberade 'neuraminidaset sker genom pelarens tvättning med 0,1 M natriumvätekar- bonatlösning och uppsamling av fraktionerna innehållande aktiv neur- aminidas. De innehåller 86 % av den använda aktiviteten.

Exemgel 5 g a) Omsättning av polyhydroximetylen med epiklorhydrin. 50 g polyhydroximetylen suspenderas i 1 liter 2-n NaOH, försättes med 250 ml epiklorhydrin och omröres 2 h vid 55 - 60°C. Suspensionens pH-värde sjunker efter kort tid till 10 - 11. gGenom tillsats av NaOH upprätthålles detta pH-värde ytterligare 1 h. Efter 2 h reaktionstid avsuges den fasta substansen, tvättas med vatten, aceton och slutligen åter med vatten. _ b) 50 g hexametylendiamin löses i 1,5 l vatten och försättes med HCl till pH 10. Till lösningen sättes det under 5 a) aktiverade poly- hydroximetylenet och det hela omröres 6 h vid 50 - 55°C. Därefter av- suges produkten och tvättas fri från hvxamotylundiamin med vattcn. 7805544-9 11 c) p Den under exempel 5 b) erhållna produkten omröres med 50 g 1-aminobensen-4-íëhydroxietylsulfonsvavelsyraester 1 h vid 55°C och pH . Därefter avfiltreras den fasta substansen, tvättas med vatten, eaceton och återigen med vatten. d) 10.g av den under 5 c) erhållna produkten tvättas på en nutsch med '200 ml 0,1-n HCl och suspenderas därpå i 300 ml 0,5-n HCI. Suspensionen försättes under omrörning med 0,1fn NaNO2-lösning vid 0 - 4°C, tills ett ringa nitritöverskott kunde fastställas vid diazotering med KJ-stärkel- sepapper. Efter 10 min frånfiltreras över en nutsch och återstoden tvättas med isvatten och därpå med 0,15 M natriumfosfatbuffer pH 7,5 via o - 4°c. ' e e) 0,75 g albumin löses i 250 ml fosfatbuffer pH 7,5, kyles till 4°C och den under 5 d) framställda produkten tillsättes. 'Suspensionen om- röres 20»h vid 4°C,_filtreras därpå och den fasta substansen tvättas med 1 M NaCl och fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (vattenhaltig 0,9- procentig NaCl-lösning med en halt av 1/15 mol Na2HP04-RHZPO4-buffer av pH 7,2).

Filtrat och tvättlutar undersöks enligt metoden för radiell immun- diffusion med avseende på albumin.f Härvid bindes 75 mg albumin till 1 g av den sålunda framställda bäraren. f) 2,4 g IgM löses i 250 ml fosfatbuffer pH 7,5 och nedkyles till 4°C. 10 g av den enligt 5 d) diazoterade produkten tillsättes och sus- pensionen omröres 20 h vid 4°C. sEfter filtreringen tvättas den fasta substansen med 1 M NaCl-lösning och med PBS. 1 g av den enligt 5 f) framställda bäraren binder 240 mg IgM.

Exempel 6 a) 10 g PHM aktiveras såsom beskrivits i exempel 5 a) b) med epiklor- hydrin, omsätts med hexametylendiamin och upparbetas. b) 10 g av den sålunda framställda bäraren succinoyleras vid 10°C och pH 6 med 5 g bärnstenssyraanhydrid, som suspenderats i 200 ml vat- ten, under 4 h. pH-värdet inregleras med 2-n Na0H. Efter den fasta substansens tvättning med vatten omröres produkten med 2,5 g N-cyklo- hexyl-N'-((N-metylmorfolino)~etyl)-karbodiimid-p-toluensulfonat vid pH 5 och 5°C i 30 min, frånfiltreras och tvättas snabbt med isvatten. c) 1 g IgG löses i 250 ml fosfatbuffer pH 7,5 och omröres med den under 5 f) framställda bäraren i 24 h vid 4°C. Efter filtrering tvättas produkten med 1 M koksalt och med PBS. 85 mg IgG bindes kovalent till 1eg av bäraren. 7805544-9 e _ :_12 Exempel 7: _ a) '20 g av den under 5 a) framställda produkten omröres med 20 g aminokapronsyra vid pH 10 och 50 f 55°C i 6 h. Därpå avsugs och tvät- tas med vatten. b) .10 g av den under 7 a) framställda produkten försättes med 2,5 g' N-cyklohexyl-N'-((N-metylmorfolino)-etyl)-karbodiimid-p-toluensulfonat, varpå 2 g N-hydroxisuccinimid tillsättes efter 5.min vid pH 5. Efter omrörning i Sch vid 24°C avfíltreras den fasta substansen och tvättas " med vatten. c) 0,5 g albumin löses i 200 ml fosfatbuffer och omröres 24 h vid 4°c med den under 7 b) framställda akfiveràae bäraren. Efter filtre- ring tvättas produkten med 1 M koksalt och med.PBS.' 0 50 mg albumin bindes kovalent till 1 g av bäraren.

Exempel 8 010 g PHM aktiveras med epiklorhydrin såsom beskrivits i exempel a) b), omsättes med hexámetylendiamin och upparbetas. a) 10 g av den sålunda framställda bäraren suspenderas i 100 ml vatten och omsättes med 500 ml 25-procentig glutardialdehyd. Efter 1 h omrörning avfíltreras den fasta substansen och tvättas med vatten eller PBS. b) - 0,5 g albumin löses i 200 ml fosfatbuffer och omröres 20 h vid 4°C med den under 8 a) framställda bäraren. Efter filtrering tvättas produkten med 1_M koksalt och med PBS.

Exempel 9 Direkt omsättning av med epiklorhydrin aktiverat polyhydroximetylen a) 10 g polyhydroximetylen aktiveras med 50 ml epiklorhydrin såsom beskrivits i exempel 5 a). Efter filtrering tvättas produkten snabbt med vatten, aceton, vatten och slutligen med PBS. b) o;s g albumin löses 1 zoo m1 Pas och omröres so n vid 4°c med den under 9 a) framställda produkten. Efter filtrering tvättas det bärar- bundna proteinet med 1 M koksalt och med PBS. 1 g av den sålunda framställda bäraren binder 45 mg albumin. 7805544-9 13 p _ Exempel 10 - I ' ] " p - g váttenolösligt polyhydroximetylen omröres vid pH 9,5 (0,15 m Na-bikarbonat/Na0H-buffet) 3 dagar vid 25°C med 30 g dietylenglykol- diglycidyleter, produkten avsuges,euttvättas väl och sättes till 0,5 g humanalbumin i 200 ml 0,15 m fosfatbuffer pH 8.och omröres 60 h vid 10°C. Efter filtrering tvättas det bärarbundna proteinet med 1 M koksaltlösning och "ÉBS". 7 _ 1 g av den sålunda framställda bäraren innehåller 35 mg bundet albumin. 1 Exempel 11 '10 g polyhydroximetylen omsättes, såsom beskrivits i exempel 10, med 30 g glycidyltris-(ëlycidyleter), sättes till 0,5 g immunglobulin G (IgG) i 200 ml 0,15 m fosfatbuffer pH 7,5 och omröres 60 h vid 4°C.

Efter filtrering tvättas produkten med 1 M koksaltlösning och med "PBS". 1 g av det sålunda framställda proteinhartset innehåller 50 mg bundet IgG.

Claims (3)

1. 7305544-9% _Patentkrav: t 1. > Bíniogisktuaktíva_föreningar bestående av en vattenolöslig hydzøfil bärarpdlyner och en bidlogiskt aktiv substans, vilka år bundna till varandra direkt eller med en bryggbildande substans, k ä'n n e tee c k n and e _av att den üattenølösligaynhydrpfila bärarpolymeren utgöres av polyhydroximetylen, vaçvid den biologiskt aktiva substan- sen utgöres av ett enzymy en-aktivator, inhibitbr, ett an- tigen.elIer en antikropp, ett_plasnaprqtein, en blodgrupp- substans, ett fyflhafiæghflfinin, ett antibiotikum,ett vitamin elïer etthormon, en peptid eller en aminosyra elier en syn- ' tetiskt.framstäIId.effektor-

2. ;. Förening.en1igt krav 1, -k ä n n e t e c k n a d "av att:fiet.vatteno1§s1iga p0ly(hydroximetylen)-et tjänar som bâtarmatnis för den btolcgiskt aktiva substansen.

3. Förening enligt krav 1 eller 2; -k ä n n e - t'e c k n.a.d av att den ßioldgiskt aktiva substansen är bunden tillIpo1y(hydroximety1en)-et över en förening med flera'funktinnellaagrupnerz.