SE444268B - Sett att framstella ett fast porost material for kromatografiskt bruk samt anvendning av materialet for isolering eller rening av biologiska makromolekyler - Google Patents

Description

löísdšvaø-6 "I" I I i _ _ ka; __,~.; “Vträuflpi-ëà www; -,_ vari R betecknar en polysackaridpolymerrest. n betecknar ett heltal. Å som kan variera mellan 1 och 1o, företrädesvis 2 - s. och :faen az. som är lika eller olika, betecknar en lägre alkylgrupp eller en hyd- * roxylerad lägre alkylgrupp. Polysackaridöverdrag kan, om så erford- l ras, föreligga i ett tvärbundet tillstånd så att stabiliteten gynnas.ï Förfarandet enligt uppfinningen medför att på nâmda poly- sackaridöverdrag eller modifierade polysackaridöverdrag föreligger ympade aminerade molekyler eller mokromolekyler, som kan utgöra re- aktiva ställen vid kromatografi, vilken aminerade molekyl eller ami- nerade makromolekyl har formeln R' - NH2, vari R' betecknar resten av den aminerade molekylen eller makromolekylen, och ympbindninqen av nämnda aminerade molekyl eller makromolekyl har formeln vari R' har ovan angiven betydelse, och R3 - C82 - becknar resten av polysackaridpolymeren eller den modifierade polysackaridpoly- meren efter det att denna utsatts för en oxiderande spaltning, följd av en reduktion. I det efterföljande avser 'lägre alkyl' en alkylgrupp med 1 - 4, företrädesvis 1 eller 2 kolatomer.

De polysackaridpolymerer och modifierade polysackarid- polymerer, som är användbara som det porösa, fasta materialet en- ligt uppfinningen är modifierade eller icke modifierade polysacka- ridpolymerer, som kan utsättas för den kända oxiderande avspalt- ningsreaktionen med hjälp av oxiderande perjodater.

Enligt föredragna utföringsformer - är den porösa mineralbäraren i synnerhet en metalloxid såsom kiseldioxid, aluminiumoxid, magnesiumoxid eller en titanoxid eller syntetiska eller naturliga derivat av dessa oxider såsom glas. silikat, boršilikat, kaolin etc.,v - är polysackaridpolymeren företrädesvis cellulosa, - är den modifierade polysækaridpolymeren en polymer med formeln I. vari R betecknar en rest av dextran, stärkelse eller cellulosa och i synnerhet dietylaminoetyldextran, DEAE-dextran, dietylaminoetylstärkelse eller dietylaminoetylcellulosa.Iaf tilll - stabilieras polysackaridpolymeröverdraget. om så önskas, igenom tvärbindning, varvid tvärbindningsmedlet t.e.x är en dikar- bonylförening, en halogenhydrin eller en diepoxid, företrädesvis 1,4-butandioldiglycidyleter, epiklorhydrin, epibromhydrin eller en epxoid med formeln CH ?5 -cH-R-u- -cn-cn \2O/ 4 Rs \o/2 vari Rs betecknar en alkyl med 1 - 20 kolatomer, företrädesvis en lägre alkyl med 1 - 4 kolatomer och R4 och R6 betecknar en kolväte- kedja med 1 - 10 kolatomer, företrädesvis en lägre alkylengrupp med 1 - 4 kolatomer, - kan den aminerade molekylen eller makromolekylen med formeln R' - NH2, som kan tjänstgöra såsom reaktivt ställe vid kro- matografi, vara alla molekyler, som bär HZN-funktioner, och som är användbara vid biospecifik, kemisk eller fysikalisk-kemisk affini- tetskromatografi. Det rör sig om molekyler, som kan delta i rever- sibel interaktioner av biospecifikt, kemiskt eller fysikaliskt- kemiskt slag, t.ex. joniska interaktioner, interaktioner, som på- verkar hydrofoba egenskaper, interaktioner, som påverkar en bio- specifik eller kemisk affinitet, t.ex. bildningen av reversibla komplex. Den aminerade molekylen eller makromolekylen kan ha en katjonisk karaktär, som kan utnyttjas i reaktioner med anjonbyte.

Den kan innehålla anoniska grupper såsom karboxyl- eller sulfon- grupper ocb ge upphov till reaktioner med katjonbyte. Den kan även vara en aminerad molekyl eller makromolekyl, som kan tjänst- göra såsom aktivt ställe vid biospeeifik kromatografi genom att t.ex. utgöra ett substrat eller en inhibitor för enzym. en recep- '&1sd91s94s%d"if ___. ¿í,e_,»iš,ri~'šâ&_?gn~L 1 .m ., :_ :. tor för hormon, proteiner, virus eller bakterier, ett antigen el- ler en antikropp. Denna aminerade molekyl eller makromolekyl kan i synnerhet'vara en polyamin såsom 3-dietylaminopropylamin eller N,N-dietyletylendiamin, taurin, ii-amino-kapronsyra, lysin, fenyl- alanin, fenylhydraiin, metaaminofenylborsyra, bakterieantigenerv globuliner, i synnerhet gamaglobuliner. bakterietoxiner, virus eller nedbrytningsprodukter därav såsom olika virusantigener. cel- lulära receptorer såsom hydrolysprodukter av gangliosider P2N-funk- tioner, i synnerhet hydrolysprodukterna av gangliosiden Gäl, såsom lysogangliosiden Gul eller partiella hydrolysprodukter av ganglio- siden GMI.

Man vet att gangliosiderna har en N-acyl-grupp (acyl, här- ledd från en fettsyra såsom stearingsyra) och minst en N-acetyl- grupp (i 3-ställning i galaktosfragmentet)_andra N-acetyl-grupper burna av N-acety1-neuraminsyramolekyler (acide sialique) kan även föreligga. N-acyl- eller N-acetyl-grupperna är delvis eller full- ständigt hydrolyserbara till NH2-grupper. Analogt med den nomenkla- tur, som föreslagits av Svennerholm för gangliosiden Gul betecknar i det följande “lysogangliosider' de föreningar, som erhålles genom total hydrolys av N-acyl- och N-acetyl-grupperna i gangliosiderna till NH2 derna, vari vissa NH2-grupper deacylerats eller deacetylerats ge- -grupper. De partiella hydrolysprodukterna från gangliosi- nom alkaliskhydrolys, utgör också användbara derivat såsom amine- rade molekyler, som kan tjänstgöra såsom reaktiva ställen i mate- rialet enligt uppfinningen. Det skall även framhållas att de mate- rial enligt uppfinningen, på vilka lysogangliosid GM1 är fixerad. kan kvarhålla koleratoxinet till och med efter behandling i starkt sur miljö t.ex. vid pH 1. Nu är det känt att gangliosiderna i sur miljö förlorar en eller flera N-acetylneuraminsyramolekyler och kan omvandlas till mono-N-acetylneuraminsyra- eller a-N-acetylneuramin- syragangliosider (eller lysogangliosider). Det framgår härav att för att fixera koleratoxinet man kan använda ett material enligt uppfinningen på vilket man fixerat, såsom aminerad molekyl med formeln R'-NH2, ett derivat av vilken gangliosid som helst (vars N-acetyl- och N-acylgrupper fullständigt eller delvis hydroly- serats till HZN-grupper) förutsatt att man därefter utsätter la- o terialet för en syrabehandling under en tillräckligt lång tid för att omvandla poly-R-acetylneuraminsyra-gangliosidderivaten till mono- eller a-N-acetylneuraminsyragangliosidderivat. ' Det ovan beskrivna förfarandet består således i synner- het i att fixera den aminerade molekylen eller den aminerade ma- kromolekylen som kan skrivas R'NH2 på polysackaridöverdraget el- ler det modifierade polysackaridöverdraget med nedanstående reak- uonsfö1ja= ° a) oxidativ spaltning av JL-glykol-grupperna för fram- ställning av karbonyl-derivat, som schematiskt kan återges med formeln R4 - CHO, vari R4 betecknar resten av polysackaridmole- kylen efter den oxiderande spaltningsreaktionen, b) omsättning av den aminerade molekylen eller makro- molekylen med karbonylgrupperna enligt reaktionen R '- ca = N - n' + H o R4 - CHO + R' - NH2 --di 4 2 c)_ reduktion av imin-bindningen till stabil aminbind- ning t.ex. genom nascerande väte enligt reaktionen R - CH = N - R' + 2H 4 > R3 - cflz - nu - R' vari R3 har ovan angiven betydelse.

Dessa olika kemiska omvandlingar kan utföras vid rus- temperatur i en kromatografikolonn.

För den spaltande oxideringsreaktionen. som är känd i och för sig, kan man t.ex. använda perjodsyra eller ett av dess derivat, såsom ett alkaliperjodat.

När den modifierade polysackaridpolymeren är en amine- rad polysackarid analogt med DEAE-dextran är det nödvändigt att efter oxidationsreaktionen mätta dessa katjoniska grupper med joner såsom halogenidjoner för att undvika all risk för stör- ning av den sista reaktionen mellan den aminerade molekylen el- ler makromolekylen och aldehydgrupperna i bäraren. ¿ i H1 -. ._ vw- v~wt7809789-óevä « r~ » _ , a För reduktionsreaktionen kan man t.ex. användaaen nyarm sagan natrmmbornyaria. _ För att belägga den porösa mineralbäraren med poly- ,“åJ g sackaridpolymeren eller med den modifierade polysackaridpoly-fš ffg meren kan man t.ex. förfara såsom beskrives i den svenska pa- “ e” tentansökningen 7608510-9, d.v.s. man satsar den porösa mine-p ralbäraren i form av ett puder i en kromatograferingskolonn,' varefter en buffert med pH 3 - 12 får passera, tills jämvikt inställes, och därefter införes en lösning av nämda polymer i samma buffert och slutligen elueras, tills dess att polymeren inte längre förekomer i eluaten, eller också impregneras den porösa mineralbäraren med hjälp av en vattenlösning av nämnda polymer med ett pH-värde av 3 - 12, och därefter torkas i ugn mellan 50 och l20° C till konstant vikt.

Eftersom den aminerade molekylen R'-NH2, fixerad på den porösa bäraren med det förfarande, som beskrives nedan, är en partiell eller fullständig hydrolysprodukt av en poly- eller mono-N-acetylneuramin-ganglipsid, omfattar förfarandet enligt uppfinningen dessutom ett fakultativt slutsteg med sur behand- ling av det erhållna materialet under en tillräckligt lång tid för att omvandla nämnda hydrolysprodukt till motsvarande hydro- lysprodukt av en mono- eller a-N-acetylneuramin-gangliosid.

För att utföra denna sura behandling kan man t.ex. använda en vattenlösning av saltsyra med en koncentration större än eller lika med 0,1 N.

För att erhålla ett cellulosaöverdrag är det fördelak- tigt att arbeta på följande sätt. Den porösa mineralbäraren impregneras med hjälp av en lösning av en cellulosaester. Där- efter torkas och den överdragna bäraren utsättes för inverkan av ett hydrolyserande medel t.ex. en alkalisk vattenlösning för hydrolys av estergrupperna. På detta sätt erhålles en porös mi- neralbärare, överdragen av på detta sätt regenererad cellulosa.

Det så erhållna cellulosaöverdraget är mycket stabilt och be- kläder perfekt porerna i den porösa mineralbäraren. Det är 0- nödigt att stabilisera detta överdrag geno tvärbindning.

I detta stadium är det möjligt att omvandla cellulosa- = överdraget till ett modifierat cellulosaöverdrag geon att on- sätta detta med ett lämligt medel, t.e:. genom omsättning sedd im en förening med formeln “ ' "7V"" ' .fx L' XI. tan-H... »nia /Rl \\ Rz vari n, R1 och R2 har ovan angivna betydelser, och X betecknar en halogenatom.

Man kan t.ex. omsätta den porösa mineralbäraren, som är impregnerad med cellulosa, med 2-klor-trietylamin vid ett alka- liskt pH-värde och på detta sätt erhålla ett dietylaminoetyl- cellulosa-överdrag.

Uppfinningen avser även förfarandet för beläggning av en porös mineralbärare med cellulosa eller modifierad cellulo- sa, vilket förfarande beskrives nedan.

Den porösa mineralbäraren, som användes enligt uppfin- ningen, bör ha en kontrollerad och väl definierad porositet.

Bärarens inre yta bör vara mindre eller lika med 100 mz/g och om möjligt ligga mellan 5 och 80 m2/g. Medelpordiametern bör vara större än eller lika med 25 nm och om möjligt ligga mel- lan 50 och 1000 nm, varvid mer exakta intervall kan anges be- roende på det tänkta användningsområdet. För större ytor eller mindre pordiametrar blir bärarens inre yta otillgänglig för den aminerade polysackaridpolymeren och slutligen för de makromo- lekyler, som skall separeras. Enligt en föredragen utförings- form av uppfinningen är den porösa mineralbäraren tillverkad av kiseldioxid eller aluminiumoxid och företrädesvis en bärare av porös kiseldioxid med anjoniska egenskaper, framställd t.ex. med de förfarande, som beskrives i de franska patentskrifterna l 473 239, 1 473 240, 1 475 929 och 1 482 867. Man använder t.ex. porösa kiseldioxider, tillhandahållna av Rhone-Poulencip' Chimie Pine under handelsnamnen Spherosilšgxöß 030, XOB 015 och §0C 005, vilka kiseldioxider har ytorna 50, 25 respektive 10 m /g. “ ' ~ 7àlól§1a9-si v I' Polysackaridpolymeren eller den modifierade polysacka-Qf ridpolymeren, som har till uppgift att impregnera och belägga . den porösa mineralbärarens inre yta, har en molekylvikt av minst 104 dalton, företrädesvis mellan 105 och 106 dalton.

Uppfinningen avser även användning av det nya materia- let, som beskrivits ovan, för rening eller separation av biolo- giska makromolekyler.

Helt allmänt består denna användning i att utnyttja af- finitetsegenskaperna hos den aminerade molekylen eller makro- molekylen, som är ympad på bäraren, i en kromatografikolonn antingen för att selektivt fixera biologiska makromolekyler, som man önskar isolera eller rena, eller för att selektivt hål- la kvar föroreningar eller andra icke önskvärda proteiner.

Denna tillämpning kännetecknas av att man i en kolonn, som innehåller materialet enligt uppfinningen, låter passera en lösning innehållande de biologiska makromolekyler, som man önskar isolera eller rena. När materialet fixerar de biologis- ka makromolekyler, so man önskar rena eller isolera, elueras dessa slutligen med en lämplig lösning, som tillåter att de bio- logiska makromolekylerna med kända metoder separeras från mole- kylen R'-NH2, vid vilken de bundits med affinitet. När t.ex. de biologiska makroolekyler, som skall isoleras, är fixerade med biospecifik affinitet till en ligand, separeras dessa med kända meto- der för separation av biologiska makromolekyler från sin li- gand. Naturligtvis väljer man, beroende på den biologiska mak- romolekylen, som skall isoleras eller renas, ett poröst mate- rial på vilket en molekyl R'-NH2 är fixerad, som har affinitet för nämnda biologiska makrmolekyl.

När materialet fixerar föroreningarna, tar man direkt till vara den önskade biologiska makromolekylen i lösning, var- vid det porösa materialet således är överdraget av en aminerad molekyl R'-NH2, som har affinitet för den förorening, som man önskar eller eliminera. Man kan slutligen eluera föroreningar- na med en lämplig lösning och sålunda regenerera materialet för ett nytt förfarande.

När den biologiska makromolekylen, som skall isoleras, eller den förorening, som skall hållas kvar, fixeras på mate- Ä 1ß° 269 6 _;,.~_,J n :if-_ .mil - »sxft-.U « rialet enligt uppfinningen geno att man utnyttjar materialets jonbytaregenskaper, utföres elueringen av den så fixerade mo- lekylen med hjälp av en lösning med lämpligt pä-värde och mola- _ ritat. "_ När man intebnskar använda jonbytaregenskaperna hos ma- terialet enligt uppfinningen, t.ex. när man endast vill använ- da de biospecifika affinitetsegenskaperna, är det lämpligt att i kolonnen använda lösningar med en tillräcklig jonstyrka för att neutralisera jonutbytarfunktionerna. När sålunda materia- let enligt uppfinningen innehåller katjoniska ställen, är det lämpligt att neutralisera katjongrupperna t.ex. med C19-joner för att eliminera all icke specifik interaktion av jontyp.

I vissa fall är det möjligt att på en gång utnyttja jon- bytaregenskaperna och andra affinitetsegenskaper, t.ex. bio- specifika affinitetsegenskaper hos materialet enligt uppfin- ningen för att i en enda kromatografering separera flera olika proteiner. Med ett material, som samtidigt har katjoniska stäl- len och ställen med biospecifik affinitet kan man t.ex. lätt utföra separationen av en blandning av tre proteiner, där ett första protein har elektropositiv karaktär, ett andra protein har elektronegativ karaktär och ett tredje protein kan fixeras på de biospecifika affinitetsställena. När man kroatograferar en sådan blandning fixeras i själva verket inte det första proteinet och det återfinns således i utloppet från kolonnen.

Det andra proteinet fixeras på de katjoniska ställena och kan elueras med hjälp av en lösning, som innehåller anjoner, som kan by*: ut proteinet på de katjoniska ställena, t.ex. en nat- riumkloridlösning. Det tredje proteinet fixeras på de biospe- cifika affinitetsställena och kan separeras därifrån med ett lämpligt elueringsmedel.

Nedan återges några icke begränsande användningsexem- pel enligt uppfinningen.

A. Rening av koleratoxin Man vet att när koleravibrion utvecklas i en lämplig od- lingsmiljö utsöndras ett toxin, benämnt koleragen eller entero- toxin, som är ansvarigt för de diarrêer, som orsakas hos män- niska av denna mikroorganism. Efter centrifugering och filtre- t» frå-ff; f' ring av den slutliga odlingsmiljön är det möjligt att erhålla Å, ¿; ett 'rått odlingsfiltrat' som innehåller koleratoxinet blan-*' T dat med många andra makromolekyler från den ursprungliga od-' lingsmiljön eller utsöndrade av vibrionerna. å en Koleratoxinet omvandlas delvis och kontinuerligt till en icke toxisk form, benämnd koleragenoid. Koleragenoid har en struktur, som ligger mycket nära strukturen för koleragen, men koleragen har dessutom en polypeptidkedja A, som är ansvarig för toxiciteten.

Koleragenet och koleragenoiden fixeras båda två selek- tivt pâ en receptor, som identifierades 1973 och som har be- tecknats 'Ganglioside Gul".

Många författare har visat intresse av koleragen och koleragenoid för framställning av vaciner, och man vet således att det är nödvändigt att kunna erhålla avsevärda mängder av dessa produkter.

Reningen av koleragen och koleragenoid har beskrivits av många författare men erfordrar ofta många steg för att man skall erhålla produkter, som är riktigt renade och standardise- rade. Av detta skäl är dessa metoder svåra att utföra i indu- striskala. Med biospecifik affinitetskromatografi är det teore- tiskt möjligt att i ett enda steg erhålla den önskade produk- ten i ett mycket rent tillstånd. Hed detta i åtanke beskrev Cuatrecasas 1973 ett förfarande för att selektivt framställa koleratoxinet genom affinitetskromatografi. Kromatografikolon- ner med agaros modifierades kemiskt för att fixera gangliosi- den Gul genom kovalent bindning. Tack vare dess affinitet för GM1 var fixeringen av koleratoxinet effektivt möjligt, men åter- utvinningen av detta toxin var svårt på grund av den extremt starka affiniteten mellan GMI, bundet till agaros och toxinet.

Detta gjorde att man var tvungen att använda denaturerande mil- jö för att dissociera komplexet, vilket medförde en denature- ring och dåligt utbyte vid förfarandets slut. Å andra sidan kräver aktiveringsmetoden med den förordade agarosen anvand- ning av cyanbromid, som är mycket farligt att hantera, och me- toden kan således medföra icke önskvärda koplikationer vid en eventuell utveckling i industriell skala. Dessutom har de de- nl ršlëxšßft--šä _ krig *__ i 1aos>7s9'-+s 'vf rivat, so framställes med agaros med cyanbrcnidmetodenfvisat='n« sig vara ganska instabila i synnerhet för sura pa-vårdenhlpfl mindre än 3), och efterso surgörning av miljön erfordras för att utvinna koleratoxinet förstår man att livstiden för dessa bärare kan bn kort via en industriell användning. ' “ " Föreliggande uppfinning tillåter att man utnyttjar ef- fektiviteten och snabbheten hos den biospecifika affinitets- kromatografin men med användning av en kromatografibårare som perfekt lämpar sig för industriellt bruk.

Användningen av denna biospecifika affinitetsbärare är endast möjlig efter det att den valda liganden immobiliserats . på porernas interna yta.

Två olika ligander, båda specifika för koleratoxinet, har använts. Den första är ett derivat av gangliosiden Gul, som har en stark 'biokemisk affinitet' och är specifik för ko- leragenet eller koleragenoiden. Den andra är kolera anti- toxin-antikropp, som har en specifik 'immunologisk~ affinitet' gentemot koleragenet och koleragenoiden. Affiniteten hos toxi- net för gangliosiden GM1 är känd för att vara mycket stark och möjligen mycket starkare än affiniteten för anti-kropparna.

Efter ympning av gangliosiden Gul på ytan av kiseldioxiden med de förfarande, som angives, har man emellertid upptäckts att den erhållna affiniteten mellan GM1, ympad på detta sätt, och koleratoxinet, är helt och hållet reversibel. I motsats till Cuatrecasas resultat är det således möjligt att utvinna kolera- toxin under relativt milda elueringsbetingelser. Detta går in- te att teoretiskt förklara och utgör ett oväntat resultat.

För att eluera det koleratoxin, som fixerats på materia- let enligt uppfinningen, kan man använda en sur buffert, t.ex. en citronsyrabuffert, en starkt koncentrerad lösning av urin- ämne, guanidin; jodid (t.ex. natriumjodid), tiocyanat (t.ex. kaliumtiocyanat) eller vilket annat kaotropiskt eller denature- rande medel som helst. även när det gäller de lämpade ligandernas stabilitet har en avsevärd förbättring erhållits tack vare föreliggade uppfinning. Det är 1 själva verket möjligt att regelbundet tvätta bärarna med lösningar såsom 0,1 N HCl eller 0,1 N fla0B, s» »o-f-'xtaa ._ . i' r , . _ d.v.s. med pH-värde av l - 13 utan att kvaliteten på den bio-f specifika affiniteten blir lidande därav. Sådan stabilitet fö- religger inte hos de kända bârarna såsom t.ex. på basis av »Ö agaros, som man måste skydda mot extrema pH-värden. V Slutligen, när det gäller mekaniska egenskaper, så är belastningen: nn zoo - 400 ni/unz/tinune möjliga utan au; bara- ren sätter sig, vilket bekräftar att de nya metoderna är in- tressanta för industriellt bruk.

! B. Andra användningsoråden.

Med materialet enligt uppfinningen, frmaställt med lysin såsom aminerad molekyl, är det möjligt att utnyttja af- finiteten lysin-plasminogen för att isolera och rena plasmino- genet från blod.

Med materialet enligt uppfinningen, framställt med metaaminofenyl-borsyra såsom aminerad molekyl, är det möjligt att reversibelt fixera socker och makromolekyler innehållande socker med cis-BL-glykol-funktion (glykoproteiner, nukleinsy- ror och lipopolysackarider), På samma sätt, med användning av bakterieantigener så- som aminerad molekyl, är det möjligt att reversibelt fixera motsvarande anti-kroppar, och med användning av gammaglobuliner såsom aminerad molekyl är det möjligt att reversibelt fixera motsvarande antigener, samt med användning av bakterietoxiner såsom aminerad molekyl är det möjligt att fixera i synnerhet motsvarande anti-kroppar etc.

Följande exempel beskriver uppfinningen utan att be- gränsa den; Exempel 1 - Ympning av lysogangliosid Gul på porös mineralbärare, impregnerad med dietylaminoetyl-dextran, tvär- bunden sekundärt. l.l Bäraren, baserad på DEAE-dextran, framställes med ett av de förfaranden, so beskrives i den svenska patentansök- ningen 7608510-9. ® 10 g Sphêrosil XOB 030 försättes med 30 ml DEAE-dextran 7,5 % med pH ll,5. Blandningen torkas över natt vid 80° C, var- efter 30 ml av en l,S-procentig butandioldiglycidyleterlösning i etyleter tillsättes. Etern avdrives under luftström, och där- “ :éïëï + .r » ~ ... i efter hane-s »inningen 1s« timar vad ao° c fa: :vazbinaniag av DEAE-dextranen. D _ _, j 1.2 Gangliosidlösningen framställes genom jonbytar-:f §f.É kromatografi på porös kiseldioxid, impregnerad med DEAE-dextran 1 § enligt den metod. sm beskrives i exempel 8 i den svenska pafšl ; tentansökningen 7608510-9. Q li Den så erhållna råa gangliosidlösningen innehåller cir- ka 40 8 gangliosid Gul och användes enligt uppfinningen.

De två N-acetyl-funktionerna och N-acyl-funktionen i gangliosiden Gul hydrolyseras således till aminfunktioner N82 genom alkalisk hydrolys med det förfarande, som beskrivits ti- digare av Holmgren, Mansson och Svennerholm, Medical Biology (1974), 52, 229 - 233. Den så erhållna produkten benämnes lysogangliosid, och den har tre N82-funktioner per molekyl.

Efter lyofilisering löses det erhållna pulvret i en karbonat- buffert 0,01 M med pH 9 innehållande 20 g NaCl per liter med en koncentration av 1 mg/ml. l ml av denna lösning innehåller cirka 370 ')1g N-acetylneuraminsyra per ml. 1.3 Perjod-oxidation av gäraren De 10 grammen av Sphërosil XOB 030, impregnerad med DEAE-dextran, sekundärt tvärbunden, sättes till 100 ml av en 0,02 M vattenlösning av natriumperjodat (pH cirka 4,5). Oxida- tionstiden är 2 timmar, och rustemperatur är lämplig för det- ta förfarande.

Bäraren tvättas därefter i en 0,01 M natriumkarbonat- lösning med pH 9, innehållande 20 g/liter natriuklorid. Den förhöjda jonstyrkan i bufferten har till syfte att mätta de katjoniska grupperna i den tvärbundna och oxiderade DEAE- dextranen med C16-joner och förhindra att de slutligen fixerar lysogangliosiderna med elektrostatiska krafter, som riskerar ^ att förhindra reaktionen mellan amingrupperna och aldehydfunk- tionerna i häraren.

I detta stadium är det lätt att försäkra sig om den oxi- derade bärarens aldehydfunktioner. I närvaro av Schiffs rea- gens utvecklas en intensiv rosaviolett färg. 1.4 Ympning av lysogangliosiden á Den föregående bäraren tvättas och försättes md S0 ulf r av lysogangliosidlösningen Gul. Efter en kontakttid cm 2 til-W mar dekanteras övervätskan. Genom en dosering av I-acetylneur- aminsyra är det lätt att visa att nästan all lysogangliosid _? _ t har kopplats (95 - 1oo s). i; *f Bäraren tvättas med karbonatbuffert pH 9. I detta sta- if dium är det lätt att även visa att färgningen av bäraren med Schiffs reagens är mycket svagare än i det föregående steget, vilket utvisar en bra fixering av lysogangliosiden på aldehyd- funktionerna i den oxiderade bäraren. 1.5 Reduktion med natriumborhydrid 50 ml av en 0,2 M NaBH4-lösning i vatten (pH 9) sättes till den föregående bäraren. Efter en kontakttid om 2 timmar vid rumstemperatur tvättas bäraren med vatten och placeras där- efter i kolonn. ' Efter jämvikt i den valda kromatograferingsbufferten 0 (fosfatbuffert 0,01 M, pH 7,2, innehållande 20 g/liter NaCl) är den biospecifika affinitetskolonnen färdig att använda.

I detta steg är det inte möjligt att påvisa något spår av aldehydfunktion genom färgning med Schiffs reagens. De aldehydfunktioner, som inte har omsatts med lysogangliosiden, har omvandlats till primära alkoholfunktioner.

Det skall framhållas att den så erhållna bäraren kan fungera perfekt som jonbytare. Om man vill upphäva joninterak- tionerna med proteinerna och endast bevara de biospecifika in- teraktionerna, är det således viktigt att ha en minimal jon- styrka. I praktiken räcker en minsta koncentration av 10 glli- ter NaCl för att undanröja jonbytareffekten. 1.6 Genom att noggrant följa samma teknik var det möjligt att.även effektivt ympa lysin, fenylalanin, fenylhydr- azin, metaaminofenylborsyra. Man vet att det skulle vara möj- ligt att även ympa alla molekyler, som bär NH2-funktioner, så- som t.ex. ett substrat eller en inhibitor för enzym, en recep- tor för hormoner, proteiner, virus eller bakterier, ett anti- gen eller en anti-krcpp och använda var och en av dessa bärare” i biospecifik affinitetskrcmatografi. , _ ß... 1:... .ast-Lima ' Exempel 2 - ïmpning av lysogangliosid Gul på poröa mineralbarare, impregnerad med cellulosa. il” 2.1 Impregnering med cellulosa _ v 10 g Sphêrosil XOC 005 (eller vilken annan porös nine-:frå °ïÄ ralbärare som helst) försattes med 30 ml av en 3-procentig_f¿5f 2 i cellulosaacetatlösning i aceton (cellulosapropionatet eller ' vilka andra estrar som helst, sm är lösliga i organiskt lös- ningsmedel och hydrolyserbara kan även användas om de kan åter- ge den ursprungliga cellulosan genom alkalisk hydrolysl.

Blandningen torkas under en varm luftstrm. Pulvret kan därefter siktas om så erfordras och placeras i kolonn.

En tvätt med 10 liter vattenlösning av 0,1 N Na0H an- vändes kontinuerligt med en hastighet av 500 ml/timme under en hel natt. Efter denna alkaliska hydrolys kan kolonnen tvättas _ med aceton eller med vatten med vilket pH-värde som helst, ty den så regenererade cellulosan är inte längre löslig och stan- nar helt och hållet kvar i det inre av porerna i den porösa mi- neralbäraren, vilka porer den bekläder i synnerhet som den ur- sprungliga polymeren lätt har kunnat komma åt hela den interna ytan. Användning av cellulosaestrar med så låg molekylvikt som möjligt förordas av detta skäl. 2.2 Framställning av lösningen av lysogangliosid GMI med aminfunktioner. xg Samma betingelser som under punkt 1.2. 2.3 Perjodoxidation av bäraren Samma betingelser som under punkt 1.3. 2.4 Ympning av lysogangliosiden Samma betingelser som under punkt 1.4. 2.5 Reduktion med natriumborhydrid NaBH¿ Samma betingelser so under punkt l.5.

Till skillnad från den bärare. som framställdes enligt ovanstående exempel, har denna inte jonbytaregenskaper, och kan därför eventuellt användas för mindre höga jonstyrkor, när detta kan vara en fördel. För affiniteten mellan lysoganglio- siden och koleratoxinet har detta ingen betydelse. 0 ; 2.6 Genom att noggrant följa samma förfarande var det m Ü möjligt att ympa jonbytarfunktioner, 1 synnerhet med 3-dietyl-¿¿ å ' .ä*i7ao97s9-si**ä= if aminopropylamin eller N,N-dietyletylendiamin och använda de så erhållna bärarna vid kromatografi av proteiner. I ïï 2.7 Hed användning av sama förfarande var det möj- ligt att ympa olika ligander med aminfunktioner sås lysin, fenylalanin, fenylhydrazin, metaminofenylboronsyra och använda de så erhållna bärarna vid biospecifik affinitetskroatografi.

På samma sätt kan man ympa alla molekyler med aminfunk- tioner såsom t.ex. ett substrat eller en inhibitor för enzym, en receptor för hormon, proteiner, virus eller bakterier, ett antigen eller en anti-kropp och använda var och en av dessa bä- rare vid biospecifik affinitetskromatografi.

Exempel 3 - Användning vid isolering och rening av koleratoxin.

De kolonner, som beskrivits i de föregående exemplen (utom punkt 2.6) är användbara vid biospecifik affinitetskro- matografi. Närvaron av 10 - 20 g/liter NaCl i kromatografe- ringsbufferten rekommenderas för att undvika varje icke speci- fik interaktion av jontyp med de elektriska laddningarna i jon- bytarfunktionerna, liganderna eller de proteiner, som förelig- ger på bäraren.

Genom att passera ett odlingsfiltrat av koleravibrioner, försatt med 10 g/liter NaCl geno var och en av kolonnerna är det lätt att bekräfta att koleragenet och koleragenoiden fast- nar på bäraren. Vid betingelser under kolonnens maximala fixe- ringskapacitet är det erhållna filtratet från kolonnens utlopp fullständigt fritt från toxisk aktivitet, mätt med kända under- sökningsmetoder.

Efter tvätt med kromatograferingsbuffert för att elimi- nera icke fixerade proteiner är det möjligt att återutvinna det fixerade koleragenet och den fixerade koleragenoiden genom eluering med citrat-citronsyrabuffert 0,05 M pH 2,8. Den er- hållna denatureringen är synbarligen försumbar efterso de er- hållna utbytena varierar mellan 50 och 100 8, mätt med klas- siska bestämningsmetoder för koleratoxin.

Beredningens renhet kan utvärderas genom kromatografi på Sephadex G-200 (koleragenet ger en topp motsvarande en mo- lekylvikt av 84.000 och koleragenoiden ger en topp motsvaran- w -.= ' r ,-. .«....-u.. -. .w .nnwu-wä-:ßußøl- ~ . .t . r , . 5; N;- ae en nøiexyivixe av ss;oóo) eiiez sea iunnoaeninxaïnnunyni med køntronantiserun. (nu: anusenmfllflfi odllnssfiltrßt-'lffälflfil inte har antikropparnot koleratmdn, vger inte mutfällninga-ä- linje med renade beredningar.) _ :ä:ÅÅå En kolonn om 10 g, framställd enligt de metoder; sol. beskrives i de ovanstående exemplen, medger att man behandlatfi* kvantireter av oaiingsfiltrat pa soo mi - io iiter. varvid Ü ' den exakta kvantiteten uppenbarligen beror av många parametv Å: rar, nämligen mängden av det toxin, som föreligger i odlings-l filtratet, och mängden GM1 i den råa gangliosidlösningen.

De möjliga tillämpningarna är följande: - framställning av en renad koleragen- och koleragenoidf lösning, som kan användas vid vacinframställning. - befria ett odlingsfiltrat av koleravibrioner från al-' la spår av koleragen och koleragenoid. - framställning av antisera gentemot dessa två typer av lösningar.

Exempel 4 - Separation av beståndsdelarna i nn bland- ning av gamma-globuliner, albumin och koleratoxiner genom en enda kromatografering.

Detta exempel har till syfte att visa möjligheterna att samtidigt använda det material, som beskrives i exempel l, vid jonbytarkromatografi och affinitetskromatografi. I motsats till ovanstående exempel 3 tillsättes inte natriumklorid till kromatografilösningsmedlet, som innehåller en artificiell blandning av tre proteiner, nämligen gama-globuliner, albumin och koleratoxin. Gamma-globulinerna, som har en elektro-posi--L tiv karaktär, adsorberas inte på den modifierade DEAE-dextran* bädden, under det att albuminet, som har en elektro-negativ ka- raktär, fixeras på denna bädd. Vad beträffar koleratoxipet fi- xeras detta på lysogangliosidställena Gäl. Med användning av en kromatograferingsbuffert med svag jonstyrka (0,01 M fosfatbuf~ fert, pH 6,8) återfinns gamma-globulinerna i kolonnutloppet i form av en icke adsorberad topp. Genom efterföljande eluering maa en buffert. som annehaiier io gapar 11:e: nazr1ux1°:1a,“§} V å utvinnes albuminet och elueras. Den slutliga elueringen med end då citratbuffert på 2,8 medger slutligen eluering av koleratoxinet. ...-._~_~.'¿.¿.4..= a: .«....»«. .ii y", _

Claims (16)

l -,._ ~ , =., f1,-.,-:¶¿__» "_ __ 13 41» z ' »Sif ' - Ky;- a 7 8 0 9 7 8 9 _ 6 u: g Patentkrav

1. Sätt att framställa ett fast poröst material för kromato- Ü grafiskt bruk varvid en porös mineralizk bärare överdragen med en polysackarid, k ä nån e t e c k n a t av att som po- lysackarid användes en polysackarid eller modifierad polysacka- rid som spaltas oxidativt med perjodsyra eller perjodsyraderi- vat, att polysackariden utsättes för en nerjodat-oxidation,att den så erhållna oxidationsprodukten får omsättas med en primär amin och sedan det erhållna iminoderivatet utsättes för inver- kan av ett reduktionsmedel, som kan reducera iminobindningen till aminobindning.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den porösa mineralbäraren är en metalloxid såsom kiseldioxid, alu- miniumoxid, magnesiumoxid, en titanoxid eller ett syntetiskt eller naturligt derivat av dessa oxider såsom glas, silikater. borsilikater eller kaolin.

3. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att poly- sackariden väljs från den grupp, som består av dextran, cellu- losa, stärkelse och motsvarande modifierade polymerer.

4. Sätt enligt krav 1 och/eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att polysackariden är en modifierad polysackarid, som har formeln R ' (C“2)n _ N vari R betecknar resten av polysackariden, n betecknar ett heltal mellan 1 och 10 och R1 och R2 betecknar en lägre alkylgrupp eller en hydroxylerad lägre alkylgrupp.

5. S. Sätt enligt krav 4. I I n n e t e c k n a t av att den¿¶Ifl?" nodifierade pelysackariden välja från dietylanineetyldetran.lï; dietylaninoetylstårkelne eller dietylanineetylcellnlona.N"'S

6. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven. k ä n n e t e c k n a t av att polysackarieen år tvarbunden.

7. Sätt enligt krav 6. k ä n n e t e c k n a t av att tvlr- bindningenedlet är en dikarbonylerad förening. en halogen- hydrin eller en diepoxid.

8. Sätt enligt krav 7. k ä n n e t e c k n a t av att det tvärbindande nedlet är 1.4-butandioldiglycidyleter. epiklor- hydrin. epibronnydrin eller en epoxid ned forneln “A RS I - CH - R. - I - of ° v* vari RS betecknar en alkylgrnpp ned 1 - 20 kolatøner. före- trädesvis en lägre alkylgrupp ned l - 1 kolatoner. och R¿ och Rs betecknar en kolvätekedja ned 1 - 10 kolatoner. före- trädesvis en lägre alkylgrupp ned l - I kolatoner.

9. Sätt enligt ett eller flera av kraven 1. 2 och 6 - 8. k ä n n e t e c k n a t av att polysackariden är cellnlena.

10. Sätt enligt ett eller flera av de föreglende kraven. k ä n n e t e c k n a t av att den prinlra aninen lr ett substrat eller en innibitor för enzyn. en recepter för nornon.¿ proteiner. virus eller bakterier. ett antigen eller en anti- -kropp.

11. ll. Sätt enligt krav 10. R 8 n n e t e c I n a t av att den prinåra aninen vllin frin den grupp. non bentir av en pelynin :leon 3-dietylaninopropylanin eller I.I-dietyl-etylendianin;Ü' lyain. fenylalanin. fenylnydrarin. tanrin. í}anine-Iaprennyra.¿f_¿ fr . .pä -..~..'.=1i=.;.-« ._-«,I.=... t..~¿¶f7" ' à¿....-.:.r. .n-........-r..~..,,. ,.. netaaninotenylborsyra. hakterieantigener. glohuliner.aisynner het ganna-glohulinerna. bakterietoxiner. virus eller nedhryt-f ningsprodukter därav alson olika viruella antigener och cellu- f,. lära receptorer. * “ ~ 1¿»"¿ï

12. Sätt enligt krav 10. k I n n e t e c k n a t av att“.¿§ receptorn är en produkt. son bildats efter partiell eller %”i total hydrolys av N-ac¶l- och N-acetylgruppera i en ganglio- sid. "i"~@

13. Sätt enligt 12. k 8 n n e t e c k n a t av att den cellullra receptorn är lysogangliosiden Gul.

14. Sätt enligt krav 9. k 3 n n e t e c k n a t av att nan onvandlar cellulosaöverdraget till ett överdrag av modifierad cellulosa genon att omsätta det ned cellulosa överdragna naterialet ned en förening ned torneln X - (CH - NR1(R2). 2,0 vari n. R och R har de i krav 5 angivna hetydelserna. 1 2 och X betecknar en halogenaton.

15. Sätt enligt något av kraven 1 - 14. k I n n e t e c k - n a t av att reduktionsreaktionen utföres ned hjälp av en hydrid sâson natriunborhydrid.

16. Användning av det enligt kraven 1 - 15 transtållda nateri- alet for isolering eller rening av biologiska nakronolekyler. -.-«.;^.¿.-Äf~f'šš.¿ï»¿fš¿u; .a-;«,».1æ¿a:=: -'“ ^ ' .X3 .'. »Vau ._