JPH026750A - 生物試料分離用のカラム充填材若しくはクロマトグラフィー部材として用いるアガロースコーティングガラス繊維 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アガロースでコーティングされたガラス繊維
を、生物試料分離用のカラム充填剤若しくはクロマトグ
ラフィー部材として使用することに関する。

バイオテクノロジーの生産物は、現在では種々のタイプ
の生物学的若しくは合成的工程で工業的に製造されてい
る。これらのバイオテクノロジー生産物は、最終産物か
ら不純物を除くために、精製が必須である。精製が必要
なバイオテクノロジー生産物の例としては、酵素、血液
製剤、調節タンパク質、ワクチンの様な薬剤、及びモノ
クロナル抗体を挙げることができる。

新規なバイオテクノロジー生産物の精製コストは、製造
コストに対して通常約３０−７０％を占める。そのよう
なことだけからも、急速に発展するバイオテクノロジー
の分野では、生物学的生産物の回収及び分離のさらに効
率的でかつ経済的な手段に対しての要求が増大している
。例えば、組み換えＤＮＡ生産物を市販しようとする期
待は圧倒的なものであり、それらの潜在的な需要は大規
模なりロマトグラフィーによる分離に対して並々ならぬ
興味を生じさせている。しかし、生物学的生産物をクロ
マトグラフィーで分離したり精製したりすることはバイ
オテクノロジー工業において難しく、コストのかかる工
程である。バイオテクノロジーやＤＮＡ生産物の商品化
の進展は、ｐＨ安定性がさらに大きく、処理量を増大で
き、迅速な吸着／解離動力学を維持する生物試料分離方
法に適する優れた部材の開発に、ある程度依存するもの
である。

生物学的な材料を分離し精製するにあたって特に重要な
ことは、新しいバイオテクノロジーの工程にしばしば生
じるエンドトキシンを除去することである。グラム陰性
菌により生産されるバイオテクノロジー生産物を精製す
ることは特に重要である。何故ならば、エンドトキシン
はグラム陰性菌の細胞膜のフラグメントであり、通常、
最終産物を含む水溶液中に見出されるからである。特に
人体や動物用の注射用製品を製造、販売する企業の間で
は、エンドトキシンに非常に関心をもっている。エンド
トキシンを注射すると、極めて低濃度でも、エンドトキ
シンにより体温が上昇する。

従って、医薬組成物からエンドトキシンを除去すること
が重要である。微生物の醗酵によって製造された注射用
製品では特に問題である。これらの製品の精製では、約
０．１ｎｇ／ｍＥ以下の濃度にエンドトキシンを除去す
ることが必須である。

エンドトキシン除去系は、製造工程で充分な量のエンド
トキシンを捕捉する一方で、エンドトキシン以外のいか
なる物質も捕捉しない等のいくつかの基準に合致する必
要がある。現在利用できる種々のエンドトキシン除去系
は、通常、負の電荷を持った物質を捕捉する傾向がある
ことが判明している。この現象は非特異的吸着と呼ばれ
、バイオテクノロジー生産物の製造では好ましくない。

現在の製造工程のほとんどは、分離や処理工程の間で粗
漏なエンドトキシン除去方法に依存している。そのよう
な粗漏な除去系として、アニオンクロマトグラフィー、
限外濾過、沈澱若しくは加熱蒸留を取り入れた方法を挙
げることができる。

例えば、メンブレン濾過法で医薬処方物からエンドトキ
シンを除くことが広く行われている。しかし、メンブレ
ン濾過は遅く、高価であり、また、該医薬製品がエンド
トキシンに対して１０倍以内の分子量をもつタンパク質
であるときには適用することができないので、このエン
ドトキシン除去系には問題がある。従って、製品の充分
な純度を得るためには、メンブレン濾過に加えて他の方
法を組み合わせることが必要である。これだけからも、
これらの方法によるエンドトキシンの除去は常には信頼
できず、また完全ではないのである。

製造業者は、製品中のエンドトキシンのレベルが高すぎ
るという理由で最終の品質管理試験に合格しなかった製
品のハツチすべての廃棄、若しくは再処理を余儀無くさ
れることがよくある。

さらに、エンドトキシンを軽率にも他の処理工程、主と
してイオン交換の際に除いている企業もある。しかし、
目的のバイオテクノロジー生産物がエンドトキシンと同
じ物理的性質を有する場合には、さらに問題が生じる。

処理工程数が少なくなるにしたがって、さらに別な問題
も生じやすくなる。アフィニティークロマトグラフィー
は１工程での精製を可能にするが、アフィニティークロ
マトグラフィーはコストが高く、また製造業者は従来の
精製技術を信頼しているという主たる理由で、商業的に
は現実には受は入れられていない。

従って、最終の生産物に悪影響を与えずに、痕跡程度の
エンドトキシンを選択的に除去するようにしたエンドト
キシン除去系が望まれている。その様な系は製造業者に
さらに良い品質の製品を製造することを保証し、また数
バッチの製品を廃棄したり再処理するときに無駄になる
時間を減じるであろう。

エンドトキシン除去系を受は入れる為に満足されなけれ
ばならないいくつかの基準がある。第一に、エンドトキ
シンの除去に用いられる支持体／配位子基材は浸出して
はならない。また、他のタンパク質を吸着してはならな
い。さらに、その系は、最終製品中のエンドトキシンを
充分に減じ、好ましくは最＃製品中にＯ１ｎｇ／ｍ１．
より少なくなる様に対数的に減じなければならない。こ
れらの基準は、例えば処理流量が１−１０００１Ｊツト
ル、流速が１分間に１０ｄから６リツトルまで、ｐＨが
２．０から１２．０の範囲で、またエンドトキシン濃度
が１１００ｎ／雁までといった、種々の製造業者が当面
する種々の処理条件の範囲により複雑になっている。

小ペプチドであるポリミキシンのようなある種の抗生物
質は、エンドトキシンに親和性があることが知られてい
る。それらを特異的エンドトキシン吸着剤として使用す
るには、該抗生物質が除去工程の間にエンドトキシンに
接触するように結合できる支持部材が必要である。従っ
て、抗生物質のエンドトキシンに対する親和性の現象を
有効に利用するエンドトキシン除去用の吸着材を用いる
ための支持部材が特に求められていた。

種々の既知の生物学的及び合成工程を用いて製造された
バイオテクノロジー生産物を精製する系であって実際に
採用でき、製造業者の特別な要求を満たす様に改良でき
るものも求められている。

本発明はこの要求にも関する。

本発明は大規模な商業的なりロマトグラフィでの分離を
経済的に行うことを可能にする改良された分離部材に関
する。

本発明は、生物学的若しくは合成工程のいずれかを用い
て製造されたバイオテクノロジー生産物を精製するのに
用いる、改良された部材に関するものである。特に本発
明は、多孔性の親水性基材であるアガロースでコーティ
ングされた比較的大きな外部表面積を有するガラス繊維
に関する。該コーティング繊維は、多くの既知の配位子
や生物学的材料の１つを該コーティングガラス繊維に結
合させることができるように修飾することができる。

該アガロースコーティングガラス繊維は生物化学的分離
に一般的な援助手段として用いられる。

該アガロースは多孔性であり、アフィニティークロマト
グラフィーでの使用のために、種々の配位子や生物学的
材料を結合して改良することができる。特に、アガロー
スを水中に分散し、熱い粘稠な溶液を製造するために加
熱する。該溶液をガラス繊維製造工程中若しくはガラス
繊維製造工程後のいずれかでガラス繊維にコーティング
する。該アガロースはガラス繊維表面上で冷えてガラス
繊維表面に接着する。

本発明の１態様は、エンドトキシンをクロマトグラフィ
ーの工程で除去するのに用いる為に、ポリミキシンＢの
様な抗生物質をアガロースコーティングガラス繊維上に
固定することに関する。エンドトキシンの混入した物質
を、抗生物質で修飾したアガロースコーティングガラス
繊維上を通過させる。エンドトキシンはアガロースコー
ティングガラス繊維に吸着されてその物質から除去され
る。

アガロースコーティングガラス繊維は分散容易であり、
卓越した流動特性を示す。ガラス繊維で達成可能な低充
填密度は高押し出し量でのクロマトグラフィー処理を可
能にする。ガラス繊維の卓越した機械特性も、流動特性
に好ましい寄与がある。

本発明のアガロースコーティングガラス繊維は、例えば
、静脈注射用の溶液を分散させるのに用いる使い捨ての
高性能フィルター装置や病院の薬局で処方箋に従って調
剤する場合に用いる使い捨てのフィルター装置等の、病
院における高性能フィルター装置としても有用である。

すでに混合された静脈注射用の溶液を製造業者から購入
する場合にも、若しくは病院の薬局が独自の静脈注射用
溶液を調製する（処方箋に従っての調剤）にしても微生
物によるエンドトキシンの混入は現実に存在する。病院
では、細菌及び粒子が患者の血流に入るのを防ぐ目的で
、静脈注射用溶液に接続した導路フィルター（ｉｎ−１
ｉｎｅ　ｆｉｌｔｅｒｓ）を用いることが多いが、これ
らの導路フィルターはエンドトキシンが放出されるのを
常に防ぐわけではない。

さらに、種々の組み換えＤＮＡ医薬品やワクチンを製造
するため、遺伝子工学や医薬品会社には低エンドトキシ
ンの細胞培養液に対する需要がある。細胞培養液の製造
業者は、改良されたエンドトキシン除去系に興味がある
。本発明のコーティングガラス繊維は細胞培養培地市場
においても有用である。

本発明によれば、良好に分散されたコーティングガラス
繊維は、生物学的生産物の精製において有効なりロマト
グラフィー支持体として用いられる。該コーティングガ
ラス繊維は、卓越した機械強度と高い外部表面積ゆえに
、高押し出し量、高流速で適用する商業的ゲル支持体に
有利である。

さらに、活性化されたコーティング繊維は低水準の非特
異的な吸収を示し、最終産物を含む溶液から充分量の混
入物を除去することができる。特にガラス繊維の高い外
部表面積及び非圧縮性がクロマトグラフィーのカラム分
離における高押し出し量を与える流特性での著しい優位
性を与える。またガラス繊維の直径とコーティング厚み
を調節することにより、分離能とカラム流で有利となる
。

本発明には適当な長さに形成され切断できるものならば
、いかなるガラス繊維でも用いることができる。ここで
用いるガラス繊維という語は、１以上の溶融ガラス流を
射出させることにより形成されるフィラメントの意味で
あり、その様なガラス繊維フィラメントが切られたり切
断される場合には形成されたガラスを短長に成形するこ
とも意味する。本発明の好ましい具体例では、ばらばら
に配列され大きさも不揃いな、切断された約１／４″の
長さのガラス繊維を使用した。ガラス繊維は非圧縮性、
高い外部表面積、肉眼的長さ、顕微鏡的直径、及び親水
性の表面等の利点を有する。

充填されたガラス繊維は、良好な流分散特性を示す。該
ガラス繊維は、従来のクロマトグラフィー部材が通常う
まく行かないような高流速でも良好に機能する。アガロ
ースコーティングガラス繊維は、典型的タンパク質に対
して測定可能な量の非特異的吸着を示さなかった。

不揃いに充填されたガラス繊維は、球状の充填材（通常
は５０％）と比べて、低い密度（５１０％）を有する。

該ガラス繊維で達成可能な低い充填密度は、高い押し出
し流量でバイオテクノロジーの生産物の処理及び精製を
可能にする。カラム充填の間の繊維の一定の分散は、重
大な流路形成なしに充填された繊維を通過するカラム流
を生じる助けとなる。

本発明はカートリッジ全体を製造業者が製造工程に導入
可能である点で簡易に使用できるカートリッジ構造のク
ロマトグラフィーカラムとしても利用できる。

さらにアガロースコーティングガラス繊維は、溶解した
物質を吸着により除くのと同様に粒子を濾過で除くのに
用いる吸着性の濾紙として用いるガラス布に成形するこ
とができる。

本発明を使用することにより、種々の生物学的材料を固
定して新規な複合物を製造することもできる。これらの
生物学的材料としては動物細胞、抗体、抗生物質、抗原
、炭水化物、細菌、補酵素、酵素、黴、微生物細胞、植
物細胞、組織培養物、若しくは酵母を挙げることができ
る。以下の例は、エンドトキシンの除去に用いるアガロ
ースコーティングガラス繊維上のポリミキシンＢの固定
に関して、本発明品の製造方法及び使用方法について記
載したものである。例えば、エンドトキシンは、流れて
いるプロセス流から活性化されたコーティング繊維上に
吸収される。エンドトキシンの供給濃度は、１７００ｎ
ｇ／ｍｊ！から０．１ｎｇ／−未満に減少する。活性化
されたコーティング繊維の受容能は、１３３，０００ｎ
ｇＩンドトキシン／ｇガラスである。

本発明のクロマトグラフィー部材は従来の、及び組み換
えＤＮＡ工学で製造された生産物からエンドトキシンを
除去したり、またアンチトロンビン■、第８因子、及び
アルブミンのような血中タンパク質を精製するのに有用
である。それぞれに特異的に応用するために、アガロー
スコーティングガラス繊維は分離される生産物に特異的
に親和性を有する物質で修飾される。

クロマトグラフィー工程を商業的にふされしいものとす
る為に満足すべきいくつかの要求としては、他のタンパ
ク質を浸出したり、吸着してはならず、かつ最終の製品
中のエンドトキシンを０．１ナノグラム／ｍ！！、より
低くしなげればならないという系の要求を挙げることが
できる。本発明によれば、生物学的材料の浸出は十分の
一以上の濃度で検出されることはなかった。

ガラス繊維は、アガロースで以下の様にコーティングさ
れる。アガロースを好ましくは２−４重量％で水中に分
散し、熱い粘稠溶液を製造するために約７０℃に加熱す
る。該アガロース溶液をガラス繊維製造工程若しくはガ
ラス繊維製造工程の後のいずれかで、ガラス繊維上にコ
ーティングする。該アガロースコーティングガラス繊維
を冷却し、ガラス表面で冷えた該アガロースは多くの水
素結合を介してガラス表面に接着する。該アガロースコ
ーティングガラス繊維はこのようにして比較的均一な大
きさを持つ生物学的に不活性な素材を形成する。

該アガロースコーティングガラス繊維は、アフィニティ
ークロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーの様な
りロマトグラフィーでの分離工程で有用である。該アガ
ロースコーティングガラス繊維は最終使用者自身の分離
の必要性のために生物学的ｖＪ料を固定するのに用いる
ことができる。

該アガロースコーティングガラス繊維は特定の製品を分
離したり精製したりするように設計された固定された抗
体、抗生物質配位子若しくはタンパク質で修飾すること
ができる。該アガロースコテインクガラス繊維は製造工
程に実質的にいかなる改変もせずに製造プロセス流に加
えられるカドリッジ方式で供給することもできる。

ガラス繊維上へのポリミキシンＢの固定は、以下の様に
して行うことができる。水サイジングされた（ｗａｔｅ
ｒ　５ｉｚｅｄ）　Ｅ　Ｋ　６．７５ガラスストランド
を４％のアガロース／水溶液を用いてオフラインコーテ
ィングした。コーティングしたストランドをデオキシコ
レ−）（ＬＭ）溶液ですすぎ、引き続いて該ストランド
が臭化シアン（ＣＮＢｒ）で活性化する前に汚染されて
いないことを確実にするためパイロジエン非含有水です
すいだ。

該アガロースコーティングガラス繊維ストランドを２Ｍ
リン酸緩衝液中１００　ｍｇ／ｄのＣＮＢｒ溶液（ｐＨ
約１１）で１時間処理して活性化し、その後該ガラスを
パイロジエン非含有水、さらに０．１ＭのＮａ１ｌＣＯ
３中０．５ＭのＮａ’ＣＩ　（ｐ　Ｈ約９．０）ですす
いだ。ポリミキシ’−’　（０，５Ｍ　　ＮａＣ１／　
０．１　ＭＮａＨＣＯ３中２００　ｍｇ／ｄ）を４℃で
終夜反応させた。

過剰のポリミキシンをパイロジエン非含有水を用いてす
すぎ、１Ｍグリシン溶液で１時間処理して未反応のイミ
ド部位を全てふさいだ。この段階で該コーティングガラ
ス繊維をパイロジエン非含有水を用いてすすぎ、水若し
くはデオキシコレ−１〜中に４℃で保存することができ
る。

以下の例は、ガラス繊維をどのように・コーティングす
ることができるかを示すものである。

２％及び４％のアガロース（シグマ社製＃Δ３７６８）
の水溶液を、Ｊ−７ストランドガラス上にホットメルト
ケムサイズ（ｃｈｅｍｓ　ｉ　ｚｅ）アプリケーターを
用いてコーティングする。該溶液の温度を約８０°±５
℃に維持し、アプリケーターの温度を約６０°±５℃と
する。該アガロースの温度を約７０℃に加熱することが
好ましい。

４００繊維／ストランドから成るパッケージもスプリッ
トストランドを合わせることにより製造できる。これら
の例におけるコーティング重量を強熱減量試験（ｌｏｓ
ｓ　ｏｎ　１ｇｎ１ｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｓ、　ＬＯＩ）
で測定して第１表に示した。少なくとも総重量の約１％
アガロースまでのコーティング゛重量を達成した。第１
表に示される様に、アガロースコーティングの重量パー
セントは２−４％の範囲とすることができる。

オフラインコーティング工程を用いることにより、高重
量のアガロースが達成される。該ガラスストランドをア
ガロース溶液中に浸漬し、ストリッピング染料を通過さ
せ、スプール上で湾曲させる。第２表には、これらの例
のコーティング重量についての情報も載せである。

第１図及び第２図は、エンドトキシン除去系の工程図で
ある。ガラス繊維を多孔性の親水性アガロースゲルでコ
ーティングした。アガロースの機能は、表面積を増加さ
せ、生物学的に不活性な表面を与えることである。

２種の化学的結合方法、すなわち第１図に示される臭化
シアンによる活性化若しくは第２図に示される塩化スル
ホニルによる活性化が示されている。

臭化シアンによる活性化では、アガロース中のビシナル
ジオールが反応して比較的安定なイミドカーボネート活
性中間体を形成する。求核的条件下にアミン（ポリミキ
シンＢ）で攻撃を受けると該アミン（ポリミキシン）は
イソ尿素結合で固定される。該結合は速やかに形成され
、中性のｐＨで安定である。

ＣＮＢｒでの修飾工程は、以下の通りよした。２Ｍリン
酸カルシウム緩衝液中１００　ｍｇ／ｍＥのＣＮＢｒ（
ｐＨ１１，５−１２，０）；　ＩＭ　　ＮａＨＣ［］３
３００．５ＭＮａＣ１（ｐＨ８，３）　　；　）リス緩
衝液中１Ｍグリシ７　（ｐＨ８，０）；　２Ｍ　　リン
酸力ｒＪウム緩衝液（ｐＨ１１，５−１２，０）；ＩＭ
　　ＮａＨＣＯ３＋０．５ＭＮａＣｌ中２００ｍｇ／ｍ
ｆポリミキシンＢ（ｐＨ８，３）；０．ＩＭ）リス緩衝
液（ｐＨ８，０）＋１％ナトリウムデオキシコレート　
（デオキシコール酸）のストック溶液を作成した。

Ｇ ０、０５　ｍＥのＣＮＢｒストック溶液と５ｍｌのリン
酸緩衝液の比率で、試料を完全に覆う（滅菌容器中で）
のに充分な量の溶液を用意した。試料を攪拌下に１時間
ＣＮＢｒ／リン酸溶液中に浸漬し、その後パイロジエン
非含有の水で３回、０．　Ｉ　Ｍ　　ＮａＨＣＯａ＋１
．５Ｍ　　ＮａＣｌで１回すすいだ。その試料を２００
ｍｇ／ｍのポリミキシンＢ溶液に浸し、２４時間浸漬し
た。少なくともその時間の一部、該溶液をかき混ぜ若し
くは攪拌して水中若しくは冷蔵庫中に保った。該試料を
パイロジエン非含有水で３回すすぎ、その後ＩＭのグリ
シン溶液で１時間浸漬した。さらに３回パイロジエン非
含有水ですすぎ、デオキシコレート溶液中に試験の準備
ができるまで浸漬した。そして、エンドトキシン除去試
験の直前にパイロジエン非含有水で３回すすいだ。

第２図に示したように、塩化スルホニルもアガロースを
活性化するのに用いられる。該塩化スルホニルは、アミ
ン上の水酸基と反応してスルホネートエステルを形成す
る。該スルホネートエステルは、異なった電子吸引基を
有する塩化スルホニルを選ぶことにより、反応性をさら
に高めたり低めたりするというような要求に応じること
ができる。形成される中間体は、所望の程度にさらに反
応性高めたり低めたりすることができる。該スルホネー
トエステルは酸性若しくは塩基性条件下で１級アミンの
攻撃を受け、できた結合は２級のアミン基となる。塩化
スルホニルでの活性化すると加水分解の攻撃に抵抗性で
、かつ広範なｐ　Ｈでも変化を受けない結合（２級アミ
ン）が生じる。塩化スルホニル反応を用いる利点の一つ
は、該塩化スルホニル化合物は、例えば臭化シアンの様
な他の化合物よりも取扱に危険が少ないということであ
る。

４種の異なった塩化スルホニル；ｐ−ニトロフェニル、
トシル、ペンタフルオロベンジル、及びトリイソプロピ
ルベンジルについてアガロース活性化能を試験した。４
種のうちではｐ−ニトロフェニルが充填量水準が最高で
あり、それに続いてトリイソプロピルベンジル、トシル
、ペンタフルオロベンジルであった。生成したペンタフ
ルオロスルホネートエステル中間体は非常に反応性であ
った。

塩化スルホニルを活性化するには非プロトン性溶媒を使
用することが必要である。第一の試験では、５％トリエ
チルアミン／酢酸エチル中で活性化した。トリエチルア
ミンは、不溶性の塩化トリエチルアンモニウム塩を形成
することにより反応中に生成するＨＣＩを封じるように
作用する。他の試験では、いくつもの他の溶媒−ピリジ
ン、ジオキサン、メチルエチルケトン、ＴＨＦを試みた
。

ピリジン中では水中若しくはエタノール中程には膨潤し
ないものの、ピリジンは他の溶媒のいずれよりも膨潤の
程度が大きかった。

典型的な活性化工程では、デシケータ−中で減圧乾燥し
た２５グラムのアガロースと１２．５グラムのｐＮＰｈ
ヲ１　０　０　ｒｄのピリジン中に分散した（ピリジン
が酸捕捉剤として作用するので、トリエチルアミンは必
要としない）。該反応混合物を緩やかに振った。ピリジ
ンを濾過し、該アガロースを蒸留水中に懸濁し、完全に
分散した。該アガロースを自然濾過し、水洗をくりかえ
した。該アガロースは最終的に吸引しつつ１１の蒸留水
ですすいだ。

活性化したアガロースは、その０．１ｇ（湿重量）を５
％の１、６〜ジアミノヘキサン１０．１ＭＮａＨＣ　Ｎ
ａＨＣＬ　　（　ｐＨ　１　１．　０　）溶液中で２時
間浸漬し、蒸留水で徹底的にすすぎ、ニンヒドリンで確
Ｓ忍するこ七により活性部位を確認した。深紫色はアガ
ロースが塩化スルホニルで非常に活性化されたことを示
す。該アガロースは湿った状態で活性部位の減少なしに
少なくとも３箇月間保存することができる。

第１表中、試料１　（コーティングしていないガラス）
と試料５は、エンドトキシン除去の効率をバッジ試験で
試験した。試料５は、ＣＮＢｒ，ポリミキシン、及びグ
リシンと反応させた。該バッジ試験では１０ｄのエンド
トキシン溶液中に２０ｒｎｇのガラスを浸漬させた。試
験したエンドトキシン溶液は、１、１０、１００，１０
００、１０，０００ｎｇ／ｍ１．の濃度であった。試料
１では、全ての溶液でエンドトキシンは除去されなかっ
た。試料５は２４時間後に１０，０００ｎｇ／ｍｆの場
合を除いて遊離のエンドトキシンの９９％を除去した。

試料５は１０．０００ｎｇ／ｍｆｆ溶液から９０％未満
のエンドトキシンを除去した。これらの結果は、薄いコ
ーティングでさえもかなりのエンドトキシンを除去する
ことを示す。試料５の受容力、Ｃ１は９９００ｎｇ＜Ｃ
＜９０，０００ｎｇ、若しくはガラス１グラムあたりに
換算すると４．９５Ｘ１０５ｎｇ＜Ｃ７ｇ＜４．５Ｘ１
０６％ｇであると評価された。

第２表は異なった種類のガラスが効果的にアガロースで
コーティングできることを示す。第２表中の試料３は、
貫通した穴が開けであるステンレス鋼管上で湾曲させで
ある。エンドトキシン溶液を管の中に汲み上げ、強制的
に穴から排出させ密集して充填されたストランドを通し
た。１．５力ラム体積／時間の流速で９９％のエンドト
キシンが除去された。

生物学的物質の精製では、滲出の問題、即ち関係のない
物質がプロセス流中に導入されることを避ける為に非常
な注意を払わなければならない。

滲出はクロマトグラフィー材量の化合物若しくはイオン
が、プロセス流で可溶化された場合に起こり、潜在的な
汚染の原因をつくりあげる。エンドトキシン除去系では
滲出可能な３成分、すなわち抗生物質若しくは抗生物質
のアミノ酸フラグメント、アガロース、及びガラス繊維
からの無機イオンがある。アガロースで完全にガラス表
面がコーティングされれば、無機イオンは問題とはなら
ない。さらに通常の分析でガラス表面から滲出するいか
なるイオンも検出できる。

第３表中、低濃度における抗生物質ポリミキシンは、４
種の異なった方法、すなわちＵＶ−スペクトル、ニンヒ
ドリン試験、コマジ−ブルー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ　Ｂ
ｌｕｅ）染色、及びピアス社（ＰｉｅｒｃｅＣｏ、）よ
り販売されているタンパクＢＣＡアッセイを用いて検出
した。１ｇ／ｍｌという下限の濃度では、ポリミキシン
は溶液中で十分の−若しくは１０−６Ｍの水準まで検出
できる。ポリミキシンの検出感度を上げ、溶液中の低レ
ベルのアガロースを検出する方法を確立するため、試料
をＬＣＦＩＤ（液体クロマトグラフィー−フレームイオ
ン化検出）で試験した。ダイレクトプローブ（ｄｉｒｅ
ｃｔ　ｐｒｏｂｅ）質量スペクトル装置を用いることに
より、ポリミキシンとアガロースの両者は１１００ｎ／
ｍ１．の水準で検出された。

第４表中、全２５カラム体積の水若しくは緩衝液を使用
中及び使用後におけるコーティングの完全性を試験する
ためにさらに実験を行った。試料はすべて１グラムのガ
ラスからなり、カラム体積は１ｍ１．の溶液として定義
した。５種の異なった試料をそれぞれ５力ラム体積のエ
ンドトキシン非含有水（ｅｆｗ）で洗った。ポリミキシ
ンとアガロースの試験のために、緩衝液はｐＨ４，５，
７，０、若しくは９．０の０．１　Ｍ　’Ｊン酸とした
。無機イオンの試験には、エンドトキシン非含有水（ｅ
ｆｗ）はｐＨを酢酸（ＨＯＡｃ）で４．５、及び水酸化
アンモニウム（ＮＨ，ＤＨ）で９．５とした。エンドト
キシン非含有水をｐＨ７のアッセイに使用した。

第１のカラム体積の緩衝液に加えて、１５番目のカラム
体積の緩衝液を集めた。５−カラム体積のｅｆｗすすぎ
液をカラムに通し、最後の１ｍｌ溶液を集めた。そして
、これらの試料についてＢＣＡのタンパク試験を行った
。緩衝イオンにより引き起こされる妨害が生じる場合に
は、試料を凍結乾燥して（ｆｌＯＡｃとＮｌ（、叶はと
もに揮発性の緩衝剤である）、ｅｆｃ中に再度■濁して
妨害を軽減する。

集めた試料についてＢＣＡ試験を実施し、その結果を第
４表に示した。いずれの緩衝条件下でも溶液中に測定可
能な量のポリミキシンは存在しなかった。緩衝液で行っ
たコントロールは、該緩衝液がアッセイ条件に影響しな
いことを示す。これらの結果は、ｐｐｔのレベルに至る
まで溶液中にポリミキシンは検出されなかったことを示
す。

上述の操作は塩化スルホニルでアガロースを前もって修
飾するのに用いられる。至適なコーティングの特性とし
ては、例えば高押し出し量で溶液からエンドトキシンを
さらに効果的に除去する薄いコーティング；低押し出し
量で最高にエンドトキシンを除去する厚いコーティング
を挙げることができる。

以下の例は、本発明のコーティング繊維の種々の使用法
を示す為に挙げたものである。示されたこれらの例は限
定的な意味に解釈されるべきではなく、また、他の種々
の使用は本発明の範囲に包含されるものである。

実施例１ ポリミキシンで活性化した本発明のコーティングガラス
は、エンドトキシンに特異的な吸着剤として有用である
。エンドトキシンの吸着の試験をするコーテイング材を
アガロースとした。本部材についてポリミキシンで活性
化したもの及び、しないものの両者を試験した。既知量
の吸着物質及びエンドトキシン含有溶液を含むフラスコ
を用いて得たこれらの試験結果を第５表に示す。これら
の試験で示された結果の１つとしては、ポリミキシンで
活性化された物質は活性化していない物質よりも相当に
多いエンドトキシンを吸着するということがある。

流れているプロセス流からエンドトキシンをポリミキシ
ン活性化アガロースコーティング繊維上に吸着させるカ
ラム実験を行った。第３図にはカラムに供給した体積に
対してエンドトキシンの濃度を比較してエンドトキシン
吸着の漏出分布を示した。本試験で供給時の濃度は１７
００ｎｇ／ｍｆｆ、流速０．５ｍＥ１分、ベツド体積は
２５ａｌｌ！とじ、充填重量を６ｇガラスとした。第４
図は、第３図に示されたグラフの最初の部分の拡大図で
ある。木材は、供給したエンドトキシンの濃度を１７０
０ｎ　ｇ　／　ｗｄ！、からＱ、ｌｎｇ／ｍ１２より低
く減じるのに有効であった。これは、エンドトキシンの
除去パセントに関して、及び許容されない程に高い水準
の供給したエンドトキシン濃度を１回の通過で０．１ｎ
ｇ／ｍ１２より低く減じることに関して卓越した性能で
ある。漏出曲線の外挿により木材の総受容能を評価する
と、１３３，０００ｎｇエンドトキシン／ｇガラス繊維
である。許容されるエンドトキシンの濃度を０．１ｎｇ
／ｍｎと仮定すると、本部ラムの有効な受容力は４９，
０００ｎｇエンドトキシン／ｇガラスである。

実施例２ 未コーティング、及びコーティングのガラス繊維材の吸
着を一連の少量バッチ試験で試験した。

これらの部材の−について（ポリミキシン活性化アガロ
ース）漏出分布を得るためにカラム試験を行った。溶液
中のエンドトキシン濃度を色原体の定量的ＬＡＬアッセ
イ方法（ライタカー、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を用い
て決定した。

エンドトキシン吸着の少量バッチ試験を行った。

すなわち、エンドトキシンのストック溶液をＥ。

ｃｏｌｉ０５５：Ｂ５由来のりポポリサッカライドＮｏ
、Ｌ−２６３７（シグマケミカル社製、セントルイス、
ＭＯ）を用いて調整した。繊維部材の所望量をエンドト
キシンの存在しないガラス管中に置いた（アガロースコ
ーティング繊維を２００ｍｇ）。

エンドトキシンのストック溶液を所望の当初濃度に希釈
し、その後、繊維部材を入れた容管に５ｄずつを加えた
。繊維部材を該エンドトキシン溶液に室温で３０分接触
させ、引き続き渦を起こして激しく攪拌した。接触時間
の最後に、上清を希釈してエンドトキシンのアッセイが
できる範囲（０，１−０，１ｎｇ／ｄ）として７　ッセ
イを行った。

エンドトキシン吸着の少量バッチ試験の結果は以下の通
りである。すなわち、アガロースコーティング繊維につ
いては、ポリミキシンによるエンドトキシンの特異的吸
着を非特異的吸着と比較した。結果を第６表に示す。表
から判るように、ポリミキシンで活性化されたアガロー
スコーティングガラス繊維は、ポリミキシンなしのアガ
ロースコーティング繊維よりも繊維重量あたり　（ｎｇ
／ｍｇ）はるかに多くのエンドトキシンを吸着した。

実施例３ 以下の様にして、カラムの調製及び吸着試験を行った。

すなわち、アガロースコーティングガラス繊維を直径２
．５　ｃｍのガラスカラムに流特性試験の場合と同じよ
うにして充填した。ベツド長を１０ｃｍとした。カラム
及びポンプの取り入れ口からフラクションコレクターに
つながる管に、約１０ベツド体積の１％デオキシコレー
ト溶液、弓き続いて２０ベツド体積のエンドトキシン非
含有水を通して洗浄した。流速約３ｍ１Ｚ分で洗浄を行
った。カラムの流出液について、エンドトキシン及びデ
オキシコレートを含有しないことを確認するために試験
した。この時点で、該カラムはエンドトキシンを含有せ
ず、吸着試験に用いることができると判断された。エン
ドトキシンを含有する供給液を選ばれた流速でカラム中
に通した。流出液フラクション（２０ｒｄ）をエンドト
キシン非含有のガラス試験管に自動フラクションコレク
ターを用いて集めた。該供給液及び集めたフラクション
のエンドトキシンをアッセイした。

アガロースコーティング、ポリミキシン活性化ガラス繊
維によるエンドトキシンの除去の漏出分布を第５図に示
す。この試験では、供給濃度を１７００ｎｇ／ｍｆ、流
速を０．５ｍ１．／分、ベツド体積を２５ｍ１！とじ、
充填量を６ｇガラスとした。これによりアガロースコー
ティング繊維について総エンドトキシン受容力及び有効
エンドトキシン受容力を評価した。総受容力は全ての利
用可能な部位が用いられた場合に吸着できる量である。

有効受容力は、第７表に示される様に、流出濃度が許容
できる最大限を越える前に吸着されたエンドトキシンの
量と定義できる。

実施例４ アガロースコーティング繊維によるタンパクの非特異的
吸着をインシュリン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を用いて試験した。ピアスケミカル社製のタンパクアッ
セイをタンパク質濃度測定に用いた。試験したどの例も
コーティング中にポリミキシンを含有しなかった。これ
らの実験は少量のエンドトキシン吸着バッチ試験と同様
に行った。非コーテイング、若しくはコーティング繊維
の至適量を計り、ガラス管中に入れた。タンパク溶液（
５−１０ｍｌｌりを加え、時々攪拌して３０分接触させ
た。接触させた後の溶液をアッセイし、当初の溶液から
の差異を計算して吸着したタンパク量を決定した。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びインシュリンのタン
パク吸着はコーティング及び非コーテイングガラス繊維
のいずれにも生じた。凝集相（ｂｕｌｋ　ｐｈａｓｅ）
の濃度が低い場合には吸着は検出できなかった。これは
、凝集相から除かれるタンパク量が大量ではないという
ことによる。第８表は試験した材料のタンパク吸着の結
果を示す。

実施例５ アガロースに固定したポリミキシンＢの市販試料をカラ
ムに充填し、クロマトグラフ試験によりエンドトキシン
除去を空間速度（ｓｐａｃｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）の関
数として試験した。カラム試験を、アガロスに固定した
ポリミキシンＢの市販試料で行った。

エンドトキシンの除去を流速の関数として測定してベー
スラインとし、それに対して試験繊維を比較した。ガラ
ス繊維のカラム試験により、該試料は空間速度が１時間
あたり０．１及び０．５の場合に１００％のエンドトキ
シンを除去することが判る。

実施例６ ガラス繊維をオフラインコーティング工程を用いてアガ
ロースでコーティングした。アガロースコーティングガ
ラスストランドを、コーティング工程の間に細首したエ
ンドトキシンを除去するために硬化後にｐＨ８の１％デ
オキシコレートの溶液に浸漬した。オフラインコーティ
ング工程でコーティングした試料についてのバッチ試験
は、デオキシコレート溶液に浸漬した試料は活性が低下
しないことを示す。

実施例７ 架橋剤溶液を加えた後、ストランドを清潔なフード中に
置き、室温で４時間硬化させる等、コーティング工程に
種々の変更が可能である。その後該ストランドをコーテ
ィング工程の間に付着したエンドトキシンを除去するた
めに１％デオキシコＬ／−トの溶液（ｐＨ７）に浸漬し
た。この改良コーティング方法を用いることにより、高
い活性が得られる。該ストランドをオフラインコーティ
ングし、バッチ試験でさらに高い活性が得られた。

該ストランドをカラムに充填した。エンドトキシン非含
有水をカラムに通しても汚染は全く生じなかった。

実施例８ さらに行った試験の結果から、ポリミキシンＢを固定し
たアガロースコーティングガラス繊維ストランドは、８
時間の間に０．２５から１０時間の空間速度で溶液から
９９％を上回るエンドトキシンを除去することが示され
た。種々の流速及び時間で、９９％を上回るエンドトキ
シンが除去された。該カラムは４０時間の試験で再生さ
れなかったことから、これらの結果は、４０ｍ１のカラ
ムの実際のエンドトキシン受容力は１．５　ｍｇを上回
ることを示すものである。典型的な工業溶液は１−当た
りｌ−１０００ナノグラムを含む。

実施例９ コーティングの第２の試験としてアガロースでオフライ
ンコーティングした種々のストランドを用いた。これら
のコーティングは厚くし、かつ系の総重量の３０−５０
％とした。コーティングしたストランドは臭化シアンを
用いて活性化した。

活性化したストランドはどのようなタンパクにも結合で
きる一般的な（ｇｅｎｅｒｉｃ）支持体を含む。活性化
したストランドを、その後ポリミキシン中に浸漬し、該
ポリミキシンはアガロース表面のシアノ基と結合した。

実施例１０ ポリミキシン−アガロース−ガラス複合材の一部を、固
定したポリミキシンの存在を定量的に測定するタンパク
試験に用いた。残りのストランドをクリシン（アミノ酸
）で洗って未反応のシアノ基をすべて中和した。その後
これらのストランドについてエンドトキシン除去活性を
測定した。得られた繊維は、選択的に９９％を上回るエ
ンドトキシンを除去し、非特異的吸着はほとんどなかっ
た。１７００ｎｇ／ｍｆ！、を含有する溶液は０．１を
下回るエンドトキシン水準に精製された。該カラムの受
容力は約１０６ナノグラムであった。アガロースコーテ
ィングガラスを架橋剤に接触させる濃度及び時間を調整
した。各１グラムのガラスを１ないし４ｍｇの架橋剤／
ｒｎＩ！、の１０ｍ１の溶液に１ないし４時間浸漬する
と良好な結果が得られた。

実施例１１ 他の試験で、ガラス繊維ストランドをアガロスでオフラ
インコーティングし、その後切断し分散してスラリーを
形成した。該スラリーをカラムに注ぎ、その後修飾して
ポリミキシンをカラム充填剤に結合させた。コーティン
グされ臭化シアンによる活性化でポリミキシンを結合さ
せた該ガラスストランドについてエンドトキシン除去試
験を行った。該ガラスストランド試料は、５０％から９
０％の間で供給されたエンドトキシンを除去した。

実施例１２ ビス（２−ハイドロキシエチル）アミノプロピルトリエ
トキシ−シランで処理しであるガラス試料を活性化する
のにｐ−二トロベンゼンスルホニルクロリドを用いた。

これらの試料をポリミキシンと反応させ、溶液からエン
ドトキシンを除去する能力を試験した。上記の処理を施
した該ガラスストランドは、９５％から９９．５％の間
で供給されたエンドトキシンを除去した。

さらに、形成工程の間のコーティングをより均なアガロ
ースコーティングで置き換えることもできることが試験
により判る。単孔ブツシュ（ｓｉｎｇｌｅ−ｈｏｌｅ　
ｂｕｓｈｉｎｇ）試験では、アガロースはガラスストラ
ンド上にコーティングされ、エンドトキシン除去のため
に修飾した後にも満足のい（ものであることが判明した
。

以上のことから、本発明に種々の改良が可能であること
が明らかであろう。もっとも、それらは本発明の範囲内
と考えられるものである。

第 表 ティング重量、 オフライン Ｒカラス布 ５０．７ ２゜ Ｓ　カラス布 ４１゜１ ３゜ ＢＫ６．７５　　ストランド ２５．４ ４゜ Ｇ７５ ストランド ４４．９ 第 表 総受容力 １３３０００ｎ　ｇ／証ガラス 有効受容力 ０．１ｎｇ／１ｆｆ ４９、０００　ｎ　ｇ　／　ｇガラス Ｏｎｇ／ｄ ５６、０００ｎ　ｇ　／　ｇガラス

【図面の簡単な説明】

第１図は、エンドトキシン除去系の１例の工程図である
。 第２図は、エンドトキシン除去系の他の例の工程図であ
る。 第３図は、カラム試験において吸着されたエンドトキシ
ン吸着の漏出分布をグラフで示したものである。 第４図は、第３図の拡大図である。 第５図は、アガロースコーティングポリミキシン活性化
ガラス繊維でのエンドトキシン吸着の漏出分布をクラブ
で示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物試料分離工程において毒素類を除去するのに
   有用なカラム充填材若しくはクロマトグラフィー部材で
   あって、好適な配位子若しくは生物学的材料を結合する
   ために修飾されたアガロースを含む多孔性の親水性基材
   でコーティングされた複数のガラス繊維を含むことを特
   徴とする、カラム充填材若しくはクロマトグラフィー部
   材。 （２）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、抗
   体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素、
   黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母から
   なる群から選ばれる請求項１記載の部材。 （３）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含む
   、請求項１記載の部材。 （４）該抗生物質がポリミキシンＢを含む、請求項３記
   載の部材。 （５）好適な配位子若しくは生物学的材料を結合するた
   めに修飾されたアガロースを含む多孔性の親水性基材を
   含むコーティングを表面に有するガラス繊維。 （６）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、抗
   体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素、
   黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母から
   なる群から選ばれる請求項５記載のガラス繊維。 （７）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含む
   、請求項６記載のガラス繊維。 （８）該抗生物質がポリミキシンＢを含む、請求項７記
   載のガラス繊維。 （９）該アガロース基材が少なくとも約１重量％の量で
   含まれる、請求項５記載のガラス繊維。 （１０）該アガロース基材がホットメルトの形態で該ガ
   ラス繊維の表面に付されている、請求項５記載のガラス
   繊維。 （１１）該アガロース基材がオフラインコーティング工
   程で該ガラス繊維の表面に付されている、請求項５記載
   のガラス繊維。 （１２）アガロース基材コーティングガラス繊維を臭化
   シアン若しくは塩化スルホニルのいずれかで活性化して
   抗生物質をガラス繊維に固定することにより該アガロー
   ス基材コーティングガラス繊維表面に該抗生物質を結合
   させた、請求項７記載のガラス繊維。 （１３）該配位子若しくは生物学的材料を結合するため
   に修飾されたアガロースを含む多孔性の親水性基材でコ
   ーティングされたガラス繊維上に固定された配位子若し
   くは生物学的材料を含む生物学的複合部材。 （１４）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、
   抗体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素
   、黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母か
   らなる群から選ばれる、請求項１３記載の複合部材。 （１５）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含
   む、請求項１３記載の複合部材。（１６）該抗生物質が
   ポリミキシンＢを含む、請求項１３記載の複合部材。 （１７）該基材がコーティングされたガラス繊維を臭化
   シアン若しくは塩化スルホニルのいずれかで活性化する
   ことによりアガロース基材コーティングガラス繊維に該
   抗生物質を固定した、請求項１５記載の複合部材。 （１８）好適な配位子若しくは生物学的材料を結合する
   ために修飾された多孔性の親水性基材でコーティングさ
   れた複数のガラス繊維を含む、生物試料分離工程におい
   て有用なカラム充填材若しくはクロマトグラフィー部材
   。 （１９）該多孔性親水性基材がアガロース、ポリアクリ
   ルアミド、デキストラン及びハイドロキシアルキルメタ
   クリレートからなる群から選ばれる、請求項１８記載の
   部材。 （２０）該多孔性親水性基材がアガロースを含む、請求
   項１８記載の部材。 （２１）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、
   抗体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素
   、黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母か
   らなる群から選ばれる、請求項１８記載の部材。 （２２）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含
   む、請求項１８記載の部材。 （２３）該抗生物質がポリミキシンＢを含む、請求項２
   ２記載の部材。 （２４）好適な配位子若しくは生物学的材料を結合する
   ために修飾された多孔性の親水性基材を含むコーティン
   グをその表面に有するガラス繊維。 （２５）該多孔性親水性基材がアガロース、ポリアクリ
   ルアミド、デキストラン及びハイドロキシアルキルメタ
   クリレートからなる群から選ばれる、請求項２４記載の
   ガラス繊維。 （２６）該多孔性親水性基材がアガロースを含む、請求
   項２５記載のガラス繊維。 （２７）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、
   抗体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素
   、黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母か
   らなる群から選ばれる、請求項２４記載のガラス繊維。 （２８）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含
   む、請求項２７記載のガラス繊維。 （２９）該抗生物質がポリミキシンＢを含む、請求項２
   ８記載のガラス繊維。 （３０）該多孔性親水性基材が少なくとも約１重量％の
   量で含まれる、請求項２４記載のガラス繊維。 （３１）該多孔性親水性基材がホットメルトの形態で該
   ガラス繊維の表面に付されている、請求項２４記載のガ
   ラス繊維。 （３２）該多孔性親水性基材がオフラインコーティング
   工程で該ガラス繊維の表面に付されている、請求項２４
   記載のガラス繊維。 （３３）該基材がコーティングされたガラス繊維を臭化
   シアン若しくは塩化スルホニルのいずれかで活性化して
   ガラス繊維に該抗生物質を固定することにより該基材が
   コーティングされたガラス繊維表面に該抗生物質を結合
   させた、請求項２７記載のガラス繊維。 （３４）多孔性の親水性基材でコーティングされたガラ
   ス繊維に固定された配位子若しくは生物学的材料を含む
   生物学的複合部材。 （３５）該多孔性親水性基材がアガロース、ポリアクリ
   ルアミド、デキストラン及びハイドロキシアルキルメタ
   クリレートからなる群から選ばれる、請求項３４記載の
   複合部材。（３６）該多孔性親水性基材がアガロースを
   含む、請求項３４記載の複合部材。 （３７）該配位子若しくは生物学的材料が、動物細胞、
   抗体、抗生物質、抗原、炭水化物、細菌、補酵素、酵素
   、黴、微生物細胞、植物細胞、組織培養物、及び酵母か
   らなる群から選ばれる、請求項３４記載の複合部材。 （３８）該配位子若しくは生物学的材料が抗生物質を含
   む、請求項３４記載の複合部材。（３９）該抗生物質が
   ポリミキシンＢを含む、請求項３４記載の複合部材。 （４０）該基材がコーティングされたガラス繊維を臭化
   シアン若しくは塩化スルホニルのいずれかで活性化して
   該多孔性親水性基材がコーティングされたガラス繊維に
   該抗生物質を固定した、請求項３８記載の複合部材。