CH642862A5 - Procede de preparation d'un materiau poreux. - Google Patents

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CH642862A5
CH642862A5 CH970078A CH970078A CH642862A5 CH 642862 A5 CH642862 A5 CH 642862A5 CH 970078 A CH970078 A CH 970078A CH 970078 A CH970078 A CH 970078A CH 642862 A5 CH642862 A5 CH 642862A5
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polymer
cellulose
modified
molecule
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Jean-Louis Tayot
Michel Tardy
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Merieux Inst
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Description

L'invention a pour objet un procédé de préparation d'un matériau poreux utilisable dans les colonnes de Chromatographie,
capable de fixer de façon réversible des macromolécules biologiques.
On connaît déjà une méthode pour capter sélectivement la toxine cholérique par Chromatographie d'affinité utilisant des colonnes d'agarose modifiées chimiquement pour fixer le ganglioside GMe par liaison covalente. Il s'est toutefois révélé difficile de récupérer cette toxine, en raison de son affinité extrêmement forte pour le GMe lié à l'agarose.
Pour remédier à cet inconvénient, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on forme sur un support minéral poreux un revêtement de polymère glucidique que l'on soumet à une oxydation périodique, que l'on fait réagir le produit d'oxydation ainsi obtenu avec la molécule ou macromolécule aminée de formule R'—NH2, et que l'on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine.
De préférence, on effectue un revêtement du support minéral poreux par le polymère polysaccharidique ou par le polymère poly-saccharadique modifié, si désiré on transforme le revêtement polysaccharidique modifié, on effectue si nécessaire une réticulation pour stabiliser le revêtement, on soumet ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié à une coupure oxydante, on fait réagir le produit d'oxydation ainsi obtenu avec la molécule ou macromolécule aminée de formule R'—NH2, puis on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine.
Le procédé décrit ci-dessus consiste donc notamment à fixer la molécule ou macromolécule aminée sur le revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié par la suite de réactions suivantes:
a) coupure oxydante des groupements a-glycol pour donner des dérivés carbonylés que l'on peut schématiser par la formule
R4—CHO, R4 étant le reste de la molécule polysaccharidique après la réaction de coupure oxydante b) réaction de la molécule ou macromolécule aminée sur les groupements carbonylés selon la réaction:
R4-CHO+R'NH2 - R4-CH=N-R'+H20
puis c) réduction de la liaison imine en liaison amine stable, par exemple par l'hydrogène naissant, selon la réaction:
R4—CH=N—R'+2H - R3-CH2-NH-R',
R3 étant défini comme précédemment.
Ces diverses transformations chimiques peuvent être effectuées à température ambiante dans une colonne de Chromatographie.
Pour la réaction de coupure oxydante, qui est connue en soi, on peut utiliser par exemple le tétraacétate de plomb, l'acide périodique ou un de ses dérivés, tel qu'un périodate alcalin.
Dans le cas où le polymère polysaccharidique modifié est un polysaccharidique aminé analogue au DEAE Dextran, il est utile, après la réaction d'oxydation, de saturer ces groupements cationi-ques par des ions, tels que des ions halogénure, pour éviter tout risque de perturbation de la réaction ultérieure de la molécule ou macromolécule aminée avec les groupements aldéhyde du support.
Pour la réaction de réduction, on peut utiliser par exemple un hydrure tel que le borohydrure de sodium.
Pour effectuer le revêtement du support minéral poreux par le polymère polysaccharidique ou par le polymère polysaccharidique modifié, on peut procéder par exemple comme décrit dans la demande de brevet principale, c'est-à-dire que l'on introduit dans une colonne de Chromatographie le support minéral poreux sous forme de poudre, on fait passer un tampon de pH 3 à 12, jusqu'à équilibre, on introduit une solution dudit polymère dans le même tampon, puis on élue jusqu'à absence de polymère dans les éluats, ou bien on imprègne le support minéral poreux à l'aide d'une solution aqueuse dudit polymère, à un pH compris entre 3 et 12, puis sèche à l'étuve entre 50 et 120° C jusqu'à poids constant.
Lorsque la molécule aminée R'—NH2, fixée sur le support poreux par le procédé qui vient d'être décrit, est un produit d'hydrolyse partielle ou totale d'un poly- ou monosialoganglioside, le procédé de l'invention comprend en outre un stade final facultatif de traitement acide du matériau obtenu, pendant un temps suffisant pour transformer ledit produit d'hydrolyse en produit d'hydrolyse correspondant d'un mono- ou asialoganglioside.
Pour effectuer ce traitement acide, on peut utiliser par exemple une solution aqueuse d'acide chlorhydrique de concentration supérieure ou égale à 0,1N.
Pour obtenir un revêtement de cellulose, il est avantageux d'opérer de la façon suivante: on imprègne le support minéral poreux à l'aide d'une solution d'un ester de cellulose, on sèche et soumet le support revêtu à l'action d'un agent d'hydrolyse, par exemple à l'action d'une solution aqueuse alcaline, de façon à hydro-lyser les groupements esters. On obtient de cette façon un support minéral poreux revêtu de la cellulose ainsi régénérée. Le revêtement de cellulose ainsi obtenu est très stable et tapisse parfaitement les pores du support minéral poreux. Il est inutile de stabiliser ce revêtement par réticulation.
Il est possible, à ce stade, de transformer le revêtement de cellulose en revêtement de cellulose modifiée en le faisant réagir avec un agent approprié, par exemple en faisant réagir avec un composé de formule:
Ri
X-(CH2)n-N^
R2
dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier entre 1 et 10, Ri et R2 représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxylé, et X est un atome d'halogène.
On peut par exemple faire réagir le support minéral poreux imprégné de cellulose avec la 2-chlorotriéthylamine, à pH alcalin, et obtenir ainsi un revêtement de diéthylaminoéthylcellulose.
L'invention a également pour objet le procédé de revêtement, sur un support minéral poreux, de cellulose ou de cellulose modifiée qui vient d'être décrit.
Le support minéral poreux utilisable selon l'invention doit avoir une porosité contrôlée bien définie. La surface interne du support doit être inférieure ou égale à 100 m2/g et si possible être comprise entre 5 et 80 m2/g. Le diamètre poreux moyen doit être supérieur ou égal à 25 nm et si possible compris entre 50 et 1000 nm, des intervalles plus précis pouvant être conseillés suivant le type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles, la surface interne du support devient inaccessible au polymère polysaccharidique aminé et, ultérieurement, aux macromolécules à séparer. Selon un mode préféré de l'invention, le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine, de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue, par exemple, selon les procédés décrits dans les brevets français Nos 1473239,1473240,1475929 et 1482867. On utilise par exemple des silices poreuses commercialisées par Rhône-Poulenc Chimie Fine sous les dénominations de Sphérosil XOB 030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives de 50, 25 et 10 m2/g.
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Le polymère polysaccharidique ou polysaccharidique modifié qui sert à imprégner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral a un poids moléculaire au moins égal à IO4 dal ton et de préférence compris entre IO5 et 10® dalton.
La présente invention a également pour objet le matériau poreux capable de fixer de façon réversible des macromolécules biologiques, obtenu par le procédé susdit.
Ces nouveaux matériaux solides poreux aptes à être utilisés comme phases stationnaires dans des colonnes de Chromatographie sont caractérisés par le fait qu'ils sont constitués par un support minéral poreux revêtu par un polymère polysaccharidique, ou par un polymère polysaccharidique modifié de formule schématique I:
Ri
R-(CH2)n—N ^ (I)
R2
dans laquelle R représente un reste de polymère polysaccharidique, n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, Rj et R2, identiques ou différents, représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxylé, ledit revêtement polysaccharidique étant si nécessaire à l'état réticulé pour favoriser sa stabilité, et par le fait que sur ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié se trouvent greffées des molécules ou macromolécules aminées capables de constituer un site réactif en Chromatographie, ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule R'—NH2, R' étant le reste de ladite molécule ou macromolécule aminée, la liaison de greffage de ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule schématique:
R3-CH2-NH-R'
R' étant défini comme précédemment et R3—CH2 représentant le reste dudit polymère polysaccharidique ou dudit polymère polysaccharidique modifié après que celui-ci a été soumis à une coupure oxydante suivie d'une réduction. Dans ce qui précède, on désigne par alkyle inférieur un radical alkyle ayant 1 à 4 et de préférence 1 ou 2 atomes de carbone.
Les polymères polysaccharidiques et polysaccharidiques modifiés utilisables pour réaliser le matériau solide poreux de l'invention sont des polymères polysaccharidiques modifiés ou non, capables de donner lieu à la réaction bien connue de coupure oxydante à l'aide d'agents oxydants tels que les périodates ou le tétracétate de plomb.
Selon des modes de réalisation préférés:
— le support minéral poreux est constitué notamment par un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie ou un oxyde de titane, ou par des dérivés synthétiques ou naturels de ces oxydes tels que les verres, les silicates, les borosilicates, le kaolin, etc.;
— le polymère polysaccharidique est notamment de la cellulose;
— le polymère polysaccharidique modifié est un polymère de formule I dans laquelle R est un reste dextrane, d'amidon ou de cellulose, et notamment le diéthylaminoéthyldextrane, DEAE Dextran, le diéthylaminoéthylamidon, ou la diéthylaminoéthylcellulose;
— le revêtement de polymère polysaccharidique est, si nécessaire, stabilisé par réticulation, l'agent réticulant étant par exemple un composé dicarbonylé, une halohydrine ou un diépoxyde, notamment le 1,4-butanedioldiglycidyléther, l'épichlorhydrine, l'épibrom-hydrine, ou un époxyde de formule:
r5
I
CH2-CH-R4-N-R6-CH-CH2
V
o o dans laquelle Rs est un alkyle ayant 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone, et R4 et R6 représentent une chaîne hydrocarbonée ayant 1 à 10 atomes, de préférence un radical alkylène inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone;
— la molécule ou macromolécule aminée de formule R'—NH2 pouvant servir de site réactif en Chromatographie peut être toute molécule porteuse de fonctions NH2 utilisable en Chromatographie d'affinité biospécifique, chimique ou physico-chimique. Il s'agit de molécules susceptibles de donner lieu à des interactions réversibles de type biospêcifique, chimique ou physico-chimique, par exemple des interactions ioniques, des interactions faisant intervenir des propriétés d'hydrophobie, des interactions faisant intervenir une affinité biospécifique ou chimique, par exemple la formation de complexes réversibles. La molécule ou macromolécule aminée peut avoir un caractère cationique susceptible d'être mis à profit dans des réactions d'échange d'anions; elle peut comporter des groupements anio-niques tels que des groupements carboxylique ou sulfonique, et donner lieu à des réactions d'échange de cations; elle peut être aussi une molécule ou macromolécule aminée pouvant servir de site réactif en Chromatographie biospécifique et constituer par exemple un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps. Ladite molécule ou macromolécule aminée peut être notamment une polyamine telle que la 3-diéthylaminopropylamine ou la N,N-di-éthyléthylènediamine, la taurine, l'acide a-aminocaproïque, la lysine, la phénylalanine, la phênylhydrazine, l'acide métaaminophénylboro-nique, les antigènes bactériens, les globulines, notamment les gammaglobulines, les toxines bactériennes, les virus ou leurs produits de dégradation tels que les produits d'hydrolyse des gangliosides possédant des fonctions NH2, en particulier les produits d'hydrolyse du ganglioside GMi tel que le lysoganglioside GM1, ou les produits d'hydrolyse partielle du ganglioside Gmi-
On sait que les gangliosides possèdent un groupement N-acyle (acyle dérivé d'un acide gras tel que l'acide stéarique) et au moins un groupement N-acétyle (en position 3 d'un fragment galactose), d'autres groupements N-acétyle portés par des molécules d'acides sialiques étant éventuellement présents. Ces groupements N-acyle ou N-acétyle sont partiellement ou totalement hydrolysables en groupements —NH2. Par analogie avec la nomenclature proposée par Svennerholm pour les gangliosides GMI, on désignera ci-après par lysogangliosides les produits obtenus par hydrolyse totale des groupements N-acyle et N-acétyle des gangliosides en groupements —NH2. Les produits d'hydrolyse partielle des gangliosides, dans lesquels certains groupements NH2 ont été désacylés ou désacétylés par hydrolyse alcaline, constituent des dérivés également utilisables comme molécules aminées pouvant servir de sites réactifs dans le matériau de l'invention. Il convient en outre de noter que les matériaux de l'invention sur lesquels se trouve fixé du lysoganglioside Gm1 sont capables de retenir la toxine cholérique même après des traitements en milieux fortement acides, par exemple à pH I. Or, il est connu qu'en milieu acide les gangliosides perdent une ou plusieurs molécules d'acide sialique et peuvent être transformés en monosialo- ou asialogangliosides (ou -lysogangliosides). Il en résulte que, pour fixer la toxine cholérique, on peut utiliser un matériau selon l'invention sur lequel on a fixé, comme molécule aminée de formule R'—NH2, un dérivé quelconque (dont les groupements N-acétyle et N-acyle ont été totalement ou partiellement hydrolysés pour faire apparaître des groupements NH2), à condition de soumettre ensuite ledit matériau à un traitement acide pendant un temps suffisant pour permettre la transformation des dérivés de polysialoganglioside en dérivés de mono- ou asialogangliosides.
L'invention a également pour objet l'utilisation du matériau susdit à la purification ou à la séparation des macromolécules biologiques.
D'une façon générale, on utilise les propriétés d'affinité de la molécule ou macromolécule aminée greffée sur le support, dans une colonne de Chromatographie, soit pour fixer sélectivement des macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier, soit pour retenir sélectivement des impuretés ou autres protéines non désirées.
Cette application est caractérisée par le fait que l'on fait passer dans une colonne contenant le matériau objet de l'invention une solution contenant les macromolécules biologiques que l'on désire s
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isoler ou purifier. Dans le cas où le matériau fixe les macromolécules biologiques que l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées avec une solution convenable, permettant de séparer, selon les méthodes connues, lesdites macromolécules biologiques d'avec la molécule R'—NH2 à laquelle elles sont fixées par affinité. Par exemple, dans le cas où les macromolécules biologiques à isoler sont fixées par affinité biospécifique sur un ligand, on sépare, selon les méthodes connues de séparation, les macromolécules biologiques d'avec leur ligand.
Bien entendu, selon la macromolécule biologique à isoler ou à purifier, on choisira un matériau poreux sur lequel est fixée une molécule R'—NH2 douée d'affinité pour ladite macromolécule biologique.
Dans le cas où le matériau fixe les impuretés, on recueille directement la macromolécule biologique désirée en solution, le matériau poreux étant alors revêtu d'une molécule aminée R'—NH2 douée d'affinité pour l'impureté que l'on désire éliminer. On peut ensuite éluer les impuretés avec une solution convenable et régénérer ainsi le matériau pour une nouvelle opération.
Lorsque la macromolécule biologique à isoler, ou l'impureté à retenir, est fixée sur le matériau de l'invention en mettant à profit les propriétés d'échange d'ions de celui-ci, l'élution de la molécule ainsi fixée est effectuée à l'aide d'une solution de pH et de molarité convenables.
Lorsque l'on ne désire pas utiliser les propriétés d'échange d'ions du matériau de l'invention, par exemple lorsque l'on veut utiliser uniquement les propriétés d'affinité biospécifique, il convient d'utiliser dans la colonne des solutions de force ionique suffisante, afin de neutraliser les fonctions échangeuses d'ions. Ainsi, dans le cas où le matériau de l'invention comporte des sites cationiques, il convient de neutraliser les groupement cationiques, par exemple par des ions Cl©, pour éliminer toute interaction non spécifique de type ionique.
Dans certains cas, il est possible de mettre à profit à la fois les propriétés d'échange d'ions et d'autres propriétés d'affinité, par exemple des propriétés d'affinité biospécifique, du matériau de l'invention pour séparer en une seule Chromatographie plusieurs protéines différentes. Par exemple, avec un matériau possédant à la fois des sites cationiques et des sites à affinité biospécifique, on peut aisément réaliser la séparation d'un mélange de trois protéines: une première protéine à caractère électropositif, une seconde protéine à caractère électronégatif et une troisième protéine capable de se fixer sur les sites d'affinité biospécifique. En effet, lorsqu'on procède à la Chromatographie d'un tel mélange, la première protéine ne se fixe pas et est donc retrouvée à la sortie de la colonne. La seconde protéine se fixe sur les sites cationiques et peut être éluée à l'aide d'une solution contenant des anions capables de la déplacer des sites cationiques, par exemple une solution de chlorure de sodium. La troisième protéine se fixe sur les sites d'affinité biospécifique et peut être séparée de ceux-ci avec un éluant convenable.
Quelques exemples d'application selon l'invention sont donnés ci-après à titre non limitatif.
A. Purification de la toxine cholérique
On sait qu'en se développant dans un milieu de culture approprié le vibrion cholérique sécrète une toxine, appelée choléragène ou en-térotoxine, qui est responsable des diarrhées provoquées chez l'homme par ce germe. Après centrifugation et filtration du milieu de culture final, il est possible d'obtenir un filtrat de culture brut contenant la toxine cholérique mélangée à de nombreuses autres macromolécules du milieu de culture initial ou sécrétées par les vibrions.
La toxine cholérique se transforme partiellement et progressivement en forme non toxique appelée choléragénoïde. Le choléragé-noïde a une structure voisine de celle du choléragène, mais le choléragène possède en plus une chaîne polypeptidique A responsable de la toxicité.
Le choléragène et le choléragénoïde se fixent tous deux sélectivement sur un récepteur qui a été identifié en 1973 et qui a été désigné par ganglioside GMi.
Plusieurs auteurs ont décrit l'intérêt du choléragène et du choléragénoïde pour la préparation de vaccins, et on conçoit donc qu'il est utile de pouvoir obtenir des quantités importantes de ces produits.
La purification du choléragène et du choléragénoïde a été décrite par de nombreux auteurs, mais nécessite souvent de nombreuses étapes pour arriver à des produits correctement purifiés et standardisés; de ce fait, ces méthodes sont difficilement industrialisables. Par Chromatographie d'affinité biospécifique, il est théoriquement possible d'obtenir en une seule étape le produit recherché dans un état très purifié. Dans cet esprit, Cuatrecasas (1973) a décrit une méthode pour capter sélectivement la toxine cholérique par Chromatographie d'affinité. Des colonnes chromatographiques d'agarose étaient modifiées chimiquement pour fixer le ganglioside GMi par liaison covalente. Grâce à son affinité pour le GMi, la fixation de la toxine cholérique était effectivement possible, mais la récupération de cette toxine était rendue difficile en raison d'une affinité extrêmement forte entre le GMi lié à l'agarose et la toxine. Cela rendait obligatoire l'utilisation de milieux dénaturants pour dissocier le complexe et entraînait une dénaturation et de mauvais rendements en fin d'opération. D'autre part, la méthode d'activation de l'agarose préconisée exige l'emploi de bromure de cyanogène, très dangereux à manipuler et pouvant donc entraîner des complications non souhaitables dans un éventuel développement industriel. Par ailleurs, les dérivés préparés sur agarose par la méthode au bromure de cyanogène se sont révélés assez instables, surtout pour des pH acides (pH < 3);
comme l'acidification du milieu était nécessaire pour récupérer la toxine cholérique, on voit que la durée de vie de ces supports risquait d'être courte en cas d'une utilisation industrielle.
La présente utilisation permet d'exploiter l'efficacité et la rapidité des chromatographies à affinité biospécifique, mais en utilisant un support chromatographique convenant parfaitement à un usage industriel.
L'utilisation de ce support en affinité biospécifique n'est possible qu'après avoir immobilisé le ligand choisi sur la surface interne des pores.
Deux sortes de ligands différents, tous deux spécifiques de la toxine cholérique, ont été utilisés. Le premier est un dérivé du ganglioside Gm, qui est doué d'une affinité biochimique forte et spécifique pour le choléragène ou le choléragénoïde. Le second est l'anticorps antitoxine cholérique, doué d'une affinité immunologique spécifique vis-à-vis du choléragène et du choléragénoïde. L'affinité de la toxine pour le ganglioside GM[ est connue pour être très forte, probablement plus forte que l'affinité pour l'anticorps. Cependant,
après greffage du ganglioside GM1 à la surface de la silice par les procédés qui seront indiqués, on a découvert que l'affinité obtenue entre le GM1 ainsi greffé et la toxine cholérique est tout à fait réversible. Contrairement aux résultats de Cuatrecasas, il est alors possible de récupérer la toxine cholérique dans des conditions d'élution relativement douces. Cela n'est pas explicable par la théorie et constitue un résultat surprenant.
Pour éluer la toxine cholérique fixée sur le matériau de l'invention, on peut utiliser un tampon acide (par exemple un tampon citrate acide), une solution fortement concentrée en urée, en guani-dine, en iodure (par exemple iodure de sodium), en thiocyanate (par exemple thiocyanate de potassium) ou tout autre agent chaotropi-que ou dénaturant.
En ce qui concerne la stabilité des ligands greffés, un progrès important a également été obtenu à la présente invention. En effet, il est possible de laver régulièrement les supports avec des solutions telles que HCl, 0,1N ou NaOH 0,1N, c'est-à-dire de pH 1 à 13, sans que les qualités d'affinité biospécifique en souffrent. De telles stabilités n'existent pas sur les supports connus (par exemple à base d'agarose) qu'il faut éviter d'amener à des pH extrêmes.
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Enfin, sur le plan mécanique, les débits possibles de 200 à 400 ml/cm2/h et l'absence de tassement du support ont bien confirmé l'intérêt de ces nouvelles méthodes pour le développement industriel envisagé.
B. Autres utilisations
Avec le matériau de l'invention réalisé avec la lysine comme molécule aminée, il est possible de mettre à profit l'affinité lysine-plas-minogène pour isoler et purifier le plasminogène du sang.
Avec le matériau de l'invention réalisé avec l'acide métaamino-phénylboronique comme molécule aminée, il est possible de fixer ré-versiblement des sucres et des macromolécules comportant des sucres à fonction cis-a-glycol (glycoprotéines, acides nucléiques et lipopolysaccharides).
De la mêmêlaçon, en utilisant comme molécule aminée des antigènes bactériens, il est possible de fixer réversiblement les anticorps correspondants; en utilisant comme molécule aminée des gammaglobulines, il est possible de fixer réversiblement les antigènes correspondants; en utilisant comme molécule aminée les toxines bactériennes, il est possible de fixer notamment les anticorps correspondants, etc.
Les exemples illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple 1:
Greffage du lysoganglioside GM/ sur support minéral poreux imprégné de diéthylaminoéthyldextrane secondairement réticulé
1.1 Le support à base de DEAE Dextran est préparé selon l'une des techniques citées dans le brevet principal.
10 g de Sphérosil XOB 030 sont additionnés de 30 ml de DEAE Dextran 7,5% à pH 11,5. L'ensemble est séché une nuit à 80° C, puis additionné de 30 ml d'une solution de butanedioldiglycidyléther à 1,5% dans l'éther éthylique. L'éther est évaporé sous un courant d'air, puis l'ensemble est mis 15 h à 80° C pour obtenir la réticulation du DEAE Dextran.
1.2. La solution de ganglioside est préparée par Chromatographie d'échange d'ions sur silice poreuse imprégnée de DEAE Dextran, selon la méthode décrite à l'exemple 8 de la demande de brevet suisse N° 9575/76.
La solution brute de ganglioside ainsi obtenue contient environ 40% de ganglioside GMI utile dans la présente application.
Les deux fonctions N-acétyle et la fonction N-acyle du ganglioside GM1 sont alors hydrolysés en fonctions aminées NH2, par hy-. drolyse alcaline, selon le procédé décrit antérieurement par Holm-gren, Mansson et Svennerholm, «Médical Biology» (1974), 52,229-233. Le produit ainsi obtenu est appelé lysoganglioside; il possède trois fonctions NH2 par molécule. Après lyophilisation, la poudre obtenue est dissoute dans un tampon carbonate 0,01 M, de pH 9, contenant 20 g/1 de NaCl, à la concentration de 1 mg/ml.
1 ml de cette solution contient environ 370 g d'acide sialique par millilitre.
1.3. Oxydation périodique du support
Les 10 g de Sphérosil XOB 030 imprégnés de DEAE Dextran secondairement réticulé sont additionnés de 100 ml d'une solution aqueuse de pêriodate de sodium 0,02M (pH voisin de 4,5). Le temps d'oxydation est de 2 h; la température ambiante convient très bien pour cette opération.
Le support est ensuite lavé dans une solution de carbonate de sodium 0,01M, de pH 9, additionnée de 20 g/1 de chlorure de sodium. La force ionique élevée de ce tampon est destinée à saturer les groupements cationiques du DEAE Dextran réticulé et oxydé par des ions Cl© et à les empêcher de fixer ultérieurement le lysoganglioside par des forces électrostatiques risquant de gêner la réaction des groupements aminés sur les fonctions aldéhyde du support.
A ce stade, il est facile de mettre en évidence les fonctions aldéhyde du support oxydé. En présence de réactif de Schiff, une coloration rose violacé intense se développe.
1.4. Greffage du lysoganglioside
Le support précédent est lavé, puis additionné de 50 ml de la solution de lysoganglioside GM1. Après un temps de contact de 2 h, le surnageant de contact est décanté. Par un dosage d'acide sialique, il 5 est facile de montrer que la quasi-totalité du lysoganglioside a été couplée (95 à 100%).
Le support est rincé en tampon carbonate de pH 9. A ce stade, il est facile de montrer également que la coloration du support avec le réactif de Schiff est beaucoup plus faible que dans l'étape précé-10 dente, indiquant une bonne fixation du lysoganglioside sur les fonctions aldéhyde du support oxydé.
1.5. Réduction par le borohydrure de sodium
50 ml d'une solution 0,1 M de NaBH4 dans l'eau (pH 9) sont ad-15 ditionnés au support précédent. Après un temps de contact de 2 h à température ambiante, le support est rincé à l'eau puis monté en colonne.
Après équilibrage dans le tampon de Chromatographie choisi (tampon phosphate 0,01 M, de pH 7,2, contenant 20 g/1 de NaCl), la 20 colonne d'affinité biospécifique est prête à l'emploi.
A ce stade, aucune trace de fonction aldéhyde n'est plus décelable par coloration avec le réactif de Schiff. Les fonctions aldéhyde n'ayant pas réagi avec le lysoganglioside sont elles-mêmes transformées en fonctions alcool primaire.
25 II faut noter que le support ainsi obtenu peut fonctionner parfaitement comme échangeur d'ions. Si l'on veut supprimer les interactions ioniques avec les protéines pour ne conserver que les interactions biospécifiques, il est donc important d'avoir une force ionique minimale. En pratique, une concentration minimale de 10 g/1 NaCl 30 suffit à supprimer l'effet d'échange d'ions.
1.6. En suivant rigoureusement la même technique, il a été possible de greffer aussi efficacement la lysine, la phénylalanine, la phén-ylhydrazine, l'acide métaaminophénylboronique. On conçoit qu'il est possible de greffer aussi toute molécule porteuse de fonctions 35 NH2, comme par exemple un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps, et d'utiliser chacun de ces supports en Chromatographie d'affinité biospécifique.
40 Exemple 2:
Greffage du lysoganglioside GM! sur support minéral poreux imprégné de cellulose
2.1. Imprégnation de cellulose
45 10 g de Sphérosil XOC 005 (ou de tout autre support minéral poreux) sont additionnés de 30 ml d'une solution acétonique d'acétate de cellulose à 3% (le propionate de cellulose ou d'autres éthers solubles en milieu organique solvant et hydrolysables peuvent convenir aussi bien, pourvu qu'ils puissent redonner la cellulose originale par hydrolyse alcaline).
L'ensemble est séché sous un courant d'air chaud. La poudre peut alors être tamisée, si nécessaire, et montée en colonne.
Un lavage par 101 de solution aqueuse de NaOH 0,1M est alors pratiqué en continu, à un débit de 500 ml/h, pendant toute une huit. Après cette hydrolyse alcaline, la colonne peut être lavée à l'acétone ou à l'eau quel qu'en soit le pH; la cellulose ainsi régénérée n'est plus soluble et reste parfaitement à l'intérieur des pores du support minéral poreux, qu'elle tapisse d'autant mieux que le polymère initial a pu accéder aisément à la totalité de la surface interne. L'emploi d'esters de cellulose de poids moléculaire aussi faible que possible est conseillé pour cette raison.
2.2 Préparation de la solution de lysoganglioside Gmà fonctions aminées
65 Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.2.
2.3. Oxydation périodique du support
Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.3.
2.4. Greffage du lysoganglioside
Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.4.
2.5. Réduction par le borohydrure de sodium NaBH\
Mêmes conditions que dans le paragraphe 1.5.
A la différence du support préparé selon l'exemple précédent, celui-ci ne possède pas de propriétés d'échange d'ions, et donc peut être utilisé éventuellement pour des forces ioniques moins élevées, dans les cas où cela pourrait être un avantage. Pour l'affinité entre le lysoganglioside et la toxine cholérique, cela est indifférent.
2.6. En suivant rigoureusement la même technique, il a été possible de greffer des fonctions échangeuses d'anions, notamment avec la 3-diêthylaminopropylamine ou la N,N-diéthyléthylènediamine, et d'utiliser les supports ainsi obtenus dans la Chromatographie des protéines.
2.7. En suivant toujours la même technique, il a été possible de greffer divers ligands à fonctions aminées, dont la lysine, la phényl-alanine, la phénylhydrazine, l'acide métaaminophénylboronique, et d'utiliser les supports ainsi obtenus en Chromatographie d'affinité biospécifique.
De la même manière, on peut greffer toute molécule à fonction(s) aminée(s), comme par exemple un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps, et utiliser chacun de ces supports en Chromatographie d'affinité biospécifique.
Exemple 3:
Application à l'isolement et à la purification de la toxine cholérique
Les colonnes décrites dans les exemples précédents (sauf 2.6.)
sont utilisables en Chromatographie d'affinité biospécifique. La présence de 10 à 20 g/1 de NaCl dans le tampon de Chromatographie est recommandée, pour éliminer toute interaction non spécifique de type ionique avec les charges électriques des fonctions échangeuses d'ions, des ligands, ou des protéines présentes sur le support.
En passant un filtrat de culture de vibrions cholériques additionné de 10 g/1 de NaCl sur chacune de ces colonnes, il est facile de vérifier que le choléragène et le choléragénoïde s'accrochent sur le support. En effet, à condition de rester en dessous de la capacité maximale de fixation de la colonne, le filtrat obtenu en sortie de colonne est complètement dépourvu d'activité toxique mesurable par les tests connus.
Après lavage par le tampon de Chromatographie pour éliminer les protéines non fixées, il est possible de récupérer le choléragène et le choléragénoïde fixés, par élution avec le tampon citrat/acide citrique 0,05M, pH 2,8. La dénaturation obtenue est apparemment né642 862
gligeable puisque les rendements obtenus varient de 50 à 100%, mesurés par les tests classiques de dosage de la toxine cholérique.
La pureté de la préparation peut être évaluée par Chromatographie sur Sephadex G-200 (le choléragène donne un pic correspondant à un poids moléculaire de 84 000, le choléragénoïde donne un pic correspondant à un poids moléculaire de 56 000) ou par des méthodes immuno-chimiques avec des antisérums de contrôle. (Un antisérum antifiltrat de culture ne possédant pas d'anticorps antitoxine cholérique ne doit pas donner de ligne de précipitation avec ces préparations purifiées.)
Une colonne de 10 g faite selon l'une des méthodes décrites dans les exemples précédents permet de traiter des quantités de filtrat de culture de 500 ml à 101, la quantité exacte dépendant évidemment de plusieurs paramètres, à savoir la quantité de toxine présente dans le filtrat de culture et la quantité de GM1 dans la solution brute des gangliosides.
Les applications possibles sont les suivantes:
— préparer une solution de choléragène et de choléragénoïde purifiés pouvant servir à la préparation d'un vaccin;
— débarrasser un filtrat de culture de vibrions cholériques de toute trace de choléragène et de choléragénoïde;
— préparer des antisérums vis-à-vis de ces deux types de solutions.
Exemple 4:
Séparation des constituants d'un mélange de gammaglobulines, d'albumine et de toxine cholérique en une seule Chromatographie
Cet exemple a pour but de démontrer les possibilités d'utilisation simultanée du matériau décrit à l'exemple 1, à la fois en Chromatographie d'échange d'ions et en Chromatographie d'affinité. Contrairement à ce qui est réalisé à l'exemple 3 précédent, on n'ajoute pas de chlorure de sodium dans le solvant de Chromatographie qui contient un mélange artificiel de trois protéines: gammaglobulines, albumine et toxine cholérique.
Les gammaglobulines, qui présentent un caractère électropositif, ne sont pas adsorbées sur la couche de DEAE Dextran modifié, tandis que l'albumine, qui présente un caractère électronégatif, est fixée sur cette couche. Quant à la toxine cholérique, elle se fixe sur les sites de lysoganglioside GM|. En utilisant un tampon de Chromatographie de faible force ionique (tampon phosphate 0,01M, pH 6,8), on retrouve les gammaglobulines en sortie de colonne sous la forme d'un pic non adsorbé. Par élution subséquente avec un tampon contenant 10 g/1 de chlorure de sodium, l'albumine est déplacée et éluée. L'élution ultérieure avec un tampon citrate de pH 2,8 permet d'éluer ensuite la toxine cholérique.
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R

Claims (23)

  1. 642 862
    2
    REVENDICATIONS
    1. Procédé de préparation d'un matériau poreux utilisable dans les colonnes de Chromatographie, capable de fixer de façon réversible des macromolécules biologiques, caractérisé en ce qu'on forme sur un support minéral poreux un revêtement de polymère glucidi-que que l'on soumet à une oxydation périodique, que l'on fait réagir le produit d'oxydation ainsi obtenu avec la molécule ou la macro-molécule aminée de formule R'—NH2, R' étant le reste de la dite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule schématique R3—CH2—NH—R', et que l'on soumet le dérivé iminé obtenu à l'action d'un agent réducteur capable de réduire la liaison imine en liaison amine.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère glucidique est un polymère polysaccharidique ou un polymère polysaccharidique modifié.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère glucidique est de la cellulose ou de la cellulose modifiée, dont on imprègne un support minéral poreux sous la forme d'une solution d'un ester hydrolysable de cellulose qu'on sèche, le support revêtu ainsi obtenu étant soumis ensuite à l'action d'une solution aqueuse alcaline de façon à hydrolyser les groupements esters, et obtenir ainsi un support minéral poreux revêtu de cellulose ou de cellulose modifiée.
  4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on transforme le revêtement de cellulose en revêtement de cellulose modifiée en faisant réagir le matériau revêtu de cellulose avec un composé de formule X—(CH2)n—NRj(R2), dans laquelle n est un nombre entier pouvant varier entre 1 et 10, Rt et R2 représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxylé, et X est un atome d'halogène.
  5. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'oxydation périodique est effectuée à l'aide de l'acide périodique ou d'un de ses dérivés.
  6. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réaction de réduction est effectuée à l'aide d'un hydrure tel que le boro-hydrure de sodium.
  7. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère glucidique est réticulé.
  8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on utilise comme agent réticulant un composé dicarbonylé, une halo-hydrine ou un diépoxyde.
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent réticulant le 1,4-butanedioldiglycidyléther, l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine ou un époxyde de formule:
    Rs I
    CH2—CH—R4—N—R6CH—CH2
    V V
    o o dans laquelle Rs est un alkyle ayant 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone, et R4 et R6 représentent une chaîne hydrocarbonée ayant 1 à 10 atomes de carbone, de préférence un radical alkylène inférieur ayant 1 à 4 atomes de carbone.
  10. 10. Matériau solide poreux utilisable dans les colonnes de Chromatographie obtenu par le procédé selon la revendication 1, capable de fixer de façon réversible des macromolécules biologiques, caractérisé en ce qu'il est constitué par un support minéral poreux revêtu d'un polymère polysaccharidique ou d'un polymère polysaccharidique modifié, et par le fait que sur ledit revêtement polysaccharidique ou polysaccharidique modifié se trouvent greffées des molécules ou macromolécules aminées capables de constituer un site réactif en Chromatographie, ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule R'—NH2, R' étant le reste de ladite molécule ou macromolécule aminée répondant à la formule schématique:
    R3-CH2-NH-R'
    R' étant défini comme précédemment et R3 — CH2 — représentant le reste dudit polymère polysaccharidique ou dudit polymère polysaccharidique modifié.
  11. 11. Matériau selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support minéral poreux est un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, la magnésie, un oxyde de titane ou un dérivé synthétique ou naturel de ces oxydes tels que les verres, les silicates, les borosili-cates ou le kaolin.
  12. 12. Matériau selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le polymère polysaccharidique ou le polymère polysaccharidique modifié est un polymère choisi dans le groupe constitué par le dextrane, la cellulose, l'amidon, et les polymères modifiés correspondants.
  13. 13. Matériau selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit polymère est un Polysaccharide modifié qui répond à la formule schématique:
    /'
    R-(CH2)n-N^
    R2
    dans laquelle R représente le reste du polymère polysaccharidique, n est un nombre entier pouvant varier de 1 à 10, et Ri et R2 représentent un radical alkyle inférieur ou un radical alkyle inférieur hydroxylé.
  14. 14. Matériau selon la revendication 13, caractérisé par le fait que ledit polymère polysaccharidique modifié est choisi parmi le diéthyl-aminoéthyldextrane, le diéthylaminoéthylamidon ou la diéthyl-aminoéthylcellulose.
  15. 15. Matériau selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit polymère polysaccharidique est la cellulose.
  16. 16. Matériau selon l'une des revendications 10 à 15, caractérisé en ce que ladite molécule ou macromolêcule aminée est un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps.
  17. 17. Matériau selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite molécule ou macromolécule aminée est choisie dans le groupe constitué par une polyamine telle que la 3-diéthylaminopropylamine ou la N,N-diéthyléthylènediamine, la lysine, la phénylalanine, la phénylhydrazine, la taurine, l'acide a-aminocaproïque, l'acide méta-aminophénylboronique, les antigènes bactériens, les globulines, notamment les gammaglobulines, les toxines bactériennes, les virus ou leurs produits de dégradation tels que les divers antigènes viraux, et les récepteurs cellulaires.
  18. 18. Matériau selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit récepteur cellulaire est un produit résultant de l'hydrolyse totale ou partielle des groupements N-acyle et N-acétyle d'un gan-glioside.
  19. 19. Matériau selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit récepteur cellulaire est le lysoganglioside GM1.
  20. 20. Utilisation du matériau selon la revendication 10 dans une colonne destinée à isoler ou à purifier les macromolécules biologiques, caractérisé en ce que ledit matériau est revêtu de ladite amine R'—NH2, douée d'affinité pour les impuretés à éliminer ou pour la macromolécule biologique à isoler, puisque, dans ce dernier cas, on élue ladite macromolécule biologique.
  21. 21. Utilisation selon la revendication 20 d'un matériau revêtu de lysoganglioside GM1 dans une colonne où l'on fait passer une solution impure de toxines cholériques, que l'on élue ensuite.
  22. 22. Utilisation selon la revendication 20, ladite solution contenant la macromolécule à purifier ayant une force ionique suffisante pour éviter toute interaction non spécifique de type ionique avec le matériau du support.
  23. 23. Utilisation selon la revendication 20, consistant à faire passer dans la colonne une solution de force ionique faible contenant une première macromolécule biologique, douée d'affinité de type ionique pour ledit matériau, et une seconde macromolécule biologique, douée d'affinité biospécifique par la molécule R'—NH2, à
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    éluer ladite première macromolécule avec une solution de force ionique suffisante pour éliminer les interactions de type ionique, puis à éluer ladite seconde macromolécule avec une solution capable de dissocier le complexe formé entre ladite seconde macromolécule et les sites réactifs de la molécule R'—NH2.
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