FR2541593A1 - Support mineral poreux pour la purification et le fractionnement des macromolecules biologiques - Google Patents

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Abstract

SUPPORTS MINERAUX POREUX REVETUS PAR UN FILM POLYMERE A BASE DE VINYLLACTAME RETICULE POUVANT PORTER DES GROUPES ORGANO-FONCTIONNELS APPROPRIES A LA FIXATION REVERSIBLE DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES. APPLICATIONS AU FRACTIONNEMENT DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES PAR CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION, D'ECHANGE IONIQUE OU D'AFFINITE SPECIFIQUE.

Description

SUPPORT EENERAL POREUX POUR LA PURIFICATION
ET LE FRACTIONNEMENT DES MACROMOLECULES BIQLOGIQUES
La présente invention a pour objet des supports minéraux poreux aptes à être utilises dans des colonnes de chromatographie pour 11 extraction des molecules biologiques.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet des supports mineraux poreux modifies par revêtement de leur surface à l'aide d'un polymère hydrophile à base de vinyllactames. L'invention a egalement pour objet la preparation des supports et leur application à l'extraction et à la separation selective des macromolecules biologiques par les mécanismes d'exclusion, d'échanges d'ions ou d'affinité spécifique.
L'extraction sélective des molécules biologiques, par exemple des protéines, des enzymes, des hormones et substances analogues à l'aide de supports permettant une séparation par exclusion ou immobilisation, adsorption/desorption, a acquis une grande importance avec le développement de la biotechnologie.
De nombreux types de supports ont déja été proposés dans ce but. D'une manière générale, l'efficacité d'un support est déterminée d'une part par ses propriétés mécaniques et hydrodynamiques, d'autre part par ses propriétés physicochimiques faisant intervenir des facteurs tels que la taille des particules, leur porosité, la capacité du support à lier des molécules fonctionnelles, le degré d'intéraction non spécifique entre le support et les substances a isoler.
Les supports organiques ont pour avantage leur hydrophilie et la facilité avec laquelle ils peuvent être modifiés par des groupes echangeurs d'ions, ligands et groupes fonctionnels qui permettent de fixer de fanon reversible des macromolécules biologiques.
Mais leur emploi est limité par la faible stabilité dimensionnelle de la matrice sous pression. A l'inverse des gels de polysaccharides (amidon, dextrane, agarose, cellulose...), les oxydes minéraux présentent d'excellentes propriétés mécaniques et hydrodynamiques qui peuvent avantageusement etre utilises en chromatographie industrielle. Toutefois, ces supports minéraux présentent des sites d'adsorptions non.spéeifiques pouvant occasionner une perte de rendement et/ou une dénaturation des macromolécules biologiques.
Pour la séparation des protéines par échanges dations, il a déjè été proposé de revêtir le support minéral à 17aide d'un film de résine obtenu par polymérisation in situ de monomères porteurs de fonctions ou sur lesquels sont fixées des fonctions pouvant servir de site réactif pour les macromolécules à immobiliser Des supports de ce type ont été décrits par exemple dans les brevets américains 4 100 149 et 4 327 191 ou français 2321932 et 2464967.
Ces supports sont bien adaptés à la production industrielle de protéines de haute pureté pour usage agro-alImentaire. Cependant du fait de la nature hydrophobe du polymère et/ou de l'interaction de la matrice minérale, le support ne peut être régénéré efficacement qu'en milieu fortement acide ou basique pouvant entraîner une dénaturation biologique de'l'activité des protéines.
L'invention a en conséquence pour but de fournir des supports aptes à être utilisés industriellement comme phases stationnaires dans des colonnes de chromatographie, ayant des propriétés hydrophiles, une résistance mécanique élevée et exempts de toute interaction non spécifique.
L'invention a également pour but de fournir des supports minéraux permettant d 'obtenir des macromolécules biologiques à usage thérapeutique.
Selon l'invention, le support minéral poreux est revêtu par un film de polyvinyllactame formé par copolymérisation sur le support a) d'un vinyllactame b) d'un agent de réticulation polyfonctionnel ainsi que éventuellement c) d'un monomère vinylique ayant un groupement réactif échangeur d'ions ou susceptible d'être modifié pour fixer des radicaux échangeurs d'ions ou des ligands spécifiques.
En fonction de la nature exacte du copolymère, neutre ou réac- tif, le support peut être utilisé en chromatographie d'exclusion, ionique ou d'affinité.
Comme support minéral poreux, on met en oeuvre un oxyde métallique tel que la silice, l'alumine, l'oxyde de titane ou les dérivés synthétiques ou naturels de ces oxydes tels que les zéolites, les silicates. On utilise préférentiellement les silices qui possèdent une surface spécifique de 5 à 400 m2/g et de préférence 10 à 100 m2/g, un diamètre poreux moyen de 100 à 3000 A et de préférence 400 à 1500 A, un volume poreux de 0,4 à 2 ml/g et une granulométrie de 4 pm à 5 mm, selon l'application envisagée. Ainsi les particules les plus fines sont utilisées dans les applications analytiques et les particules les plus grosses dans-les applications préparatives.-
Les polyvinyllactames qui revêtent le support sont des produits en eux-mêmes connus.Ils sont préparés à partir de monomères de formule
Figure img00030001

ou R est H ou bas alkyl et x est 2 a 5. De tels monomeres a) incluent la N-vinylpyrrolidone, le Nvinylcaprolactame, le N-vinyl ss propiolactame, l'a méthylvinylpropiolactame.
On donne la préférence au N-vinylpyrrolidone-2.
Ces monomères peuvent être réticulés à l'aide d'agents de réticulation polyfonctionnels b) connus dans la technique tels que par exemple, les diacrylates de polyols comme le diacrylate ou le diméthacrylate de diéthylène glycol ou de dibutanediol 1-4 et les dérivés vinyliques ou allyliques de triazine comme le triallylisocyanurate. Comme agent de réticulation b) on peut encore mettre en oeuvre des monomères de type silanique de formule CH2 = CH-Si X3 (II) dans laquelle chaque X, identique ou différent, représente un radical hydrolysable alcoxy inférieur, ou acetoxy ou phenoxy ou un halogène. Des exemples de dérivés silaniques disponibles sont le vinyltriméthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, le vinyltriacétoxysilane, le vinyltrichlorosilane, le vinyl tris( methoxyéthoxy) silane.
Selon un premier aspect de l'invention, le support est utilisé en chromatographie d'exclusion pour la séparation des macromolécules biologiques d'avec de petites molécules (sels, alcools...). Le polymère de revetement est alors formé par polymérisation sur le support d'un vinyllactame a) en présence d'un agent de réticulation b) choisi essentiellement parmi les dérivés silaniques de formule II, ce qui permet de former une liaison stable entre le support minéral et le polyvinyllactame.
Selon un second aspect de l'invention, le support est utilisé en chromatographie d'échange d'ions ou d'affinité. Des groupements fonctionnels appropriés sont introduits à la surface du support par copolymérisation du vinyllactame a) avec un monomère vinylique c) portant un groupement réactif changeur dotions ou susceptible d'être utilisé dans une réaction chimique pour introduire des radicaux échangeurs d'ions ou fixer des ligands spécifiques.
Les monomères copolymérisables auxquels on peut faire appel sont des composés de formule
Figure img00040001

dans laquelle R1 est H ou CH3 et R2 représente
- un radical aryl tel que phényl ou naphtényl
- un groupe fonctionnel réactif Y tel que -C#N, -CONH2, -CH2OH, -COOR3 où R3 est H ou alkyl en C1-C6 ou -NH2, -halogène, -SO3H, -PO(OH)2.
Figure img00040002
- ou un groupe fonctionnel Y ayant la signification précédente
relié à l'atome de carbone insaturé par l'intermédiaire d'un
radical divalent alkylène lineaire ou ramifié en C1-C30,
phénylène, cycloalkylène, (CH2)n -O-(CH2)m-,
(CH2)n -CO-(CH2)m-, -(CH2)n-COO-(CH2)m-,
-(CH2)n -SO2-(CH2)m-, -(CH2)n NR4 ( 2 m
- < CH2) nCONR4 (CH2)m
où R4 est H ou alkyle en C1-C3 et n, m est un nombre entier allant de O à 12.
Comme monomère copolymérisable c) on peut citer l'acide (meth)acrylique, l'acide 4-pentenoique, l'acide vinylbenzène sulfonique, l'acide vinylbenzène carboxylique, l'acrylamide et le methacrylamide, l'acrylonitrile et' le méthacrylonitrile, l'alcool allylique, l'amine allylique, la 1-2 diméthyl 4-penténylamine, l'acrylate et le méthacrylate de 2-3 époxypropyle, le n.méthylolacrylamide, l'acide 6-acrylamidohexano4que, le styrène.
Le choix du-monomère vinylique réactif c) pour l'obtention du copolymère fonctionnel est seulement limité par l'utilisation qui sera faite-du groupement fonctionnel. On peut par exemple choisir un monomère portant un groupe cationique ou un groupe anionique et utiliser directement le support comme resine echangeuse d'ions.
Si le monomère c) ne comporte pas lui-même de groupe échangeur d'ions, il est possible de le modifier ultérieurement par réaction chimique selon toute technique connue dans la mesure où cette réac tion est compatible avec la stabilité du copolymère.
Il est également possible de modifier ultérieurement le groupe réactif Y présent dans le copolymère selon toute technique classique pour l'obtention d'un nouveau groupement fonctionnel Y'. Cette modi- fication peut consister par exemple à transformer une amine primaire en amine tertiaire ou en sel d'ammonium quaternaire pour réaliser un support échangeur d'anions, ou à transformer un échangeur cationique en échangeur anionique par réaction sur un groupe -COOH d'une diamine que l'on transforme éventuellement en ammonium quaternaire par alkylation.
Cette modification peut encore consister à fixer un groupement fonctionnel, éventuellement par l'intermédiaire d'un bras ("spacer") permettant l'immobilisation du ligand spécifique d'une macromolécule biologique. Ce ligand peut être un substrat ou un inhibiteur d'enzymes, un récepteur d'hormones, de protéines, de virus ou de bactéries, un antigène ou un anticorps.
Pour obtenir le revêtement du support minéral par le polymère réticulé, le vinyllactame a) le réticulant b) éventuellement le comonomère c) et un initiateur sont mis en solution dans un solvant, la solution est imprégnée sur le support puis le solvant est évapo- ré et les monomères réticulés par tout procédé connu-en soi tel que la chaleur ou en présence de rayonnements ultraviolets. Comme solvant, on met en oeuvre tous produits solvants des monomères et du catalyseur, dont le point d'ébullition est le plus bas possible pour favoriser son évaporation ultérieure. Ce sont, par exemple, le chlorure de méthylène, les chlorofluorométhanes (Flugènes) l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle.
De manière générale, la quantité de monomère(s) à mettre en oeuvre est choisie de manière à obtenir à la surface du support un film de polymère compris entre 1 et 15 mg/m2 et de préférence entre 1 et 6 mg/m2.
Dans le cas où l'on désire obtenir un support fonctionnalise, le rapport des monomères a + b/c détermine la quantité de groupements fonctionnels répartis sur le film polymère. De préférence on utilise le comonomère réactif fonctionnel c) en quantité telle que la quantité de groupes fonctionnels répartis à la surface du support soit compris entre 0,05 et 2 m.eq/g de support.
Selon la nature du ou des monomère(s) la quantité de réticulant peut varier entre 1 et 50 % en poids par; rapport au poids total des monomères a + b + c.
-Le support minéral revêtu du polymère à base de vinyllactame selon l'invention est particulièrement bien approprié à la purifl cation, à la séparation ou au fractionnement à l'échelle industrielle des protéines en général, du sérum et autres protéines d'origine animale, végétale ou bactérienne, aussi bien que des enzymes, isoenzymes ou hormones.
Par chromatographie d'exclusion steriqueD les macromolécules sont éluées de manière quantitative sans adsorption sur la résine.
Par chromatographie d'échanges d'ions ou d'affinité > le support permet de fixer de manière reversible les macromolécules en mettant en oeuvre des interactions de type biospecifique, chimique ou physico-chimique. Dans le cas d'interactions ioniques, la macromolécule biologique fixée peut être éluée par un simple accroissement de la force ionique et/ou du pH. Les macromolécules obtenues de très haute pureté ne subissent pas d'altération de leur activité biologique. Les supports selon l'invention sont donc particulièrement bien adaptés à la production industrielle des macromolecules à usage thérapeutique dans l'industrie pharmaceutique et médicale.
On donne ci-après, ~titre illustratif et non limitatif, des exemples de réalisation de l'invention.
Exemple 1
Préparation du support
100 g de silice ayant une granulométrie de 100 à 200 pm, une surface spécifique de 185 m2/g, un diamètre poreux moyen de 150 A et un volumeporeux de 1 cm /g sont séchés à 150 C sous pression réduite pendant 5 heures.
La silice sèche obtenue est introduite dans une solution homogène contenant 250 ml de flugène il (CC13 F), 80 ml de N-vinyl pyrrolidone, 15 ml de vinyltriéthoxysilane et 0,5 g de péroxyde de dilauroyle. Le flugène 11 est évaporé à température ambiante puis la silice imprégnée est chauffée à 800C pendant 17 h pour obtenir la réticulation.
La silice est alors mise en suspension dans 400 ml dteau permutée et portée à l'ébullition pendant 5 h. Après filtration, la silice est lavée à l'eau permutée , à l'acétone puis séchée sous vide à 400C. L'analyse donne un taux de carbone de i2 % en poids par rapport à la silice revêtue.
Application au fractionnement de protéines par chromatographie d'exclusion stérique
20 g de la résine préparée ci-avant sont chargés et maintenus comprimés dans une colonne de 1 cm de diamètre. Après avoir équilibré la résine avec un tampon phosphate 0,05 M à pH 7, on injecte ensuite 10 ml d'une solution de ce même tampon contenant 1 % d'albumine et 1 % d'immunoglobulines IgG.
En éluant ensuite la résine avec la même solution tampon'à un débit de 40 ml/h, on recueille séparément en sortie de colonne d'abord les immunoglobulines puis l'albumine de manière quantitative. On n'observe aucune adsorption protéique sur la résine.
Exemple 2
Préparation du support
100 g de silice ayant une granulométrie de 100 à 200 pm, une surface spécifique de 25 m2/g, un diamètre poreux moyen de 1250 A et un volume poreux de 1 ml/g sont séchés à 1500C sous pression réduite pendant 5 h.
La silice sèche obtenue est introduite dans une solution de 250 ml de flugène 11 dans laquelle ont été homogénéisés 50 m de
N-vinylpyrrolidone, 2 ml d'acide acrylique, 15 mi de vinyltriéthoxysilane et 0,50 g de péroxyde de dilauroyle. Après avoir évaporé le solvant à température ambiante, la silice imprégnée est chauffée à 800C pendant 16 h pour obtenir la réticulation.
La silice est alors mise en suspension dans 400 ml d'eau permutée et portée à l'ébullition pendant 5 h. Après filtration, la silice est lavée à l'eau permutée, à l'acétone puits sechée sous vide à 40 C.
La silice greffée échangeuse de cations faible ainsi obtenue présente les caractéristiques suivantes
% C 6,05
% H 1,09
% N 0,3
Capacite ionique : 0,20 m.eq/g
Quantité de polymère fixé : 3,2 mg/m2
Application à la purification de l'albumine par fixation sélective de #=globulines
5 g de la résine cationique préparée ci-avant sont chargés et maintenus comprimés dans une colonne de 1 cm de diamètre. Après avoir équilibré la résine avec un tampon acétate 0,1 H à pH 5,5, on injecte à un débit de 40 ml/h 100 ml d'une solution de ce meme tampon contenant 0,455 g de protéines dont la composition en albumire et n S-globulines est respectivement de 96 % et 4 %.
La résine est ensuite lavée avec 40 ml de la même solution tampon. Les solutions effluente et de lavage sont regroupées en une seule solution dont les analyses montrent qu'elle contient C,413 g d'albumine totalement pure. En effet, les immunoélectro- phorèses simple et croisée de cette solution montrent l'absence de toute trace de S-globulines.
La résine est ensuite régénérée avec un tampon acétate 1 H à pH 5,5 qui permet d'éluer les Hglobulines et des traces d'albumine.
Application - à la purification de l'albumine par élution sélective
10 g de la résine cationique sont chargés et maintenus comprimes dans une colonne de 1 cm de diamètre. Après avoir équilibré la résine avec un tampon acétate 0,025 H à pH 4,7, on injecte à un débit de 40 ml/h 85 ml d'une solution de ce même tampon contenant 0,357 g de protéines dont la composition en albumine et en ss- globulines est respectivement de 94 % et 6 %. La résine est ensuite lavée avec 40 ml de la même solution tampon. Les solutions effluente et de lavage sont regroupées en une seule solution dont les analysesmontrent l'absence de toute matière protéique.
On injecte ensuite sur la colonne au même débit 68 ml de tampon acétate 0,1 H à pH 5,5. Les analyses effectuees sur cet éluat montrent qu'il contient 263 mg d'aibumine totalement pure. En effet, les immunoélectrophorèses simple et croisée de cet éluat montrent l'absence de toute trace de ss-globulines.
La résine est ensuite régénérée avec un tampon acétate 1 M à pH 5,5 qui permet d'éluer les ss-globulines et l'albumine résiduelle.
Exemple 3 Préparation d' immunoadorbant
Application à la purification d'anticorps
L'bexaméthylènediamine est couplée au support échangeur cationique faible préparé à l'éxemple 2 selon la méthode classique utilisant comme agent de condensation la N-éthoxycarbonyl-2-éthoxy- 1,2-dihydroquinoline ou E.E.D.Q.
Après avoir immergé 25 g de l'échangeur cationique dans 150 ml d'éthanol contenant 18,5 g d'E.E.D.Q., on ajoute 8,75 g d'hexaméthylènediamine préalablement dissout dans 50 ml d'éthanol à 50 2.
Le mélange est alors ajusté à pH 5 avec H2SO4 1N. On laisse sous agitation pendant 20 heures à température ambiante, on filtre et lave successivement avec 100 ml d'éthanol à 50 %, 100 ml de Na Cl 1M, 100 ml d'eau permutée et enfin avec 100 ml d'acétone.
Après avoir séché sous vide pendant 5 heures, la silice greffée NH2 obtenue présente les caractéristiques suivantes
% C 7,8
% H 1,3
% N 1,08
L'antigène constitué par le complexe formé entre l'albumine bovine et la N-désacétylthiocolchicine est ensuite couplé sur la silice greffée NH2 en utilisant le m8me mode de condensation que ci-dessus. On obtient ainsi un immunoadsorbant capable de fixer de manière spécifique les anticorps dirigés contre cet antigène.
Application à la purificaoon d(lt-corps
10 g de l'immunoadsorbant préparé ci-avant sont chargés et maintenus comprimés dans une colonne de 1 cm de diamètre. Après avoir équilibré la résine avec un tampon phosphate 0,05 M à pH 7, on injecte à un débit de 20 ml/h 40 ml d'antisérum de chèvre ayant reçu l'antigène constitué par le complexe formé entre l'albumine bovine et la N-désacétylthiocolchicine. Les analyses effectuées sur le sérum qui percole de la résine montrent l'absence d'anticorps. Après avoir lavé la colonne avec 40 ml de la même solution tampon, on injecte sur la résine 50 ml d'acide propionique 1 M.
La solution effluente qui percole de la colonne est neutralisée en continu à pH 7 avec une solution de Na OH 1N. Les analyses montrent que l'on récupère dans l'éluat neutralisé 60 % des anticorps contenus dans le sérum de départ.

Claims (13)

RVENDICATIONS
1. Support minéral poreux pour la purification et le fracton- nement des macromolécules biologiques caractérise & ommat;aE en ce qulil est constitué d'un oxyde métallique revetu par un film polymère à base de vinyllactame formé par copolymérisation sur le support a) dun vinyllactame b) d'un agent de réticulation polyfonctionnela ainsi que, éventuellement, c) d'un monomère vinylique ayant un groupement réactif échangeur d'ions ou susceptible entre modifié pour fixer des radicaux échangeurs d'ions ou des ligands spécifiques.
2. Support selon la revendication 1 caractérisé en cetque l'oxyde métallique est une silice, une alumine, un oxyde de titane ou un dérivé naturel ou synthétique de ces oxydes.
3. Support selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'oxyde minéral est une silice ayant une surface spécifique comprise entre 5 et 400 m2/g, de préférence 10 à 100 m2/g, un diamètre poreux moyen compris entre 100 et 3000 Ag de préférence 400 à 1500 d, un volume poreux compris entre 0,4 et 2 ml/g, et une granulométrie comprise entre 0,4 m et 5 mm.
4. Support selon la revendication i, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est choisi parmi les diacrylates de polyols, les dérivés vinyliques ou allyliques de triazine, les vinylsilanes de formule H2C = CH-SiX3 dans laquelle X, identique ou différent, représente un radical alkoxy, acetoxy, phénoxy ou un halogène.
5. Support minéral poreux pour la séparation des macromo lécules biologiques par chromatographie d'exclusion caractérisé en ce qu'il est constitué d'un oxyde minéral revêtu d'un film de polyvinyllactame formé par copolymérisation sur le support d'un vinyllactame réticulé par un vinylsilane de formule H2C = CH-SiX3 où X, identique ou différent, représente un radical alkoxy, acétoxy, phénoxy ou un halogène.
6. Support minéral poreux pour la fixation reversible de macromolécules biologiques caractérisé en ce qu'il est constitué d'un oxyde minéral revêtu par un film polymère obtenu par copolymérisation sur le support a) d'un vinyllactame, b) d'un agent de réticulation polyfonctionnel et c) d'un monomère vinylique copolymérisable de formule
Figure img00100001
dans laquelle R1 est H ou CH3 et R2 est choisi dans le groupe représenté par
- un radical aryl
- un groupe fonctionnel réactif Y
- un groupe fonctionnel Y relié à l'atome de carbone insaturé par I1 intermédiaire d'un radical divalent.
7. Support selon la revendication 6 dans lequel le groupe fonctionnel Y du monomère vinylique c) est choisi parmi -CEN, -CONH2, -CH20H, -COOR3 où R3 est H ou alkyl en C -C ou -NH2, -OH, -halogène, -S03H, -PO(OH)2.
Figure img00110001
8. Support selon l'une des revendications 1 à 7 caractérise en ce que le vinyllactame est la N-vinylpyrrolidone-2.
9. Support selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisé en ce que le radical R2 est modifié en un nouveau groupe Y' échangeurs d'ions ou susceptible d'immobiliser le ligand spécifique d'une macromolécule biologique.
10. Procédé de préparation du support selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé par le fait que l'on imprègne l'oxyde minéral par une solution dans un solvant a) du vinyllactame, b) du réticulant, éventuellement c) du comonomère vinylique reactif et d'un initiateur, on évapore le solvant et on réticule les monomères en présence de chaleur ou de rayonnements ultraviolets.
11. Procédé selon revendication 10 caractérisé en ce que la quantité de monomères est choisie de manière à obtenir sur le support un film de polymère compris entre I et 15 mg/m2, de préfe- rence entre 1 et 6 mg/m2.
12. Procédé selon les revendications 10 ou 11 caractérisé en ce que la quantité de comonomère réactif c) est calculée de manière à ce que le nombre de groupes fonctionnels répartis à la surface du support soit compris entre 0,05 et 2 m.eq/g de support.
13. Utilisation du support selon l'une des revendications 1 à 9 pour la purification et le fractionnement de macromolécules biologiques par chromatographie d'exclusion, d'échange d'ions ou d'affinité spécifique.
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