JPS58500127A - 回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は物質の回収に関する。

特に本発明は、乳汁や血清などから免疫グロブリンを回収する方法に関する。本 明細書では、「乳汁」とは全乳あるいは脱脂乳やホエイのような全乳の誘導物を 意味し、これらは液状、あるいは水に可溶性かまたは分散可能であれば固体状で もよく、全乳あるいはその誘導物が生物学的に活性のある免疫グロブリンを含む ものを指す。

回収された免疫グログリンは、抗体による保護作用という生物学的に有用な機能 を有するため、いわゆる「免疫孔」から免疫グロブリンを回収することが好まし い。病気にかかりやすいヒトや動物に適切な免疫グロブリンを、食餌としである いは注射により与えれば、治療効果および／あるいは予防効果がある。回収免疫 グログリンはまた疾患に対する免疫応答を理解する有用な研究手段としても使わ れ、またこれらの免疫グログリンは免疫診断検査の基礎をなしている。

乳汁、荷に牛乳は特別重要な天然の免疫グロブリン源である。乳牛のような哨乳 動物は広範囲の疾患に対してうまく免疫させることができる。

抗体産生をおこさせる病原生物の例としては、大腸菌、サルモ洋う菌、赤痢菌、 およびコレラ菌などの細菌、ロータウィルス（ｒｏｔａｖｌｒｕｓ　）やポリオ のようなウィルス、クラミジアやキャンディダなどのカビ類、ギアルソア（Ｇｉ ａｒｄｌａ　）のような原生動物および嬬虫や肝ジストマなどがある。

もうひとつの重要な免疫グロブリン源は血液である。

たとえば抗破傷風免疫グロブリンは馬の血液より得られる。

免疫した牛の乳からの免疫グログリン回収方法が今までに発表されているが、こ れらの方法は所期の免疫グロブリンを含有する原乳より濃縮物を得るために、濾 過あるいは限外濾過などの方法を使用している。このような方法では牛乳の大部 分は捨てられてむだになり、濃縮物は有用な免疫グロブリンを含有しているが、 同時に原乳中の他の多くの微量成分を濃縮された形で含有している。このような 高濃度ではこれらの微量成分の多くは好ましくはない。さらに、きびしい処理条 件ｒでは免疫グロブリンは簡単に失活してし１うため、このような方法では免疫 グログリンの力価はたいてい減少する。

したがって原料の大部分を捨てることなく、また原料に存在する他の微量成分を 同時に濃縮してしまうこ′　となく、乳汁のような原料から、有用な高力価の免 疫グロブリンを経済的に抽出できる方法が必要である。

このような方法を用いれば理想的には次の２つの最終産物が得られるであろう。

ひとつは純粋な濃縮された免疫グログリンであり、もうひとつは原材料より免疫 グログリンのみ欠けたものである。注射用に用いる場合は、高純度の免疫グログ リンが特に重要である。

特に注目すべきものはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＣ）およびＩｇＥクラスの免疫グロ ブリンである。

本発明は、原料のひとつあるいは２つ以上の免疫グロブリンに対し特異的である が、原料中のその他の通常の成分には特異性のない低親和性の抗体の結合した不 溶性担体に、免疫グロブリンの原料を接触させて抗体を免疫グログリンと結合さ せ、残存する原料を除去した後膣免疫グロブリン分子を抗体より分離することよ り成る、免疫グロブリンの回収方法を与える。

好ましい実施態様として本発明は、ひとつあるいは２つ以上の乳汁免疫グロブリ ンに対し特異的であるが、乳汁中のその他の通常の成分には特異性のない低親和 性の抗体の結合した不溶性担体に、乳汁を接触させて抗体を免疫グロブリン分子 と結合させ、残存する乳汁を除去した後膣免疫グロブリン分子を抗体より分離す ることより成る、高純度で高力価の免疫グロブリンの乳汁からの回収方法を与え る。

本発明のひうひとっの実施態様は、ひとつあるいは２つ以上の乳汁免疫グロブリ ンには特異的であるが、乳汁中のその他の通常の成分には特異性がなくかつ不溶 性の担体に固定化された、低親和性の抗体から成る、乳汁の通過できる免疫吸着 カラムあるいは一過器と、該免疫吸着カラムあるいは濾過器を溶出させて結合免 疫グロブリンを抗体より分離する装置より成ることを特徴とする、高純度かつ高 力価の乳汁免疫グログリンの回収装置である。また本装置は、溶出前に免疫吸着 カラムあるいは濾過器を洗い流し乳汁を除去する装置を備えていることが好まし い。

回収した免疫グロブリンの高純度を確保するために、核゛抗体は目的とする免液 グログリンとは特異的に結合するが、処理すべき原料にふつうに存在するその他 の物質には結合しないものであることが重要である。

高力価を維持するために、回収操作中に免疫グロブリンが著しく失活しないこと が不可欠である。したがって原料から免疫グロブリンを抽出するのに用（・る抗 体は、免疫グログリンに対し特異的な親和性を有するが、抗体と免疫グロブリン 間の結合は充分弱く、たとえばＰＨあるいは電解質濃度のわずかの変化により、 免疫グロブリンを抗体より比較的容易に分離することができるものでなければな らない。

適切な溶出液ある（・は溶出方法としては次のようなものがある。

ａ）結合抗体が活性を有する中性に近いＰＨから２の方へ下げさせるか、あるい は１０または１１の方へ上げさせることができる溶液、たとえばグリシン／塩酸 緩衝液、酢酸水溶液、プロピオン酸水溶液、あるいはアンモニア水溶液。

ｂ）極性を低トさせる系、たとえば５０％エチレングリコール水溶液、あるいは １０％ジオキサン水溶液。

Ｃ）解離剤、たとえば６−８Ｍ尿素水溶液、ある（・は６Ｍ塩酸グアニソン水溶 液。

ｄ）コアトロピックイオン（電解質）、たとえば適切なモル濃度のヨウ化ナトリ ウム、塩化マグネシウムあるいはチオシアン酸ナトリウムの水溶液、およびｅ） 電気泳動的脱着。

抗体より免疫グログリンを溶出したあとで、免疫グロブリンと溶出液をたとえば 透析などの方法によりできるだけすみやかに分離することがふつう望ましい。

免液グロブリンを溶出液と長時間接触させておくと免疫グロブリンが多少失活す ることがあるため、免疫グログリンは生理学的に中性な環境に移さな、すればな らない。

抗体はいわゆる［単一クローン性抗体Ｊ、すなわち、たとえば哺乳動物の単一の 膵臓細胞のような単一の抗体産生細胞より得られた永久細胞株により産生される 抗体であることが望ましい。そのよう々永久細胞株は、たとえば抗体性を示す免 疫グロブリンで免疫した動物の膵臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られる ハイグリドーマ細胞株として手に入れることができる。

本発明に用いる抗体は高い特異性を有することが好ましいことを考えると、理想 的には該抗体は免疫グロブリン分子の唯ひとつの結合部位（決定基）を認識する ことが好ましい。抗体は抗−（軽鎖）抗体あるいは抗−（重鎮）抗体のどちらで もよ−・。前者はラムダ軽鎖あるいはカッパ軽鎖と特異的に結合するが、軽鎖を 有スるすべてのクラスの免疫グロブリンを取り出す。

後者は個々の免疫グロブリン（たとえば牛のＩ、（）ユ）、あるいは個々の特徴 的な重鎮上に存在する共通の抗原決定基を有するいくつかの免疫グロブリンと特 異的に結合する。

本発明の好ましい実施態様としては、液状の原料が、抗体の結合した不溶性担体 床中を流れることにより、免疫グロブリンの除去がなされる二とが好ましい。た とえば該液体原料を担体を充填したカラムの中を流すことができる。この担体は 比較的大きな表面積を有することが必要で、したがって小さい球状、網状、ある いは細かい網の目状でなければならない。

担体物質の化学的性質自身は本発明にとって決定的に重要ではない。生物学的活 性のあるたん白質性物質（たとえば酵素）を固定化する多くの技術が文献に記載 されているため、当該技術分野で広範囲の適切な担体が知られて（・る。多くの 適切な担体が市販されている。担体物質（当該技術分野でしばしばマトリックス と称される）としては、ナイロン、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポ リアクリルアミド、炭素轍維、がラス、紙、ラテックス、あるいは抗体を固定化 させ抗体の所期の抗原結合性や抗原分離特性を少なくともかなり保持できるもの ならどんな物質でもよい。

担体物質は通常の使用条件において分解することなく、細菌繁殖や汚染の危険を 低下させるものでなければならない。

生物学的活性のあるたん白質を担体に結合させる多様の化学的万人が知られてい る。いくつかのマ）　ＩＪラックスすでに化学構造の中に適切な官能基を有して おり、必要な場合にはそれらの官能基を結合反応に用いたり、若干変更したりす ることが可能である。最初からそのような官能基を有さない他のマトリックスに ついては、そのような官能基を導入する方法が知られている。ふつう官能基には 活性化が必要であり、この活性化にも多くの方法が知られている。

たとえばナイロンの酸加水分解により多量のカルボキシル基（−Ｃ０ＯＨ）とア ミノ基（−ＮＨ２）が得られ、この加水分解はたん白質の分解に使用できる。カ ルボキシル基は、たとえばＮ−ヒドロキシコ・・り酸アミドエステルあるいはＮ −カルボシイミドを用いて活性化できる。アミノ基は、たとえばグルタルアルデ ヒドあるいは臭化シアンを用いて活性化できる。アがロースやセルロースなどの 多糖類はもともと水酸基（−ＯＨ）を持っており、これは、たとえば臭化シアン あるいは過ヨウ素酸酸化により活性化できる。ポリスチレンやポリアクリルアミ ドはもともと適当な官能基を持っていないが、そのような官能基は容易に導入で きる。たとえばニトロ化と還元によりポリスチレンにアミン基が導入される。し かる後に、ナイロンで採用した方法を用（・てアミノ基が活性化され、あるいは 必要であれば水酸基のような他の官能基に変換することもできる。

ガラスは市販の試薬を用いてンリル化され、シリル化によりぶつうアミノ基が得 られ、アミン基は前述したように活性化される。

例として、本発明の特に好ましい実施態様を詳細に説明する。

乳汁かもの免疫グログリンの回収 免疫した牛の乳は多量の免疫グログＩＪ　７　Ｉｇｏｌを含有する。これはたと えばヒトや動物の消費用に乾燥牛乳や牛乳伏替物などの合成食塩に添加し、胃腸 疾患などの感染に対し受動免疫を与えることができる。

Ｉ　ｇＧｌに対し特異的な単一クローン性抗体は原理的に既知の方法で産生させ ることができる。典型的な方法では、ＤＥＡＥセルロースによるイオン交換クロ マトグラフィー（これは研究用には充分多量の精製免疫グロゾリ／が得られるが 、工業的方法としては不経済である）の典型的な方法により単離した精製Ｉ　ｇ Ｇｌを１無菌」マウスのような宿主動物に注射し、宿主の膵臓細胞に抗体を産生 させる。それから宿主動物を殺し膵臓を取り出し遊離の膵臓細胞を得る。ポリエ チレングリコールなどの標準試薬を用い、これらの細胞をミエローマ細胞と融合 させ、抗体を産生ずる・・イブリドーマ細胞を得る。抗−ＩｇＧ□を産生ずる細 胞株を免疫化学的方法によりふるいわけ、試験管内あるいは生体内で培養し、次 に便宜的に固定化した牛Ｉｇ（）１からの溶出特性を調べて相対的親和力により 選別する。

選択した単一クローン性抗体を産生ずる細胞株をさらに培養し、生成した抗体画 分は化学的方法あるいは好ましくは親和性選別試験に用いた溶出方法に似た方法 により精製し、抗体を固体の支持体に結合させる。

この免疫吸着剤はたとえばカラムに詰めることができる。

免疫吸着剤含有カラムは通常の牛乳加工装置の中に組みこまれ、この装置の中の 牛乳処理量の中の少なくともかなりの部分がカラムを通過するようにする。ナイ ロン、紙あるいは綿でできた一過器を、牛乳加工ラインの中へ組みこむことはふ つうになされており、そのような濾過器は本発明の目的に適応させる二とができ る。しかし本発明の免疫吸着剤は標準牛乳濾過器よりうしろの方へ置くことが好 ましい。免疫吸着剤上の抗体が免疫グログリンで飽和した時は、適当な間隔で免 疫吸着カラムあるいは一過器を交換し、免疫グロブリンを飽和した免疫吸着剤よ り回収する。そして該免疫吸着剤は再使用の準備ができる。

この免疫吸着カラムあるいは一過器は、牛乳加工う０ インの中の重要な部分ともなり得るし、末端の加工装置として用いることもでき る。前者の場合にカラム内あるいは濾過器内の牛乳の流速が加工ライン全体の流 れる速度を妨げるようになると面倒な事態になることもある。たとえば牛乳の低 温殺菌にふつうに用いられる熱交換器の中では、牛乳が加熱しすぎたり焦げたり するのを避けるために、牛乳が急速で支障なく流れることが必要である。これは 密に充填した担体の中はゆっくり流れた方が効率的なこともある免疫吸着カラム や濾過器内の最適流速と一致しないことがある。「ライン内」調整のために免疫 グロブリン回収の効率と牛乳加工工場全体の処理量とのバランスをとらなければ ならない。この矛盾を避けるもうひとつの配置は、免疫吸着カラムあるいは濾過 器を大容量貯蔵タンクに関連した再循還系の中に組み入れることであり、それに より牛乳が通常の加工ラインにはいる前に、牛乳から免疫グロプリ／が回収され る。もうひとつの配置は牛乳をひとつの大容量タンクからもうひとつの大容量タ ンクヘボンゾで送り、免疫吸着カラムや濾過器をその中間に入れ牛乳を通過させ る方法である。

どのような配置をとるにせよ、２個かあるいはそれ以上の免疫吸着カラムあるい は濾過器を平行して使うのが有利である。したがってたとえば牛乳から免疫グロ グリンを回収するためにひとつのカラムあるいは濾過器を使っている間、もうひ とつのカラムあるいは戸１ 過器をさきに吸着した免疫グロブリンを回収するために溶出することができる。

次に最初のカラムある（・は濾過器が免疫グロブリンで飽和したら、牛乳の流れ を最初のカラムから次のカラムへかえることができる。

すぐ交換できるカラムあるいは濾過器の必要性を避けるために個々の免疫吸着カ ラムあるいは一過器に溶出装置をとりつけることができる。その装置は溶出前に カラムあるいは濾過器に残っている牛乳を洗い流せることが好ましい。また次に 牛乳に接触させる前に溶出溶媒が洗い流せるのが理想的である。洗浄液はたとえ ば希薄な生理食塩水あるいはリン酸緩衝化生理食塩水ＣＰＢＳ　）のようＫ、牛 乳加工ラインに微量はいっても免疫吸着剤に害を与えたり危険な汚染物になった りしないような生理的に無害な液でなければならない。

この方法を用いると初乳中の高濃度の抗体が早く便利に回収できるばかりでなく 、通常の牛乳中に比較的少量しか存在しない免疫グロブリンも経済的に回収され る。

ふつう免疫グロブリンは、たとえば牛乳の総たん白質量の１チにもはるかに満た ない量であり、したがって本発明の回収機構の特異性によりこの有用な抗原物質 を除去しても、原料の組成は事実上変化しない。特に本発明の応用される牛乳の 栄養学的性質は基本的に変化せず、加工乳は通常の方法でヒトあるいは動物用の 食物として利用できる。

１２ 本発明の有効性は次の実験法で示される。

Ｂａ１ｂ／ｃマウスに精製牛Ｉ　ｇｏｌを腹腔内投与し、４２日、５４日そして ６１日８に追加免疫注射をした。細胞融合の６日前にも静脈内に追加免疫注射を した。マウスを殺し膵臓を取り出し、細胞を細かくさいて生理食塩水に入れて牌 細胞を無菌的に調製した。細胞遊浮液を２００×ノで５分間遠心分離後、ペレッ トを１０７細胞／ｍｌで生理食塩水に再浮遊させた。これらの操作は室温で行な った。

ｂ）融合のためのミエローマ細胞の調製ヒポキサンチングアニンフォスフオリゴ ジルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ　）の欠損したＢａ１ｂ／ｃミエローマ細 胞（Ｐ　５　ｘ　６３．Ａｇ８．フローラダラドリーズ（Ｆｌｏｗ　ＬａｂＯｒ ａｔｏｒｌｅｓ　）より購入できる）を箋１０％牛脂児血清と１０％馬血清を含 むダルベコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養を続げた。この株の増殖はヒボ キサンチン、アミノグチリン、チミジン培地（ＨＡＴ）で阻害できる。融合の日 に、ミエローマ細胞浮遊液を２０Ｑｘ９で５分間遠心分離し、ペレットを生理食 塩水に再浮遊し、２００×９で５分間遠心し、最後に１０７細胞／　ｍｌの濃度 で生理食塩水に浮遊させた。

Ｃ）腹膜マクロファージの調製 ３ １１表口Ｕ３８−５００１２７　（５）融合の前日に３匹のＢａ１ｂ／ｃマウス を殺し、腹部の皮膚を除去し、恥骨結合の真上から注射針を入れ、注射針の先が 肝臓の右葉の−１にくるように、４−５ｍ１の生理食塩水を腹膜投与した。腹部 を軽くマツサージしてから中の液を抜きとり、マウス１匹あたり１−３×１０６ 個のマクロファージを得た。マクロファージをボリデロピレンチューグに集めＤ ＭＥＭで洗浄し、集めて計測し、次に２００Ｘ９で５分間遠心分離し、ＨＡＴに ５Ｘ１０５細胞／　ｍｌになるように再浮遊した。細胞をリングロゾレート（Ｌ ｉｎｂｒｏ　ｐｌａｔｅ　）中の１カツプあたり２−５　ｘ　１０’細胞になる ように分注し、翌日使用できるように６％Ｃ０２インキユベータに入れておいた 。

融合のために２Ｘ１０’個の牌細胞を５×１０７個のミエローマ細胞といっしょ にし、浮遊液を２００×２で５分間遠心分離した。上澄液は捨てペレットはほぐ した。このペレットにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　３０００の５０チ溶 液（Ｗ／Ｖ）を１．Ｑｍ！、あるいはＰＥＧ　１５００の６５％溶液（Ｗ／Ｖ　 ）を０．２ｍｌ加えた。細胞を室温で攪拌しながら１分間インキュベートし、つ ぎに攪拌せず［３７°Ｃの水浴中に２分間浸した。次に５分間にわたり２０ｍ１ の生理食塩水をゆっくり加えて融合を停止させた。そして２００×りで５分間細 胞を遠心分離した。上清を捨４ てペレットは静かにＨＡＴに再浮遊させた。次に細胞をカップあたり７Ｘ１０’ （膵臓）濃度になるように、前処理をしたりグロ（ＬｉｂｒＯ）　プレートに分 散した。

そのプレートを６％ＣＯ２インキュベーター中で３７培養液を４日月、７８目、 １０日８に、そしてそれ以後は一日おきに第３週の終わりまで検査した。

これらのおのおのの日に培地１ｍｌを吸引により取り、新しいＨＡＴ培地でおき かえることを２１日８まで続け、それ以後は通常の増殖培地でおきかえた。１０ ４個以上のハイブリッド細胞を含む穴からの上清を酵素結合免疫測定法を用い、 牛Ｉ　ｇｏｌに対する抗体について検査した。陽性のクローンは２ｍｌの新鮮な 培地を含む２５ｍ１容フラスコに移した。ハイブリッド細胞がこの２５．７１１ のフラスコ中で′・１とんど集合してくるまで増殖した後ただちに１０％ＤＭＳ ｏ中で凍結させて保存した。

保存したクローン試料をプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ　）−処理したマウスに 注射した。１５日間後にこれらのマウスの腹水を集めた。この腹水の中には約３ ■／　ｍｌの特異的単一クローン性抗体が含まれていた。

ｇ）抗体の選択 本発明の目的のための抗−（牛ＩｇＧ１）抗体とじて５ の適否は、臭化シアンで活性化させたセファロースに結合した牛Ｉ　ｇＧｌを含 むカラムに、該抗体を含む腹水を通すことにより評価した。ＰＢＳを用いてカラ ムから腹水を洗い流したのち、室温においてＭｇ（Ｊ２溶液のモル濃度を０から ５Ｍまで増加させて溶出し、抗体の有無を調べた。５Ｍ以下の濃度で分離してく る抗体は、牛ＩｇＧ□に対する親和力は充分弱く、抗体が免疫した牛の牛乳より 選択的にかつのちに回収できるように抽出する方法の基礎をなす。

４Ｍ濃度のＭｇ（Ｊ２において分離してきた抗体の１５′ｍｆを、カラムに充填 した。、５９の臭化シアン活性化セファロースに結合させ、カラムを免疫した牛 の牛乳で溶出した。ＰＢＳで洗浄し４ＭのＭｇＣｆ２水溶液で溶出したのち、３ ■のＩ　ｇＧｌが回収された。

同じカラムを用いてこの回収操作を１ｏ回繰返し、おのおのの場合に約３ｑのＩ 　ｇＧｌが得られた。この事実はカラムの抽出能力が約６■ＩｇＧ□であること を示しており、これは免疫吸着剤の効率を低下させるような、立体的阻害のよう な因子を考慮にいれればきわめて妥当な値である。これはまた免疫吸着剤が再使 用可能であることをはっきり示している。ふつうの牛乳は約０．５■／　ｍｌの Ｉｇ（）１を含有しており、したがってこの免疫吸着剤は１回の操作にっき５− ６　ｍｌの牛乳のＩ　ｇＧｌのすべてを抽出する能力があることを１６ 示していた。

カラムは１年間４°Ｃに維持した。この間１００回以上カラムを使用し、回収さ れた免疫グロブリンの収率は一定しており、これはカラムが再使用できることを さらに示している。

抗体の試験管内培養 前述した方法より得られた抗つシＩｇＯ単一りローン性抗体は、ハイグリッド細 胞株の試験管内培養により大量に生産することができる。試験管内培養では相当 量（たとえばキログラム量）の抗体が得られ、工業的規模の免疫吸着装置の製造 が可能になる。

回収した免疫グロブリンの生物学的活性の・Ｑｌｌ定ａ）抗−ヘモリジン活性 免疫グログリン調製液の連続希釈液を標準量のへモリジン調製液に添加した。次 にヒツジ赤血球を加えた。赤血球が溶解したものは免疫グロブリンが存在しない ことを示し、赤血球がボタン状になったものは充分量の免疫グロブリンが存在し ていることを示していた。牛乳と牛血液を用いた実験で次の結果が得られた。

牛　乳　抗体価 原液　１／１０００ 単一クロ一ン性抗体免疫 吸着剤中を通過してきた液　１／６４０ｉ　Ｍ　ＭｇＣｆ２溶出ピーク　１／６ ４０７ ′Ｉ積昭５８−５００１２７　（６） 血　清　抗体価 原液　１／２０００ 通過してきた液　１／６４０ １ＭＭｇ（Ｊ２ピーク　１／６４０ ｂ）抗−０１４９大腸菌活性 ヒツジ赤血球を、加熱により死滅させた０１４９大腸菌から調製した抗原で、６ ０分・間吸着させることにより被膜した。血球を洗浄し、連続希釈した免疫グロ グリン調製液を標準量の血球に添加した。血球の凝集は免疫グロブリンの存在を 示していた。

０１４９大腸菌で免疫した牛の血清の硫酸アンモニウム沈澱物より免疫グロブリ ン調製液を得た。その結果は以下に示す通りである。

免疫グロブリン調製液　抗体価 原血清　１／３２０００ 通過してきたもの　１／３２０００ １ＭＭｇｃｚ、、ピーク　１／４００ 再吸着と溶出後の １Ｍ　ＭｇＣｊ！２のピーク　１／４００本発明を用いることにより、単一クロ ーン性免疫吸着剤を用いて牛乳と血清より、生物学的活性を完全に維持したまま 牛免疫グロブリンを単離することが可能であることを、これらの測定が示してい る。

免疫グログリンの工業的規模の回収 例としてのみ、添付した図面に乳汁からの免疫グロ８ プリンの工業的規模の回収装置のいくつかを示す。それらのうち 図１−　本発明の免疫吸着カラムの立面断面図を示０ 図２−２個の免疫吸着カラムを含む回収装置の一般的配置を示す。

図６−大容量タンクへの循環装置を含む回収装置の一般的配置を示す。

１凶１に示したように免疫吸着カラムは直立型の円筒容器１０１であり、この円 面容器の上部１０３の中央に入口管１０２があり、底部１０５の中央に出口管１ ０４がある。多孔性円板１０６が底部１０５のすぐ上にあり容器の水平断面全体 に広がっている。この円板１０６の目的は免疫吸着物質１０７（ビーズ状で描か れており、容器１０１の中に充填されている）の支持体となり、また免疫吸着物 質粒子が、カラム中を流れる液体により出口１０４よつ流出させられることを防 ぐことにある。第２の多孔性円板１０８が免疫吸着物質１０７の上に位置し、同 様に本容器の水平断面全体に広がっている。円板１０８は免疫吸着物質を定位置 に固定させるのに役だち、免疫吸着物質床中の液体の均一な流れを維持するのに 役立っている。円板１０日の上にあるプレフィルタ−１０９は液体中の固形粒子 をふるいわけることにより、この液が免疫吸着剤床に捕捉されたり、流れを妨害 したりすることのな９ いようにしている。

容器１０１は、牛乳加工装置の作成に用（・られる通常の物質であればどのよう な物質を使って作成してもよい。そのひとつのよい例がステンレススチールであ る。もし必要であれば、容器の内側にガラスのような不活性物質をとりつけるこ ともできる。

：図２は牛乳に通常の加工処理をする前の、牛乳回収のための「加工ライン内」 の配置を示す。この装置では入口管２０１がプレフィルタ−２０２を通って２方 向弁２０３につながっている。プレフィルタ−２０２は免疫吸着カラムに組みこ まれたいかなるプレフィルタ−（図１の１０９の部分）の代用もでき、またこの ように組みこまれたいかなるプレフィルタ−と共に用いることもできる。弁２０ ３から管２０４と２０５が出ておりそれぞれ免疫吸着カラム２０６と２０７に達 してい乙。カラム２０６の下端より管２０８が出て２方向弁２０９につながり、 そこから出口管２１０と２１１が出て、管２１１は２方向弁２１２を通して通常 の牛乳加工装置（図には出ていない）につながっている。同様に、カラム２０７ の下端より出た管２１３が２方向弁２１４に達し、そこから出口管２１５と２１ ６が出て、管２１６は２方向弁２１２で管２１１とつなつｔつている。

この装置はまた個々の免疫吸着カラムを洗い流す装置と個々のカラムを溶出する 装置を有している。この２０ 洗浄装置は洗浄液の貯蔵容器２１７を有し、管２１８を通してボンデ２１９に達 しさらに管２２０につながっている。この管２２０は接合部２２１において分管 ２２２と分管２２４にわかれる。最初の分管２２２は管２０４の入［］弁２２３ につなかり、２番目の分管２２４は管２０５の入口弁２２５につながっている。

溶出装置は溶出液の貯蔵容器２２６を有し、管２２７がボンデ２２８に達し、そ こから管２２９が接合部２３０につながり、そこから最初の分管２３１がパイプ ２０４の入口弁２３２につながり、２番目の分管２３３がパイプ２０５の入口弁 ２３４につながって（・る。

実際の操作にあたっては、免疫吸着カラムの２０６と２０７は交互に使用するこ とができる。したがってたとえば、大容量タンク（図には出ていない）からの牛 乳はボンデにより管２０１とプレフィルタ−２０２を通り、管２０４さらにカラ ム２０６へと達する。牛乳はカラム２０６から管２０８と管２１１を通り通常の 牛乳加工ラインに達する。牛乳がカラム２０６を通過する間に免疫グロブリンは 免疫吸着剤に吸着される。

一方前に免疫グロブリンで飽和させておいた第２０カラム２０７は、貯蔵容器２ １７の洗浄液で牛乳を洗い流され、洗浄液は管２１５を通して捨てられる。カラ ム２０７から牛乳が洗い流されれば、カラムを貯蔵容器２２４の１容出液で溶出 することができる。この溶出１ 液は出口管２１５より集めろことができる。溶出液が充分量の結合免疫グロブリ ンを免疫吸着剤より除去してしまえば、カラムをもう一度洗浄液で洗浄し再使用 が可能となる。カラム２０６が免疫グログリンにより飽和されたならば、弁２０ ３を用いて牛乳の流れを未飽和のカラム２０７の方へ変換できる。最初は流入し てくる牛乳がカラム２０７の残存している液と入れかわっている間、カラム２０ ７より出てくる液体を管２１５より捨てることができる。残存する洗浄液をカラ ム２０７より除去できたなら、弁２１４と管２１６を用いて新鮮な牛乳を牛乳加 工ラインの方へ変換できる。

本装置にはわずかに２個の免疫吸着カラムしか描かれてないが、もつと多くのカ ラムを平行して使用するのが好ましい。このようにすれば操作の自由度があがり 、個々のカラムを洗浄したり再使用の前に溶出したりする時間を長くすることが できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｉｌｌ　乳汁や血清などの天然の原料から免侵グロデリ／を回収する方法におい て、原料の１つ以上の免役グロデリ／に特異的ではあるが、その他のふつうの成 分には特異的でない低親和性の抗体を結合しｆこ不溶性担体に、免疫グロブリン の原料を接触させて、抗体を免疫グロブリン分子と結合させ、残存する原料を除 去し１こ後免疫グログリフ分子を抗体より分離することを特徴とする。上記免疫 グロブリンの回収方法。 （２）乳汁より高り５度かつ高力価の免疫グログリ／ヲ回収する方法において、 １つ以上の乳汁免疫グロブリンに特異的であるが、乳汁のその他のふつうの成分 には特異的でない低親和性の抗体を結合した不溶性担体に乳汁乞接触させ℃、抗 体を免疫グロブリン分子と結合させ、残存する乳汁乞除去しｆこ後免疫グロブリ ン分子を抗体より分離することを特徴とする。上記免疫グログリンの回収方法。 （３）抗体が単一クローン性抗体である、請求の範囲第１項あるいは第２項に記 載の方法。 （４）抗体−が免疫吸着カラムあるいは１過器に結合しており、結合し１こ免疫 グロブリンン、免疫吸着カラムあるいは濾過器より溶出することにより分離する ことを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の方法。 （５）　免疫吸着カラムあるいは濾過器を、溶出前に生理４ 学的に中性の液体で洗浄することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。 （６）　免疫吸着カラムあるいは一過器を溶出後、しかし免疫グログリンをさら に吸着させるのに使用する前に。 生理学的に中性の液体で洗浄することを特徴とする請求の範囲第５項に記載つ方 法。 （７）　原料が牛乳であり、回収される免疫グロブリンが牛ＩｇＣ）１であるこ とを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のうちいずれか１項に記載の方法。 １３）　抗体が１つ以上の乳汁免疫グロブリンに特異的ではあるが、乳汁のその 他のふつうの成分には特異的で々い低親和性の抗体であることを特徴とする、不 溶性担体に結合した抗体より成る免疫吸着カラムあるいは濾過器。 １９）抗体の結合した担体物質中に乳汁な通過させる前に、乳汁中の固体粒子を ふるいわけるためのプレフィルタ−を組みこんだ、請求の範囲第８項に記載の免 疫吸着カラム。 １０）１つ以上の乳汁免疫グログリンに特異的ではあるが、乳汁中のその他の通 常の成分には特異的でなくかつ不溶性の担体に固定化された低親和性の抗体から 成る、乳汁の通過できる免疫吸着カラムあるいは濾過器と、該免疫吸着カラムと 濾過器を溶出させて結合免疫グロブリンを抗体より分離する要素より成ることを 特徴とする、高純度および高力価の乳汁免疫グロブリン２５ の回収装置。 （１１）　溶出に先たち免疫吸着カラムあるいは濾過器より乳汁を洗い流す装置 をさらに有することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の装置。 （１７Ｊ　乳汁より免疫グロブリンを回収するためにひとつの免疫吸着カラムを 使用している間に、別の免疫吸着カラム又は濾過器を溶出し再使用の準備ができ るように、少なくとも２つの平行した免疫吸着カラムあるいは一過器より成るこ とを特徴とする請求の範囲第１０項あるいは第１１項に記載の装置。 ０Ｊ　請求の範囲第１０項より第１２項のうちいずれか１項に記載の装置をＭす ることを特徴とする乳汁加エデラント。 ０滲　免疫グロブリン回収装置がプラントの「加工ライン内」の装置であること を特徴とする請求の範囲第１３項に記載の乳汁加ニブラント。 ｔｌｓｌ　免疫グログリン回収装置が、大容量乳汁タンクに連結した再循環装置 の一部を成すことを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の乳汁加ニブラント。 （１６）乳汁がポンプで最初の大容量タンクから２番目の大容量タンクに移動さ せられる間に、乳汁が免疫グロブリン回収装置を通過できることを特徴とする請 求の範囲第１６項に記載の乳汁加ニブラント。 持ｚ１０．ｆｆ５８−５００１２７　（２）