JPS59155259A - 腫瘍細胞除去用炉過器 - Google Patents
腫瘍細胞除去用炉過器Info
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- JPS59155259A JPS59155259A JP58030010A JP3001083A JPS59155259A JP S59155259 A JPS59155259 A JP S59155259A JP 58030010 A JP58030010 A JP 58030010A JP 3001083 A JP3001083 A JP 3001083A JP S59155259 A JPS59155259 A JP S59155259A
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- tumor
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、水に不溶性とした抗胆瘍モノクロナ云ル抗体
床よりなる吸着剤を収容したガン細胞除去用濾過器に関
する。更に詳しくはカン患者の骨謀、血液等の被濾過液
中に含まれる腫瘍細胞を除去あるいは腫瘍細胞を破壊除
去するための濾過器に胸する。
床よりなる吸着剤を収容したガン細胞除去用濾過器に関
する。更に詳しくはカン患者の骨謀、血液等の被濾過液
中に含まれる腫瘍細胞を除去あるいは腫瘍細胞を破壊除
去するための濾過器に胸する。
白血病、リンパ腫等の骨髄ガンあるいは肺ガン、乳ガン
、悪性゛肉腺等の固形カンの際、そのガン細胞は、骨髄
あるいは血液中を流れ、しばしばガンの転移をみる。白
血病やリンパ腫等の骨髄カンの場合、化学療法、放射線
療法により寛解状態まで同腹させることはできるが、残
存している白血病＃ｌ胞やリンパ腫細胞が再度増殖する
場合が多く、患者の生存率は、極めて低い。また肺カン
、乳ガン、悪性内臓等の固形カンの場合、外科手術によ
るガン組賊の摘出および化学療法、放射線療法がなされ
ているが、カン細胞が、はんの少しでも患者体内に生き
残っていると、再発転移がしばしばみられる。すなわち
、固形ガンも骨髄ガンと同様極めて生存率の低い医患で
ある。
、悪性゛肉腺等の固形カンの際、そのガン細胞は、骨髄
あるいは血液中を流れ、しばしばガンの転移をみる。白
血病やリンパ腫等の骨髄カンの場合、化学療法、放射線
療法により寛解状態まで同腹させることはできるが、残
存している白血病＃ｌ胞やリンパ腫細胞が再度増殖する
場合が多く、患者の生存率は、極めて低い。また肺カン
、乳ガン、悪性内臓等の固形カンの場合、外科手術によ
るガン組賊の摘出および化学療法、放射線療法がなされ
ているが、カン細胞が、はんの少しでも患者体内に生き
残っていると、再発転移がしばしばみられる。すなわち
、固形ガンも骨髄ガンと同様極めて生存率の低い医患で
ある。
骨髄ガンおよび固形ガン共に、化学療法や放射線療法に
よシ、患者体内のガン細胞を完全に殺せればよいのだが
、強め化学療法や強い放射線療法は、逆に正常細胞をも
殺してしまい、患者の回復は難しい。そこで、自己骨髄
移植法、ｊなわら、骨髄ガンの場合は、患者の寛解期に
、患者骨′Ｎをトリ出し、いわゆるインキュベーター中
に保存し、その間に強い化学療法、強い放射線療法で、
正常細胞の一部も殺しながら、ガン細胞を殺し、その後
、保存しておいた自己骨髄を移植する方法が試みられて
いるが、この骨髄中に、少しでもカン細胞が残存してい
ると、カンは容易に再発してしまう。また固形カンの場
合も、陶様のことが言え、生体内、特に血液中、骨髄中
にガン細胞が残存すると、カンは容易に再発ｉｉｉ移す
る。
よシ、患者体内のガン細胞を完全に殺せればよいのだが
、強め化学療法や強い放射線療法は、逆に正常細胞をも
殺してしまい、患者の回復は難しい。そこで、自己骨髄
移植法、ｊなわら、骨髄ガンの場合は、患者の寛解期に
、患者骨′Ｎをトリ出し、いわゆるインキュベーター中
に保存し、その間に強い化学療法、強い放射線療法で、
正常細胞の一部も殺しながら、ガン細胞を殺し、その後
、保存しておいた自己骨髄を移植する方法が試みられて
いるが、この骨髄中に、少しでもカン細胞が残存してい
ると、カンは容易に再発してしまう。また固形カンの場
合も、陶様のことが言え、生体内、特に血液中、骨髄中
にガン細胞が残存すると、カンは容易に再発ｉｉｉ移す
る。
従って、体内へ移植する骨髄、血液等から腫瘍細胞を完
全に除去しておくことが必要である。
全に除去しておくことが必要である。
零発明者らは、骨髄中、血准中等の腫瘍細胞を除去ある
いは破壊除去するために抗腫瘍モノクロナル抗体を受用
することに着目したが、抗腫瘍モノクロナル抗体はヒト
以外の動物白米でるり、骨髄、血液等と混合した場合、
異種動物タンパクを除去することが困難であり、かかる
異種動物タンパクの混入した骨髄、血液等を患者に戻し
之場合、往々にして強いショックを起さしめる。
いは破壊除去するために抗腫瘍モノクロナル抗体を受用
することに着目したが、抗腫瘍モノクロナル抗体はヒト
以外の動物白米でるり、骨髄、血液等と混合した場合、
異種動物タンパクを除去することが困難であり、かかる
異種動物タンパクの混入した骨髄、血液等を患者に戻し
之場合、往々にして強いショックを起さしめる。
本発明の目的は、骨髄、血液等その他体内への投与物中
の腫瘍細胞を除去るるいは破壊除去するための一過器を
提供することにある。
の腫瘍細胞を除去るるいは破壊除去するための一過器を
提供することにある。
上記の目的及び以下の説明によって明ら力・となるその
他の目的は、本発明、即ち、水不溶性仇肺鵜モノクロナ
Ｉし抗体をｇ＆看剤としてなる腫瘍細胞除去用濾過器を
用いることによって達成される。
他の目的は、本発明、即ち、水不溶性仇肺鵜モノクロナ
Ｉし抗体をｇ＆看剤としてなる腫瘍細胞除去用濾過器を
用いることによって達成される。
本発明の一過器は、収容する不溶化抗腫瘍モノクロナル
抗体が、そこから流出して体内に導入されないよりに、
出口に対して濾過板によって遅閉されている。濾過板と
して不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の漏出を防ぐ細孔ｔ
ｌ−有するものであればよい。好ましくは人血ン夜体外
傭壌系において、血液内に生成するガス気泡、血小板凝
塊、赤血球凝塊、脂肪粒、フィブリン塊などの異物全濾
過除去するために使用されている直径４０μ以下の細孔
を持つフィルター、例えばバリアフィルター（ジョンソ
ン エンド ジョンソン社製）なト４ｃ用いることがで
きる。このよ５にすることによって、不溶化抗腫瘍モノ
クロナル抗体にもとよシ他の上記異物の流出も防ぐこと
ができる。な２、不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体のみの
流出を防ぐのに必要な細孔ｔ−有する濾過板を備えたイ
ンキュベーク−を用いる場合は、他の異物の体内への流
入を防ぐため本発明のインキュベーターから流出し次骨
髄や血液全文に濾過するための適当なフィルター、たと
えば前記フィルターに骨髄や血液を体内へ戻す前に通過
させればよい。
抗体が、そこから流出して体内に導入されないよりに、
出口に対して濾過板によって遅閉されている。濾過板と
して不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の漏出を防ぐ細孔ｔ
ｌ−有するものであればよい。好ましくは人血ン夜体外
傭壌系において、血液内に生成するガス気泡、血小板凝
塊、赤血球凝塊、脂肪粒、フィブリン塊などの異物全濾
過除去するために使用されている直径４０μ以下の細孔
を持つフィルター、例えばバリアフィルター（ジョンソ
ン エンド ジョンソン社製）なト４ｃ用いることがで
きる。このよ５にすることによって、不溶化抗腫瘍モノ
クロナル抗体にもとよシ他の上記異物の流出も防ぐこと
ができる。な２、不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体のみの
流出を防ぐのに必要な細孔ｔ−有する濾過板を備えたイ
ンキュベーク−を用いる場合は、他の異物の体内への流
入を防ぐため本発明のインキュベーターから流出し次骨
髄や血液全文に濾過するための適当なフィルター、たと
えば前記フィルターに骨髄や血液を体内へ戻す前に通過
させればよい。
本発明の濾過器に用いられる水不溶化抗腫瘍モノクロナ
ル抗体粒子は、そのままで、腫瘍細ｊｍを吸着する能力
を有し、ヒトの補体の存在下で腫瘍細胞を破壊する能力
を有するものである。抗腫瘍モノクロナル抗体としては
、腫瘍細胞を動物に免疫し、この動物の抗体産生細胞と
骨髄腫細胞との間に、融合細胞ハイブリッドを作製し、
該ハイブリットラフローン化し、これらクローンのうち
該腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す抗腫瘍抗体を産生する
クローンよシ得られた抗腫瘍モノクロナル抗体を精製し
たものが用いられる。すなわち、精製の過程で混在する
γ−グロブリン以外のクンバクを極力除去し、高度に精
製したものが好ましい。
ル抗体粒子は、そのままで、腫瘍細ｊｍを吸着する能力
を有し、ヒトの補体の存在下で腫瘍細胞を破壊する能力
を有するものである。抗腫瘍モノクロナル抗体としては
、腫瘍細胞を動物に免疫し、この動物の抗体産生細胞と
骨髄腫細胞との間に、融合細胞ハイブリッドを作製し、
該ハイブリットラフローン化し、これらクローンのうち
該腫瘍細胞に対し細胞毒性を示す抗腫瘍抗体を産生する
クローンよシ得られた抗腫瘍モノクロナル抗体を精製し
たものが用いられる。すなわち、精製の過程で混在する
γ−グロブリン以外のクンバクを極力除去し、高度に精
製したものが好ましい。
当該抗腫瘍モノクロナル抗体を酵素の不溶化などで知ら
れる水不溶性とする処理を施すことＫよって水不溶化モ
ノクロナル抗体が得られる。
れる水不溶性とする処理を施すことＫよって水不溶化モ
ノクロナル抗体が得られる。
抗腫瘍モノクロナル抗体は、γ−グロブリン画分を変性
させない限り、いかなる精製法によって精製されたもの
でも、これを不溶化することによって、本発明のインキ
ュベーク−中に用いられる不宕化抗腫瘍モノクロナル抗
体とすることができる。好ましい精製法は、たとえは抗
腫瘍モノクロナル抗体水落液から硫酸アンモニウムの４
０％飽和で沈澱する画分を分取する方法である。
させない限り、いかなる精製法によって精製されたもの
でも、これを不溶化することによって、本発明のインキ
ュベーク−中に用いられる不宕化抗腫瘍モノクロナル抗
体とすることができる。好ましい精製法は、たとえは抗
腫瘍モノクロナル抗体水落液から硫酸アンモニウムの４
０％飽和で沈澱する画分を分取する方法である。
抗腫瘍モノクロナル抗体の不溶化には、−ｆｆＫ酵累な
ど生物活性タンパク質の不溶化法として知られる生物活
性を失うことなく水不溶性とする手法か適用される。
ど生物活性タンパク質の不溶化法として知られる生物活
性を失うことなく水不溶性とする手法か適用される。
従米英施又は提案されている酵素の不溶化方法としては
、高分子多楯体を臭化シアンで活性化させたものに酵素
を結合させるとか、ケイ累材料に酵素を共有結合させる
など不溶性担体に化学的に結合させる方法（特開昭４６
−１８８８号）、活性炭吸着などの物理的（米国特奸第
２７１７８５１）若しくは塩基性陰イオン父換体に吸着
させるなどの静電的な方法（特公唱４５−６８７０号）
、適当なマトリックス、例えばフィブリン■合体中に酵
素を埋没させる方法（特洲唱４９−４１５８４号）な沈
抗鹿賜モノクロナル抗体を用いること以外は同様の方法
によって達せられる。
、高分子多楯体を臭化シアンで活性化させたものに酵素
を結合させるとか、ケイ累材料に酵素を共有結合させる
など不溶性担体に化学的に結合させる方法（特開昭４６
−１８８８号）、活性炭吸着などの物理的（米国特奸第
２７１７８５１）若しくは塩基性陰イオン父換体に吸着
させるなどの静電的な方法（特公唱４５−６８７０号）
、適当なマトリックス、例えばフィブリン■合体中に酵
素を埋没させる方法（特洲唱４９−４１５８４号）な沈
抗鹿賜モノクロナル抗体を用いること以外は同様の方法
によって達せられる。
抗に瘍モノクロナル抗体を化学的に結合させて不溶化す
るために用いられる担体は、抗腫瘍モノクロナル抗体と
結合可能な基、例えはカルボキシル基又はアミン基など
を有する水不溶性何機又は無機高分子材料である。例え
ばポリアクリルアミドケル〔パイオーケｔしく Ｂｉｏ
−ｇｅｌ ） Ｐ −８００など：米国、バイオゲル社
発売〕、アガロース〔セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ） ４ Ｂなど：スウェーデン南、ファルマシア社
発売〕、デキストラン〔セファデックス（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ ） Ｇ ２００、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｌ
）ＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘ ）、ＱＡＥ−セファデッ
クス（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ）など：スウエーデ
ン国、ファルマシア社発光〕、丈にはセルロース（Ｄｈ
：ＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース、ＡＥ−セルロ
ースなど）のような抗腫瘍モノクロナル抗体と直接結合
しない多糖体で、これらを臭化シアンで処理することに
より結合能を与えた材料が有利に用いられる。多糖類を
美化シアンで処理する方法はＰ、クアトレカサス及びＣ
，ｔＳ、アンフィンセン（ｃｕａｔｒｅｃａ８ａａ、
Ｐ、ａｎｄ Ａｎｆｉｎｓｏｎ。
るために用いられる担体は、抗腫瘍モノクロナル抗体と
結合可能な基、例えはカルボキシル基又はアミン基など
を有する水不溶性何機又は無機高分子材料である。例え
ばポリアクリルアミドケル〔パイオーケｔしく Ｂｉｏ
−ｇｅｌ ） Ｐ −８００など：米国、バイオゲル社
発売〕、アガロース〔セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ） ４ Ｂなど：スウェーデン南、ファルマシア社
発売〕、デキストラン〔セファデックス（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ ） Ｇ ２００、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｌ
）ＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘ ）、ＱＡＥ−セファデッ
クス（ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ）など：スウエーデ
ン国、ファルマシア社発光〕、丈にはセルロース（Ｄｈ
：ＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース、ＡＥ−セルロ
ースなど）のような抗腫瘍モノクロナル抗体と直接結合
しない多糖体で、これらを臭化シアンで処理することに
より結合能を与えた材料が有利に用いられる。多糖類を
美化シアンで処理する方法はＰ、クアトレカサス及びＣ
，ｔＳ、アンフィンセン（ｃｕａｔｒｅｃａ８ａａ、
Ｐ、ａｎｄ Ａｎｆｉｎｓｏｎ。
Ｃ，Ｂ、）（メンーメ イン 工ンザイモロジイジャコ
ビＡｆ！ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏｌｏ
ｇｙ 、 ＸＸ■。
ビＡｆ！ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｇｙｍｏｌｏ
ｇｙ 、 ＸＸ■。
ｅｄ、ｂｙ Ｊａｋｏｂｙ 、 Ｗ、Ｂ、）ｐｐ３４５
、（１９７１））によって提案されているアフィニテ
ィークロマトグラフィーの手法でタンパクを分離する方
法として既に確立されている。
、（１９７１））によって提案されているアフィニテ
ィークロマトグラフィーの手法でタンパクを分離する方
法として既に確立されている。
同様にして結合基を何しないポリアミド、例えはナイロ
ン、ポリアセタール、ポリスチレンなど合能の基を与え
ることができる。丈に又カラスのような無機材料も、こ
れをアミノアルキルシラン抗に！緩モノクロナル抗体を
物理的又は静電的に吸着ざゼて不だ化さぜる担体として
は、クインウ土、ｆｔ！３ａ縦などの外、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス、ＤｈＡｌ、−セルロースなどのイオン文
換体などが挙けられる。又抗腫瘍モノクロナル抗体を不
溶化する架橋剤として鉱１例えはゲルタールアルデヒド
のような二官能性化合物を用いることかできる。
ン、ポリアセタール、ポリスチレンなど合能の基を与え
ることができる。丈に又カラスのような無機材料も、こ
れをアミノアルキルシラン抗に！緩モノクロナル抗体を
物理的又は静電的に吸着ざゼて不だ化さぜる担体として
は、クインウ土、ｆｔ！３ａ縦などの外、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス、ＤｈＡｌ、−セルロースなどのイオン文
換体などが挙けられる。又抗腫瘍モノクロナル抗体を不
溶化する架橋剤として鉱１例えはゲルタールアルデヒド
のような二官能性化合物を用いることかできる。
＃素を閉じ込めて不離化させるのに用いられるマトリッ
クスは、高分子社の打機重合体のゲル又は−維が用いら
れるが、抗腫瘍モノクロナル抗体についても適当な手紋
ヲ遇ぷことによって、これらか用いられ得る。例えｄＲ
Ａ量体の１合の際に、抗腫瘍モノクロナル抗体が恵白糸
に存在すれば、それは生成重合体ゲル中に閉じ込められ
る。
クスは、高分子社の打機重合体のゲル又は−維が用いら
れるが、抗腫瘍モノクロナル抗体についても適当な手紋
ヲ遇ぷことによって、これらか用いられ得る。例えｄＲ
Ａ量体の１合の際に、抗腫瘍モノクロナル抗体が恵白糸
に存在すれば、それは生成重合体ゲル中に閉じ込められ
る。
担体にタンパク結合用能基を与える処理剤で処Ｍｌ−ｊ
る＊ｆＦは次のとおりである。
る＊ｆＦは次のとおりである。
■ 多ａｒＷＡ担体の場合、通Ｍ美化シアンを用い、ｐ
ｉ（１０〜１２．で冷却しながら行う。
ｉ（１０〜１２．で冷却しながら行う。
■ 高分子重合体である巨大網状構造を何するメタアク
リレート重合体も又同様にして、ｐ）１１０〜１２で臭
化シアンで活性化するとよい結果が得られる。
リレート重合体も又同様にして、ｐ）１１０〜１２で臭
化シアンで活性化するとよい結果が得られる。
■ 無機質担体であるガラスの活性化は、オルガノシラ
ンによって行われる。その条件としては、不活性溶媒に
オルガノシランを溶かし、室温で十分な時間反応させる
ことによって得られる。
ンによって行われる。その条件としては、不活性溶媒に
オルガノシランを溶かし、室温で十分な時間反応させる
ことによって得られる。
■ 重合体−トラップ法としては、抗腫瘍モノクロナル
抗体を吸着する担体はすべて可能であるか、より簡便な
担体が好ましい。例えばＤＥＡＥ−−ｔｉミルロース、
蒸留水で十分に抗浄し、温度を室温忙保りてかきまぜる
仁とＫよって抗腫瘍モノクロナル抗体と結合させ、この
抗腫瘍モノクロナル抗体結合担体は、次いで２次的担体
でもって重合化させ得る。
抗体を吸着する担体はすべて可能であるか、より簡便な
担体が好ましい。例えばＤＥＡＥ−−ｔｉミルロース、
蒸留水で十分に抗浄し、温度を室温忙保りてかきまぜる
仁とＫよって抗腫瘍モノクロナル抗体と結合させ、この
抗腫瘍モノクロナル抗体結合担体は、次いで２次的担体
でもって重合化させ得る。
以上のようセして得られた結合能を何する担体と抗腫瘍
モノクロナル抗体との反応は、中性付近（ｐｆ１６〜８
）で約８〜２５℃で行うことができる。
モノクロナル抗体との反応は、中性付近（ｐｆ１６〜８
）で約８〜２５℃で行うことができる。
このよ５Ｋして得られる不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体
は濾過床として多故の粒子状のものからなることが好ま
しくその粒子がフイＩジターのボアーサイズよりも大き
く、且つできるだけ強固なものが望ましい。すなわち他
の異物と共にこの粒子を濾過除去するためには粒子径は
４０μよりも大きく、骨髄、血液等によって崩壊を来さ
ない強さを何することが望ましい。このためＫｉｄ、無
機担体との結合又は吸着により生じた不溶化抗腫瘍モノ
クロナル抗体又は、多糖類担体上結合した抗腫瘍モノグ
ロナル抗体で粒子径が４０μより大であり、しかも抗腫
瘍細胞を効率よく破壊させるためＫなるべく小さなもの
が好ましい。又崩壊を防ぐために、担体上で不溶化した
抗腫瘍モノクロナル抗体を更に高分子材料のゲルあるい
は繊維に１改めて閉じ込めることもできる。
は濾過床として多故の粒子状のものからなることが好ま
しくその粒子がフイＩジターのボアーサイズよりも大き
く、且つできるだけ強固なものが望ましい。すなわち他
の異物と共にこの粒子を濾過除去するためには粒子径は
４０μよりも大きく、骨髄、血液等によって崩壊を来さ
ない強さを何することが望ましい。このためＫｉｄ、無
機担体との結合又は吸着により生じた不溶化抗腫瘍モノ
クロナル抗体又は、多糖類担体上結合した抗腫瘍モノグ
ロナル抗体で粒子径が４０μより大であり、しかも抗腫
瘍細胞を効率よく破壊させるためＫなるべく小さなもの
が好ましい。又崩壊を防ぐために、担体上で不溶化した
抗腫瘍モノクロナル抗体を更に高分子材料のゲルあるい
は繊維に１改めて閉じ込めることもできる。
本発明による濾過器は、内部に上記の不溶化抗腫瘍モノ
クロナル抗体粒子を含み、好ましくは少なくとも被濾過
液出口に対しては、前に！、濾過板によって不溶化抗腫
瘍モノクロナル抗体の流出を防ぐようにしたものであり
、また骨髄および血液中の腫瘍細胞と効率よく結合、破
壊させるような十分な不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の
表面積をもったものであることが好ましい。さらには、
水不溶化抗腫瘍性モノクロナル抗体の血液、骨髄等の被
濾過液中における懸濁状態を保り次めに必要なゆるやか
なかきませを行うようにしてもよい。
クロナル抗体粒子を含み、好ましくは少なくとも被濾過
液出口に対しては、前に！、濾過板によって不溶化抗腫
瘍モノクロナル抗体の流出を防ぐようにしたものであり
、また骨髄および血液中の腫瘍細胞と効率よく結合、破
壊させるような十分な不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の
表面積をもったものであることが好ましい。さらには、
水不溶化抗腫瘍性モノクロナル抗体の血液、骨髄等の被
濾過液中における懸濁状態を保り次めに必要なゆるやか
なかきませを行うようにしてもよい。
−過板はｖ１１改投けることができる。複数個の濾過板
を用いた場合、不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の体内へ
の流入防止は更に保障される。
を用いた場合、不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体の体内へ
の流入防止は更に保障される。
本発明の濾過器は、原則的にいかなる形態であっても無
菌的に、水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体を収容できる
形態であれはよいが、当該濾過器は、インキュベーク−
としても使用しうる形態とすることが好ましい。この場
合、生体外において患者の骨髄、血ｇ、等を無菌的に、
水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体と８７℃程１度で６０
分間以上接触させた上で、ヒトの補体を加え、さらに室
温で１〜２時間反応させ、腫瘍細胞を＆ＩＬＩｓさせそ
の後濾過板を通過後、骨髄、血液等を患者に戻せばよい
Ｏ ５１％１図は、本発明濾過器の代表例であり、インキュ
ベーク−としても使用しうる態様のものである。ｌＩ／
′ｉ水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体収容部であシ、入
口２および出口８に骨髄、血′ｆ＆、等の被沖過液を濾
過するため、及び水不溶性抗腫瘍モノクロナル抗体４の
出口への漏出を防止するための少なくとも一重の濾過板
５．５′を有する。収容部ｌ中には水不溶性抗腫瘍モノ
クロナル抗体４が収容されている。２０入口より流入さ
れた被濾過液は収容部ｌ内で水不溶性抗腫瘍モノクロナ
ル抗体粒子４と混合される。混合液の懸濁状態を保つた
め６で示される回転モーターで収容部１が回転される。
菌的に、水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体を収容できる
形態であれはよいが、当該濾過器は、インキュベーク−
としても使用しうる形態とすることが好ましい。この場
合、生体外において患者の骨髄、血ｇ、等を無菌的に、
水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体と８７℃程１度で６０
分間以上接触させた上で、ヒトの補体を加え、さらに室
温で１〜２時間反応させ、腫瘍細胞を＆ＩＬＩｓさせそ
の後濾過板を通過後、骨髄、血液等を患者に戻せばよい
Ｏ ５１％１図は、本発明濾過器の代表例であり、インキュ
ベーク−としても使用しうる態様のものである。ｌＩ／
′ｉ水不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体収容部であシ、入
口２および出口８に骨髄、血′ｆ＆、等の被沖過液を濾
過するため、及び水不溶性抗腫瘍モノクロナル抗体４の
出口への漏出を防止するための少なくとも一重の濾過板
５．５′を有する。収容部ｌ中には水不溶性抗腫瘍モノ
クロナル抗体４が収容されている。２０入口より流入さ
れた被濾過液は収容部ｌ内で水不溶性抗腫瘍モノクロナ
ル抗体粒子４と混合される。混合液の懸濁状態を保つた
め６で示される回転モーターで収容部１が回転される。
〈腫瘍細胞の除去・破壊効果の検定方法〉骨髄あるいは
血液中の腫瘍細胞の除去破壊効果は、次の方法で検定す
ることができる。
血液中の腫瘍細胞の除去破壊効果は、次の方法で検定す
ることができる。
■ 株、化さＡ７；腫瘍細胞を指標とｙゐ方法（コ（に
木方伝、は抹化玲３声腟都細胞倉指標むして用いる。特
に、本格治療の際のインキュベーク−兼用濾過器中の不
溶化抗腫瘍モノクロナル抗体と、骨髄あるいは血液の量
比を定めるための小規模予備実験に使用される。
木方伝、は抹化玲３声腟都細胞倉指標むして用いる。特
に、本格治療の際のインキュベーク−兼用濾過器中の不
溶化抗腫瘍モノクロナル抗体と、骨髄あるいは血液の量
比を定めるための小規模予備実験に使用される。
既に確立されている１つ以上の腫瘍株細胞を本発明のイ
ンキュベーター兼用濾過器処理前の骨髄あるいは血液中
に混合する。混合Ｊｔ半は、骨髄あるいは血液の細胞１
０６個に対して、腫瘍株細胞１０’〜ｌＯ５個の割合で
よい。この腫瘍株細胞を含む骨髄あるいは血液を、本発
明のインキュベーター兼用濾過器に通し、騰瘍細胞破壊
除去処３！！！を行なう。この処理後の骨髄あるいは血
ｇを株細胞用の培地に接腫し、培養する。培養により形
成された集落を形態学、細胞遺伝学の面より分析する。
ンキュベーター兼用濾過器処理前の骨髄あるいは血液中
に混合する。混合Ｊｔ半は、骨髄あるいは血液の細胞１
０６個に対して、腫瘍株細胞１０’〜ｌＯ５個の割合で
よい。この腫瘍株細胞を含む骨髄あるいは血液を、本発
明のインキュベーター兼用濾過器に通し、騰瘍細胞破壊
除去処３！！！を行なう。この処理後の骨髄あるいは血
ｇを株細胞用の培地に接腫し、培養する。培養により形
成された集落を形態学、細胞遺伝学の面より分析する。
また、処理後の骨髄あるいは血液に当該動部細胞に対す
る抗腫瘍モノクロナル抗体を加え反応させ、これに螢光
物質を標識した羊の抗マウス免疫グロブリンを加え、こ
れを螢光活性化細胞分離分析器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｕ
ｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ
）を用いて分析する。
る抗腫瘍モノクロナル抗体を加え反応させ、これに螢光
物質を標識した羊の抗マウス免疫グロブリンを加え、こ
れを螢光活性化細胞分離分析器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｕ
ｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ
）を用いて分析する。
末法により、魔瘍株ｍ胞とともに、当該肛瘍細胞が破壊
除去されていることを確認する。
除去されていることを確認する。
■ 螢光活性化細胞分離分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ ）本発明のインキュベーター兼用濾過器
処理前の骨髄あるいは血液の低比重の細胞のみｔ−速度
沈降法めるいは密度勾配遠心法で腫瘍細胞を含む一分を
２０〜２５０倍＃細する。この濃細膝瘍細胞画分に抗腫
瘍モノクロナル抗体を加え、８７℃程度で６０分間程度
反応させる。この反応混合献を洗滌後講光物質で標識し
た羊の抗マウス免疫グログリンを加え、３７℃程度で６
０分間程度反応させる。洗滌後、螢光活性化細胞分離分
析器を用いて腫瘍細胞の濃度を求める。
ｅＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ ）本発明のインキュベーター兼用濾過器
処理前の骨髄あるいは血液の低比重の細胞のみｔ−速度
沈降法めるいは密度勾配遠心法で腫瘍細胞を含む一分を
２０〜２５０倍＃細する。この濃細膝瘍細胞画分に抗腫
瘍モノクロナル抗体を加え、８７℃程度で６０分間程度
反応させる。この反応混合献を洗滌後講光物質で標識し
た羊の抗マウス免疫グログリンを加え、３７℃程度で６
０分間程度反応させる。洗滌後、螢光活性化細胞分離分
析器を用いて腫瘍細胞の濃度を求める。
上記同様の方法で、本発明のインキュベーター兼用濾過
器処理後の骨髄あるいは血液中の腫瘍細胞の分析を行な
い。インキュベーター兼用濾過器を通過することによっ
て腫瘍細胞が破壊除去されていることを確認する。
器処理後の骨髄あるいは血液中の腫瘍細胞の分析を行な
い。インキュベーター兼用濾過器を通過することによっ
て腫瘍細胞が破壊除去されていることを確認する。
〈正常造血幹細胞への無毒性ｕ＆認試験〉骨髄を本発明
のインキュベーター兼用ヂ過器で処理する場合、特に造
血幹細胞が、インキュベーター兼用濾過器で破壊あるい
は失活しないことを確認しておく必要がある。これは、
本格治療の前に、小規模のインキュベーターを使った予
備天険で不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体量と骨髄あるい
は血液の最適量比を求める際、同時に行なえはよい。
のインキュベーター兼用ヂ過器で処理する場合、特に造
血幹細胞が、インキュベーター兼用濾過器で破壊あるい
は失活しないことを確認しておく必要がある。これは、
本格治療の前に、小規模のインキュベーターを使った予
備天険で不溶化抗腫瘍モノクロナル抗体量と骨髄あるい
は血液の最適量比を求める際、同時に行なえはよい。
■ 顆粒球・単球集落形成単位（ＣＦＵ−Ｃ）たとえば
、インキュベーター処理前および処理後の骨髄２ｘｉｇ
５個を別々に、ＣＦＵ−Ｃ用培地（Ｒｏｂｉｐｓｏｎ
Ｗ、 Ａ、 、Ｐｉｋｅ Ｂ、 Ｌ、 ： Ｃｏｌｏｎ
ｙＧｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ ｋｉａ
Ｉ−ｒｏｗ Ｃｅ１ｌｓ ＩｎＶｉｔｒｏ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（Ｅｄ、
Ｆ、 Ｓｔｏｈｌｍａｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９７０）
）に植え、たとえば７．５チｃｏ２ 存在下で８７℃
で約１０〜１４日培養し、１つの集落に、４０個以上の
細胞を含む顆粒球−大食細胞の集落を顕微鏡で数える。
、インキュベーター処理前および処理後の骨髄２ｘｉｇ
５個を別々に、ＣＦＵ−Ｃ用培地（Ｒｏｂｉｐｓｏｎ
Ｗ、 Ａ、 、Ｐｉｋｅ Ｂ、 Ｌ、 ： Ｃｏｌｏｎ
ｙＧｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ ｋｉａ
Ｉ−ｒｏｗ Ｃｅ１ｌｓ ＩｎＶｉｔｒｏ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅ１
ｌｕｌａｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（Ｅｄ、
Ｆ、 Ｓｔｏｈｌｍａｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９７０）
）に植え、たとえば７．５チｃｏ２ 存在下で８７℃
で約１０〜１４日培養し、１つの集落に、４０個以上の
細胞を含む顆粒球−大食細胞の集落を顕微鏡で数える。
処理前と処理後においてＣＦＵ−ＣＫ変化のないことを
確認する。
確認する。
■ 赤血球集落形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）たとえば、イノ
キュベーク−処理前および処理後の骨髄ｌＸｌ０’個を
別々に、ＣＦＵ−Ｅ用培地（Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ Ａ、
Ｄ、、Ｃｕｒｔｉｓ Ｊ、 Ｄ、 、ＭｃＣｕｌｌｏ
ｃｈＥ、Ａ、 、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏ
１ｏｎｉｅｓ １ｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｍａｒｒｏｗ、 Ｂｌｏｏｄ ｌ ９７４ 、４４
： ６５９）に植え、九とえは７．５４ＣＯ２存在下で
８７℃、７〜９日問培養する。８個以上の細胞よシなる
赤血球集落形成単位で政える。赤血球であることは、ベ
ソジジン染色により４ｌｓする。処理前と処理後におい
てＣＦＵ−Ｃに父化のないことを確認する。
キュベーク−処理前および処理後の骨髄ｌＸｌ０’個を
別々に、ＣＦＵ−Ｅ用培地（Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ Ａ、
Ｄ、、Ｃｕｒｔｉｓ Ｊ、 Ｄ、 、ＭｃＣｕｌｌｏ
ｃｈＥ、Ａ、 、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏ
１ｏｎｉｅｓ １ｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆ Ｈｕｍａｎ
Ｍａｒｒｏｗ、 Ｂｌｏｏｄ ｌ ９７４ 、４４
： ６５９）に植え、九とえは７．５４ＣＯ２存在下で
８７℃、７〜９日問培養する。８個以上の細胞よシなる
赤血球集落形成単位で政える。赤血球であることは、ベ
ソジジン染色により４ｌｓする。処理前と処理後におい
てＣＦＵ−Ｃに父化のないことを確認する。
■ 赤血球破裂形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）たとえば、イン
キュベーター処理前および処理後の骨髄ｌＸｌ０６個を
別々にＢＦＵ−ｈ用培地（Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ Ａ、
Ｄ、 、Ｃｕｒｔｉｓ Ｊ、 Ｄ、 、ＭｃＣｕｌｌｏ
ｃｈＥ、 Ａ、 、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ
Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ ｉｎ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓｏｆ
Ｈｕｍａｎ Ｍａｒｒｏｗ、 Ｂｌｏｏｄ １９７４
、４４ ：６５９ ）に植え、たとえば３７℃で１４
日同層養し、１つの集落に５０個以上の細胞を含む集落
を顕微鏡で数える。処理前と処理後において、ＢＦＬＩ
−Ｅに変化のないことを確認する。
キュベーター処理前および処理後の骨髄ｌＸｌ０６個を
別々にＢＦＵ−ｈ用培地（Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ Ａ、
Ｄ、 、Ｃｕｒｔｉｓ Ｊ、 Ｄ、 、ＭｃＣｕｌｌｏ
ｃｈＥ、 Ａ、 、Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ
Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ ｉｎ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓｏｆ
Ｈｕｍａｎ Ｍａｒｒｏｗ、 Ｂｌｏｏｄ １９７４
、４４ ：６５９ ）に植え、たとえば３７℃で１４
日同層養し、１つの集落に５０個以上の細胞を含む集落
を顕微鏡で数える。処理前と処理後において、ＢＦＬＩ
−Ｅに変化のないことを確認する。
■ Ｔ−リンパ球集落形成単位（ｃＦＵ−ＴＬ）たとえ
ば、インキュベーク−処理前および処理後の骨髄４Ｘｌ
Ｏ’個を別々にＣＦＵ−ＴＬ用培地（Ｐｉｋｅ Ｂ、
Ｌ、 、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｗ、 Ａ、 ：Ｈｕｍａｎ
ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ Ｃｏ１ｏｎｙ ｇｒｏｗｔｈ
ｉｎ ａｇａｒ−ｇｅｌ、 Ｊ。
ば、インキュベーク−処理前および処理後の骨髄４Ｘｌ
Ｏ’個を別々にＣＦＵ−ＴＬ用培地（Ｐｉｋｅ Ｂ、
Ｌ、 、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｗ、 Ａ、 ：Ｈｕｍａｎ
ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ Ｃｏ１ｏｎｙ ｇｒｏｗｔｈ
ｉｎ ａｇａｒ−ｇｅｌ、 Ｊ。
Ｃｅ１ｌ Ｐｂｙｓｉｏｌ ７６：７７．１９７０ ）
に植え、たとえば５ Ｔｏ ＣＯ２存在下で３６℃、’
ｙ８１！ｉ１培養する。
に植え、たとえば５ Ｔｏ ＣＯ２存在下で３６℃、’
ｙ８１！ｉ１培養する。
８０個以上の細胞よシなる集落を顕微鏡で飲える。
処理前と処理後において、ＣＦＵ−ＴＬＩＣｉ化のない
ことを確認する。
ことを確認する。
〈最適不溶化抗腫瘍抗体量〉
不溶化抗腫瘍抗体量と骨髄あるいは血液のＪ＆適量比は
友とえば、次のようにして永める。
友とえば、次のようにして永める。
容：１ｔｌＯ−のインキュベーター（大人用インキュベ
ーターは通常、１．θ０〇−容量でめるゆえ１／ｌ ０
０のスクール）に、抗腫瘍モノクロナル抗体（細胞毒性
値、ｌ： １００．０００〜１ ： １．０（７０，０
００）の容量にして０．２５−分を結合し之担体を黒画
的に収容したものを用いて、骨髄あるいは血ｙｓｍｔ２
加え、処理を行なう。処理前後の骨髄るるいは血液につ
いて、次の項目の分析を行ない最ｉｔｉ量の検討を行な
う。
ーターは通常、１．θ０〇−容量でめるゆえ１／ｌ ０
０のスクール）に、抗腫瘍モノクロナル抗体（細胞毒性
値、ｌ： １００．０００〜１ ： １．０（７０，０
００）の容量にして０．２５−分を結合し之担体を黒画
的に収容したものを用いて、骨髄あるいは血ｙｓｍｔ２
加え、処理を行なう。処理前後の骨髄るるいは血液につ
いて、次の項目の分析を行ない最ｉｔｉ量の検討を行な
う。
ａ、腫瘍細胞の除去・破壊効果の検定
■ 株化された腫瘍細胞を指標とする方法■ 螢光活性
化細胞分離分析 す、正常造血幹細胞への無毒性＊ｍ試験■ 顆粒球・単
球集落形成単位 ■ 赤血球集落形成単位 ■ 赤血球破裂形成単位 ■ １゛−リンパ球集落形成単位 以上の項目を満さない場合、インキュベーター内の不溶
化抗Ｍ、瘍モノクロナル抗体蓋を増減することによシ以
上の項目を満す条件を捜す。
化細胞分離分析 す、正常造血幹細胞への無毒性＊ｍ試験■ 顆粒球・単
球集落形成単位 ■ 赤血球集落形成単位 ■ 赤血球破裂形成単位 ■ １゛−リンパ球集落形成単位 以上の項目を満さない場合、インキュベーター内の不溶
化抗Ｍ、瘍モノクロナル抗体蓋を増減することによシ以
上の項目を満す条件を捜す。
この小スクールの予備試験で得られた最適条件でもって
大スケールの本治療を行なう。本治療の際のインキュベ
ーターの容量は、大人用として、ｔ、ｏｏｏゴ容鷲を、
また小人用として、５０〇−容量を用いる。
大スケールの本治療を行なう。本治療の際のインキュベ
ーターの容量は、大人用として、ｔ、ｏｏｏゴ容鷲を、
また小人用として、５０〇−容量を用いる。
実施例１
粒子径４０〜１９０μのセファロース４Ｂ（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）約２００ｄｌＣＡ化シアン５０
ｆ′ｔ−投入してかきませながら、４Ｎ−ＮａＯＨでｐ
Ｈを１１に調整する。この間温度を１０〜２０℃に保っ
た。ｐＨを１１に保たせながら約１０分間枠・きまぜを
続ける。次いでこの反応液を濾過してＦ液を除き、残渣
を集めて０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄し、活性化
セファロース４Ｂ約２００ｄを得た。
ン、ファルマシア社製）約２００ｄｌＣＡ化シアン５０
ｆ′ｔ−投入してかきませながら、４Ｎ−ＮａＯＨでｐ
Ｈを１１に調整する。この間温度を１０〜２０℃に保っ
た。ｐＨを１１に保たせながら約１０分間枠・きまぜを
続ける。次いでこの反応液を濾過してＦ液を除き、残渣
を集めて０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄し、活性化
セファロース４Ｂ約２００ｄを得た。
抗急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ）モノクロナル抗体は
、次のようＫして得た。急性骨髄性白血病患者の静脈血
を抗凝固剤ヘパリンを加えた試験管に、無菌的にとル、
フィコ−ルーツ・イパクー密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ’−
Ｈｙｐａｑｕｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ）で１白血病細
胞ｔ−分離した。この白血病細胞は、リパーゼ、シック
過ヨウ素酸塩、ペロキシダーゼ、α−ナフチル酢酸エス
テラーゼ、ナフトールＡＳＤクロル酢酸エステラーゼ等
の染色により、ＡＭＬと分析された。このＡＭＬ細胞は
、液体窒素中に保存した。
、次のようＫして得た。急性骨髄性白血病患者の静脈血
を抗凝固剤ヘパリンを加えた試験管に、無菌的にとル、
フィコ−ルーツ・イパクー密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ’−
Ｈｙｐａｑｕｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ）で１白血病細
胞ｔ−分離した。この白血病細胞は、リパーゼ、シック
過ヨウ素酸塩、ペロキシダーゼ、α−ナフチル酢酸エス
テラーゼ、ナフトールＡＳＤクロル酢酸エステラーゼ等
の染色により、ＡＭＬと分析された。このＡＭＬ細胞は
、液体窒素中に保存した。
Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに１５Ｘ１０’個のＡＭＬ細胞を腹
膜腔内に注射免疫した。１週間後に静脈内へ１５ＸｌＯ
’個のＡＭＬ細胞を注射してブースターをかけた。ブー
スター後８臼目に、マウスの牌臓細胞をとり出した。ａ
ｘｔｏ８の婢臓細胞と８Ｘ１０７個のマウスのミエロー
マ細胞（Ｐ Ｂ ／ Ｘ ６ Ｂ −Ａｇ ８ ）をポ
リエチレングリコール４８チ溶液中で３７℃１分間、さ
らにポリエチレングリコール２５チ溶液中で８７℃、１
分間反応させることにより、細胞融合を行なった。この
細胞混合液をＲＰＭＩ培地に懸濁し、ＲＰＭＩ−ＨＡＴ
培地（）・イボキサンチン１０−’Ｍ、アミノプテリン
１０−６ Ｍ、チミジン２Ｘ１０−’Ｍ ）で洗蜂後、
改めて懸濁し、９６大のリングロ社製の平底マイクロテ
ィシュカルチャープレートに、各穴４Ｘ１０５となるよ
うに入れた。培養は、第１週はＨＡＴ培地で、第２週と
第８週は、ＨＴ培地（ＨＡＴより、アミノプテリンを除
いたもの）で、その後は、グルタミン酸やピルビン酸を
加えｆｃ１５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ培地で行なり
九。細胞融合後、２５日後に、培地の上清をマイクロサ
イトドキシシティ−テスト（Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａ
ｔｈｏｌ、 ６９ １０１０８−１２０（１９７，ｌで
スクリーニノグした。ＡＭＬｉ胞に対して特異的に細胞
毒性を示す１つの穴の融合細胞を限界希釈法でクローン
化してゆき、特異的クローンの融合細胞のみを、フラス
コ内で培養し、更に、マウスの腹膜腔内に、この融合細
胞を注射してマウス腹水内で高力価の抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体の培養を行なった。抗ＡＭＬモノクロナル抗体
Ｌｏｔ ＴＮｏｏｇ （Ａｓｃｉｔｅｓ腹水）は、次の
方法で精製した。抗ＡＭＬモノクロナル抗体Ｌｏｔ Ｔ
Ｎｏｏｇ（腹水）を０．９ Ｓ ＮａＣｔ液を等ｆｆ１
２Ｕえｆｃ後、硫酸アンモニウムｔｌ−４０％濃度とな
るように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９チＮａ
Ｃ６液を当初加えた量の倍量加え、溶解させた後、更に
硫酸アンそニウムを４（ｌ濃度となるように加え沈澱画
分を分取した。この沈澱画分をなるべく少鼠の０．９５
ＪＮａＣｔ液で溶解させた後、０．０２ＭＰｈｏｓｐｈ
ａｔｅｄＢｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ （生理的リ
ン酸緩衝液）を外液として透析した。透析終了後、この
散液をＤＥＡＥ−Ｃｅｌ Ｉｕｌｏｆ ｊｎｅカラムに
加え、カラムクロマドグ２フイーを行なった。
膜腔内に注射免疫した。１週間後に静脈内へ１５ＸｌＯ
’個のＡＭＬ細胞を注射してブースターをかけた。ブー
スター後８臼目に、マウスの牌臓細胞をとり出した。ａ
ｘｔｏ８の婢臓細胞と８Ｘ１０７個のマウスのミエロー
マ細胞（Ｐ Ｂ ／ Ｘ ６ Ｂ −Ａｇ ８ ）をポ
リエチレングリコール４８チ溶液中で３７℃１分間、さ
らにポリエチレングリコール２５チ溶液中で８７℃、１
分間反応させることにより、細胞融合を行なった。この
細胞混合液をＲＰＭＩ培地に懸濁し、ＲＰＭＩ−ＨＡＴ
培地（）・イボキサンチン１０−’Ｍ、アミノプテリン
１０−６ Ｍ、チミジン２Ｘ１０−’Ｍ ）で洗蜂後、
改めて懸濁し、９６大のリングロ社製の平底マイクロテ
ィシュカルチャープレートに、各穴４Ｘ１０５となるよ
うに入れた。培養は、第１週はＨＡＴ培地で、第２週と
第８週は、ＨＴ培地（ＨＡＴより、アミノプテリンを除
いたもの）で、その後は、グルタミン酸やピルビン酸を
加えｆｃ１５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ培地で行なり
九。細胞融合後、２５日後に、培地の上清をマイクロサ
イトドキシシティ−テスト（Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａ
ｔｈｏｌ、 ６９ １０１０８−１２０（１９７，ｌで
スクリーニノグした。ＡＭＬｉ胞に対して特異的に細胞
毒性を示す１つの穴の融合細胞を限界希釈法でクローン
化してゆき、特異的クローンの融合細胞のみを、フラス
コ内で培養し、更に、マウスの腹膜腔内に、この融合細
胞を注射してマウス腹水内で高力価の抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体の培養を行なった。抗ＡＭＬモノクロナル抗体
Ｌｏｔ ＴＮｏｏｇ （Ａｓｃｉｔｅｓ腹水）は、次の
方法で精製した。抗ＡＭＬモノクロナル抗体Ｌｏｔ Ｔ
Ｎｏｏｇ（腹水）を０．９ Ｓ ＮａＣｔ液を等ｆｆ１
２Ｕえｆｃ後、硫酸アンモニウムｔｌ−４０％濃度とな
るように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９チＮａ
Ｃ６液を当初加えた量の倍量加え、溶解させた後、更に
硫酸アンそニウムを４（ｌ濃度となるように加え沈澱画
分を分取した。この沈澱画分をなるべく少鼠の０．９５
ＪＮａＣｔ液で溶解させた後、０．０２ＭＰｈｏｓｐｈ
ａｔｅｄＢｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ （生理的リ
ン酸緩衝液）を外液として透析した。透析終了後、この
散液をＤＥＡＥ−Ｃｅｌ Ｉｕｌｏｆ ｊｎｅカラムに
加え、カラムクロマドグ２フイーを行なった。
Ｄ Ｅ Ａ Ｅ −Ｃｅ１ｌｕｌｏｆ ｉｎｅクロマト
グラフィーは、第２図のような結果となった。このグラ
フにおける最初のピーク部分を、精製抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体Ｌｏｔ ＴＮＯＯ８Ｐとした。その細胞毒性値
は、第１表のような結果であった。
グラフィーは、第２図のような結果となった。このグラ
フにおける最初のピーク部分を、精製抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体Ｌｏｔ ＴＮＯＯ８Ｐとした。その細胞毒性値
は、第１表のような結果であった。
ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ分画の最初のピーク
画分５０−に対して、活性化セファロース４Ｂ２００ｍ
ｌ加え、４゛Ｃで１６時聞かきまぜを続けて反応させた
。かくして、抗ＡＭＬモノクロナル抗体Ｌｏｔ ＴＮＯ
Ｏ８Ｆがセファロース４Ｂと結合した不溶化抗ＡＭＬモ
ノクロナル抗体７ｉｌ−得た。不溶化抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体約１−を無菌的に１０ゴ容量の第１図に示した
インキュベーク−兼用テ過器に収容した。具体的には、
不溶化抗ＡＭＬモノクロナル抗体をエチレンオキ丈イド
を用いて滅菌しあらかじめオートクレーブでｔＩ！ｉ、
面を施したインキュヘーター兼用濾過器に収容している
。この不溶化抗ＡＭＬモノクロナル抗体収容インキュベ
ーター兼用濾過器を用いて、ＡＭＬ細胞の除去効果を検
討し、その結果を第２表に示した。
画分５０−に対して、活性化セファロース４Ｂ２００ｍ
ｌ加え、４゛Ｃで１６時聞かきまぜを続けて反応させた
。かくして、抗ＡＭＬモノクロナル抗体Ｌｏｔ ＴＮＯ
Ｏ８Ｆがセファロース４Ｂと結合した不溶化抗ＡＭＬモ
ノクロナル抗体７ｉｌ−得た。不溶化抗ＡＭＬモノクロ
ナル抗体約１−を無菌的に１０ゴ容量の第１図に示した
インキュベーク−兼用テ過器に収容した。具体的には、
不溶化抗ＡＭＬモノクロナル抗体をエチレンオキ丈イド
を用いて滅菌しあらかじめオートクレーブでｔＩ！ｉ、
面を施したインキュヘーター兼用濾過器に収容している
。この不溶化抗ＡＭＬモノクロナル抗体収容インキュベ
ーター兼用濾過器を用いて、ＡＭＬ細胞の除去効果を検
討し、その結果を第２表に示した。
当該除去効果試験は、次のよりにして行りた。
寛解期のＡＭＬ患者骨髄を用意した。患者骨髄１０６個
／−に対シ、ＡＭＬ株、ｍｎｗｃｃ−５ｏｒ、１０３個
／ｌ１１ｔを加え、計８．０ゴを、不溶化抗Ａへ１Ｌモ
ノクロナル抗体インキュベーター兼用ＭＭ器に加え、回
転させながら、８７℃で６０分間インキュベートした。
／−に対シ、ＡＭＬ株、ｍｎｗｃｃ−５ｏｒ、１０３個
／ｌ１１ｔを加え、計８．０ゴを、不溶化抗Ａへ１Ｌモ
ノクロナル抗体インキュベーター兼用ＭＭ器に加え、回
転させながら、８７℃で６０分間インキュベートした。
次に、インキュベーターを呈温に戻し、患者血清補体を
８．０―加え、２時間、同様に回転させながら、インキ
ュベーションを行なった。
８．０―加え、２時間、同様に回転させながら、インキ
ュベーションを行なった。
駁下奈白
以上のように不溶化抗ＡＭＬ抗体インキュベーク−は、
ＡＭＬＭＢｆＩ＆を除去・破壊し、かつ正常造血幹細胞
に対しては無毒である。
ＡＭＬＭＢｆＩ＆を除去・破壊し、かつ正常造血幹細胞
に対しては無毒である。
なお、抗Ａ Ｍ Ｌ ％ ／ ９ ロチ／１／抗体Ｌｏ
ｔ ＴＮ ００ ｇの正常細胞および白血病細胞に対
する細胞毒性は第３表のようであった。また、ヒト株細
胞に対する細胞毒性のテスト結果は第４麦にまとめた。
ｔ ＴＮ ００ ｇの正常細胞および白血病細胞に対
する細胞毒性は第３表のようであった。また、ヒト株細
胞に対する細胞毒性のテスト結果は第４麦にまとめた。
る細胞毒性
第４表 抗ＡＭ Ｌ−ｒ−ノクロナル抗体Ｌｏｔ ＴＮ
ＯＯ８（腹水）のヒト株化細胞に対する細胞毒性これら
のテストにおいて正常細胞は、健康人ボランティアの末
梢血よシとり、正常末梢リンパ球をＦｉｃｏｌｌ−ｆ（
ｙｐａｑｕｅ （フィコール ハイバック）を用いて分
離し、更にＴｊ？よび５９９７球は、Ｅ−ロゼツト法お
よびナイロンクール法で分離した。
ＯＯ８（腹水）のヒト株化細胞に対する細胞毒性これら
のテストにおいて正常細胞は、健康人ボランティアの末
梢血よシとり、正常末梢リンパ球をＦｉｃｏｌｌ−ｆ（
ｙｐａｑｕｅ （フィコール ハイバック）を用いて分
離し、更にＴｊ？よび５９９７球は、Ｅ−ロゼツト法お
よびナイロンクール法で分離した。
Ｍｏｎｏｃｙｔｅ （卓球）はＣ１ｃｃｉａｒｅｌｌｉ
ｅｔ ａｌ［Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ １０
： ８６８ （１９７８））の方法で、Ｇｒａｎｕｌ
ｏｃｙｔｅｓ （顆粒球）はＥｌ−Ａｗｏｒ ｅｔ
ａｌ ［Ｔｉ５ｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ １５
： ８４６１９８０〕 の方法で分離し、Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（コウルターカウンター）で細胞の
大きさを測ることにより、その純度を確認し友。また、
白血病り、隼離し、液体窒素中に保存した。
ｅｔ ａｌ［Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｐｒｏｃ １０
： ８６８ （１９７８））の方法で、Ｇｒａｎｕｌ
ｏｃｙｔｅｓ （顆粒球）はＥｌ−Ａｗｏｒ ｅｔ
ａｌ ［Ｔｉ５ｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ １５
： ８４６１９８０〕 の方法で分離し、Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（コウルターカウンター）で細胞の
大きさを測ることにより、その純度を確認し友。また、
白血病り、隼離し、液体窒素中に保存した。
培養ｍ胞群としては）ＩＧ、ＧＣ−５０（ＡＭＬ）、Ｇ
７２１（ＣＭＬ）、Ｇ−９８０８、ＮＴＦ−５（ＴＡＬ
Ｌ）、Ｎａ１（ｎｕｌｌ ＡＬＬ）、Ｈａｎａ （Ｂｕ
ｒｋｉｔｔ ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｉ Ｖ−１０（
Ｂ Ｌｙｍｐｂｏｂｌａｓｔｓ ）等の確立され几ｍ胞
群を使用した。これらの細胞は、５％Ｃ０２存在下で、
１（ｌ牛脂児血貢を含むＲＰＭＩ培地中で８７℃で増殖
さぞた。
７２１（ＣＭＬ）、Ｇ−９８０８、ＮＴＦ−５（ＴＡＬ
Ｌ）、Ｎａ１（ｎｕｌｌ ＡＬＬ）、Ｈａｎａ （Ｂｕ
ｒｋｉｔｔ ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｉ Ｖ−１０（
Ｂ Ｌｙｍｐｂｏｂｌａｓｔｓ ）等の確立され几ｍ胞
群を使用した。これらの細胞は、５％Ｃ０２存在下で、
１（ｌ牛脂児血貢を含むＲＰＭＩ培地中で８７℃で増殖
さぞた。
さらに、 Ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅ
５ｔ （マイクロ４ｊイトトキシテイテスト）は、Ｔｅ
ｒａｓａｋｉ ｅｔａｌ ： Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅ
ｔ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｆ（ＬＡ −Ａ −Ｂ−
Ｃａｎｄ Ｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ、 Ａｍ、 Ｊ、 Ｃ
Ｉ ｉｎ、 Ｐａｔｈｏ１６９ ：１０Ｂ、１９７８の
方法に準じて行なった。
５ｔ （マイクロ４ｊイトトキシテイテスト）は、Ｔｅ
ｒａｓａｋｉ ｅｔａｌ ： Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅ
ｔ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｆ（ＬＡ −Ａ −Ｂ−
Ｃａｎｄ Ｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ、 Ａｍ、 Ｊ、 Ｃ
Ｉ ｉｎ、 Ｐａｔｈｏ１６９ ：１０Ｂ、１９７８の
方法に準じて行なった。
第１図は本発明濾過器の一実施例の折面図であり、第２
図は抗ＡＭＬモノクロナｒＶ抗体Ｌｏｔ００８のカラム
クロマトグラフィーである。 １・・・水不溶性モノクロナル抗体収容部２・・・入
口 ３・・・出 口４・・・水不溶性モノクロ
ナル抗体 ５．５′・・・濾過板 ６・・・回転モーター第
１図 第２図 ５ １０ １５ ２０ ２５７ラクション
図は抗ＡＭＬモノクロナｒＶ抗体Ｌｏｔ００８のカラム
クロマトグラフィーである。 １・・・水不溶性モノクロナル抗体収容部２・・・入
口 ３・・・出 口４・・・水不溶性モノクロ
ナル抗体 ５．５′・・・濾過板 ６・・・回転モーター第
１図 第２図 ５ １０ １５ ２０ ２５７ラクション
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （リ 水不溶性抗腫瘍七ノクロナル抗体を吸着剤として
なる腫瘍細胞除去用ＦＭ器。 （２〕 被Ｆｌ！液の入口及び出口、当該出口に設け
られた濾過板、当該濾過板によって出口からの漏出を防
止するように収容された水不溶化抗朧瘍モノクロナル抗
体の床を含むことを特徴とする特許請求の範囲第（０項
記載の腫瘍細胞除去濾過器。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58030010A JPS59155259A (ja) | 1983-02-23 | 1983-02-23 | 腫瘍細胞除去用炉過器 |
| US06/582,446 US4816409A (en) | 1983-02-23 | 1984-02-22 | Method of eliminating tumor cells and device therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58030010A JPS59155259A (ja) | 1983-02-23 | 1983-02-23 | 腫瘍細胞除去用炉過器 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59155259A true JPS59155259A (ja) | 1984-09-04 |
Family
ID=12291895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58030010A Pending JPS59155259A (ja) | 1983-02-23 | 1983-02-23 | 腫瘍細胞除去用炉過器 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4816409A (ja) |
| JP (1) | JPS59155259A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0245064A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-15 | Ube Ind Ltd | インターロイキン２レセプターの除去装置およびそれを備えた血液体外循環装置 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004732A1 (en) | 1991-09-09 | 1993-03-18 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Methods and devices for treating hemophilia and aids |
| AU741438B2 (en) * | 1996-08-26 | 2001-11-29 | Hemasure, Inc. | Method for removing tumor cells from tumor cell-contaminated stem cell products |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4172124A (en) * | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
| SE452336B (sv) * | 1978-06-16 | 1987-11-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent |
| DE2840655C2 (de) * | 1978-09-19 | 1982-06-16 | Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG Apparatebau KG, 6380 Bad Homburg | Vorrichtung zur Blutentgiftung |
| JPH0218858B2 (ja) * | 1979-06-11 | 1990-04-26 | Gambro Lundia Ab | |
| AU6156780A (en) * | 1979-08-24 | 1981-04-09 | G.D. Searle & Co. | Stack plate culture |
| JPS57103649A (en) * | 1980-12-18 | 1982-06-28 | Asahi Chemical Ind | Sterilized gamma-globulin fixing column |
| JPS58500127A (ja) * | 1981-02-26 | 1983-01-20 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | 回収 |
| US4714556A (en) * | 1981-06-29 | 1987-12-22 | Ambrus Clara M | Blood purification |
| US4377639A (en) * | 1982-01-18 | 1983-03-22 | University Of Toledo | Tissue culture device for mass cell culture |
| US4551435A (en) * | 1983-08-24 | 1985-11-05 | Immunicon, Inc. | Selective removal of immunospecifically recognizable substances from solution |
| US4693985A (en) * | 1984-08-21 | 1987-09-15 | Pall Corporation | Methods of concentrating ligands and active membranes used therefor |
-
1983
- 1983-02-23 JP JP58030010A patent/JPS59155259A/ja active Pending
-
1984
- 1984-02-22 US US06/582,446 patent/US4816409A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0245064A (ja) * | 1988-08-02 | 1990-02-15 | Ube Ind Ltd | インターロイキン２レセプターの除去装置およびそれを備えた血液体外循環装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4816409A (en) | 1989-03-28 |
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