JPH1129494A - 抗体の高収率精製およびウイルス不活性化のためのクロマトグラフイー法 - Google Patents

抗体の高収率精製およびウイルス不活性化のためのクロマトグラフイー法

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JPH1129494A
JPH1129494A JP10105352A JP10535298A JPH1129494A JP H1129494 A JPH1129494 A JP H1129494A JP 10105352 A JP10105352 A JP 10105352A JP 10535298 A JP10535298 A JP 10535298A JP H1129494 A JPH1129494 A JP H1129494A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 高純度ガンマーグロブリン（抗体）の取得。 【解決手段】 ヒト血漿から、ｐＨ３．８〜４．５にお
ける抗体の懸濁、それに続くカプリル酸の添加、そして
ｐＨ５．０〜５．２へのｐＨシフトを伴う。混入してい
るタンパク質、脂質およびカプリル酸塩の沈殿物が生成
し、そして除去されるが、一方、大多数の抗体は溶液中
に残る。再び、カプリル酸ナトリウムが、少なくとも約
１５ｍＭの最終濃度まで添加される。この溶液が、ウイ
ルスの不活性化を実施するために、２５℃で１時間イン
キュベートされる。沈殿物（主としてカプリル酸塩）が
除去され、そして清澄な溶液は、イオン強度を低下する
ために純水で希釈される。２種の異なる樹脂を用いるア
ニオン交換クロマトグラフィーが利用されて、出発時の
分布に類似のサブクラス分布をもつ非常に純粋なＩｇＧ
を得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、タンパク
質精製およびウイルス不活性化／除去、そして具体的に
は、血漿および他の給源からのγ−グロブリン精製のた
めの改良法に関する。
【０００２】
【従来の技術】カプリル酸のようなカルボン酸は、血漿
産物の調製（タンパク質の沈殿）とウイルスの不活性化
の両方に使用されてきた。例えば、Sengらによるそのよ
うな使用の概要（1990）、参照。
【０００３】カプリル酸塩を用いる分画：ヒト免疫グロ
ブリンの調製の際、カプリル酸は、一般に、温度やイオ
ン強度のようなパラメーターが最適化される限り、ｐＨ
４．８において、ほとんどの血漿タンパク質の効果的な
沈殿剤として認識されている。Steinbuchら(1969)は、
ＩｇＧ、セルロプラスミンおよびＩｇＡに影響を与えず
に、カプリル酸を用いる大部分の血漿タンパク質の沈殿
を記述している。Steinbuchらは、カプリル酸を用いて
哺乳動物血清からＩｇＧを単離し、そして広範囲の非免
疫グロブリンの沈殿が、やや酸性側ではあるがｐＨ４．
５以下ではないｐＨで、最も良好に得られることを報告
した。血漿は、０．０６Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ４．８
により２：１希釈され、次いで、２．５ｗｔ％カプリル
酸塩により処理して沈殿を開始させた。ＤＥＡＥ−セル
ロースへのその上澄液のバッチ吸着は、単離されたＩｇ
Ｇ画分から付加的な不純物を除去するために使用され
た。Steinbuchらによるその後の研究は、コーン・エタ
ノール画分ＩＩＩに存在するほとんどのタンパク質およ
びリポタンパク質（免疫グロブリン以外の）を沈殿させ
るためのカプリル酸の使用を示した。（Steinbuch et a
l., 1973）。
【０００４】上記、Steinbuchの方法は、ＩｇＧの回収
に０．８６ｗｔ％カプリル酸を用いて、細胞培養培地お
よびマウスからの腹水症液（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉ
ｄ）に応用された。（Russo et al., 1983）。同じ方法
は、２．１６ｗｔ％カプリル酸塩を用いて希釈されたヒ
ト血漿に応用された。（Habeeb et al., 1984）。Habee
bらは、カプリル酸沈殿に続いてＤＥＡＥセルロースで
の分画を行った。得られる血漿由来のＩｇＧは、凝集
体、プラスミンおよびプラスミノーゲンを含まなかっ
た。その上、得られたＩｇＧは、抗補体活性において低
く、そして貯蔵中比較的安定であった。
【０００５】これらの研究の結果として、科学者らは、
さらに、ＩｇＡ、ＩｇＧ、α−１酸糖タンパク質および
プレアルブミンを精製するためのいくつかの技術を開発
して、現在では、沈殿反応が高い温度とｐＨ依存性であ
ると結論した。（Steinbuchet al., 1969; Steinbuch e
t al., 1973; またTenold, 1996,参照）。
【０００６】例として、ＩｇＡが、ｐＨ４．８における
存在するカプリル酸によるＩｇＡ溶解度に基づき、コー
ン画分ＩＩＩからの日常的な分画副産物として調製され
た。（Pejaudier et al., 1972)。ＤＥＡＥ−セルロー
ス吸着と溶出によって低温エタノール画分ＩＩＩから単
離されたＩｇＡは、さらに、カプリル酸沈殿によって精
製された。沈殿条件は、１．５〜２％タンパク質濃度、
０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ５．０、１．１２ｗｔ％
カプリル酸であった。
【０００７】哺乳動物血清および腹水症液からの免疫グ
ロブリンの２段階精製が報告された（McKinney et al.,
1987）。最初に、アルブミンおよび他の非免疫ＩｇＧ
タンパク質がカプリル酸を用いて沈殿され、次いで、硫
酸アンモニウムが上澄液に添加されてＩｇＧを沈殿させ
た。
【０００８】Kotheらに対する米国特許第5,164,487号
（1992）は、凝集体、血管作動性物質およびタンパク質
分解酵素を含まない静脈内で許容されるＩｇＧ調製物製
造のためのカプリル酸の使用に関する。その方法は、イ
オン交換または疎水性マトリックスによるクロマトグラ
フィー精製の前に、ＩｇＧを含有する出発材料を０．４
％〜１．５％カプリル酸と接触させることを含む。
【０００９】また、カプリル酸ナトリウムは、アルブミ
ンを精製するために使用されてきた。これらの方法によ
れば、カプリル酸ナトリウムは、血漿処理のために添加
され、その処理工程が高温にさらされる時にアルブミン
を保護する。極端な温度は、処理工程のグロブリンを変
性するだけでなく、不純物、ネオ抗原を生じる。（Schn
eider et al., 1979; Condie, 1979; またPlan, 1976、
参照）。
【００１０】Tenold（1996）は、コーン画分ＩＩ＋ＩＩ
ＩまたはＩＶ−１流出液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）からのア
ルブミンの単離のために、分配剤としてのカプリル酸塩
の使用を示している。再び、カプリル酸ナトリウムは、
グロブリンを変性（および沈殿）するために使用され
る。
【００１１】ウイルス不活性化：Sengらによる米国特許
第4,939,176号（1990）は、生物学的に活性なタンパク
質溶液中のウイルスを、その溶液をカプリル酸と接触さ
せることによって不活性化する方法を報告している。そ
の方法について述べられた好適な条件は、ｐＨ４〜ｐＨ
８、および非イオン型のカプリル酸０．０７％〜０．０
０１％であった。化学薬剤の使用によるウイルス不活性
化の他の方法が知られている。Neurathらに対する米国
特許第4,540,573号（1985）は、抗ウイルス剤としてリ
ン酸ジ−またはトリ−アルキルの使用を教示する。Lemb
achらによる米国特許第4,534,972号（1985）は、治療学
的または免疫学的に活性なタンパク質の溶液を、実質的
に感染性因子を含まなくする方法を記述している。Lemb
achの方法では、タンパク質の溶液は、遷移金属錯体、
例えば銅フェナントロリンおよび還元剤と接触して、実
質的にタンパク質の活性に影響を与えずにウイルスの不
活性化が実施される。
【００１２】アニオン交換クロマトグラフィー：Bloom
ら（1991）は、抗体調製物を精製するためのアニオン交
換クロマトグラフィーの使用の例を提供する。それらの
方法は、抗体を含み、そしてプロテインＡが混入する溶
液を、アニオン交換樹脂と接触させ、次いで、イオン強
度を増加する条件下でその樹脂から抗体を溶出すること
を含む。
【００１３】Friesenに対するカナダ特許第1,201,063号
は、血漿画分を、２種の異なるアニオン交換樹脂を用い
る２段階分離法にかけることによって、静脈内使用に適
切なＩｇＧの調製を教示している。各段階で、アニオン
交換樹脂を平衡化するために使用されるバッファーは、
また、樹脂からＩｇＧ含有画分を溶出するのに使用され
る。
【００１４】静脈内投与のためのヒトＩｇＧおよびアル
ブミン含有組成物を単離する方法は、Kimuraら（1984）
によって記述されている。その方法は、ｐＨ、エタノー
ル濃度、イオン強度および温度の制御条件下での沈殿段
階を必要とする。
【００１５】
【発明の構成】本発明は、ヒト血漿および他の給源から
の抗体（特にＩｇＧタイプの）の精製のための改良法で
ある。本方法は、ｐＨ３．８〜４．５における抗体の懸
濁、続いてカプリル酸（または他のカプリル酸塩源）の
添加、そしてｐＨ５．０〜５．２へのｐＨシフトを伴
う。混入しているタンパク質、脂質およびカプリル酸塩
の沈殿物が生成し、そして除去されるが、一方、大多数
の抗体は溶液中に残る。再び、カプリル酸ナトリウム
が、少なくとも約１５ｍＭの最終濃度まで添加される。
この溶液が、活性なウイルスの力価を実質的に低下する
のに十分な条件下でインキュベートされる（例えば２５
℃で１時間）。沈殿物（主としてカプリル酸塩）が除去
され、そして清澄な溶液は、イオン強度を低下するため
に純水で希釈される。２種の異なる樹脂を用いるアニオ
ン交換クロマトグラフィーが利用されて、出発時の分布
に類似の抗体サブクラス分布をもつ非常に純粋な抗体調
製物を得る。
【００１６】この方法は、処理スキムの必須部分として
ウイルス不活性化および除去を組み合わせ、そしてγ−
グロブリン溶液の後ウイルス処理操作を最小にするの
で、先行技術とは異なる。処理スキム中にウイルス処理
を統合することによって、この方法は、収率を最大に
し、純度９９％を超えるγ−グロブリンを生産する。
【００１７】材料および方法 ｐＨの調整は、１Ｍ酢酸。２Ｍ酢酸、６％ＮａＯＨ、１
ＭＮａＯＨもしくは１ＭＨＣｌを用いて行った。カプリ
ル酸ナトリウム保存液は、注射用水中３０％カプリル酸
ナトリウムを混合することにより溶解することによって
作成された。ヒト血漿画分ＩＩ＋ＩＩＩは、Lebingら
（1994）によって記述されたように生産された。すべて
の試薬は、ＵＳＰグレードまたはそれ以上であった。ネ
フェロ分析は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｒｒａｙ ３６０
ＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒおよびＢｅｃｋｍａｎキット
を用いて行われた。分析用ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈａａ
ｓＧ３０００ＳＷおよびＧ４０００ＳＷ ＳＥＣカラム
をもつＨＰ１０５０システムを用いて行われた。タンパ
ク質は、ビューレット法を用いて測定された。
【００１８】操作は、しっかりしていて（ｒｏｂｕｓ
ｔ）そして単純である（図１、参照）。工程は、沈殿し
た抗体を、ｐＨ４．２付近において純水中に再溶解する
ことによって始まる。実際には、ペースト１単位当たり
の水の量を増加することが、収量増加をもたらす。しか
しながら、ペースト数百キログラムを処理する場合に
は、作業限界内に容器およびカラムスケールを保つため
に、若干の収量を犠牲にすることが実際的である。免疫
グロブリンの需要は、一般に、供給をはるかに上回って
いるので、溶解段階、ウイルス不活性化およびクロマト
グラフィーを横断する収率は、相対的に重要である。
【００１９】エンベロープ・ウイルスの不活性化は、ｐ
Ｈ感受性沈殿物の大部分が、不活性化段階の前に除去さ
れる必要がある。その上、カプリル酸ナトリウム含量
は、エンベロープ・ウイルスの完全な不活性化を達成す
るためには、２５℃維持の間１５〜６０ｍＭでなければ
ならない。ウイルス不活性化の研究は、１６ｍＭまたは
１８ｍＭのカプリル酸塩が、２４℃で３０分間に、ウシ
・ウイルス性下痢ウイルスおよび偽狂犬病ウイルスの４
ｌｏｇユニット以上を不活性化することを確認した。
この付加的な化学的ウイルス不活性化は、また、製造工
程中に組み入れられたｐＨ４．２５維持段階のウイルス
不活性化を補足する。
【００２０】工程の主要な段階は、次のように規定され
る： １） 沈殿した免疫グロブリンを含有する組成物を、激
しく混合しながら５℃において、注射用純水（ＷＦＩ）
中に懸濁すること。好適な実施態様では、画分ＩＩ＋Ｉ
ＩＩペーストが使用されるが、他の給源、例えば腹水症
液、抗体を含有する組織培養培地、他のヒト血漿画分ま
たは動物血漿画分も、また使用されてもよい。
【００２１】２） その混合液をさらに激しく混合しな
がら、酸、好ましくは酢酸の添加によってｐＨ３．８〜
４．５、好ましくは４．２に低下させることにより、免
疫グロブリンを溶液に溶解すること。
【００２２】３） カプリル酸イオン源（例えば４０％
ｗ／ｖカプリル酸ナトリウム水溶液）を、最終濃度１５
ｍＭ〜２５ｍＭ、好ましくは２０ｍＭまで添加し、そし
て塩基（例えば１ＭＮａＯＨ）を用いてｐＨ５．０〜
５．２、好ましくは５．１まで上げるよう調整するこ
と。
【００２３】４） 周囲温度（例えば５〜２５℃）にお
ける濾過による沈殿したタンパク質、脂質およびカプリ
ル酸塩の除去。濾過は、濾過助剤（例えば、この場合
は、濾過助剤が２％〜５％ケイソウ土である）の添加を
要する。溶液は、通常の流下濾過を用いて濾過される。
この段階は、非エンベロープ・ウイルスの有意な減少を
もたらす。遠心分離が濾過に置き換わってもよい。
【００２４】５） さらにカプリル酸塩を添加して、濃
度約１５ｍＭ〜約６０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭまで戻
すよう調整するが、一方ｐＨは、酸（例えば１Ｍ酢酸）
の添加によって５．０〜５．２、好ましくは５．１に維
持される。
【００２５】６） 温度は、約２５〜３５℃、好ましく
は２５℃に上げられ、そして約１５分〜約６時間、好ま
しくは約１時間の間維持される。より長いインキュベー
ション時間が、収量における若干の犠牲はあるが使用さ
れてもよい。主としてカプリル酸塩および若干の付加的
なタンパク質の沈殿物が、この段階で形成される。
【００２６】７） 濾過助剤（ケイソウ土）が添加さ
れ、そして沈殿物が通常の流下濾過によって除去され
る。エンベロープ・ウイルスは、カプリル酸塩維持によ
って不活性化され、そして非エンベロープ・ウイルス
は、濾過床上に捕捉される。
【００２７】８） 清澄液は、純水により希釈されて、
伝導率１〜８ｍＳ／ｃｍ、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ未満
に低下される。
【００２８】９） その溶液を、連続して結合された２
種のアニオン交換クロマトグラフィーを通過させるこ
と。アニオン交換体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミンお
よび他の残っているタンパク質不純物を除去する能力に
関して選ばれる。負荷後、カラムは平衡化バッファーを
用いて洗浄される。通過および洗浄画分が精製ＩｇＧと
して回収される。両カラムは、同じバッファーにより、
そして同じｐＨにおいて平衡化される。
【００２９】数種のアニオン交換樹脂の組み合わせ物
が、樹脂の選択性に依存して利用されてもよい。アニオ
ン交換樹脂は、アルコール／ｐＨ沈殿した血漿画分中に
見いだされる不純物を選択的に除去する能力に関して選
ばれる。この方法の開発において、満足できる精製が、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｑ ＆ ＡＮＸ
樹脂およびＥ．Ｍｅｒｃｋ ＴＭＡＥ Ｆｒａｃｔｏｇ
ｅｌの組み合わせ物により得られた。
【００３０】クロマトグラフィーについて述べられる条
件は、一般に、ｐＨ５．０〜５．２にわたる。ｐＨ＜
５．０では、不純物はカラムを通過する。ｐＨ＞５．２
では、収量が犠牲にされる。純度の低下は、イオン強度
がクロマトグラフィーの間に増加するように観察される
ので、クロマトグラフィーの間のイオン強度は、比較的
に重要である。
【００３１】好適な実施態様では、溶液は、ｐＨ５．１
において２０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化された第１の
アニオン交換体に直接適用される。この後に、第１のア
ニオン交換カラムからの非結合画分（通過液）が、第２
のアニオン交換カラム上に直接適用される。このカラム
もまた、ｐＨ５．１において２０ｍＭ酢酸バッファーで
平衡化されている。タンパク質溶液は、典型的には、５
０〜１１０ｍｇＩｇＧ／ｍｌ充填樹脂の割合で第１のカ
ラム上に負荷される。タンパク質溶液は、典型的には、
７５〜９５ｍｇＩｇＧ／ｍｌ充填樹脂の割合で第２のカ
ラム上に負荷される。また、タンパク質対樹脂の比は、
これらの限界を越えても調節できるが、そうすること
は、収率および純度に影響をもたらすであろう。タンパ
ク質溶液は、続いて、約２倍カラム量の平衡化バッファ
ーを添加され、それが、すべての非結合ＩｇＧをカラム
から洗い出す。非結合画分は、高度に精製されたＩｇＧ
として回収され、次いで、それはダイアフィルトレーシ
ョンされ、そしてタンパク質が最終製剤価まで濃縮され
る。
【００３２】最終産物のための好適な条件は、この製造
者によって保有される特許に基づいて選択される。これ
らの条件（低ｐＨおよび低塩）は、理論的に、いかなる
ＩｇＧ産物にも好都合であろう。回収されたタンパク質
はｐＨ４．２に調整される、それは、濃度約５％（ｗ／
ｖ）まで限外濾過される。次いで、純水に対してダイア
フィルトレーションされる。
【００３３】精製されたＩｇＧは、安定な液状製剤（Te
nold,1983記載のように）や、また他の適当な最終製剤
（例えば、凍結乾燥製剤）のいずれのためにも濃縮され
る。液状製剤では、精製ＩｇＧは濃縮されて、無菌濾過
後に５％または１０％ＩｇＧ（ｗ／ｖ）のいずれかを得
る。濾過前にｐＨは、３．８０〜４．２５に調整され、
そしてマルトースまたはグリシンが添加されて、静脈内
注射に適合しうるように浸透性を調整される。次いで、
無菌バルクは、抗補体活性を低下させ、そしてエンベロ
ープ・ウイルスを不活性化するために、少なくとも２１
日間は保存される。
【００３４】本明細書で使用されるように、濃度につい
てのパーセント値は重量／容量に基づいて測定される。
【００３５】本明細書で使用されるように、活性ウイル
スの力価を実質的に低下させることは、少なくとも約２
ｌｏｇユニット、より好ましくは少なくとも約３ ｌ
ｏｇユニット、もっとも好ましくは少なくとも約４ ｌ
ｏｇユニットで活性ウイルスを低下させることを意味す
る。
【００３６】本明細書で使用されるように、実質的にす
べてのタンパク質は、少なくとも約９０％のタンパク質
を意味する。実質的にタンパク質がないということは、
タンパク質が約５％未満であることを意味する。
【００３７】
【実施例】
（実施例１）コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストからＩｇＧの精製 画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストを、５℃の純水１２倍の容量
中に可溶化した。混合液のｐＨを酢酸でｐＨ４．２に調
整し、１時間混合した。この段階はＩｇＧを溶液にし
た。
【００３８】次いで、混合液ｐＨをＮａＯＨおよびカプ
リル酸ナトリウムを用いてｐＨ５．２まで調整した
（「ｐＨスイング（ｓｗｉｎｇ）」）。タンパク質およ
び脂質が沈殿した。混合液を濾過して、ウイルス不活性
化を妨害する沈殿物を除去することによって清澄化し
た。カプリル酸塩濃度をｐＨ５．１において２０ｍＭに
調整し、そして混合液を２５℃で１時間インキュベート
して、エンベロープ・ウイルスの不活性化を実施した。
【００３９】その混合液を濾過して、クロマトグラフィ
ーのための澄明な溶液を作成した。溶液の伝導率を、純
水を用いて２．０〜３．０ｍＳ／ｃｍに調整した。伝導
率の調整後、溶液のｐＨを５．０〜５．２に調整した。
【００４０】次いで、溶液を、２種のアニオン交換カラ
ム（強アニオン交換体に続いて弱アニオン交換体）に直
接適用した。２種のカラムは直列に結合された。ＩｇＧ
はカラムを通過したが、不純物（カプリル酸を含む）は
２種のアニオンカラムに結合した。
【００４１】クロマトグラフィーから回収された通過液
のｐＨを、酢酸を用いて３．８〜４．０に調整した。そ
れを、バッファー（純水）を７回交換してダイアフィル
トレーションした。次いで、それを濃縮し、そしてｐＨ
４．２において最終製剤化した。
【００４２】ペーストの溶解から最終産物までの総収率
は６９％であった（表、参照）。これは、アルコール処
理洗浄を用いる先行法の収率（４８％）を上回る有意な
改良であった（先行法の概要を示す図２参照）。
【００４３】
【表１】
【００４４】（実施例２）細胞培養培地からＩｇＧの精製 最初に、モノクローナル抗体を含有する細胞系増殖培地
を、適当なｐＨおよび伝導率に調整する。これは、ｐＨ
を酢酸で４．２に調整しながら純水に対するダイアフィ
ルトレーションによって行った。伝導率は１．０ｍＳ／
ｃｍ未満にしなければならない。
【００４５】モノクローナル抗体の精製を、上記の段階
にしたがって達成する。次いで、精製されたモノクロー
ナル抗体を濃縮し、そしてグリシン、マルトースまたは
他の適切な添加剤を用いてｐＨ４．２に最終製剤化す
る。ｐＨ４．２における製剤化によって、５℃で２年間
安定な液剤が達成できる。これは商業的観点から非常に
望ましいことである。
【００４６】（検討）免疫グロブリンは、コーンのアル
コール分画の間にＩＩ＋ＩＩＩ画分とともに沈殿する。
沈殿は、タンパク質表面の総電荷とその溶媒との相互作
用に依存する。厳密な塩、アルコールおよびｐＨ範囲
は、タンパク質が沈殿する範囲をいくぶんは限定でき
る。しかしながら、ほとんどのタンパク質は、広範囲の
ｐＨおよびアルコール濃度（１．５ｐＨ単位および１０
％アルコール）にわたって沈殿する。かくして、タンパ
ク質の沈殿範囲はオーバーラップしがちである。すべて
３種の主要な免疫グロブリンタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡお
よびＩｇＭは、それらの等電点の類似性により共沈殿す
る。免疫グロブリンのさらなる分離は、この類似性によ
って複雑になる。それ故、沈殿を利用する製造スキム
は、ＩｇＧの有意な量が、必ずＩｇＡおよびＩｇＭとと
もに共沈殿することになる。
【００４７】収率低下に加えて、古典的な沈殿法は、エ
タノールの使用が必要である。エタノールはタンパク質
を変性するので、タンパク質の安定性を増大するために
は、処理の間、低温（典型的には−５℃）が要求され
る。クロマトグラフィーは、沈殿法戦略において通常起
きるタンパク質の変性問題を回避できる。タンパク質の
クロマトグラフィー段階は、一般に、タンパク質の安定
性に好ましい条件下で行うことができる。エタノール分
画法のその他の欠点は、アルコールが、その化学的性質
により潜在的な爆発危険物であって、爆発防止設備と特
別な操作法を要することである。この事実は分画法のコ
ストを有意に増大するので、慣用のクロマトグラフィー
法にはない欠点である。
【００４８】イオン交換クロマトグラフィーは、タンパ
ク質とイオン交換媒体の両方における表面分布および電
荷密度という利点を利用する。アニオン交換樹脂は、陽
性に帯電した表面を提供する。電荷密度は樹脂に特異的
であり、そして一般に、ｐＨに依存しない（樹脂の作業
範囲内では）。典型的なアニオン交換体は、正味の陰電
荷をもつ（すなわち、溶液のｐＨがタンパク質の等電点
以上である場合に）タンパク質を結合するであろう。事
実、タンパク質の表面は、単一電荷が存在せず；むし
ろ、それは、陽性、陰性および中性電荷のモザイクであ
る。表面構造は、与えられたタンパク質に特異的であ
り、そしてイオン強度やｐＨのような溶液条件によって
影響されるであろう。この独特な性質は、個々のタンパ
ク質が、アニオン交換樹脂に結合したり、またそこから
離れたりする、特定の条件を確立するために利用でき
る。これらの条件を確立することによって、ただわずか
に異なる表面または電荷の性質をもつタンパク質が、高
収率（＞９５％）で効果的に分離できる。
【００４９】クロマトグラフィー樹脂支持体の構造上の
改良は、大規模なクロマトグラフィーを、より普通の精
製方法へ実際的に変えることができた。強固な樹脂は、
大容量を急速に（＜５時間）処理することを可能にし、
そして高いリガンド密度は、大容量処理に必要な能力を
増大する。高い収率、生産物純度および処理の簡易性と
結び付くこれらのファクターは、大規模な製造における
クロマトグラフィーの使用には好都合である。
【００５０】
【発明の効果】本明細書に述べられたクロマトグラフィ
ー法は、非常に特異的なクロマトグラフィー樹脂の利点
を利用する。２種のアニオン交換体は、タンパク質不純
物とウイルス不活性化剤を選択的に除去するのに使用さ
れる。得られる生産物は、ネフェロ分析かサイズ排除ク
ロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）のいずれによっ
てアッセイした場合でも、純度＞９９％である。
【００５１】また、本方法は、ＩｇＧの損失を最小にす
るよう計画される。ウイルス不活性化および除去は、溶
解およびクロマトグラフィー段階中に注意深く組み入れ
られており、それ故、本方法の効率を高めている。ペー
スト溶解から最終産物までの総収率は６９％である
（表、参照）。これは、アルコール処理洗浄（４８％）
を用いる現行処理の収率を超える有意な改良である。
【００５２】本方法は、実施例１において、ヒトのコー
ン画分ＩＩ＋ＩＩＩペーストについて行われた。しかし
ながら、本方法が、ヒト以外の動物から単離された血漿
画分について、同等の結果をもって良好に使用できるこ
とが期待される。
【００５３】前記実施例は、本発明を具体的に説明する
ことを意図しており、そしてその改変が当業者によって
行われるであろうと考えられる。したがって、本発明の
範囲は、以下の特許請求の範囲によって制約されること
を意図しない。
【００５４】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
【００５５】１． 初発ｐＨにおいて抗体および他の物
質を含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化
された抗体調製物を調製する方法であって、次の段階： ａ）出発溶液にカプリル酸イオン源を添加し、そして沈
殿物および抗体を含む上澄液を形成するようｐＨを調整
すること、 ｂ）上澄液を、実質的にすべてのウイルスを不活性化す
る時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度の条件
下でインキュベートすること、 ｃ）上澄液を、少なくとも一定の他の物質を樹脂に結合
させるが、抗体を樹脂に結合させない条件下で、少なく
とも１種のイオン交換樹脂と接触させること、ならびに ｄ）抗体を回収すること、を含む方法。
【００５６】２． 出発溶液が血漿由来の抗体を含み、
段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．６の範囲であり、そ
して段階ｂ）のｐＨが約５．０〜約５．２の範囲であ
る、第１項の方法。
【００５７】３． 出発溶液が哺乳動物細胞培養培地か
ら得られ、段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．６の範囲
であり、そして段階ｂ）のｐＨが約５．０〜約５．２の
範囲である、第１項の方法。
【００５８】４． 段階ｄ）において回収された抗体を
最終剤形に製剤化する段階をさらに含む、第１項の方
法。
【００５９】５． 免疫グロブリンおよび他の物質を含
む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された
免疫グロブリン調製物を調製する方法であって、次の段
階： （ａ）出発材料を、第１の沈殿物および免疫グロブリン
を含む第１の上澄液が形成される、ｐＨ、温度およびカ
プリル酸塩濃度の条件に調整すること、 （ｂ）第１の
上澄液を第１の沈殿物から分離すること、（ｃ）第１の
上澄液を、第２の沈殿物および免疫グロブリンを含む第
２の上澄液が形成される、時間、ｐＨ、温度およびカプ
リル酸塩濃度の条件下でインキュベートすること、
（ｄ）第２の上澄液を第２の沈殿物から分離すること、
（ｅ）第２の上澄液を、実質的に、免疫グロブリンは第
１の樹脂に結合されないが、他の物質が第１の樹脂に結
合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第１
のアニオン交換樹脂と接触させること、（ｆ）実質的に
すべての免疫グロブリンを含む画分を、段階（ｅ）で得
られた樹脂から分離すること、（ｇ）段階（ｆ）の画分
を、実質的に、免疫グロブリンは第２の樹脂に結合され
ないが、他の物質が第２の樹脂に結合されるようなｐＨ
およびイオン強度の条件下で、第２のアニオン交換樹脂
と接触させること、および（ｈ）実質的にすべての免疫
グロブリンを含む精製され、ウイルスを不活性化された
免疫グロブリン調製物を、段階（ｇ）で得られた樹脂か
ら分離すること、を含む方法。
【００６０】６． 段階ａ）のｐＨが約３．８〜約４．
６の範囲であり、段階ａ）のカプリル酸塩濃度が約１５
ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲であり、段階ｃ）のｐＨが約
５．０〜約５．２の範囲であり、そして段階ｃ）のカプ
リル酸塩濃度が約１５ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である、
第５項の方法。
【００６１】７． 免疫グロブリンが免疫グロブリンＧ
である、第５項の方法。
【００６２】８． 免疫グロブリンの給源が、ヒト血漿
画分、ヒト以外の動物血漿画分および哺乳動物細胞培養
培地からなる群から選ばれる、第５項の方法。
【００６３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を記述する流れ図である。
【図２】抗体を単離するための先行技術法を示す流れ図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドーグ・シー・リー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27502 アペツクス・アルテアサークル116 (72)発明者 ハンス−インゴルフ・ポール アメリカ合衆国ノースカロライナ州27511 キヤリー・クイーンフエリーロード1107

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 初発ｐＨにおいて抗体および他の物質を
    含む出発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化され
    た抗体調製物を調製する方法であって、次の段階： ａ）出発溶液にカプリル酸イオン源を添加し、そして沈
    殿物および抗体を含む上澄液を形成するようｐＨを調整
    すること、 ｂ）上澄液を、実質的にすべてのウイルスを不活性化す
    る時間、ｐＨ、温度およびカプリル酸イオン濃度の条件
    下でインキュベートすること、 ｃ）上澄液を、少なくとも一定の他の物質を樹脂に結合
    させるが、抗体を樹脂に結合させない条件下で、少なく
    とも１種のイオン交換樹脂と接触させること、ならびに ｄ）抗体を回収すること、を含む方法。
  2. 【請求項２】 免疫グロブリンおよび他の物質を含む出
    発溶液から、精製され、ウイルスの不活性化された免疫
    グロブリン調製物を調製する方法であって、次の段階： （ａ）出発材料を、第１の沈殿物および免疫グロブリン
    を含む第１の上澄液が形成されるｐＨ、温度およびカプ
    リル酸塩濃度の条件に調整すること、 （ｂ）第１の上
    澄液を第１の沈殿物から分離すること、 （ｃ）第１の上澄液を、第２の沈殿物および免疫グロブ
    リンを含む第２の上澄液が形成される時間、ｐＨ、温度
    およびカプリル酸塩濃度の条件下でインキュベートする
    こと、 （ｄ）第２の上澄液を第２の沈殿物から分離すること、 （ｅ）第２の上澄液を、実質的に、免疫グロブリンは第
    １の樹脂に結合されないが、他の物質が第１の樹脂に結
    合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、第１
    のアニオン交換樹脂と接触させること、 （ｆ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む画分を、
    段階（ｅ）の結果物から分離すること、 （ｇ）段階（ｆ）の画分を、実質的に、免疫グロブリン
    は第２の樹脂に結合されないが、他の物質が第２の樹脂
    に結合されるようなｐＨおよびイオン強度の条件下で、
    第２のアニオン交換樹脂と接触させること、ならびに （ｈ）実質的にすべての免疫グロブリンを含む精製さ
    れ、ウイルスの不活性化された免疫グロブリン調製物
    を、段階（ｇ）の結果物から分離すること、を含む方
    法。
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