JPS6064999A - インタ−フェロン−γの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロン−γを工業的規模において
収率よく、かつ簡便な操作で精製する方法に関する。

インターフェロン−Ｔは分子Ｍ２〜４万の糖蛋白質で、
顕著な免疫抑制作用、抗ウィルス作用、抗腫瘍作用、抗
細胞作用を有する。

インターフェロンを精製、回収する先行技術としては、
ヨードイオンあるいは硫シアン酸イオンを出す水溶性の
塩を用いる方法（特公昭４３−１６０６１号公報）、エ
タノールを用いる方法（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
ｏｆａ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｓｔｉｏｎ　Ｗｏｒｋ　５ｈｏｐ　ＩｎＶｉｔｒｏ論
文第３号、１９７３年）、弱酸性および弱塩基性のイオ
ン交換体を用いるカラムクロマトグラフィーとゲル濾過
を組み合わせる方法（特公昭５１−３４４４’２号公報
）等があげられるが、これらの方法はいずれも煩雑な操
作と長時間を要するものであり、特にインターフェロン
の回収率が５０％以下にとどまるものであった。しかも
、これらはインターフェロン−αの精製に関するもので
あり、インターフェロン−αとインターフェロン−γは
その溶液中での安定性を異にする。そのためインターフ
ェロン−Ｔのｔｉｉ製には、全く新たな検討を要する。

かかる実情丁に、本発明者らはインターフェロ７−７、
ｆ−１工業的規）桑４２、簡単４操１，７効イ４よ。

精製する方法について研究を重ねて来たところ、アフィ
ニテイ・クロマトグラフィーの技術に基づいて水不溶性
固定化抗インターフェロン−γ抗体を吸着体とすること
にって特異的にインターフェロン−γが精製されるごと
を見いだして本発明を完成した。

即ら、本発明はインターフェロン−Ｔを含イ１−」゛る
粗製インターフェロン水溶液を、水不溶性固定化抗イン
ターフェロン−γに接触さ−Ｕてインターフェロン−Ｔ
を吸着させた後、吸着さ−Ｈたインターフェロン−Ｔを
溶出させることによるインターフェロン−Ｔの精製法に
関する。

本発明に関するインターフェロン−Ｔとしζは、インタ
ーフェロン−Ｔ産生性ヒト山来細１１　（たとえば、白
血球、リンパ球、腹腔、肺臓、ｌＩ甲臓などの細胞の様
な網内系細胞、培養１ノンノく芽球ｌｌ１Ｉ包、特に好
ましく白血球）をフイトヘマク゛ルゴーニン（ＰＨＡ）
やコンカナバリン（Ｃｏｎ−Ａ）等の適当なマイトジェ
ンをインデューサーとし−ご刺激することによって得ら
れたもの、遣（云子工学で大腸菌、枯草菌、酵母等によ
って生産されたものなどその由来を問わず広く使用可能
であり、粗製インターフェロン−γ溶液としてムよ、た
とえ＆ｆインターフェロンーＴ産生性ヒト山来細胞上ン
青、ｕ１体抽出液、これらの予備的精製物（〕ことえム
ヨ、１県りＶ１１ＱＩＪＥ過処理など）などがあげら１
＋、る。

抗インターフェロンー目よ、ンｆ　ＩＪクロー・ノール
法、モノクローナル法などシこよって１得られたものカ
ー使用される。

ポリクローナル法の場合、抗インターフェロン−γは、
高度に精製したインターフェロン−γを！Ｊｊ物に免疫
し、得られる抗血を青より回収、ｔｆｉ製−３−ること
によって製造される。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行えばよく、たとえ
ば高度精製ヒト■因子とフし１インｌ゛の完全アジュバ
ントの混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、
数日後採血を行い室温で凝固せしめた後、４℃で一夜放
置後、３０００ｒｐｍ〜２０分間の遠心分離により当該
抗血清が得られる。

免疫にもういる動物としては、好ましくは〜例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が挙げられる。当
該抗血清の精製は、たとえば下記文献１．２に記載の方
法にて行われる。

文ＭＩ　Ｊ、八ｍ、　ＣＩ＋ｅｍ、Ｓｏｃ、、Ｇ２．　
３３１１６　（１９４０） 文献２　１’ｅｄ、Ｐｒｏｃ、、　１７．１１６１　（
１９５１３）モノクロー−ノールの場合、細菌融合法に
より抗インターフェｌコン−γを製造する。

細胞融合法は自体既知の手段にて行われ、その−例は増
殖性を持った細胞と目的とする抗体を産生しているリン
パ球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せしめ
ることにより、増りｊ（（性と抗体産生能とを同時に兼
ねそなえた細胞を製するもので、この細胞の産４卜する
抗体は一個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗
体である。

増殖性を持った細胞として、例えばミエローマ細胞を、
抗体産生リンパ球として、例えば白血球、リンパ球、腹
腔、肺臓、肺臓などの細胞の様な網内系細胞を用いてイ
ンターフェロン−Ｔのモノクローナル抗体が製造される
。

本発明者等はモノクローナル抗体を産生ずる融合細胞の
取（Ｈを意図して長年研究を重ねてきた結果１．インタ
ーフェロン−γに対する抗体を産生ずる融合細胞株を見
いだし、しかも当該−Ｍ１合細胞株が産生ずるモノクロ
ーナル抗体は、インターフェロン−α、インターフェロ
ン−β、大腸菌、枯草菌または動物血清とは共通反応を
示さず、インターフェロン−Ｔに対して特異的に反応す
ることを見いだした。

このようにして得られた抗インターフェロン−γから水
不溶性固定化抗インターフェロン−γ抗体を得る方法と
しては、たとえば下記の如き水不溶性担体に抗インター
フェロン−γを結合させる方法があげられる。

（１１アミノ酸のコポリマー（Ｊ、　Ｂｉｏ＋、、　（
：ｌ＋ａｍ、。

副別、　１９７０　（１９６１） （２）セルロース（Ｎａｔｕｒｅ、　１８９．５７６　
（１９６１）　）（３）アガロースまたはセファデック
ス（Ｎａｔｕｒｅ、　２１５−１４９１　（１９６７）
　、Ｎａｔｕｒｅ、　３４５　３０５９　（１９７０） （４）ポリアクリルアミド（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　８
．４０’？４（１９６６） 本発明においてインターフェロン−γの吸着は、たとえ
ばインターフェロン−γを含有する粗製インターフェｌ
ノン水溶液と水不溶性固定化抗インターフェロン−Ｔ抗
体とを、好ましくは緩やかな攪拌下に、たとえば室温程
度で０．５〜２時間程度混合（攪１’Ｐ　）する方法、
水不溶性固定化抗インターフェロン−γ抗体をカラムに
充１眞し、粗製イン−クーフエロン水／８液を流す方法
（好適条件：室１／＋！ｈ）にておこなわれる。

粗製インターフェロン水／８液はそのまま上記の吸着処
理にイ」シてもよいが、好ましくは吸着に先立って、ｆ
ＩｉＵインターフェロン水溶液は脱塩、ｐｌ＋の調製（
好ましくは、ｐｌ＋５．６〜９、さらに好ましくはｐ１
１６〜８）、透析、凍結乾燥等の処理を施しておくこと
が好ましい。粗製インターフェロン水溶液はｐ１１５．
６〜９の緩衝液、特にｐ１１６〜８の低イオン強度の緩
衝液（たとえば、塩化ナトリウムとして０．５Ｍ以下の
生理食塩水）で平衡化されていることが好ましい。

水不溶性固定化抗インターフェロン−γ抗体の容量は、
通富粗製インターフェロン水／８液の１７５〜１／２０
程度である。

かくして水不溶性固定化抗インクーフエロンーＴ抗体に
インターフェロン−γのみが特異的に吸着され、他の不
純蛋白質は吸着されない。この吸着物は、好ましくは上
記緩ｆｆｉ？ａ　（たとえば、生理食塩水）で洗浄して
残留物を洗い出す。インターフェロン−γの溶出は、ｐ
ｌ＋５．６〜９の緩ｉＩｉ液、特にｐ１１６〜８の高イ
オン強度の緩衝液によって行われる。かかる緩衝液とし
ては、たとえばＩＭ以」二の塩類ン容ｌ夜（イ列えば、
１〜３ＭのＫ　Ｓ　ＣＮ溶ｌ皮、３〜５ＭのＭ［ＣＩ２
溶液、２〜５Ｍの塩酸クアニジン溶液）、０．２Ｍ以上
のアミノ酸、０．０１Ｍ以上のイミダゾール又はこれら
のエステル頓、および０．１　Ｍ以上のアミン類（例え
ば、５〜８Ｍの尿素溶液）などが用いられる。

ｌ容量（展開）されたインターフェロン−γはその活性
を溶出液において追跡することによって回収され、不純
物のないｉｌ゛（−ピークとして回収される。

かくして（ｉｌられたインターフェロン−γはそのまま
、または適当な安定化剤を添加して、好まし２くは脱塩
透析、除菌濾過、分注後、凍結乾燥層剤とすることが出
来る。

本発明に係るインターフェロン−ｒ　Ｏ）　ｔｉ’？製
法は、その回収率が略１００％で得られたインターフェ
ロン−Ｔの比活性はｌ　Ｘ　ｌ　（＋　’Ｉ　−１ｘ　
ｌ　Ｏ“−１であること、ｔｉ’ｊ製操作が簡単で且つ
短Ｉｈ間であるごと等から、工業的規模におりるインタ
ーフェロンＪン−Ｔの語法として好適である。

以下、実施例を以て本発明をより置体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお
、実施例におけるインターフェロン−γの活性はＦ　Ｌ
　−５ｉｎｄｖｉｓ　ｖｉｒｕｓ系のＣＰＥ阻止法によ
って測定した。

実施例１ インターフェロン−γをＢ　Ａ　Ｌ　Ｃ／Ｃ系マウスに
１０週間免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、
その牌綱胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミ
エローマ細胞であるＸ６３−Ａｇ８６５３（アメリカ、
ＦＬＯＷ社より入手）とポリエチレングリコール＃１０
００存在下で混合し融合せしめた。この融合細胞の内、
インターフェロンーコに対する抗体を産生じている１１
■胞を、血球凝集反応、酵素免疫反応、及び中和抗体反
応等の方法で検査しながらインターフェロン−γ産生株
を得た。この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜１０日
目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水はインター
フェロン−Ｔの活性を強く阻書した。このマウス腹水中
のモノクローナル抗体を常法に従いＣＮ　Ｂｒ活性化セ
ファロース（ファルマシア社製）へ結合せしめ、水不溶
性固定化モノクローナル抗体を調製した。

この水不溶性固定化モノクローナル抗体１０ｍ１をカラ
ムへ充填し、インターフェロン−γを含む水溶液を室温
度にて５０．ｍｌ／時の流速で流下さ−Ｕ、インターフ
ェロン−γを吸着せしめた。ｒＵｉ’２億単位のインタ
ーフェロン−Ｔを吸着させた後、０．１〜１．０ＭのＮ
　ａｃＩ溶液でカラムを洗浄し不純物質を除去した。

次に２ＭのＫＳＣＮ熔液をカラムへ注入し、インターフ
ェロンーＴを熔出した。

溶出したインターフェロン−Ｔの回収卸はｌ　（、Ｑ８
千万単位、回収率は９５％、蛋白質当たりの比活性はｌ
Ｘ１０８であり、その精製率は出発原料の２００倍に上
昇した。

実施例２ 実施例１で使用したモノクローナル抗体力うノ、に、前
記と同様にしてインターフェロン−γを吸着せしめた後
、洗浄、その後５ＭのＭＨＣＩ２１容液でインターフェ
ロン−γを溶出した。回収率は出発原料の９７％で比活
性は１０００倍に上昇した。

実施例３ ヒト白血球にＰＨＡをインデューサーとして産生じた粗
製インターフェロン−γ約５億単位を、ウサギの皮肉に
３回投与し、３日後採血を行い、抗血清を得、さらにＤ
ＥＡＥ−セルしｊ−スを用いて精製抗インターフェロン
ーγ抗体を回収した。

この抗体を実施例１と同様に固定し、水不溶性固定化ポ
リクローナル抗体を調関し、これをカラＪ１に充がした
。インターフェロン−γを含む水溶液をこのカラムにア
プライし、インターフェロン−γを吸着さ−Ｕた。その
後、未吸着蛋白質などをＯ０ＩＭリン酸緩ｉ！ｉｌ夜、
（ｐＨ７，０＞　でｌ客用、ｌ先に／Ｉ　した。

その後、１Ｍリン酸緩衝を夜（ｐＨ７，０）で溶出を行
い、インターフェロン−Ｔの回収を行った。インターフ
ェロン−Ｔの回収率は１００％、精製度は５００倍であ
り、得られたインターフェロン−γの比活性はｌＸ１０
８であった 実施例４ １１１製インターフェロン−γ　（比活性；ｌＸｌ０８
）の水溶液を実施例１と同じ抗体カラムにアプライし、
実施例３と同一条件で吸着、洗浄を行った後、インター
フェロン−γの溶出を行いインターフェＬ：ｌ　７−７
の回収を行った。インターフェロン−Ｔの回収率は１０
０％で精製度は１力ｆｌ１位であった。また、得られた
インターフェ［１ンーＴの比活性はＩ　Ｘ　］　＋ｌ　
Ｅ＋であった。

特許出願人　株式会社　ミトリ＋字 手　続　ネｉｌｉ　ＪＥ　鴇：（自発）昭和５８年１２
月２λ日 昭和５８年特許願第１７３９４２号 ２、発明の名称 インターフェロン−γの精製法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 ■５４１ 住　所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３ニューライ
フ平野町４０６号 電話（０６）　２２７−１１５６ 商品国際特許事務所 氏名弁理士（８０７９）高話　− ５、補正命令の日付 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」の欄、及び「発明の詳細な
説明」の欄 （１）明細書の「特許請求の範囲」全文を別紙のとおり
に訂正する。

（２）同書第４ｐｊ、第１１行ノ１１．．，７Ｊを［−
ニョって」に訂正する。

（３）同書−第６頁、第２行の「ピロ１因子」を１イン
ターフエＩＩンーγ」に訂正する。

（４）同書第６頁、第１４行の「細菌」を［イＩＩ＋胞
−１に訂正する。

（５）同書第９頁、第１１行（７）ｒ２０Ｊを１−２０
００」に訂正する。

（６）同店第９頁、最終行の「３」を「４」にもＩ’　
ｉＬする。

（７）同書第１　ｆ１頁、下から第６行の「略】００％
で」を「約１００％で、」にδＩ°正する。

（８）同書第１０頁、下から第５行のｒｌ　０９．、ｌ
のΔＬ　Ｂ　Ｊに貧Ｉ正する。

（１０）同書第１２頁、第１０行の「２」を［３，５Ｊ
にｒｉ’ｌ正する。

（１１）同吉第１Ｈ７、第１３行の「９５％−１を［１
］０％」にｄ１正する。

（１２）同書第１２４＝＜、第１３行の１蛋白質」の後
にｒ１ｍｒ＋Ｊを加入する。

（Ｉ３）同書第１２頁、第１４行のｒｌＸ１０８ｊの後
に１単位−１を加入する。

（１４）同書第１３頁、第１５行（７）　ｒ　Ｉ　Ｍ　
’）　７　ｒ（ｉ桜＋１液」を１５Ｍ塩酸グアニジン′
／ｇ液１に訂正す（１５）同書第１３頁、第１９行の「
ｌ×１０８」の後に［単位／ｍｇ蛋白Ｊを加入する。

（１６）　同書第１４頁、第１行（７）ｒｌＯ’Ｊをｒ
ｌｏ４単位／ｍｇ蛋白」に訂正する。

０００倍」に訂正する。

（１９）　ｌｉｉＪｆｆｍ　Ｉ　４　、Ｆ（、第８行）
「ｌ　ｘ　ｌ　Ｏ９Ｊ　（７）（＆に「ｆ１！位／ｍｇ
蛋白」を加入する。

（別紙） 特許請求の範囲 （１）インターフェロン−γを含有する粗製インターフ
ェロン水溶液を、水不溶性固定化抗インターフェロン−
Ｔに接触さ・Ｕてインターフェロン−Ｔを吸着させた後
、吸着させたインターフェロン−γを溶出さ・ｌること
を特徴とするインターフェロン−γの精製法。

（２）インターフェリン−Ｔがヒト自ＩＩＩ口、）ミを
マイトジェンで刺激して１１７られるインターフエ［１
ンーンである特許請求の範囲第ｆｉ１項記載のインター
ンｊＩ）　ンー　γ　の打ｉ製ｌ去。

（３）インターフェロン−γが遺伝子工学的に生産され
たものであるＺ］、＋１許請求の範囲第（］）項記載の
インターフェロン、−γのｔｉ’ｉ　′Ｍ法。

（４）抗インターフェ１」ンーγが遺伝子上“ｙ的にり
Ｌ産されたものである特許請求の範囲第（１）項記載の
一インターフェロンーγオ青製法。

（５）抗インターフエｌ′Ｊン〜γがｉｌ「度精盟イン
ターフェロン−Ｔを動物に免疫して（−１１られるボリ
クＩＪ−ナル抗体である特許請求の範囲第（１）項記載
のインターフェロン−γの精製法。

（６）抗インターフェロン−Ｔがインターフェロン−γ
を免疫した動物のリンパ球と動物由来のミエローマ細胞
とを細胞融合してｊｑられるハイブリ１゛−マにより産
生じたモノクローナル抗体である特許請求の範囲第ｆｉ
１項記載のインターフェ１」ンーγのオｒＭ法。

（７）インターフェロン−γの水不溶性固定化抗インタ
ーフェロン−Ｔへの吸着、および水不溶性固定化抗イン
ターフェロン−γ抗体への未吸着物の洗浄に際して、ｐ
１１６〜８の無機塩緩衝液を使用する特許請求の範囲第
（１）項記載のインターフェロン−Ｔの精製法。

（８）水不溶性固定化抗インターフェロン−Ｔからのイ
ンターフェロン−γの溶出に際して、ｐ１１６〜８の無
機塩緩衝液を使用する特許請求の範囲第（１１項記載の
インターフェロン−Ｔの精製法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）インターフェロン−γを含有する粗製インターフ
   ェロン水溶液を、水不溶性固定化抗インターフェロン−
   γに接触させてインターフェロン−Ｔを吸着させた後、
   吸着させたインターフェロン−Ｔを溶出させることを特
   徴とするインターフェロン−γの精製法。 （２）インターフェロン−Ｔがヒト白血球をマイジエン
   で刺激して得られるインターフェロン−Ｔである特許請
   求の範囲第（１）項記載のインターフェロン−Ｔの精製
   法。 （３）インターフェロン−Ｔが遺伝子工学的に生産され
   たものである特許請求の範囲第（１）項記載のインター
   フェロン−Ｔの精製法。 （４〕抗インターフェロン−γが遺伝子工学的に生産さ
   れたものである特許請求の範囲第＋１１項記載のインタ
   ーフェロン−ＴＩｉ製法。 （５）抗インターフェロン−γが高度精製インターフェ
   ロン−γを動物に免疫して得られるポリクローナル抗体
   である特許請求の範囲（１１項記載のインターフｌロン
   −Ｔの精製法。 （６）抗インターフェロン−γがインターフェロン−Ｔ
   を免疫した動物のリンパ球と動物由来のミエローマ細胞
   とを細胞融合して得られるハイブリドーマにより産生し
   たモノクローナル抗体である特許請求の範囲第＋１１項
   記載のインターフェロン−Ｔの＄１製法。 （７）インターフェロン−Ｔの水不熔性固定化抗インタ
   ーフェロン−γへの吸着、インターフェロン−γの希釈
   、および水不溶性固定化抗インターフェロン−Ｔ抗体へ
   の未吸着物の洗浄に際して、ｐ１１６〜８の無機塩緩衝
   液を使用する特許請求の範囲第（１）項記載のインター
   フェロン−γの精製法。 （８）水不熔性固定化抗インターフェロン−Ｔからのイ
   ンターフェロン−γの溶出に際して、ｐ　Ｉ＋　６〜８
   の無機塩緩衝液を使用する特許請求の範囲第（１１項記
   載のインターフェロン−γの精製法。