CH719843B1

CH719843B1 - Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, die aus der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C erhalten wurde.

Info

Publication number: CH719843B1
Application number: CH000695/2023A
Authority: CH
Inventors: Bieri Michael; Heck Tobias
Original assignee: Csl Behring Ag
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2023-06-28
Publication date: 2024-06-14
Also published as: WO2024003171A1; CH719843A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, die während oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C erhalten wird, das Verfahren umfassend das Bestrahlen einer während oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Prazipitat C gewonnenen Testprobe, mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum, das Messen der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotspektrum, wodurch Testwellenlängenspektren erzeugt werden, sowie das Vergleichen der Testwellenlängenspektren mit Referenzwellenlängenspektren, die von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen des Analyten erhalten wurden, um die Konzentration des Analyten in der Testprobe zu bestimmen.

Description

Gebiet der Erfindung

[0001] Die Erfindung betrifft Verfahren zur Inline-, At-Line-, Off-Line- und/oder On-Line-Überwachung von Parametern in trüben Lösungen oder Suspensionen und die Anwendung derselben in Verfahren zur Reinigung von Lösungen, die Proteine und andere Komponenten enthalten.

Querverweis auf frühere Anträge

[0002] Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der australischen vorläufigen Anmeldungen 2022901797 und 2022903894, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Hintergrund der Erfindung

[0003] Die Nachfrage nach gereinigten Proteinen wie z.B. spezifischen Antikörpern ist erheblich gestiegen. Solche gereinigten Proteine können für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke verwendet werden.

[0004] Menschliches Blutplasma wird seit Jahrzehnten industriell für die Herstellung weithin etablierter und akzeptierter Plasmaproteinprodukte wie Humanalbumin (HSA), Immunglobulin (IgG), Gerinnungsfaktorkonzentrate (Gerinnungsfaktor VIII, Gerinnungsfaktor IX, Prothrombinkomplex usw.) und Inhibitoren (Antithrombin, C1-Inhibitor usw.) verwendet. Im Laufe der Entwicklung solcher aus Plasma gewonnener Arzneimittel wurden Plasmafraktionierungsverfahren etabliert, die zu Zwischenprodukten führen, die mit bestimmten Proteinfraktionen angereichert sind, die dann als Ausgangsmaterial für Plasmaproteinprodukte dienen. Typische Verfahren sind z.B. in Molecular Biology of Human Proteins (Schultze H.E., Heremans J.F.; Volume I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; S. 236-317) beschrieben. Diese Art von Trennverfahren ermöglicht die Herstellung mehrerer therapeutischer Plasmaproteinprodukte aus demselben Plasmaspenderpool. Dies ist wirtschaftlich vorteilhaft gegenüber der Herstellung von nur einem Plasmaproteinprodukt aus einem Spenderpool und hat sich daher als Industriestandard für die Blutplasmafraktionierung durchgesetzt.

[0005] Ein Beispiel für diese Art von Fraktionierungsverfahren, die kalte Ethanolfraktionierung von Plasma, wurde von E. J. Cohn und seinem Team während des Zweiten Weltkriegs in erster Linie für die Reinigung von Albumin entwickelt (Cohn EJ, et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 62: 459-475). Bei der Cohn-Fraktionierung wird die Ethanolkonzentration schrittweise von 0 % auf 40 % erhöht, während der pH-Wert von neutral (pH 7) auf etwa 4,8 abgesenkt wird, was zur Ausfällung von Albumin führt. Während sich die Cohn-Fraktionierung in den letzten 70 Jahren weiterentwickelt hat, basieren die meisten kommerziellen Plasmafraktionierungsverfahren auf dem ursprünglichen Verfahren oder einer Abwandlung davon (z.B. Kistler/Nitschmann), wobei Unterschiede im pH-Wert, in der lonenstärke, der Polarität des Lösungsmittels und der Alkoholkonzentration ausgenutzt werden, um das Plasma in eine Reihe von ausgefällten Hauptproteinfraktionen zu trennen (z. B. die Fraktionen I bis V bei Cohn).

[0006] Mit dem Ziel, die Gewinnung von polyvalentem IgG zu verbessern, wurden Variationen des Cohn'schen Fraktionierungsverfahrens entwickelt. So verwendeten Oncley und Mitarbeiter die Fraktionen II+III von Cohn als Ausgangsmaterial mit unterschiedlichen Kombinationen von kaltem Ethanol, pH-Wert, Temperatur und Proteinkonzentration im Vergleich zu den von Cohn beschriebenen, um eine aktive Immunglobulin-Serumfraktion herzustellen (Oncley et al., (1949) J. Am. Chem. Soc. 71, 541-550). Heute ist die Oncley-Methode die klassische Methode zur Herstellung von polyvalentem IgG. Es ist jedoch bekannt, dass etwa 5% der Gamma-Globuline (antikörperreicher Anteil) mit der Fraktion I ausgefällt werden und etwa 15% des gesamten im Plasma vorhandenen Gamma-Globulins durch den Schritt Fraktion II+III verloren gehen (siehe Tabelle III, Cohn EJ, et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 62: 459-475). Die Kistler/Nitschmann-Methode zielte darauf ab, die IgG-Gewinnung zu verbessern, indem der Ethanolgehalt einiger Fällungsschritte reduziert wurde (Fällung B gegenüber Fraktion III). Die erhöhte Ausbeute geht jedoch auf Kosten der Reinheit (Kistler & Nitschmann, (1962) Vox Sang. 7, 414-424).

[0007] Ursprünglich wurden aus diesen Fraktionierungsverfahren gewonnene Immunglobulin G (IgG)-Präparate erfolgreich zur Prophylaxe und Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten eingesetzt. Da die Ethanolfraktionierung jedoch ein relativ grober Prozess ist, enthielten die IgG-Produkte Verunreinigungen und Aggregate in einem Ausmass, dass sie nur intramuskulär verabreicht werden konnten. Seitdem haben weitere Verbesserungen der Reinigungsverfahren zu IgG-Zubereitungen geführt, die für die intravenöse (IVIg genannt) und subkutane (SCIg genannt) Verabreichung geeignet sind.

[0008] Schätzungen zufolge wurden im Jahr 2010 weltweit etwa 30 Millionen Liter Plasma verarbeitet, aus denen eine Reihe von therapeutischen Produkten hergestellt wurde, darunter etwa 500 Tonnen Albumin und 100 Tonnen IVIg. Der Mg-Markt macht etwa 40-50% des gesamten Plasmafraktionierungsmarktes aus (P. Robert, Worldwide supply and demand of plasma and plasma derived medicines (2011) J. Blood and Cancer, 3, 111-120). Da die Nachfrage nach IVIg weiterhin stark ist (zusammen mit der steigenden Nachfrage nach SCIg), besteht also weiterhin die Notwendigkeit, die Gewinnung von Immunglobulinen aus Plasma und verwandten Fraktionen zu verbessern. Vorzugsweise muss dies auf eine Weise geschehen, die sicherstellt, dass die Gewinnung anderer aus Plasma gewonnener therapeutischer Proteine nicht beeinträchtigt wird.

[0009] Aus kommerzieller Sicht sind die anfänglichen Fraktionierungsprozesse entscheidend für die Gesamtproduktionszeit und die Kosten, die mit der Herstellung eines therapeutischen Proteins verbunden sind, insbesondere von aus Plasma gewonnenen Proteinen, da die nachfolgenden Reinigungsschritte von der Ausbeute und Reinheit des/der gewünschten Proteins/Proteine in diesen anfänglichen Fraktionen abhängen. Für Plasmaproteine wurden zwar mehrere Varianten der Kaltethanolfraktionierung entwickelt, um die Proteinausbeute bei geringeren Betriebskosten zu verbessern, doch sind höhere Proteinausbeuten in der Regel mit einer geringeren Reinheit verbunden.

[0010] Es besteht ein Bedarf an neuen und/oder verbesserten Verfahren zur Bestimmung der Konzentration verschiedener Analyten in komplexen Lösungen während der Plasmabehandlung, um die nachgeschaltete Effizienz zu verbessern, die Abfallmenge zu verringern und/oder die Ausbeute des Endprodukts zu erhöhen. Aufgrund der Heterogenität der aus Plasma gewonnenen Produktlösungen und - suspensionen ist die Quantifizierung wichtiger chemischer Komponenten, wie z.B. Proteine, komplex und konnte bisher nur mit Hilfe von Offline-Analysemethoden erfolgen, die einen hohen Probenahmeaufwand und Analysezeiten von in der Regel mehreren Tagen erfordern. Daher besteht ein Bedarf an neuen analytischen Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Analyten in trüben, insbesondere stark trüben Lösungen oder Suspensionen.

[0011] Die Bezugnahme auf den Stand der Technik in der Beschreibung ist keine Anerkennung oder Andeutung, dass dieser Stand der Technik in irgendeiner Rechtsordnung zum allgemeinen Wissen gehört oder dass vernünftigerweise erwartet werden kann, dass dieser Stand der Technik von einem Fachmann auf dem Gebiet der Technik verstanden, als relevant angesehen und/oder mit anderen Teilen des Standes der Technik kombiniert wird.

Zusammenfassung der Erfindung

[0012] In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe bereit, die wahrend oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C erhalten wird wobei das Verfahren umfasst: – Bestrahlen einer während oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C gewonnenen Testprobe, mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotspektrum, zur Erzeugung von Testwellenlängenspektren, – Vergleich der Testwellenlängenspektren mit Referenzwellenlängenspektren, die von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen des Analyten erhalten wurden, um die Konzentration des Analyten in der Testprobe zu bestimmen.

[0013] NIR-Spektren enthalten in der Regel Hunderte von Variablen und daher wird vorzugsweise eine Form der multivariaten Datenanalyse zur Analyse der Rohdaten aus den Messungen verwendet. Solche multivariaten Datenanalysemethoden sind in der Fachwelt wohlbekannt und umfassen die partielle Kleinstquadratregression (PLS), die PLS-Diskriminanzanalyse (PLS-DA), die gewöhnliche Kleinstquadratregression (OLS), die MLR (multiple lineare Regression), die OPLS (Orthogonal-PLS); SVM (Support Vector Machines); GLD (allgemeine Diskriminanzanalyse); GLMC (verallgemeinertes lineares Modell); GLZ (verallgemeinertes lineares und nichtlineares Modell); LDA (lineare Diskriminanzanalyse); Klassifizierungsbäume; Clusteranalyse; neuronale Netze; und Pearson-Korrelation.

[0014] In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe bereit, die wahrend oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Prazipitat C erhalten wird wobei das Verfahren umfasst: – Bestrahlen einer während oder nach Anschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Prazipitat C gewonnenen Testprobe, mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich Nahinfrarotspektrum, zur Erzeugung von Testwellenlängenspektren, – Vergleichen der Testwellenlängenspektren mit einem Referenzdatensatz in Form eines Modells, das unter Verwendung einer multivariaten Analyse von verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen des Analyten erzeugt wurde, um die Konzentration des Analyten in der Testprobe zu bestimmen.

[0015] In einem Aspekt handelt es sich bei dem Analyten um Gesamtprotein oder Alkohol (z.B. Ethanol) handeln. In diesen Ausführungsformen können die Verfahren dann zur Bestimmung der Konzentration von Gesamtprotein oder Ethanol in einer Testprobe verwendet werden, die aus der Verarbeitung von Blutplasma gewonnen wurde.

[0016] In einem Aspekt handelt es sich bei der Messmethode bevorzugt um die Transflexionsmessung.

[0017] In einer Ausführungsform umfasst die Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge im Bereich von etwa 750 bis etwa 2500 nm. In einer anderen Ausführungsform weist die Lichtquelle eine Wellenlänge von etwa 800 bis 1100 nm auf. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Lichtquelle eine Wellenlänge von etwa 1100 bis etwa 2500 nm. Vorzugsweise umfasst die Lichtquelle eine Wellenlänge von etwa 1400 bis etwa 2200 nm.

[0018] In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Lichtquelle eine Wellenlänge, die in Wellenzahlen ausgedrückt wird, und die Wellenzahl liegt zwischen etwa 4.000 und etwa 12.500 cm<-1>.

[0019] In einer Ausführungsform umfassen die Wellenlängenspektren Messungen der Reflexion, der Transmission oder der Transflexion bei Wellenlängen im Bereich von etwa 750 bis etwa 2500 nm. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Wellenlängenspektren Messungen bei Wellenlängen von etwa 800 bis 1100 nm. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Wellenlängenspektren Messungen der Reflexion, Transmission oder Transflexion bei Wellenlängen von etwa 1100 bis etwa 2500 nm. Vorzugsweise umfassen die Nahinfrarot-Wellenlängenspektren Messungen bei Wellenlängen von etwa 1400 bis etwa 2200 nm.

[0020] In einer weiteren Ausführungsform werden die Wellenlängenspektren in Wellenzahlen ausgedrückt, und die Wellenzahl liegt zwischen etwa 4.000 und etwa 12.500 cm<-1>.

[0021] In einem Aspekt kann die Modellerstellung die Identifizierung von Signaländerungen in Wellenzahlbereichen der Spektren beinhalten.

[0022] In einer Ausführungsform, insbesondere wenn es sich bei dem Analyten um Gesamtprotein handelt, können die Wellenzahlbereiche einen oder mehrere von etwa 9'000 bis etwa 7'500 cm<-1>, etwa 6'900 bis etwa 5'600 cm<-1>und etwa 4'935 bis etwa 4'500 cm<-1>umfassen. In einer Ausführungsform können die Wellenzahlbereiche einen oder mehrere der Bereiche 9'000 bis 7'500 cm<-1>, 6'900 bis 5'600 cm<-1>und 4'935 bis 4'500 cm<-1>umfassen.

[0023] In einer Ausführungsform, insbesondere wenn es sich bei dem Analyten um einen Alkohol wie Ethanol handelt, können die Wellenzahlbereiche einen oder mehrere der folgenden Bereiche umfassen: 9'400 - 5'400 cm<-1>, oder 9'400 - 5'448 cm<-1>.

[0024] In einer Ausführungsform werden die wichtigsten von Wasser abgeleiteten Signale ausgeschlossen. Typischerweise treten die wichtigsten von Wasser abgeleiteten Signale zwischen 7'500 und 6'900 cm<-1>und zwischen 5'600 und 4'935 cm<-1>auf.

[0025] In einer Ausführungsform, insbesondere wenn es sich bei dem Analyten um Gesamtprotein handelt und die Probe aus der Verarbeitung von Cohn Fraktion V (Fr V) oder Kistler/Nitschmann Präzipitat C stammt, können die Wellenzahlbereiche etwa 9'000 bis etwa 7'500 cm<-1>und/oder etwa 6'000 bis etwa 5'600 cm<-1>umfassen. In einer Ausführungsform können die Wellenzahlbereiche 9'000 bis 7'500 cm<-1>und/oder 6'000 bis 5'600 cm<-1>umfassen.

[0026] In einem Aspekt ist das Modell der verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren ein Modell, das unter Verwendung der Regression der kleinsten partiellen Quadrate (PLS) von verarbeiteten Wellenlängenspektren von Proben mit bekannten Konzentrationen des Analyten unter Verwendung einer hierin beschriebenen Methode erzeugt wird.

[0027] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer aus der Plasmabehandlung erhaltenen Probe beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Bereitstellung von Trainingsproben, die aus der Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma gewonnen wurden, wobei die Proben bekannte Konzentrationen des Analyten aufweisen, – Bestrahlung der Trainingsproben mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit der bekannten Konzentration des Analyten herzustellen,um so ein Modell zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe zu erhalten, die aus der Verarbeitung von Blutplasma gewonnen wurde. Optional wird die multivariate Analyse ausgewählt aus aus partieller Kleinstquadratregression (PLS); PLS-Diskriminanzanalyse (PLS-DA); gewöhnliche Kleinstquadratregression (OLS); multiple lineare Regression (MLR); orthogonal-PLS (OPLS); Support Vector Machines (SVM); allgemeine Diskriminanzanalyse (GLD); verallgemeinertes lineares Modell (GLMC); verallgemeinertes lineares und nichtlineares Modell (GLZ); lineare Diskriminanzanalyse (LDA); Klassifizierungsbäume; Clusteranalyse; neuronale Netze; und Pearson-Korrelation.

[0028] In einem Aspekt werden die Trainingsproben aus der routinemässigen Herstellung von aus Blut gewonnenen Plasmaprodukten, wie hierin weiter beschrieben, gewonnen und umfassen beispielsweise Immunglobuline und andere aus Blutplasma gewonnene Proteine einschliesslich Albumin und Gerinnungsfaktoren.

[0029] In einem Aspekt ist die spektrale Vorbehandlung eine erste Ableitung, eine Vektornormierung oder eine Kombination aus erster Ableitung und Vektornormierung. Alternativ kann die spektrale Vorbehandlung auch eine Min-Max-Normierung sein.

[0030] In einem Aspekt kann, wenn es sich bei dem Analyten um ein Protein handelt, die Proteinkonzentration in den Referenz- oder Trainingsproben mit jedem in der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden, z.B. mit dem Dumas-Assay oder einem hierin beschriebenen Verfahren.

[0031] In einem Aspekt kann, wenn es sich bei dem Analyten um einen Alkohol wie Ethanol handelt, die Konzentration von Alkohol (z.B. Ethanol) in den Referenz- oder Trainingsproben mit allen in der Technik bekannten Mitteln oder unter Verwendung theoretischer Werte oder mit allen hier beschriebenen Mitteln (z.B. Gaschromatographie oder enzymatische Ethanolbestimmung) bestimmt werden.

[0032] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Proteinkonzentration in einem Bereich von etwa 10 g/kg bis etwa 150 g/kg, 10 g/kg bis 150 g/kg, etwa 15 g/kg bis etwa 45 g/kg, 15 g/kg bis 45 g/kg, etwa 20 g/kg bis etwa 35 g/kg, 20 g/kg bis 35 g/kg, etwa 100 g/kg bis etwa 150 g/kg oder 100 g/kg bis 150 g/kg. In einer Ausführungsform, in der das Protein in der Testprobe überwiegend aus IgG besteht oder eine signifikante Menge davon enthält, kann der Proteinkonzentrationsbereich etwa 15 g/kg bis etwa 40 g/kg, 15 g/kg oder 40 g/kg, etwa 16 g/kg bis etwa 42 g/kg, 16 g/kg bis 42 g/kg, etwa 20 g/kg bis etwa 35 g/kg oder 20 g/kg bis 35 g/kg betragen. In einer Ausführungsform, in der das Protein in der Testprobe überwiegend aus Albumin besteht oder eine signifikante Menge Albumin enthält, kann der Proteinkonzentrationsbereich etwa 100 g/kg bis etwa 150 g/kg oder 100 g/kg bis 150 g/kg betragen.

[0033] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Konzentration von Alkohol (z.B. Ethanol) in einem Bereich von etwa 1 % v/v bis etwa 65% v/v, oder 1 % v/v bis 65% v/v, oder etwa 8% bis etwa 40% v/v, oder 8% bis 40% v/v.

[0034] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Fraktionierung von Blutplasma verwendet wird, einschliesslich der Herstellung einer oder aller Cohn-Fraktionen I, Cohn-Fraktion (I+)II+III, Cohn-Fraktion IV (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4) und Cohn-Fraktion V und anderer ähnlicher Fraktionsvarianten oder Präzipitate. Darüber hinaus ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Fraktionierung von Blutplasma verwendet wird, einschliesslich der Herstellung von Kistler/Nitschmann-Präzipitat A, Kistler/Nitschmann-Präzipitat B, Kistler/Nitschmann-Fraktion IV und Kistler/Nitschmann-Präzipitat C sowie anderer ähnlicher Fraktions- oder Präzipitatvarianten.

[0035] Der hier verwendete Begriff Cohn-Fraktion (I+)II+III umfasst Cohn-Fraktion I+II+III oder Cohn-Fraktion II+III. Er entspricht auch dem Kistler/Nitschmann-Präzipitat A und anderen ähnlichen Fraktionsvarianten oder Präzipitaten.

[0036] Die hier verwendete Cohn-Fraktion IV umfasst die Cohn-Fraktion IV1und IV4.

[0037] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Fraktionierung von Blutplasma zur Herstellung der Cohn-Fraktion V verwendet wird. Ferner ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren in einem Aspekt die Bestimmung der Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Fraktionierung von Blutplasma zur Herstellung eines oder beider Kistler/Nitschmann-Präzipitate C verwendet wird.

[0038] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration eines Bereichs, der typischerweise während der Verdünnung oder Resuspendierung von Plasmafraktionen verwendet wird, einschliesslich einer oder aller Cohn-Fraktionen I, Cohn-Fraktion (I+)II+III, Cohn-Fraktion IV (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4) und Cohn-Fraktion V und anderer ähnlicher Fraktionsvarianten oder Präzipitate. Darüber hinaus ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Verdünnung oder Resuspendierung von Plasmafraktionen verwendet wird, einschliesslich eines oder aller Kistler/Nitschmann-Präzipitate A, Kistler/Nitschmann-Präzipitate B, Kistler/Nitschmann-Fraktion IV und Kistler/Nitschmann-Präzipitate C und anderer ähnlicher Fraktions- oder Präzipitatvarianten.

[0039] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration während der Resuspendierung einer oder aller Cohn-Fraktionen I, Cohn-Fraktion II+III, Cohn-Fraktion I+II+III oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat A oder anderer ähnlicher Fraktionen oder Präzipitate gemessen.

[0040] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration während der Resuspendierung von Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4oder einer anderen ähnlichen Fraktion oder eines Präzipitats) gemessen.

[0041] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration nach der Resuspendierung einer oder aller Cohn-Fraktionen I, Cohn-Fraktion II+III, Cohn-Fraktion I+II+III oder Kistler/Nitschmann-Fällungspaste A und vor einer Filtration (z.B. Klärfiltration) der resuspendierten Paste oder einer signifikanten Verringerung der Trübung der resuspendierten Paste gemessen.

[0042] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration nach der Resuspendierung der Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich der Cohn-Fraktion IV1, IV4oder einer anderen ähnlichen Fraktion oder eines Präzipitats) und vor einer Filtration (z.B. Klärfiltration) der resuspendierten Paste oder einer signifikanten Verringerung der Trübung der resuspendierten Paste gemessen.

[0043] In einer Ausführungsform wird die Cohn-Fraktion I, die Cohn-Fraktion (I+)II+III, die Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich der Cohn-Fraktion IV1, IV4oder einer anderen ähnlichen Fraktion oder eines Niederschlags), die Kistler/Nitschmann-Fällung A, die Kistler/Nitschmann-Fraktion IV oder die Kistler/Nitschmann-Fällung B oder eine andere ähnliche Fraktion oder ein ähnlicher Niederschlag durch Zugabe eines oder mehrerer Verdünnungsmittel, wie destilliertes Wasser, resuspendiert. In der Regel wird die Paste durch Zugabe eines oder mehrerer Verdünnungsmittel in einem Verhältnis des 1-7-Fachen des Gewichts der Fällungspaste resuspendiert. In einer Ausführungsform wird die Paste bei einer Temperatur unter 26°C resuspendiert, einschliesslich 25°C, 24°C, 23°C, 22°C, 21°C, 20°C, 19°C, 18°C, 17°C, 16°C, 15°C, 14°C, 13°C, 12°C, 11°C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C, 6°C, 5°C, 4°C, 3°C, 2°C, 1°C, 0°C, -1°C, -2°C, -3°C, -4°C, -5°C, -6°C, - 7°C oder -8°C. In einer Ausführungsform beträgt die Resuspendierungstemperatur <21°C.

[0044] In einer Ausführungsform liegt die Ethanolkonzentration in der resuspendierten Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion (I+)II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4oder anderer ähnlicher Fraktionen oder Präzipitate), Kistler/Nitschmann-Präzipitat A, Kistler/Nitschmann-Fraktion IV oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat B, oder andere ähnliche Fraktionen oder Präzipitate, Paste zwischen dem Bereich von etwa 2 % (w/w) bis etwa 30 % (w/w), etwa 2 % (w/w) bis etwa 20 % (w/w), etwa 5 % (w/w) bis etwa 30 % (w/w), etwa 5 % (w/w) bis etwa 20 % (w/w), etwa 5 % (w/w) bis etwa 15 % (w/w) oder etwa 5 % (w/w) bis etwa 10 % (w/w) liegt.

[0045] In einer Ausführungsform liegt die Proteinkonzentration in der resuspendierten Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion (I+)II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4oder anderer ähnlicher Fraktionen oder Präzipitate), Kistler/Nitschmann Präzipitat A, Kistler/Nitschmann Fraktion IV oder Kistler/Nitschmann Präzipitat B oder andere ähnliche Fraktionen oder Präzipitate, Paste liegt im Bereich von etwa 5% (w/w) bis etwa 15% (w/w), typischerweise etwa 10% (w/w) bis etwa 15% (w/w).

[0046] In einer Ausführungsform wird der resuspendierten Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion (I+)II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste (einschliesslich Cohn-Fraktion IV1, IV4oder anderer ähnlicher Fraktionen oder Präzipitate), Kistler/Nitschmann-Fällung A, Kistler/Nitschmann-Fraktion IV oder Kistler/Nitschmann-Fällung B oder anderer ähnlicher Fraktionen oder Präzipitate vor einem Filtrationsschritt (z. B. Klärfiltration) oder vor einer signifikanten Verringerung der Trübung der Paste Filterhilfe zugesetzt.z. B. Klärfiltration) oder vor einer signifikanten Verringerung der Trübung der resuspendierten Paste.

[0047] In einem Aspekt ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren die Bestimmung der Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Verdünnung oder Resuspendierung von Cohn-Fraktion V verwendet wird. Ferner ermöglichen die erfindungsgemässen Verfahren in einem Aspekt die Bestimmung der Ethanolkonzentration in einem Bereich, der typischerweise bei der Verdünnung oder Resuspendierung von Kistler/Nitschmann-Präzipitat C verwendet wird.

[0048] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration während der Resuspendierung von Cohn-Fraktion-V-Paste oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat-C-Paste gemessen.

[0049] In einer Ausführungsform wird die Gesamtprotein- oder Ethanolkonzentration nach der Resuspendierung der Cohn-Fraktion-V-Paste oder der Kistler/Nitschmann-Präzipitat-C-Paste und vor jeglicher Filtration (z.B. Klärfiltration) der resuspendierten Paste oder vor einer signifikanten Verringerung der Trübung der resuspendierten Paste gemessen.

[0050] In einer Ausführungsform wird die Cohn-Fraktion-V-Paste oder die Kistler/Nitschmann-Fällungspaste C durch Zugabe eines oder mehrerer Verdünnungsmittel, wie z.B. destilliertes Wasser, resuspendiert. Typischerweise wird die Cohn-Fraktion-V-Paste oder die Kistler/Nitschmann-Fällungspaste C durch Zugabe eines oder mehrerer Verdünnungsmittel in einem Verhältnis zwischen dem 1 bis 3-fachen des Gewichts der Fällungspaste resuspendiert. In einer Ausführungsform wird die Cohn Fraktion V Paste oder die Kistler/Nitschmann Fällungspaste C bei einer Temperatur unter 26°C, vorzugsweise bei oder unter 25°C, bei oder unter 24°C, bei oder unter 23°C, bei oder unter 22°C, bei oder unter 21 °C, bei oder unter 20°C, bei oder unter 19°C, bei oder unter 18°C, bei oder unter 17°C, bei oder unter 16°C, bei oder unter 15°C, bei oder unter 14°C, bei oder unter 13°C, bei oder unter 12°C, bei oder unter 11°C, bei oder unter 10°C, bei oder unter 9°C, bei oder unter 8°C, bei oder unter 7°C, bei oder unter 6°C, bei oder unter 5°C, bei oder unter 4°C, bei oder unter 3°C, bei oder unter 2°C, bei oder unter 1°C oder 0°C. In einer Ausführungsform beträgt die Resuspendierungstemperatur <21°C.

[0051] In einer Ausführungsform liegt die Ethanolkonzentration in der resuspendierten Cohn-Fraktion-V-Paste oder Kistler/Nitschmann-Fällungspaste C im Bereich von etwa 5 % (w/w) bis etwa 15 % (w/w), typischerweise etwa 5 % (w/w) bis etwa 10 % (w/w).

[0052] In einer Ausführungsform liegt die Proteinkonzentration in der resuspendierten Cohn-Fraktion-V-Paste oder Kistler/Nitschmann-Fällungspaste C im Bereich von etwa 5% (w/w) bis etwa 15% (w/w), typischerweise etwa 10% (w/w) bis etwa 15% (w/w).

[0053] In einer Ausführungsform wird der resuspendierten Paste der Cohn-Fraktion V oder der Kistler/Nitschmann-Paste des Präzipitats C vor einem Filtrationsschritt (z.B. Klärfiltration) oder vor einer signifikanten Verringerung der Trübung der resuspendierten Paste Filterhilfe zugesetzt.

[0054] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Konzentration von Gesamtprotein oder Immunglobulin G (IgG) während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion II+III, Cohn-Fraktion I+II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste, Kistler/Nitschmann-Präzipitat A oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat B-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Resuspendieren von Cohn Fraktion I, Cohn Fraktion II+III, Cohn Fraktion I+II+III, Cohn Fraktion IV Paste, Kistler/Nitschmann Präzipitat A oder Kistler/Nitschmann Präzipitat B Paste mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, um eine Reihe von Trainingsproben herzustellen, die unterschiedliche Gesamtprotein- oder IgG-Konzentrationen umfassen, wobei die Proben bekannte Konzentrationen an Gesamtprotein oder IgG aufweisen, – Bestrahlen der Trainingsproben mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit der bekannten Konzentration von Gesamtprotein oder IgG zu erhalten.

[0055] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Ethanolkonzentration während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion II+III, Cohn-Fraktion I+II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste, Kistler/Nitschmann-Präzipitat A oder Kistler/NitschmannPräzipitat B-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Resuspendieren von Cohn Fraktion I, Cohn Fraktion II+III, Cohn Fraktion I+II+III, Cohn Fraktion IV Paste, Kistler/Nitschmann Präzipitat A oder Kistler/Nitschmann Präzipitat B Paste mit einem geeigneten Verdünnungsmittel und Rühren, bis der Niederschlag gelöst ist, – gegebenenfalls schrittweise Zugabe von Ethanol zur Resuspendierung und Entnahme einer Trainingsprobe nach jeder schrittweisen Zugabe, um eine Reihe von Trainingsproben mit unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen zu erzeugen, wobei die Proben bekannte Ethanolkonzentrationen aufweisen, – Bestrahlen der Trainingsproben mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit der bekannten Konzentration des Ethanols zu erhalten.

[0056] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Ethanolkonzentration während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion I, Cohn-Fraktion II+III, Cohn-Fraktion I+II+III, Cohn-Fraktion IV-Paste, Kistler/Nitschmann-Präzipitat A oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat B-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Resuspendieren einer Cohn Fraktion I, Cohn Fraktion II+III, Cohn Fraktion I+II+III, Cohn Fraktion IV Paste, Kistler/Nitschmann Präzipitat A oder Kistler/Nitschmann Präzipitat B Paste mit einem geeigneten Verdünnungsmittel und Rühren, bis der Niederschlag aufgelöst ist, – Bestrahlen der Resuspendierung mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich; – gegebenenfalls schrittweise Zugabe von Ethanol zur Resuspendierung und Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion nach jedem Schritt der Ethanolzugabe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit bekannten Ethanolkonzentrationen herzustellen.

[0057] Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Gesamtprotein, IgG oder Ethanol während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion I-, Cohn-Fraktion II+III-, Cohn-Fraktion I+II+III-, Cohn-Fraktion IV-Paste, Kistler/Nitschmann-Präzipitat A- oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat B-Paste beschrieben, zur Reinigung von Albumin beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Bestrahlen einer Testprobe, die zu einem Zeitpunkt während oder nach Abschluss der Resuspendierung der Paste in einem geeigneten Verdünnungsmittel erhalten wird, mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Testwellenlängenspektren, – Vergleich der Testwellenlängenspektren mit einem Referenzdatensatz in Form eines Modells, das unter Verwendung einer multivariaten Analyse von verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen von Gesamtprotein, Albumin oder Ethanol erzeugt wurde, um die Konzentration des Gesamtproteins, Albumins oder Ethanols in der Testprobe zu bestimmen.

[0058] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Konzentration von Gesamtprotein oder Albumin während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion-V-Paste oder einer Kistler/Nitschmann-Präzipitat-C-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: - Resuspendieren von Cohn Fraction V Paste oder Kistler/Nitschmann Precipitate C Paste mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, um eine Reihe von Trainingsproben mit unterschiedlichen Gesamtprotein- oder Albumin-Konzentrationen herzustellen, wobei die Proben bekannte Konzentrationen an Gesamtprotein oder Albumin aufweisen, – Bestrahlen der Trainingsproben mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit der bekannten Konzentration von Gesamtprotein oder Albumin zu erhalten.

[0059] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Konzentration von Ethanol während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion-V-Paste oder einer Kistler/Nitschmann-Fällungs-C-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Resuspendieren der Paste Cohn Fraktion V oder der Paste Kistler/Nitschmann Präzipitat C mit einem geeigneten Verdünnungsmittel und Rühren, bis der Niederschlag gelöst ist, – gegebenenfalls schrittweise Zugabe von Ethanol zur Resuspendierung und Entnahme einer Trainingsprobe nach jeder schrittweisen Zugabe, um eine Reihe von Trainingsproben mit unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen zu erzeugen, wobei die Proben bekannte Ethanolkonzentrationen aufweisen, – Bestrahlen der Trainingsproben mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit der bekannten Konzentration des Ethanols zu erhalten.

[0060] Es wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Modells zur Bestimmung der Konzentration von Ethanol während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion-V-Paste oder einer Kistler/Nitschmann-Fällungs-C-Paste beschrieben, wobei das Verfahren umfasst: – Resuspendieren der Paste Cohn Fraktion V oder der Paste Kistler/Nitschmann Präzipitat C mit einem geeigneten Verdünnungsmittel und Rühren, bis der Niederschlag gelöst ist, – Bestrahlen der Resuspendierung mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich; – gegebenenfalls schrittweise Zugabe von Ethanol zur Resuspendierung und Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion nach jedem Schritt der Ethanolzugabe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Trainingswellenlängenspektren, – Auswahl interessanter Spektralbereiche in den Trainingswellenlängenspektren; – gegebenenfalls Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung; – Erstellung eines Modells durch Anwendung einer multivariaten Analyse auf die Spektren, um eine Korrelation mit bekannten Ethanolkonzentrationen herzustellen.

[0061] In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Gesamtprotein, Albumin oder Ethanol während oder nach der Resuspendierung einer Cohn-Fraktion-V-Paste oder einer Kistler/Nitschmann-Präzipitat-C-Paste zur Reinigung von Albumin bereit, wobei das Verfahren umfasst: – Bestrahlen einer Testprobe, die zu einem Zeitpunkt während oder nach Abschluss der Resuspendierung der Paste in einem geeigneten Verdünnungsmittel erhalten wird, mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich, zur Erzeugung von Testwellenlängenspektren, – Vergleich der Testwellenlängenspektren mit einem Referenzdatensatz in Form eines Modells, das unter Verwendung einer multivariaten Analyse von verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen von Gesamtprotein, Albumin oder Ethanol erzeugt wurde, um die Konzentration des Gesamtproteins, Albumins oder Ethanols in der Testprobe zu bestimmen.

[0062] In einem Aspekt enthalten die Trainingsproben Analytkonzentrationen über den Konzentrationsbereich für die Bestimmung der Testprobe. Wenn beispielsweise die mögliche Konzentration eines Analyten in einer Testprobe innerhalb eines Bereichs von X g/kg bis Y g/kg liegt, dann umfassen die Trainingsproben Konzentrationen des Analyten bei und zwischen X g/kg und Y g/kg.

[0063] In einem Aspekt werden die Trainingsproben und die Testprobe einer Lichtquelle im Nahinfrarotbereich bei einer Temperatur im Bereich von etwa -8°C bis etwa 37°C oder -8°C bis 37°C ausgesetzt. In der Regel liegt die Temperatur im Bereich von etwa 10 °C bis etwa 37 °C, vorzugsweise im Bereich von etwa 15 °C bis etwa 30 °C. Die Temperatur kann etwa 15 °C, etwa 16 °C, etwa 17 °C, etwa 18 °C, etwa 19 °C, etwa 20 °C, etwa 21 °C, etwa 22 °C, etwa 23 °C, etwa 24 °C, etwa 25 °C, etwa 26 °C, etwa 27 °C, etwa 28 °C, etwa 29 °C oder etwa 30 °C betragen. In einer Ausführungsform beträgt die Temperatur 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C oder 24 °C.

[0064] In einem Aspekt wird die Lichtquelle im Nahinfrarotbereich mit Hilfe einer Sonde, die Licht mit Wellenlängen im Nahinfrarotbereich emittieren kann, auf die Trainingsproben und/oder die Testprobe angewendet. Optional ist die Sonde so konfiguriert, dass sie in ein industrielles Gerät zum Mischen, Filtrieren oder Reinigen von Proteinen eingebaut werden kann, einschliesslich der Verwendung zur Inline-Messung der Reflexion, der Transmission oder der Transflexion der Trainingsproben über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotbereich.

[0065] In einem Aspekt bestrahlt die Lichtquelle die Trainingsproben und/oder die Testprobe mit Licht im Nahinfrarotbereich während des Mischens dieser Proben. Die Lichtquelle kann in einem Winkel auf die Probe(n) gerichtet werden, der parallel zur Richtung des Flüssigkeitsstroms während des Mischens der Probe(n) verläuft. Alternativ kann die Lichtquelle während des Mischens der Probe(n) in einem Winkel auf die Probe(n) gerichtet werden, der nicht parallel zur Richtung des Flüssigkeitsstroms verläuft, z.B. kann die Lichtquelle während des Mischens der Probe(n) in einem Winkel von 45° oder etwa 45° zur Richtung des Flüssigkeitsstroms auf die Probe(n) gerichtet werden.

[0066] In einem Aspekt kann die Qualität des erstellten Modells anhand der folgenden statistischen Parameter beurteilt werden: • Anzahl der latenten Variablen (PLS-Faktoren) im Modell, • Bias, • RMSECV, • RMSEP für unabhängige Testproben, • R<2>, und/oder • RPD-Wert.

[0067] In einem Aspekt wird die den Analyten enthaltende Probe aus der Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma gewonnen, einschliesslich jeder aus Blut, vorzugsweise menschlichem Blut, gewonnenen Plasmaprobe. In bestimmten Ausführungsformen wird die Probe aus der Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma gewonnen oder abgeleitet, das frisches Plasma, kryoarmes Plasma oder kryoreiches Plasma umfasst. Mit anderen Worten kann die Quelle des Plasmas Blut, vorzugsweise menschliches Blut, vorzugsweise Frischplasma, kryoarmes Plasma oder kältereiches Plasma sein. Das Plasma kann aus einer Reihe von Spenden und/oder Probanden gewonnen und gepoolt werden. Bei dem Plasma kann es sich um Hyperimmunplasma handeln.

[0068] In einem Aspekt handelt es sich bei der Probe, die den Analyten enthält, um eine Resuspendierung eines Präzipitats oder einer Paste, die aus Blutplasma gewonnen wurde, wie hierin weiter beschrieben.

[0069] In einem Aspekt enthält die Probe Oktansäure. Daher enthält die octansäurehaltige Probe auch aus Blut gewonnenes Plasma oder wird durch die Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma gewonnen oder abgeleitet.

[0070] In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Probe, die den Analyten enthält, eine Blutplasmafraktion (Zwischenprodukt). In besonderen Ausführungsformen ist die Fraktion eine Cohn-Fraktion. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmafraktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cohn-Fraktion I (Fr I), Cohn-Fraktion II+III (Fr II+III), Cohn-Fraktion I+II+III (Fr I+II+III), Cohn Fraktion II (Fr II), Cohn Fraktion III (Fr III), Cohn Fraktion IV (Fr IV), Cohn Fraktion V (Fr V), Kistler/Nitschmann Präzipitat A, Kistler/Nitschmann Präzipitat B, Kistler/Nitschmann Präzipitat C. In einer anderen Ausführungsform ist die Plasmafraktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cohn Fraktion I (Fr I), Cohn Fraktion II+III (Fr ll+III), Cohn Fraktion I+II+III (Fr I+II+III) oder Kistler/Nitschmann Präzipitat A (KN A, PPT A oder Fr A). Die Plasmafraktion kann eine Kombination aus verschiedenen Fraktionen sein. Zum Beispiel kann die Plasmafraktion eine Kombination aus KN A und einer oder mehreren der Fraktionen Fr I, Fr II+III und Fr I+II+III sein.

[0071] In einem Aspekt kann die Probe, die den Analyten enthält, Filterhilfsmittel (z.B. Kieselgur und Perlit oder Zellulose oder Kieselgel) enthalten.

[0072] In einem Aspekt ist die Probe, die den Analyten enthält, eine trübe Lösung oder Suspension. In einer Ausführungsform kann die trübe Lösung oder Suspension einen nephelometrischen Trübungswert (NTU) von gleich oder grösser als 10 NTU, gleich oder grösser als 15 NTU, gleich oder grösser als 20 NTU, gleich oder grösser als 25 NTU, gleich oder grösser als 30 NTU, gleich oder grösser als 35 NTU, gleich oder grösser als 40 NTU, gleich oder grösser als 45 NTU, gleich oder grösser als 50 NTU, gleich oder grösser als 55 NTU, gleich oder grösser als 60 NTU, gleich oder grösser als 65 NTU, gleich oder grösser als 70 NTU, gleich oder grösser als 75 NTU, gleich oder grösser als 80 NTU, gleich oder grösser als 85 NTU, gleich oder grösser als 90 NTU, gleich oder grösser als 95 NTU, gleich oder grösser als 100 NTU, gleich oder grösser als 150 NTU, gleich oder grösser als 200 NTU, gleich oder grösser als 250 NTU, gleich oder grösser als 300 NTU, gleich oder grösser als 350 NTU, gleich oder grösser als 400 NTU, gleich oder grösser als 450 NTU, gleich oder grösser als 500 NTU, gleich oder grösser als 550 NTU, gleich oder grösser als 600 NTU, gleich oder grösser als 650 NTU, gleich oder grösser als 700 NTU, gleich oder grösser als 750 NTU, gleich oder grösser als 800 NTU, gleich oder grösser als 850 NTU, gleich oder grösser als 900 NTU, gleich oder grösser als 950 NTU, gleich oder grösser als 1.000 NTU, gleich oder grösser als 1.500 NTU, gleich oder grösser als 2.000 NTU, gleich oder grösser als 2.500 NTU, gleich oder grösser als 3.000 NTU, gleich oder grösser als 3.500 NTU, gleich oder grösser als 4.000 NTU, gleich oder grösser als 4.500 NTU, gleich oder grösser als 5.000 NTU, gleich oder grösser als 5.500 NTU, gleich oder grösser als 6.000 NTU, gleich oder grösser als 6.500 NTU, gleich oder grösser als 7.000 NTU, gleich oder grösser als 7.500 NTU, gleich oder grösser als 8.000 NTU, gleich oder grösser als 8.500 NTU, gleich oder grösser als 9.000 NTU, gleich oder grösser als 9.500 NTU, oder gleich oder grösser als 10.000 NTU aufweisen. In einer Ausführungsform kann die trübe Lösung oder Suspension einen NTU-Wert von 10 NTU bis 100 NTU, 10 NTU bis 90 NTU, 10 NTU bis 80 NTU, 10 NTU bis 70 NTU, 10 NTU bis 60 NTU, 10 NTU bis 50 NTU, 10 NTU bis 40 NTU, 10 NTU bis 30 NTU, 10 NTU bis 20 NTU, 20 NTU bis 100 NTU, 30 NTU bis 100 NTU, 40 NTU bis 100 NTU, 50 NTU bis 100 NTU, 60 NTU bis 100 NTU, 70 NTU bis 100 NTU, 80 NTU bis 100 NTU, oder 90 NTU bis 100 NTU aufweisen. In einer Ausführungsform kann die trübe Lösung eine maximale NTU von 10.000 NTU, 9.500 NTU, 9.000 NTU, 8.500 NTU, 8.000 NTU, 7.500 NTU, 7.000 NTU, 6.500 NTU, 6.000 NTU, 5.500 NTU, 5.000 NTU, 4.500 NTU, 4.000 NTU, 3.500 NTU, 3,000 NTU, 2.500 NTU, 2.000 NTU, 1.500 NTU, 1000 NTU, 950 NTU, 900 NTU, 850 NTU, 800 NTU, 750 NTU, 700 NTU, 650 NTU, 600 NTU, 550 NTU, 500 NTU, 450 NTU, 400 NTU, 350 NTU, 300 NTU, 250 NTU, 200 NTU, 150 NTU, 100 NTU oder 50 NTU aufweisen.

[0073] In einem Aspekt oder einer Ausführungsform werden beliebige oder alle Schritte des Verfahrens Inline, at-line, off-line und/oder on-line durchgeführt.

[0074] Fachleute wissen, dass Plasmafraktionierungsverfahren in gewissem Masse anpassungsfähig sind und im Laufe der Jahre optimiert und variiert wurden, um z.B. verschiedenen Herstellern und unterschiedlichen Produktprofilzielen gerecht zu werden. Ein Beispiel für eine solche Modifikation ist das Vorhandensein oder Fehlen des Cohn-Fraktionierungsschritts IV-1, der zur Extraktion von Alpha-1-Antitrypsin verwendet werden kann. Es versteht sich also von selbst, dass die hierin beschriebenen Methoden und Produkte mit Modifikationen und Variationen von Humanplasmafraktionierungsverfahren durchgeführt werden können und dass solche Modifikationen und Variationen in den Anwendungsbereich dieser Offenbarung fallen.

[0075] In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Trainingsproben einen repräsentativen Satz von Proben, die verschiedene Variablen abdecken, wie z.B. verschiedene Pastentypen, Probentemperaturen, Gerätevariabilität, Bedienerhandhabung, Rohmaterialien und Plasmaquellen.

[0076] Sofern der Kontext nichts anderes erfordert, sind der Begriff „umfassen“ und Abwandlungen des Begriffs, wie z.B. „umfassend“, „umfasst“ und „enthaltend“, nicht so zu verstehen, dass weitere Zusatzstoffe, Bestandteile, ganze Zahlen oder Schritte ausgeschlossen werden.

[0077] Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung und weitere Ausführungsformen der in den vorangehenden Abschnitten beschriebenen Aspekte werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich, die beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen gegeben wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

[0078] Abbildung 1: Oben: NIR-Rohspektren eines Trainingssatzes, gemessen mit der Transflexions- (schwarz) und Reflexionssonde (grau). Unten: Vorbehandelte (vektoriell normalisierte + 1. Ableitung) Spektren. Abbildung 2a: Grafische Zusammenfassung von Modgen; durch NIR vorhergesagte Proteinkonzentration (y-Achse) vs. Referenzproteinkonzentration (Dumas; x-Achse) in g/kg. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = tatsächlicher Wert (Steigung = 1). Die Werte b-r auf der X-Achse repräsentieren einen Bereich von 16 g/kg. Die Werte b-k auf der Y-Achse stellen einen Bereich von 18 g/kg dar. Abbildung 2b: Grafische Zusammenfassung von Modiab; durch NIR vorhergesagte Proteinkonzentration (y-Achse) vs. Referenzproteinkonzentration (Dumas; x-Achse) in g/kg. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = tatsächlicher Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse b-o repräsentieren einen Bereich von 26 g/kg. Die Werte auf der Y-Achse a-g repräsentieren einen Bereich von 30 g/kg. Abbildung 3: Durchschnittliche Proteinkonzentrationen der Proben im Testreihe, vorhergesagt durch Modgen[in g/kg]. Die Werte auf der X-Achse a-h repräsentieren einen Bereich von 14 g/kg. Die Werte auf der Y-Achse a-d stellen einen Bereich von 15 g/kg dar. Abbildung 4: NIR-Spektren beim Resuspendieren von Präzipitat A (Fr A oder PPT A) bei 20 °C. A. Rohspektren. B. 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren. Grau: Zugabe von Paste, bis die Temperatur 20 °C erreicht; schwarz: Resuspendierung. C. Vorhergesagte Proteinkonzentration [in g/kg] unter Verwendung des NIR-basierten Modells im Vergleich zur Proteinkonzentration, die nach Dumas zwischen 2 und 24 Stunden nach der Resuspendierung bestimmt wurde. Abbildung 5: NIR-Spektren beim Resuspendieren der Cohn-Fraktionen I+II+III (Fr I+II+III) bei 20 °C. A. Rohspektren. B. 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren. Grau: Zugabe von Paste, bis die Temperatur 20 °C erreicht; schwarz: Resuspendierung. C. Vorhergesagte Proteinkonzentration [in g/kg] unter Verwendung des NIR-basierten Modells im Vergleich zur Proteinkonzentration, die nach Dumas zwischen 2 und 24 Stunden nach der Resuspendierung bestimmt wurde. Abbildung 6: NIR-Spektren beim Resuspendieren der Cohn-Fraktionen II+III (Fr II+III) bei 20 °C. A. Rohspektren. B. 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren. Grau: Zugabe von Paste, bis die Temperatur 20 °C erreicht; schwarz: Resuspendierung. C. Vorhergesagte Proteinkonzentration [in g/kg] unter Verwendung des NIR-basierten Modells im Vergleich zur Proteinkonzentration, die nach Dumas zwischen 2 und 24 Stunden nach der Resuspendierung bestimmt wurde. Abbildung 7: 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren nach Modellcompüber die Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab von Cohn-Fraktion (I+)II+III und Cohn-Fraktion IV. Abbildung 8: Vorhergesagte Ethanolkonzentration mit dem NIR-basierten Modellcompim Vergleich zur theoretischen Ethanolkonzentration [in % v/v]. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = wahrer Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse a-j repräsentieren einen Bereich von 45 %. Die Werte b-g auf der Y-Achse entsprechen einem Bereich von 50 %. Abbildung 9: 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren nach ModelI+II+IIIüber Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab der Cohn-Fraktion (I+)II+III. Abbildung 10: Vorhergesagte Ethanolkonzentration mit NIR-basiertem ModelhI+II+IIIim Vergleich zur theoretischen Ethanolkonzentration [in % v/v]. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = wahrer Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse ag repräsentieren einen Bereich von 30 %. Die Werte auf der Y-Achse b-h stellen einen Bereich von 30 % dar. Abbildung 11: 1. 1. Ableitung + Vektornormierung vorbehandelte Spektren nach ModellIVüber Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab von Cohn-Fraktion IV. Abbildung 12: Vorhergesagte Ethanolkonzentration mit dem NIR-basierten ModellIVim Vergleich zur theoretischen Ethanolkonzentration [in % v/v]. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = wahrer Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse a-j repräsentieren einen Bereich von 18 %. Die Werte auf der Y-Achse a-j entsprechen einer Spanne von 18 %. Abbildung 13: NIR-Rohspektren des für ModellAlbresuspverwendeten Trainingssatzes. Abbildung 14: Grafische Zusammenfassung von ModellAlbresusp; durch NIR vorhergesagte Proteinkonzentration (y-Achse) vs. Referenzproteinkonzentration (Dumas; x-Achse) in g/kg. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = tatsächlicher Wert (Steigung = 1). Die Werte b-k auf der X-Achse repräsentieren einen Bereich von 45 g/kg. Die Werte b-k auf der Y-Achse stellen einen Bereich von 45 g/kg dar. Abbildung 15: Vorhergesagte Proteinkonzentration des unabhängigen Testreihees mit ModellAlbresusp(y-Achse) im Vergleich zur Referenzproteinkonzentration (Dumas; x-Achse) in g/kg. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = tatsächlicher Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse a-e repräsentieren einen Bereich von 20 g/kg. Die Werte b-e der Y-Achse repräsentieren einen Bereich von 15 g/kg. Abbildung 16: Vorbehandelte (1<st>Ableitung) NIR-Rohspektren des für das ModellEtOHverwendeten Trainingssatzes. Abbildung 17: A) Grafische Zusammenfassung des ModellEtOH; durch NIR vorhergesagte Ethanolkonzentration (y-Achse) im Vergleich zur Referenz-Ethanolkonzentration (x-Achse) in %w/w. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = wahrer Wert (Steigung = 1). Die Werte b-f auf der X-Achse repräsentieren einen Bereich von 4 % w/w. Die Werte b-f auf der Y-Achse stellen einen Bereich von 4 % w/w dar. B) Vorhergesagte Ethanolkonzentration des unabhängigen Testreihees unter Verwendung des ModellEtOH(y-Achse) im Vergleich zur Referenz-Ethanolkonzentration (x-Achse) in %w/w. Jedes Spektrum wird durch einen einzelnen Datenpunkt dargestellt. Durchgehende schwarze Linie: vorhergesagter Wert = wahrer Wert (Steigung = 1). Die Werte auf der X-Achse b-h repräsentieren einen Bereich von 6 % w/w. Die Werte auf der Y-Achse c-g stellen einen Bereich von 4 % w/w dar. Abbildung 18: Echtzeit-Vorhersage der Ethanolkonzentration während der Resuspendierung von Kistler-Nitschmann-Fällungsprodukt C (Quadrate, 2 Durchläufe) und Cohn-Fällungsprodukt V (Kreuze) mittels Inline-NIRS unter Verwendung des ModellEtOH. Die Werte auf der Y-Achse a-d repräsentieren einen Bereich von 6%w/w.

Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen

[0079] Es wird nun im Detail auf bestimmte Ausführungsformen der Erfindung eingegangen. Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit den Ausführungsformen beschrieben wird, soll die Erfindung nicht auf diese Ausführungsformen beschränkt werden. Im Gegenteil, die Erfindung soll alle Alternativen, Modifikationen und Äquivalente abdecken, die in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung gemäss der Definition in den Ansprüchen einbezogen werden können.

[0080] Der Fachmann kennt viele Methoden und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind und die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf die beschriebenen Verfahren und Materialien beschränkt. Es versteht sich, dass die in dieser Beschreibung offenbarte und definierte Erfindung sich auf alle alternativen Kombinationen von zwei oder mehr der erwähnten oder aus dem Text oder den Zeichnungen ersichtlichen Einzelmerkmale erstreckt. Alle diese unterschiedlichen Kombinationen stellen verschiedene alternative Aspekte der Erfindung dar.

[0081] Alle Patente und Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wird, sind durch Verweis in ihrer Gesamtheit einbezogen.

[0082] Für die Zwecke der Auslegung dieser Spezifikation schliessen die im Singular verwendeten Begriffe auch den Plural ein und umgekehrt.

[0083] Aufgrund der Heterogenität von aus Plasma gewonnenen Produktlösungen und -suspensionen ist die Quantifizierung wichtiger chemischer Komponenten wie Proteine oder Alkohol (z.B. Ethanol) komplex und konnte bisher nur mit Hilfe von Offline-Analysemethoden erfolgen. Dies kann sich erheblich auf die Effizienz des Prozesses auswirken.

[0084] Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, einige der Unzulänglichkeiten früherer Ansätze zur Verarbeitung von Plasmaprodukten zu beheben, indem Inline-Systeme zur Bestimmung der Konzentration verschiedener Analyten in komplexen Lösungen während der Blutplasmaverarbeitung bereitgestellt werden. Die Methoden der vorliegenden Erfindung haben den Vorteil, dass sie die Effizienz der nachgeschalteten Prozesse verbessern, den Abfall reduzieren und/oder die Ausbeute des Endprodukts verbessern.

[0085] Der Ansatz ermöglicht auch die Quantifizierung von Analyten in verschiedenen Ausgangsmaterialien, die bei der Herstellung von Blutplasmaprodukten verwendet werden, ohne vorherige Probenvorbereitung, wie sie bei den derzeitigen Inline-Verfahren erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil der Methoden der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit, den Verlauf der Produktverarbeitung (z.B. Resuspendierung) und anderer Reaktionen in Echtzeit zu überwachen, was zu einer Reduzierung der Zykluszeit führt. Die hierin definierte Erfindung wurde auf die Produktion im Produktionsmassstab angewandt, um die Analytkonzentration zu bestimmen.

Definitionen

[0086] Der Begriff „aus der Verarbeitung von Blutplasma gewonnene Probe“ bezieht sich auf jedes Material, insbesondere proteinhaltiges Material, das aus der Fraktionierung oder Verarbeitung von Blutplasma stammt. Bei der Probe kann es sich um eine Suspension, ein Konzentrat oder ein Filtrat eines „proteinhaltigen Präzipitats“ handeln, wobei das „proteinhaltige Präzipitat“ aus Blutplasma gewonnen wird.

[0087] Es wird deutlich, dass die Proben (einschliesslich der Testprobe), die gemäss den hier beschriebenen Methoden analysiert werden, keine „isolierten“ Proben sein müssen. Mit anderen Worten, der Begriff „Probe“ soll einfach einen kleinen Teil oder eine kleine Menge eines grösseren Ganzen oder einer grösseren Menge bezeichnen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen daher At-Line-, Inline- und Off-Line-Verfahren umfassen, bei denen die Lichtquelle im hinteren Infrarotspektrum auf einen kleinen Teil einer grösseren Gesamtlösung angewendet wird und bei denen die Lichtquelle auf den kleinen Teil der Gesamtlösung in situ oder auf ein Aliquot der Lösung angewendet werden kann, das aus der grösseren Gesamtlösung entfernt (isoliert) wurde.

[0088] Der hier verwendete Begriff „Inline“ bezieht sich auf eine Analysemethode, bei der eine Sonde, eine Probenahmeschnittstelle oder ein Sensor (z.B. zur Bereitstellung einer Lichtquelle im nahen Infrarotspektrum) direkt in einem Prozessbehälter oder in einer Linie mit einem Strom von fliessendem Material platziert werden kann, um die Analyse durchzuführen. Das Verfahren kann die Platzierung einer Sonde in einem Strömungssystem oder in einem Bioreaktor beinhalten. Ein solches Verfahren kann eine Analyse ermöglichen, ohne dass die Sonde oder irgendwelche Materialien oder Proben aus der Masse entfernt werden müssen (d.h. die Probe bleibt für die Analyse „in situ“).

[0089] Der Begriff „online“ bezieht sich hier auf eine Analysemethode, bei der das Material oder die Proben nicht aus der Schüttung entnommen werden müssen. Es kann jedoch eine Trennung von der Hauptprozesslinie und die Durchführung von Messungen an einem Teil des Schüttguts erforderlich sein. Dies kann durch Hinzufügen einer Probenahmeschleife erreicht werden, die eine Probe des Schüttguts zur Sonde oder zum Sensor leitet, wobei die abgeleitete Probe je nach Anwendung wieder in den Prozessstrom, den Materialfluss oder das Schüttgut eingeleitet oder entsorgt werden kann.

[0090] Der hier verwendete Begriff „at-line“ bezieht sich auf eine Methode, die eine manuelle Probenahme mit anschliessender diskontinuierlicher Probenvorbereitung, Messung und Auswertung umfasst. Bei der At-Line-Messung wird die Analyse in der Regel am oder in der Nähe des Prozessstroms, des Materialflusses oder des Schüttguts durchgeführt.

[0091] Der hier verwendete Begriff „off-line“ bezieht sich auf eine Methode, die den grössten physikalischen Unterschied zwischen dem Prozessstrom, dem Fluss oder der Materialmasse und der Analyse der Probe beinhaltet. Ähnlich wie bei der At-Line-Messung wird bei der Off-Line-Messung eine Analyseprobe aus dem grösseren Materialstrom entnommen. Bei der Offline-Analyse werden in der Regel die Probe oder manchmal auch mehrere Proben entnommen, um sie in einem offiziellen Labor zu analysieren.

[0092] Der Begriff „eiweisshaltiges Präzipitat“ bezieht sich auf jedes gefällte Material, das ein Protein enthält und aus Blutplasma stammt. Dieser Begriff kann sich auf Plasma, Serum, aus Plasma oder Serum hergestellte Präzipitate beziehen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht er sich in der Regel auf Präzipitate aus Plasma, wie z. B. Cohn- oder Oncley-Ethanol-Präzipitate oder Kistler-Nitschmann-Präzipitate.

[0093] Der Bestimmungskoeffizient „R<2>“ gibt an, wie viel Prozent der Varianz durch das Vorhersagemodell erklärt wird. Je höher der Koeffizient ist, desto besser ist die Korrelation zwischen den Referenzdaten und den Spektraldaten.

[0094] Wie hier verwendet, ist „Bias“ die systematisch gemittelte Abweichung zwischen den Referenzwerten und den vorhergesagten Werten.

[0095] Bei der hier verwendeten „Kreuzvalidierung“ (auch als interne Validierung bezeichnet) werden einzelne (vom Benutzer definierte) ausgelassene Proben aus dem Kalibrierungs- oder Trainingssatz entfernt. Unter Verwendung der verbleibenden Proben wird ein chemometrisches Modell erstellt und zur Vorhersage der zuvor extrahierten Probe verwendet. Ein Vergleich der vorhergesagten mit den durch die Referenzmethode ermittelten tatsächlichen Werten zeigt, wie gut das Modell die Proben vorhersagt.

[0096] „(Regression) der partiellen kleinsten Quadrate“ ist ein statistisches Verfahren, bei dem die Prädiktoren auf eine kleinere Menge unkorrelierter Komponenten reduziert werden und eine Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate auf diese Komponenten anstatt auf die ursprünglichen Daten durchgeführt wird.

[0097] Der hier verwendete Begriff „RMSECV“ steht für „root mean square error of cross validation“ und ist ein quantitatives Mass für die Vorhersagefähigkeit des Modells während der Kreuzvalidierung. Der RMSECV ist vergleichbar mit dem RMSEP für die externe Validierung unter Verwendung eines unabhängigen Probensatzes.

[0098] Der hier verwendete „RMSEP“ (root mean square error of prediction) ist ein quantitatives Mass für die Vorhersagefähigkeit des Modells während der externen Validierung unter Verwendung eines unabhängigen Testreihees von Stichproben. Der RMSEP ist vergleichbar mit dem RMSECV für die Kreuzvalidierung.

[0099] Wie hier verwendet, ist „RPD“ das Verhältnis von Standardabweichung (SD) und Standardfehler der Vorhersage (SEP).

[0100] Die Standardabweichung kann bestimmt werden durch:

[0101] Wie hier verwendet, ist „SEP“ der „Standardfehler der Vorhersage“, d.h. der um den Bias korrigierte RMSEP.

Proben mit Analyten

[0102] Die Verfahren der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Bestimmung der Menge oder Konzentration verschiedener Analyten, die in Blutplasma, Fraktionen oder in Derivaten oder Resuspendierungen von daraus gefälltem Material vorhanden sind. Typischerweise umfasst der zu bestimmende Analyt das Gesamtprotein, kann aber auch andere in den Proben vorhandene Komponenten umfassen, einschliesslich Alkohol (z.B. Ethanol). Bei dem Analyten kann es sich um einen Zusatzstoff handeln, d.h. um eine exogene Komponente, die während des Prozesses hinzugefügt wird und die nicht von Natur aus im Blutplasma vorkommt.

[0103] Bei dem Plasma kann es sich um Frischplasma, „normales“ Plasma, „Hyperimmun“-Plasma, kryoarmes Plasma (auch als Kryosupernatant bezeichnet) oder kryoreiches Plasma handeln. Optional wurde das Plasma behandelt, um Bestandteile wie C1-Inhibitor, PCC (Prothrombinkomplexkonzentrat) und/oder AT-III zu entfernen. Das Plasma kann aus einer Reihe von Spenden und/oder Personen stammen und gepoolt werden.

[0104] Der Begriff „Kryosupernatant“ (auch „kryoarmes Plasma“, „kryopräzipitatarmes Plasma“ u. ä.) bezieht sich auf Plasma (aus Vollblutspenden oder Plasmapherese), aus dem das Kryopräzipitat entfernt wurde. Die Kryopräzipitation ist der erste Schritt bei den meisten heute verwendeten Plasmaproteinfraktionierungsmethoden für die grosstechnische Herstellung von Plasmaproteintherapeutika. Bei dieser Methode wird in der Regel gefrorenes Plasma zusammengeführt, das unter kontrollierten Bedingungen (z.B. bei oder unter 6 °C) aufgetaut wird, und das Präzipitat wird dann entweder durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen. Die überstehende Fraktion, die dem Fachmann als „Kryosupernatant“ bekannt ist, wird im Allgemeinen zur Verwendung aufbewahrt. Das daraus resultierende kryoarme Plasma hat einen reduzierten Gehalt an Faktor VIII (FVIII), von Willebrand-Faktor (VWF), Faktor XIII (FXIII), Fibronektin und Fibrinogen. Kryosupernatant ist ein gängiges Ausgangsmaterial für die Herstellung einer Reihe von therapeutischen Proteinen, darunter Alpha-1-Antitrypsin (AAT), Apolipoprotein A-I (APO), Antithrombin III (ATIII), der Prothrombinkomplex mit den Gerinnungsfaktoren (II, VII, IX und X), Albumin (ALB) und Immunglobuline wie Immunglobulin G (IgG).

[0105] Der Begriff „kryoreiches Plasma“ bezieht sich auf Plasma (aus Vollblutspenden oder Plasmapherese), das eingefroren und dann aufgetaut wurde, aus dem aber das Kryopräzipitat nicht entfernt wurde.

[0106] Wenn das Plasma für den Transport von einem Entnahmeort eingefroren wurde, wird das gefrorene Plasma aufgetaut und dann vor der Zentrifugation in einem Pooling-Tank gesammelt. Das Kryopräzipitat wird durch kontinuierliche Zentrifugation entfernt. Das kryoabgereicherte Plasma kann in einen Edelstahlfraktionierungstank gepumpt und für prozessbegleitende Kontrollen beprobt werden.

[0107] Bei dem Plasma kann es sich um Hyperimmunplasma handeln, unabhängig davon, ob es von mehr als einer oder mehreren hundert Personen oder von einer einzelnen Person gewonnen wurde. So kann das Plasma beispielsweise aus dem Blut von Personen gewonnen werden, die eine Immunreaktion auf eine Infektion gezeigt haben und sich davon erholt haben (und daher ansonsten gesund sind).

[0108] Die Probe, die den interessierenden Analyten enthält, kann ein Präzipitat oder eine Fraktion sein, die aus der Verarbeitung von Blutplasma stammt. Zur selektiven Ausfällung von Proteinen aus einer Lösung können viele verschiedene Verfahren eingesetzt werden, beispielsweise durch Zugabe von Salzen, Alkoholen und/oder Polyethylenglykol in Kombination mit einer pH-Einstellung und/oder einem Kühlschritt. Es ist daher davon auszugehen, dass die vorliegende Erfindung auf die meisten Proteinpräzipitate, wie z. B. Immunglobulin G-haltige Proteinpräzipitate, anwendbar ist, unabhängig davon, wie sie ursprünglich hergestellt wurden. Es sei darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung auch bei der Abtrennung anderer Proteinarten, einschliesslich Albumin, Immunglobulinen (Ig) wie IgA, IgD, IgE oder IgM, angewendet werden kann, und zwar entweder jede Art von Immunglobulin allein oder eine Mischung davon. Es ist vorgesehen, dass auch rekombinante Proteine in dieser Hinsicht geeignet sind.

[0109] Bei der Probe kann es sich um ein beliebiges IgG- oder albuminhaltiges Material handeln (z.B. in Form einer Paste, eines Präzipitats oder von Einschlusskörpern) oder um ein Ausgangsmaterial wie eine Lösung, aus der das IgG oder Albumin beispielsweise durch eines oder mehrere der oben erläuterten Verfahren ausgefällt werden kann, sei es aus Plasma oder Serum menschlichen oder tierischen Ursprungs, Fermentationsbrühe, Zellkultur, Proteinsuspension, Milch oder anderen ursprünglichen Quellen. Das immunglobulinhaltige Material oder die Lösung kann monoklonale oder polyklonale Immunglobuline enthalten. In einigen Fällen ist das immunglobulinhaltige Ausgangsmaterial eine Lösung, die polyklonale Antikörper enthält. In anderen Ausführungsformen umfasst das Ausgangsmaterial einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon. In anderen Ausführungsformen kann es sich bei der Probe um ein beliebiges alkoholhaltiges (z.B. ethanolhaltiges) Material handeln oder um ein Ausgangsmaterial wie eine Lösung, der Alkohol (z.B. Ethanol) zur Förderung der Ausfällung zugesetzt worden ist.

[0110] Um die Immunglobuline oder das Albumin aus dem Plasma zu gewinnen, wird das Plasma in der Regel einer Alkoholfraktionierung unterzogen, die mit anderen Reinigungsverfahren wie Chromatographie, Adsorption oder Fällung kombiniert werden kann. Es können aber auch andere Verfahren eingesetzt werden. Das proteinhaltige Präzipitat kann beispielsweise das II+III-Präzipitat nach der Cohn-Methode sein, wie die Methode 6, Cohn et. al. J. Am; Chem. Soc., 68 (3), 459-475 (1946), die Methode 9, Oncley et al. J. Am; Chem. Soc., 71, 541-550 (1946), oder den I+II+III-Niederschlag, die Methode 10, Cohn et.al. J. Am; Chem. Soc., 72, 465-474 (1950); sowie die Methode von Deutsch et.al. J. Biol. Chem. 164, 109-118 (1946) oder das Präzipitat-A von Nitschmann und Kistler Vox Sang. 7, 414-424 (1962); Helv. Chim. Acta 37, 866-873 (1954). Zu den alternativen Präzipitaten, die das interessierende Protein enthalten, gehören unter anderem andere Immunglobulin G- oder albuminhaltige Oncley-Fraktionen, Cohn-Fraktionen und Ammoniumsulfat-Präzipitate aus Plasma, wie sie von Schulze et al. in US-Patent 3,301,842 beschrieben werden. Weitere alternative Präzipitate, die das interessierende Protein enthalten, sind u. a. Oktansäurepräzipitate, wie z. B. in EP893450 beschrieben.

[0111] „Normales Plasma“, „Hyperimmunplasma“ (wie z. B. hyperimmunes Anti-D-, Tetanus- oder Hepatitis-B-Plasma) oder ein dazu äquivalentes Plasma kann als Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen Kaltethanolfraktionierungsverfahren verwendet werden.

[0112] Der Überstand des 8%-igen Ethanol-Präzipitats (Methode von Cohn et al.; Schultze et al. (s.o.), S. 251), des Präzipitats II+III (Methode von Oncley et al.; Schultze et al. (s.o.) S. 253) oder des Präzipitats B oder IV (Methode von Kistler und Nitschmann; Schultze et al. (s.o. Schultze), S. 253) sind Beispiele für eine IgG-Quelle, die mit der Plasmafraktionierung im industriellen Massstab kompatibel ist. Das Ausgangsmaterial für ein Reinigungsverfahren zur Gewinnung von IgG oder Albumin in hoher Ausbeute kann alternativ jedes andere geeignete Material aus verschiedenen Quellen wie Fermentationen und Zellkulturen oder anderen Proteinsuspensionen sein.

[0113] Bei der Cohn'schen Fraktionierungsmethode wird im ersten Fraktionierungsschritt die Fraktion I gewonnen, die hauptsächlich aus Fibrinogen und Fibronektin besteht. Der Überstand aus diesem Schritt wird weiterverarbeitet, um die Fraktion II+III und anschliessend die Fraktionen III und II auszufällen. Die Fraktion II+III enthält in der Regel etwa 60% IgG sowie Verunreinigungen wie Fibrinogen, IgM und IgA. Die meisten dieser Verunreinigungen werden dann in Fraktion III entfernt, die als Abfallfraktion gilt und normalerweise verworfen wird. Der Überstand wird dann behandelt, um die IgG-haltige Hauptfraktion, Fraktion II, auszufällen, die mehr als 90% IgG enthalten kann. Die oben genannten %-Werte beziehen sich auf die prozentuale Reinheit des IgG. Die Reinheit kann mit jeder in der Technik bekannten Methode gemessen werden, wie z.B. Gelelektrophorese oder Immunnephelometrie. Bei der Methode von Kistler & Nitschmann entspricht die Fraktion I der Fraktion I der Cohn-Methode. Das nächste Präzipitat/die nächste Fraktion wird als Präzipitat A (Fraktion A) bezeichnet. Dieser Niederschlag ist weitgehend äquivalent, wenn auch nicht identisch, mit der Fraktion II+III von Cohn. Der Niederschlag wird dann wieder aufgelöst und die Bedingungen werden angepasst, um den Niederschlag B (Fraktion B) auszufällen, der der Cohn-Fraktion III entspricht. Auch hier handelt es sich um eine Abfallfraktion, die normalerweise entsorgt wird. Der Überstand von Präzipitat B wird dann weiterverarbeitet, um Präzipitat II herzustellen, das der Cohn-Fraktion II entspricht.

[0114] Besondere proteinhaltige Präzipitate oder Suspensionen davon können Plasmaproteine, Peptidhormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine und polyklonale Immunglobulinproteine, Plasmaproteine ausgewählt aus menschlichen und tierischen Blutgerinnungsfaktoren einschliesslich Fibrinogen, Prothrombin, Thrombin, Prothrombinkomplex, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXla, FXII, FXIIa, FXIII und FXIIIa, von Willebrand-Faktor, Transportproteine einschliesslich Albumin, Transferrin, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Hämoglobulin und Hämopexin, Proteaseinhibitoren einschliesslich β-Antithrombin, α-Antithrombin, α-2-Makroglobulin, C1-Inhibitor, Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor (TFPI), Heparin-Cofaktor II, Protein-C-Inhibitor (PAI-3), Protein C und Protein S, α-1-Esterase-Inhibitorproteine, α-1-Antitrypsin, antiangionetische Proteine einschliesslich latentem Antithrombin, hochglykosylierte Proteine einschliesslich α-1-Säureglykoprotein, Antichymotrypsin, Inter-α-Trypsin-lnhibitor, α-2-HS-Glykoprotein und C-reaktives Protein sowie andere Proteine wie histidinreiches Glykoprotein, Mannanbindendes Lektin, C4-bindendes Protein, Fibronektin, GC-Globulin, Plasminogen, Blutfaktoren wie Erythropoietin, Interferon, Tumorfaktoren, tPA, γCSF.

[0115] In bestimmten Ausführungsformen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten, z.B. des Gesamtproteins, während der Resuspendierung eines aus Blutplasma gewonnenen Präzipitats angewendet werden. Insbesondere können die Methoden zur Bewertung der Proteinkonzentration in Echtzeit während der Resuspendierung und zur Unterstützung bei der Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration verwendet werden, um die Bestimmung der Menge der nachfolgenden Reagenzien zur Resuspendierung zu erleichtern. Der Vorteil der erfindungsgemässen Methoden besteht darin, dass der Hersteller die proteinhaltige Probe nicht manuell entnehmen muss, um dann manuell die Menge des hinzuzufügenden Reagenz zu berechnen. Darüber hinaus kann das Fortschreiten der Proteinauflösung während der Resuspendierung des proteinhaltigen Präzipitats oder der Paste, wie hier beschrieben, in Echtzeit überwacht werden, was eine effizientere Bestimmung des Zeitpunkts ermöglicht, an dem die Resuspendierung abgeschlossen ist, den optimalen Zeitpunkt für die Zugabe der nachfolgenden Reagenzien oder die Durchführung des nächsten Schritts in der Produktverarbeitung, wodurch unnötige Zykluszeiten reduziert werden.

[0116] Ein Grossteil der zur Extraktion von Plasmaproteinen verwendeten Kernmethoden basiert auf der Kryopräzipitation und Ethanolfraktionierung. Albumin und IgG waren die ersten Proteine, die aus menschlichem Plasma durch mehrstufige, sequenzielle Kaltethanolverfahren fraktioniert wurden. Cohn und seine Kollegen leisteten Pionierarbeit bei der Plasmafraktionierung, indem sie niedrige Temperaturen und die Zugabe von Ethanol von 8% bis 40% v/v zur Abtrennung von Albumin verwendeten. Mit der Methode von Cohn konnten fünf Fraktionen gewonnen werden, die von Fraktion I bis Fraktion V reichen und jeweils durch Anpassung von Parametern wie Ethanolkonzentration, Proteinkonzentration, Temperatur und pH-Wert hergestellt werden.

[0117] In einem Beispiel wird das Verfahren in grossem Massstab durchgeführt. Zum Beispiel wird das Verfahren in industriellem oder kommerziellem Massstab durchgeführt. Methoden zur Durchführung in industriellem oder kommerziellem Massstab sind für den Fachmann offensichtlich und/oder werden hier beschrieben. Das im industriellen Massstab durchgeführte Verfahren umfasst beispielsweise die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin aus Plasma oder einer Fraktion davon.

[0118] In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 500 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. Zum Beispiel wird die Reinigung von IgG oder Albumin in grossem Massstab unter Verwendung von 500 kg bis 1000 kg oder 1000 kg bis 2500 kg oder 2500 kg bis 5000 kg oder 5000 kg bis 7500 kg oder 7500 kg oder 10000 kg oder 10000 kg bis 12500 kg oder 12500 kg bis 15000 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 1000 kg oder 2500 kg oder 5000 kg oder 7500 kg oder 10000 kg oder 12500 kg oder 15000 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 1000 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 2500 kg Plasma oder einer Plasmafraktion durchgeführt. In einem Beispiel wird eine grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 5000 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 7500 kg Plasma oder einer Plasmafraktion durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 10000 kg Plasma oder einer Plasmafraktion durchgeführt. In einem Beispiel wird eine grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 12500 kg Plasma oder einer Fraktion davon durchgeführt. In einem Beispiel wird die grosstechnische Reinigung von IgG oder Albumin unter Verwendung von mindestens 15000 kg Plasma oder einer Plasmafraktion durchgeführt.

[0119] Während der Verarbeitung von Plasma zu spezifischen proteinreichen Fraktionen gibt es verschiedene Stufen, die die Verwendung von Ethanol beinhalten, und die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um die in einer komplexen Lösung vorhandene Ethanolmenge zu bestimmen, die dann über erforderliche Anpassungen informieren kann. Ferner kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um festzustellen, wann eine bestimmte Ethanolkonzentration während eines Schritts der Ethanolzugabe erreicht wurde.

[0120] Wie hier beschrieben, kann die Probe, die den Analyten enthält, eine trübe Lösung oder Suspension sein, insbesondere eine stark trübe Lösung oder Suspension. In jeder Ausführungsform kann (a) die trübe Lösung oder Suspension einen NTU-Wert haben, der gleich oder grösser ist als jeder hier beschriebene Wert, (b) die trübe Lösung oder Suspension kann einen NTU-Wert haben, der gleich oder grösser ist als jeder hier beschriebene Wert, oder (c) die trübe Lösung oder Suspension kann einen maximalen NTU-Wert haben, der gleich oder grösser ist als jeder hier beschriebene Wert. In der Regel wird die Trübung mit verschiedenen Methoden der Photometrie trüber Medien gemessen, wie z. B. Nephelometrie, Optometrie, Trübungsmessung. Trübungsmessungen werden mit einem Instrument wie einem Trübungsmesser oder Nephelometer durchgeführt. Dabei handelt es sich in der Regel um einen photoelektrischen Detektor, der das von einer Flüssigkeit gestreute Licht misst. Vor allem die Streuung des Lichts an Suspensionen ermöglicht es, die Konzentration der in einer Flüssigkeit suspendierten Stoffe zu schätzen. Normalerweise besteht dieses Gerät aus einer Weisslicht- oder Infrarotlichtquelle. Bei der Nephelometrie wird das gestreute Licht in einem Winkel von 90° und 25° zum einfallenden Licht gemessen. Bei der Trübungsmessung wird das Streulicht mit einem Sensor gemessen, der sich in der Achse des einfallenden Lichts befindet. Solche Trübungsanalysemethoden sind auf dem Gebiet der Technik wohlbekannt, und es gibt eine breite Palette von Instrumenten für die Trübungsanalyse, einschliesslich handgehaltener und Inline-Sensoren, z. B. das handgehaltene Trübungsmessgerät TL2360 von Hach, das die Trübung in nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) unter einem Winkel von 90° misst. In jedem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung sieht das Verfahren ferner einen Schritt zur Bestimmung der Trübung einer Probe vor, die aus der Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma stammt. Vorzugsweise ist die Trübung der Probe ein beliebiger hierin beschriebener Wert oder Bereich. Vorzugsweise umfasst der Schritt der Bestimmung der Trübung einer Probe die Messung der Trübung in einem 10-mL-Volumen einer Probe, die aus der Verarbeitung von aus Blut gewonnenem Plasma in 11-mm-Glasröhrchen gewonnen wurde, unter Verwendung eines Hach TL2360-Trübungsmessers, der mit NTU-Primärformazin-Lösungsstandards kalibriert wurde, in einem 90°-Winkel.

Methoden zur Erzeugung von Wellenlängenspektren

[0121] Der Fachmann wird mit Standardgeräten vertraut sein, die für die Anwendung von Lichtquellen im nahen Infrarotbereich verwendet werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung und in den bevorzugten Ausführungsformen, die sich auf die Bestimmung der Proteinkonzentration während der Verarbeitung von Blutplasmaproben beziehen, kann die Ausrüstung die Verwendung einer NIR-Sonde umfassen, die zur Verwendung in einem grossen Gefäss geeignet ist, das die interessierenden Proben enthält.

[0122] In einer Ausführungsform ist das NIR-Spektroskopie-Instrument so angeordnet, dass es die Testprobe während des Mischens in einem grossen Tank analysiert und NIR-Daten in Echtzeit liefert. In bestimmten Ausführungsformen können mehrere Sonden an ein einziges Spektrometer angeschlossen werden. So kann in einer Ausführungsform eine erste Sonde an der ersten Position angeordnet sein, während eine zweite Sonde an der zweiten Position und gegebenenfalls eine dritte Sonde an der dritten Position angeordnet ist. Alle diese Sonden können an das gleiche Spektrometer angeschlossen werden. Der Fachmann wird verstehen, dass die Verwendung mehrerer NIR-Sonden dazu beitragen kann, einen genaueren Bereich von Daten in Bezug auf Test- oder Trainingsproben zu erhalten, die den interessierenden Analyten enthalten.

[0123] Die Sonde des NIR-Spektroskopiegeräts kann als Tauchsonde ausgeführt sein oder einen Teil einer Durchflusszelle bilden. Der gesamte Prozessfluss oder ein Nebenstrom des Flusses kann durch eine solche Durchflusszelle geleitet werden.

[0124] In bevorzugten Ausführungsformen ist die NIR-Sonde so konfiguriert, dass sie die Messung von NIR-Spektren während des Mischens einer Probe ermöglicht. Der optische Schlitz der NIR-Sonde kann parallel zur Richtung des Flüssigkeitsstroms während des Mischens ausgerichtet sein. In der Regel ist der optische Schlitz der NIR-Sonde so ausgerichtet, dass er während des Mischens nicht direkt auf den Flüssigkeitsstrom gerichtet ist. So kann der optische Schlitz beispielsweise senkrecht oder in einem Winkel zum Flüssigkeitsstrom während des Mischens stehen. Mit anderen Worten, die NIR-Sonde kann entlang der Wand des Behälters nach unten ausgerichtet sein.

Methoden zur Erstellung von Modellen/Referenzdatensätzen

[0125] Der Fachmann ist mit allgemeinen Ansätzen zur Erstellung eines Referenzdatensatzes oder eines Modells repräsentativer NIR-Spektren vertraut, mit denen die Spektren von Testproben zum Zwecke der Bestimmung der Analytkonzentration verglichen werden können.

[0126] Der Referenzdatensatz kann von einer oder mehreren Proben stammen, die eine bekannte Konzentration des Analyten enthalten, wobei die Konzentration des Analyten durch eine Methode bestimmt wurde, die angesichts der Zusammensetzung der Referenz- und Testproben geeignet ist. Im Zusammenhang mit trüben Lösungen oder Suspensionen, die Proteine enthalten, kann beispielsweise die Dumas-Methode, die auf der Bestimmung des Gesamtstickstoffgehalts beruht, die geeignetste Methode zur Bestätigung der Proteinkonzentration sein, im Gegensatz zu anderen Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration, wie dem Biuret-Assay, dem BCA-Assay, dem Bradford-Assay oder der Absorption bei 280 nm.

[0127] Für die Referenz- oder Trainingsproben, für die die Proteinkonzentration bestimmt wurde, können dann repräsentative NIR-Spektren gewonnen werden, so dass die repräsentativen NIR-Spektren als Grundlage für ein Modell verwendet werden können, anhand dessen die Spektren der Testwellenlängen bewertet werden können.

[0128] Der Fachmann wird verstehen, dass die Genauigkeit des Modells umso grösser ist, je mehr repräsentative NIR-Spektren oder Trainingsspektren zur Verfügung stehen.

[0129] Möglicherweise müssen die Daten (die Testspektren oder die Referenz- bzw. Trainingsspektren, die zur Ableitung eines geeigneten Modells verwendet werden) einer spektralen Vorbehandlung unterzogen werden. Diese Vorbehandlungen können angewandt werden, um spektrale Veränderungen hervorzuheben. Beispiele für geeignete spektrale Vorbehandlungen sind Vektornormierung, erste Ableitung, Min-Max-Normalisierung, Geradensubtraktion, multiplikative Streuungskorrektur, zweite Ableitung und Kombinationen davon. Die Vorbehandlung der Testspektren oder der Referenz- oder Trainingsspektren, die zur Ableitung eines geeigneten Modells verwendet werden, ist vorzugsweise die Vektornormierung oder die erste Ableitung. In einer Ausführungsform ist die Vorbehandlung der Testspektren oder der Referenz- oder Trainingsspektren, die zur Ableitung eines geeigneten Modells verwendet werden, die Vektornormierung in Kombination mit der ersten Ableitung.

[0130] Das Modell kann mit einem multivariaten Kalibrierungsalgorithmus erstellt werden, wie z.B. Multiple Linear Regression (MLR), Principal Component Regression (PCR) oder Partial Least Squares (PLS)-Regression. Vorzugsweise wird das Modell mit Hilfe der Partial Least Squares (PLS)-Regression, wie sie hier beschrieben ist, erstellt. Der PLS-Algorithmus ist beschrieben in (Haaland, Thomas, Anal. Chem 60 (1998) 1193; Martens, Naes, Multivariate Kalibrierung, J. Wiley & Sons, New York (189): Kapitel 3.5; Brown, Apply. Spectosc. 49, No. 12 (1995) 14A; und Bouveresse, Hartmann, Massard, Last, Prebble, Anal. Chem. 68, Nr. 6 (1996) 982).

[0131] Hier werden Methoden zur Bewertung der Qualität eines bestimmten Modells beschrieben (einschliesslich der Feststellung, ob weitere Trainingsdaten zur Weiterentwicklung des Modells erforderlich sind).

[0132] In bestimmten Beispielen können bei der Bewertung der Modellqualität der verschiedenen chemometrischen Modelle oder multivariaten Modelle folgende Kriterien berücksichtigt werden: • Rang: entspricht der Anzahl der Faktoren des chemometrischen Modells. Ein niedrigerer Rang führt in der Regel zu einer höheren Modellstabilität. • Root Mean Square Error der Kreuzvalidierung (RMSECV): Der RMSECV sollte minimiert werden. • Residuale Vorhersageabweichung (RPD): Indikator für die Modellleistung. Die RPD sollte maximiert werden. • R<2>: Bestimmungskoeffizient, beschreibt die Beziehung zwischen den Spektraldaten und den Konzentrationsdaten. Das R<2>sollte möglichst nahe bei 100 liegen.

[0133] Bei der Bewertung der Vorhersagefähigkeit der chemometrischen Modelle oder der multivariaten Modelle anhand eines unabhängigen Datensatzes können auch die folgenden Kriterien berücksichtigt werden: • Bias: Durchschnittliche Differenz zwischen Referenzwerten und vorhergesagten Werten. Sollte nahe bei 0 liegen. • Mittlerer quadratischer Fehler der Vorhersage (RMSEP): Genauigkeitsindikator für die Vorhersage unabhängiger Proben. Der RMSEP sollte minimiert werden. • Residuale Vorhersageabweichung (RPD): Indikator für die Modellleistung. Die RPD sollte maximiert werden. • R<2>: Bestimmungskoeffizient, beschreibt die Beziehung zwischen den Spektraldaten und den Konzentrationsdaten. Das R<2>sollte möglichst nahe bei 100 liegen.

[0134] Die Erstellung des Modells kann Trainingsproben beinhalten, die einen repräsentativen Probensatz umfassen, der Variablen wie unterschiedliche Pastentypen, Probentemperaturen, Gerätevariabilität, Bedienerhandhabung, Rohmaterialien und Plasmaquellen abdeckt. Durch die Verwendung solcher unterschiedlichen Referenzproben zur Erfassung solcher Variablen bei der Erstellung des Trainingsmodells wird die Robustheit des Modells bei der Bewertung einer Vielzahl von Proben mit Analyten unbekannter Konzentration weiter gewährleistet.

Beispiele

Beispiel 1-Beschreibung des NIR-Messaufbaus für die at-lineProteinbestimmung in Ig-Niederschlagssuspension.

NIR-Spektrometer

[0135] Die NIR-Messungen wurden mit einem FT-NIR Matrix-F Prozessspektrometer der Bruker Optics GmbH durchgeführt. Das NIR-Prozessspektrometer kann für die spektroskopische Analyse von Flüssigkeiten, Suspensionen und Feststoffen durch Transmission, diffuse Reflexion und Transflexion verwendet werden (die beiden letzteren werden hier verwendet).

NIR-Sonden

[0136] Die NIR-Spektren der Trainingsproben wurden hauptsächlich mit einer Transflexionssonde aufgenommen (Einzelheiten siehe Tabelle 1). Einige wenige Spektren wurden auch mit einer Reflexionssonde aufgenommen, um diese beiden Messprinzipien zu vergleichen und das für den beabsichtigten Zweck am besten geeignete auszuwählen

Tabelle 1.In der Machbarkeitsstudie verwendete NIR-Sonden.

[0137] IN271 (Bruker) Transflexionsgrad Spalt: 1 mm / OPL: 2 mm 5 m Reflektor-NIR-12S-300H (Solvias) Reflexionsgrad k.A. 5 m

Software

[0138] Die Spektrenerfassung und Datenbearbeitung erfolgte mit den folgenden Softwareprogrammen: – Bruker OPUS: Basissoftware für die Bedienung des Spektrometers, die Spektrenaufnahme und die Definition der Geräteparameter. – Bruker OPUS QUANT: Softwarepaket für die Erstellung, Optimierung und Validierung von NIR-Modellen sowie für die quantitative Analyse.

At-line Messaufbau

[0139] Der Messaufbau für die NIR At-line-Datenerfassung bestand aus folgenden Komponenten: einem Magnetrührer, einem Laborlifter, einem Magnetrührstab (2,5 cm Länge), einem Stativ und einer Klemme.

[0140] NIR-Spektren wurden mit 64 Scans im Spektralbereich zwischen 4000<-1>und 11000 cm<-1>bei einer Auflösung von 16 cm<-1>aufgenommen.

[0141] Ein Hintergrundspektrum von Luft wurde aufgenommen und zur Korrektur der NIR-Spektren der Proben verwendet. Die Spektren aller Proben wurden in dreifacher Ausführung aufgenommen.

[0142] Bei offensichtlichen spektralen Ausreissern (erkennbar an der Form des Spektrums, z.B. aufgrund von Lufteinschlüssen im Spalt) wurden alle Wiederholungsspektren der betreffenden Probe manuell aus den Trainings- und Testdatensätzen ausgeschlossen.

[0143] Die NIR-Sonde wurde mit einem Stativ und einer Klemme befestigt. Ein Magnetrührer wurde in den Probenbehälter gegeben und die Probe wurde 2 Minuten lang bei 450 U/min gerührt. Dann wurde die Probe auf dem Laborlifter angehoben, bis die Sonde in die Probe eingetaucht war. Die Probe wurde eine weitere Minute lang gerührt, um eine homogene Verteilung der Suspension im Spalt der Transflexionssonde zu gewährleisten.

Analytische Referenzmethode - Dumas-Assay

[0144] Die Konzentration des Gesamtproteins in den Trainingsproben wurde mit der Dumas-Methode zur Bestimmung des Gesamtstickstoffs quantifiziert (Europäisches Arzneibuch, Kapitel 2.5.33 „Total Protein“, Methode 7, Verfahren B, aktuelle Fassung; US Pharmacopoeia <1057> „Biotechnology-Derived Articles - Total Protein Assay“, Methode 7, Verfahren 2, aktuelle Fassung; JP Pharmacopoeia, G3 „Biotechnological/Biological Products - Total Protein Assay“, Methode 7, Verfahren B, aktuelle Fassung). Das Ergebnis wird in g/kg angegeben. Alle Referenzproben wurden vor der Analyse bei 2 °C - 8 °C gelagert.

Vorbereitung der Probe

Laborproben

[0145] Im Labor wurden Proben des resuspendierten IgG-Präzipitats von verschiedenen Präzipitattypen und verschiedenen Präzipitatchargen mit Natriumacetatpuffer in 100-ml-Vakuumflaschen hergestellt. Das Gesamtprobenvolumen betrug ca. 70 mL.

[0146] Alle Laborproben wurden in dreifacher Ausführung bei Raumtemperatur von ca. 21 °C gemessen. Zusätzlich wurden einige Proben auch bei ca. 15 °C und ca. 30 °C bis 35 °C gemessen; zur Temperaturanpassung wurden die Proben vor der NIR-Messung in einem Wasserbad temperiert. Wurden die Proben nicht am Tag ihrer Herstellung gemessen, wurden sie bis zur Messung bei 4 °C gelagert.

Routine-Proben

[0147] Für jede Routinepartie wurden zwei unabhängige Proben in 100-ml-Vakuumflaschen in die Ig-Herstellungsanlagen überführt. Die NIR-Spektren der Proben wurden im Labor und/oder mit NIR-Spektrometern aufgenommen, die in den Routineproduktionsanlagen zur Verfügung standen.

[0148] Routineproben wurden in dreifacher Ausführung bei Raumtemperatur von ca. 21 °C gemessen. Zusätzlich wurden einige Proben auch bei ca. 15 °C und ca. 30 °C bis 35 °C gemessen; zur Temperaturanpassung wurden die Proben vor der NIR-Messung in einem Wasserbad temperiert. Wurden die Proben nicht am Tag ihrer Herstellung gemessen, wurden sie bis zur Messung bei 4 °C gelagert.

Chemometrische Modelle oder multivariate Modelle

Erstellung von Modellen mit QUANT

[0149] In einem typischen NIR-Spektrum einer resuspendierten IgG-Präzipitatprobe gibt es zwei Hauptpeaks bei ca. 6.900 cm<-1>und 5.000 cm<-1>Wellenzahl, die die vollständige Absorption des einfallenden Lichts durch das in der Matrix enthaltene Wasser widerspiegeln. Da in diesen Spektralbereichen kaum Licht den Detektor erreicht, können keine quantitativen Informationen zuverlässig extrahiert werden. Aus diesem Grund wurden die Spektralbereiche um diese Peaks nicht in die Modelle aufgenommen.

[0150] Um spektrale Veränderungen hervorzuheben, werden die Rohspektren häufig vorbehandelt. Die vorbehandelten Spektren bilden die Grundlage für die Erstellung von chemometrischen quantitativen Modellen. Die angewandten Spektrenvorbehandlungen waren erste Ableitung, Vektornormierung und die Kombination aus erster Ableitung und Vektornormierung.

[0151] Alle Modelle wurden auf der Grundlage der aufgenommenen Spektren und der entsprechenden Proteinreferenzwerte mit dem Bruker QUANT-Softwarepaket erstellt. Die optimale Kombination der Spektralbereiche und der Vorbehandlung der Spektren wurde mit dem Optimierungswerkzeug der Software bestimmt. Zur internen Validierung der Modelle wurde eine Kreuzvalidierung durchgeführt.

Qualitätskriterien für Modelle

[0152] Bei der Bewertung der Modellqualität der verschiedenen chemometrischen Modelle oder multivariaten Modelle wurden die folgenden Kriterien berücksichtigt: – Rang: entspricht der Anzahl der Faktoren des chemometrischen Modells. Ein niedrigerer Rang führt in der Regel zu einer höheren Modellstabilität. – Mittlerer quadratischer Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV): Der RMSECV sollte minimiert werden. – Residuale Vorhersageabweichung (RPD): Indikator für die Modellleistung. Die RPD sollte maximiert werden. – R<2>: Bestimmungskoeffizient, beschreibt die Beziehung zwischen den Spektraldaten und den Konzentrationsdaten. Das R<2>sollte möglichst nahe bei 100 liegen.

[0153] Bei der Bewertung der Vorhersagefähigkeit der chemometrischen Modelle oder der multivariaten Modelle anhand eines unabhängigen Datensatzes wurden die folgenden Kriterien berücksichtigt: – Bias: Durchschnittliche Differenz zwischen Referenzwerten und vorhergesagten Werten. Sollte nahe bei 0 liegen. – Mittlerer quadratischer Fehler der Vorhersage (RMSEP): Genauigkeitsindikator für die Vorhersage unabhängiger Proben. Der RMSEP sollte minimiert werden. – Residuale Vorhersageabweichung (RPD): Indikator für die Modellleistung. Die RPD sollte maximiert werden. – R<2>: Bestimmungskoeffizient, beschreibt die Beziehung zwischen den Spektraldaten und den Konzentrationsdaten. Das R<2>sollte möglichst nahe bei 100 liegen.

Beispiel 2-Sondenauswahl für die At-Line-Proteinbestimmung in Ig-Präzipitat-Suspension:Transflexionsmodus gegenüber Reflexionsmodus

[0154] Eine Reihe von Trainingsproben für eine Art von Ig-Niederschlagssuspension wurde sowohl mit der Transflexions- als auch mit der Reflexionssonde gemessen. Die Spektren der Proben, die mit den beiden Sondentypen gemessen wurden, sind in Abbildung 1 dargestellt. Auf der Grundlage der Spektren der Trainingsproben und der entsprechenden Proteinreferenzwerte wurde für jeden Messmodus ein eigenes Modell erstellt. Die Spektralbereiche wurden während der Optimierung auf fünf Standardbereiche festgelegt (9400-7500 cm<-1>, 7500-6100 cm<-1>, 6100-5450 cm<-1>, 5450-4600 cm<-1>, 4600-4250 cm<-1>). Die Eigenschaften der NIR-Modelle sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2.Modelleigenschaften für Transflexions- und Reflexionsdaten

[0155] RMSECV 0.374 0.546 Rang 5 6 RPD 21.1 14.4 R<2> 99.77 99.52

[0156] Aus beiden Spektraldatensätzen konnte ein Modell von hoher Qualität erstellt werden. Das aus den Transflexionsdaten erstellte Modell ergab einen geringeren Fehler (RMSECV), einen niedrigeren Rang, einen höheren RPD und R<2>im Vergleich zu dem aus den Reflexionsdaten erstellten Modell. Daher wurde die Transflexionssonde der Reflexionssonde vorgezogen. Alle weiteren NIR-Studien für Ig-Niederschlagssuspensionen wurden mit der NIR-Transflexionssonde fortgesetzt.

Beispiel 3-At-line-Proteinbestimmung in Ig-Niederschlagssuspension

Allgemeine NIR-Modelle

[0157] Die NIR-Modelle Modgen(Abbildung 2a) und Modlab(Abbildung 2b) wurden entwickelt, um die Vorhersage der Proteinkonzentration in Ig-Fällungssuspensionen verschiedener Fällungstypen (PPT A, Fr I+II+III, Fr II+III) zu erleichtern.

[0158] Multivariate NIR-Modelle wurden durch partielle Kleinstquadratregression (PLS) unter Verwendung des Softwarepakets OPUS QUANT erstellt, um Rohspektren von Trainingsproben in Verbindung mit den jeweiligen Proteinreferenzwerten (Dumas) zu verarbeiten.

[0159] Basierend auf den Signaländerungen in den NIR-Belastungsplots wurden die Wellenlängenbereiche von ca. 9'000 - 7'500 cm<-1>, 6'900 - 5'600 cm<-1>und 4'935 - 4'500 cm<- 1>für die NIR-Modelloptimierung ausgewählt; die wichtigsten von Wasser abgeleiteten Signale zwischen 7'500 und 6'900 cm<-1>und zwischen 5'600 und 4'935 cm<-1>wurden ausgeschlossen.

[0160] Die NIR-Modelle wurden mit einer vordefinierten Auswahl an spektralen Vorbehandlungen optimiert, d.h. erste Ableitung, Vektornormierung und die Kombination aus erster Ableitung und Vektornormierung.

[0161] Ein vorläufiger Satz von NIR-Modellen wurde ausgewählt und durch interne Kreuzvalidierung mit einer Standardanzahl von 1 ausgelassenen Probe pro 30 im Modell enthaltenen Proben validiert. Die Auswahl des Modells aus dem vorläufigen Satz von NIR-Modellen erfolgte durch gründliche Bewertung der statistischen Qualitätsmerkmale der internen Validierungsergebnisse und der Qualität der Vorhersage für unabhängige Testproben.

Prüfung der Modellrobustheit

[0162] Um sicherzustellen, dass das Modell einen repräsentativen Satz von Spektren umfasst, wird die Modellgeneralisierung (d.h. die Fähigkeit des Modells, sich ordnungsgemäss an neue, zuvor nicht gesehene Daten anzupassen, die aus derselben Verteilung stammen wie die, die zur Erstellung des Modells verwendet wurde) während der Datenerfassung kontinuierlich bewertet. Die Prüfung der Fähigkeit des Modells zur Verallgemeinerung wird als „Prüfung der Modellrobustheit“ bezeichnet.

[0163] Kurz gesagt, die RMSECV- und R<2>-Werte, die aus der Kreuzvalidierung des Modells gewonnen wurden, werden damit verglichen: 1. Die RMSEP- und R<2>-Werte, die aus der Validierung des Testreihees desselben Datensatzes gewonnen wurden, der nach dem Zufallsprinzip in zwei gleiche Teilmengen (einen Trainings- und einen Testreihe) aufgeteilt wurde, wobei die gleichen Spektralbereiche und Vorbehandlungen wie bei der ursprünglich durchgeführten Kreuzvalidierung verwendet wurden. 2. Die RMSEP- und R<2>-Werte, die aus der Validierung des Testreihees desselben Datensatzes gewonnen wurden, der nach dem Zufallsprinzip in zwei gleiche Teilmengen aufgeteilt wurde (ein Trainings- und ein Testreihe, die von 1 ausgetauscht wurden), wobei die gleichen Spektralbereiche und Vorbehandlungen wie bei der ursprünglich durchgeführten Kreuzvalidierung verwendet wurden.

[0164] Wenn kein oder nur ein geringer Unterschied in den Fehlertoleranzen (RMSECV/RMSEP und R<2>) zwischen der Kreuzvalidierung und den beiden Testreihevalidierungen zu beobachten ist, wird das Modell als ausreichend stabil angesehen. Andernfalls sollte das Modell weiter verbessert werden (z.B. durch Anreicherung mit zusätzlichen Spektren), um die Vorhersagefähigkeit des Modells zu erhöhen.

Eigenschaften des Modells Modgen

[0165] Tabelle 3 enthält eine Zusammenfassung des optimierten NIR-Modells Modgen; eine Visualisierung von Modgenist in Abbildung 2a dargestellt.

Tabelle 3.Eigenschaften und Qualitätsmerkmale von Modgen

[0166] Anzahl der Proben 1'012 Proben Labor (Verdünnungsreihe)*: n = 653 - PPT A: n = 228 - Fr I+II+III: n = 231 - Fr II+III: n = 194 Labor (Routineproben)*: n = 210 - PPT A: n = 84 - Fr I+II+III: n = 84 - Fr II+III:n = 42 Grossanlagen (Routineproben): n = 149 - PPT A: n = 62 - Fr I+II+III: n = 75 - Fr II+III: n = 12 Spektrale Vorbehandlungen Vektorielle Normierung Kalibrierungsregionen 6'773 - 5'593 cm<-1>, 4'775 - 4'497 cm<-1> Anzahl der PLS-Faktoren(Rang) 15 RMSECV [g/kg] 0.880 R<2> 94.73 RPD 4.35 Vorurteil -0.00112 Versetzt 1.57 Korrelationskoeffizient R 0.9733 Eigenschaft/Qualitätsmerkmal Neigung 10.947 Robustheit des Modells Kommentar Testreihe A RMSEP = 0,843 Das Modell gilt als robust, da für den RMSEP der einzelnen Testsätze und den RMSECV des Trainingssatzes ähnliche Werte ermittelt wurden. Ausserdem wurde kein Anstieg des Fehlers bei kleinerem Stichprobenumfang im Trainingsset beobachtet. R<2>= 94,68 Testreihe B RMSEP = 0,853 R<2>= 95,05 * Jede Probe wurde im Labor bei drei verschiedenen Temperaturen gemessen.

Eigenschaften des Modells Modlab

[0167] Tabelle 4 gibt einen Überblick über das optimierte NIR-Modell Modlab; eine Visualisierung von Modlabist in Abbildung 2b für einen Proteinbereich von 16 bis 42 g/kg dargestellt..

Tabelle 4.Eigenschaften und Qualitätsmerkmale von Modlab

[0168] Anzahl der Proben 1'041 Proben Labor (Verdünnungsreihe)*: n = 653 - PPT A: n = 258 - Fr I+II+III: n = 300 - Fr II+III: n = 269 Spektrale Vorbehandlungen Erste Ableitung Kalibrierungsregionen 9'003 - 7'498 cm<-1>, 6'403 - 5'593 cm<-1>, 4'605 - 4'497 cm<-1> Anzahl der PLS-Faktoren(Rang) 14 RMSECV [g/kg] 0.843 R<2> 97.7 RPD 6.59 Vorurteil -0.0136 Versetzt 0.711 Korrelationskoeffizient R 0.9884 Neigung 0.976

Vorhersagekraft von Modgen

[0169] Die Vorhersagefähigkeit des NIR-Modells Modgenwurde mit einer Reihe unabhängiger Proben (d.h. Proben, die nicht in den Modellen enthalten sind) aus der Ig-Routineproduktion bewertet, die Suspensionen der verschiedenen Ig-Fällungstypen (PPT A, Fr I+II+III, Fr II+III) umfassten. Die NIR-Spektren der Routine-Proben (2 unabhängige Proben, jede in dreifacher Ausführung gemessen) wurden mit verschiedenen Spektrometern aufgenommen.

[0170] Wenn die absolute Differenz zwischen dem Mittelwert der 2 x 3 Routinespektren einen Höchstwert von 1,5 g/kg überstieg, wurden alle Wiederholungsspektren der betreffenden Probe aus dem Testdatensatz entfernt.

[0171] Eine Zusammenfassung der Vorhersage für den Testdatensatz, der die verschiedenen Niederschlagstypen umfasst, ist in Tabelle 5 und Abbildung 3 enthalten.

[0172] Der RMSEP für den gesamten Testreihe, der die verschiedenen Niederschlagstypen enthält, betrug 0,880 g/kg und war damit dem RMSECV von 0,860 g/kg für Modgensehr ähnlich (Tabelle 5), was auf die Robustheit der Vorhersage unabhängiger Proben durch Modgenhinweist. Darüber hinaus ist die Vorhersage der Proben im Testreihe durch eine vernachlässigbare Verzerrung von -0,0624, einen Offset von 2,446, eine Steigung von 0,920 und einen Korrelationskoeffizienten (R) von 0,9277 gekennzeichnet.

Tabelle 5.Zusammenfassung der statistischen Qualitätsattribute und derZusammensetzung des Testreihees,die zur Bestimmung der Vorhersagefähigkeitvon Modgenüber den gesamten Satz unabhängiger Proben verwendet wurden,dieverschiedene Ausfällungstypen abdecken.

[0173] Gesamtzahl der Proben imTestreihe 467 Proben Grossanlagen (Routineproben): - PPT A: n = 320 - Fr I+II+III: n = 114 - Fr II+III: n=33 RMSEP [g/kg] 0.880 RPD 2.64 Vorurteil 0.0624 Versetzt 2.446 Korrelationskoeffizient (R) 0.9277 Neigung 0.920

Beispiel 4-Inline-Proteinbestimmung in Ig-Niederschlagssuspension

[0174] 400 g bis 900 g des Ig-Niederschlags (PPT A, Fr I+II+III, Fr II+III) wurden in einem verkleinerten Doppelmantel-Stahlreaktor unter strenger Temperaturkontrolle resuspendiert. Die NIR-Prozessüberwachung der Resuspendierung des Ig-Niederschlags wurde gestartet, nachdem die Suspension eine Zieltemperatur von 20 °C erreicht hatte, und ca. 24 Stunden lang fortgesetzt.

[0175] Der NIR-Aufbau bestand aus einem Matrix FT-NIR-Prozessspektrometer mit einer IN271-Transflexionssonde und einer 5 m langen optischen Faser. Die NIR-Sonde wurde durch einen Unterspiegelanschluss in den Füllstand eingeführt und so konfiguriert, dass die NIR-Spektren während des Mischens einer Probe gemessen werden konnten. Der optische Spalt der NIR-Sonde wurde parallel zur Richtung des Flüssigkeitsstroms während des Mischens ausgerichtet.

[0176] Die Bedingungen für die NIR-Datenerfassung entsprachen denen des in Beispiel 1 beschriebenen at-line NIR-Systems. Die NIR-Spektren wurden in Abständen von 3 Minuten aufgenommen.

[0177] NIR-Modelle, die mit At-Line-Proben der Ig-Präzipitat-Suspension entwickelt wurden, wurden für die Inline-Proteinquantifizierung während der Ig-Präzipitat-Resuspendierungsreaktion verwendet.

[0178] Zusätzlich wurden nach 2 h und ca. 24 h Referenzproben entnommen und mit dem Dumas-Protein-Assay analysiert.

[0179] Die Ergebnisse der Inline-Überwachung sind in den Abbildungen 4, 5 und 6 für Resuspendierungsreaktionen von drei verschiedenen Ig-haltigen Präzipitaten (PPTA, Fr I+II+III bzw. Fr II+III hier) dargestellt. Zusätzlich zu den NIR-Rohspektren wurden die Spektren mit erster Ableitung und Vektornormierung vorbehandelt, um spektrale Veränderungen hervorzuheben.

[0180] Die Ergebnisse zeigen, dass NIR-Modelle, die für die at-line-Proteinvorhersage entwickelt wurden, auch für die Inline-Proteinvorhersage bei der Resuspendierung von Alkohol- (z. B. Ethanol-) Präzipitaten aus Blutplasma funktionieren. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Quantifizierung von Proteinen in einer Resuspendierung einer Paste ermöglicht, die aus einer Ethanolfällung von Blutplasma gewonnen wurde, ohne dass eine vorherige Probenvorbereitung erforderlich ist, wie dies bei den derzeitigen At-Line- und Off-Line-Verfahren der Fall ist. Darüber hinaus ermöglichen die Methoden die Überwachung des Fortschritts der Pastenresuspendierung in Echtzeit, wodurch die Zykluszeiten zwischen den einzelnen Verarbeitungsschritten verringert werden können.

Beispiel 5-Beschreibung des NIR-Messaufbaus für die Inline-Ethanol (EtOH)-Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab

NIR-Spektrometer

[0181] Die NIR-Messungen wurden mit einem FT-NIR Matrix-F Prozessspektrometer der Bruker Optics GmbH durchgeführt. Das NIR-Prozessspektrometer kann für die spektroskopische Analyse von Flüssigkeiten, Suspensionen und Feststoffen durch Transmission, diffuse Reflexion und Transflexion verwendet werden.

NIR-Sonden

[0182] Die Transflexion wurde eingesetzt, um die Ethanolkonzentration und andere Matrixverschiebungen während der Fraktionierung im Produktionsmassstab zu verfolgen. Dementsprechend wurden die NIR-Spektren im verkleinerten Modell mit einer Transflexionssonde (IN271-02, 1 mm Spaltbreite) von Bruker aufgenommen.

[0183] Die NIR-Spektren wurden in Abständen von 3 Minuten mit folgenden standardisierten Geräteeinstellungen aufgenommen: Vorverstärker B (für Produkt) oder Vorverstärker A (für Luftuntergrund), 64 Scans, Spektralbereich 4'000 - 11'948 cm<-1>, Auflösung 16 cm<-1>.

Software

[0184] Die Datenerfassung erfolgte mit dem CMET der Bruker Optics GmbH.

[0185] Die Modelloptimierung und -kalibrierung sowie die Vorhersage von Datensätzen, die nicht im Kalibrierungsdatensatz enthalten waren, wurden mit dem OPUS-Softwarepaket QUANT durchgeführt.

[0186] Die qualitative Analyse der Entwicklung der Spektren aufgrund von Änderungen in der Probenmatrix, insbesondere Änderungen der Ethanolkonzentration, wurde mit dem OPUS-Softwarepaket 3D durchgeführt.

Chemometrische Modelle oder multivariate Modelle

Erstellung von Modellen mit QUANT

[0187] Alle Modelle wurden auf der Grundlage der aufgenommenen Spektren und der entsprechenden Ethanol-Referenzwerte mit dem Bruker QUANT-Softwarepaket erstellt. Die optimale Kombination der Spektralbereiche und der Vorbehandlung der Spektren wurde mit dem Optimierungswerkzeug der Software bestimmt. Zur internen Validierung der Modelle wurde eine Kreuzvalidierung durchgeführt.

Qualitätskriterien für Modelle

[0188] Bei der Bewertung der Modellqualität und der Vorhersagefähigkeit der verschiedenen chemometrischen Modelle oder multivariaten Modelle wurden ähnliche Kriterien wie in Beispiel 1 beschrieben berücksichtigt.

Beispiel 6-At-line-Bestimmung von EtOH bei der Plasmafraktionierung

Allgemeine NIR-Modelle

[0189] Die NIR-Modelle ModellI+II+III(entwickelt unter Verwendung von Proben aus der Plasmafraktionierung der Cohn-Fraktion (I+)II+III), Modeliv (entwickelt unter Verwendung von Proben aus der Plasmafraktionierung der Cohn-Fraktion IV) und Modcomp(entwickelt unter Verwendung von Proben aus der Plasmafraktionierung sowohl der Cohn-Fraktion (I+)II+III als auch der Cohn-Fraktion IV)) wurden entwickelt, um die Vorhersage der Ethanol (EtOH)-Konzentration in Plasmafraktionierungsschritten zu erleichtern.

[0190] Multivariate NIR-Modelle wurden durch partielle Kleinstquadratregression (PLS) unter Verwendung des Softwarepakets OPUS QUANT erstellt, um Rohspektren von Trainingsproben in Verbindung mit der theoretischen Ethanolkonzentration zu verarbeiten.

[0191] Basierend auf den Signaländerungen in den NIR-Belastungsdiagrammen wurden die Wellenlängenbereiche von ca. 9'400 - 5'448 cm<-1>für die NIR-Modelloptimierung von Modellcomp, ModelI+II+IIIund ModellIVausgewählt.

[0192] Die NIR-Modelle wurden mit einer vordefinierten Auswahl an spektralen Vorbehandlungen optimiert, z.B. erste Ableitung, Vektornormierung, Min-Max-Normalisierung, Geradensubtraktion und die Kombination von erster Ableitung und Vektornormierung.

[0193] Das Modellcompbasiert auf Vektornormierung und der ersten Ableitung als Vorbehandlung und weist einen mittleren quadratischen Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) von 0,149 sowie einen PLS-Rang von 10 auf. Eine Überlagerung der vorbehandelten Spektren ist in Abbildung 7 dargestellt.

[0194] ModelI+II+IIIbasiert auf Vektornormierung und der ersten Ableitung als Vorbehandlungen und weist einen mittleren quadratischen Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) von 0,0576 sowie einen PLS-Rang von 7 auf. Eine Überlagerung der vorbehandelten Spektren ist in Abbildung 9 dargestellt.

[0195] Das Modelliv verwendet die Vektornormierung und die erste Ableitung als Vorbehandlungen und weist einen mittleren quadratischen Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) von 0,0564 sowie einen PLS-Rang von 9 auf. Eine Überlagerung der vorbehandelten Spektren ist in Abbildung 11 dargestellt.

Vorhersagekraft von Modcomp

[0196] Das Modellcompwurde zur Vorhersage der Ethanolkonzentration in einem Produktionslauf der Plasmafraktionierung von Cohn-Fraktion (I+)II+III und Cohn-Fraktion IV verwendet.

[0197] Die theoretische Ethanolkonzentration wurde für jedes aufgezeichnete Spektrum auf der Grundlage der zugegebenen Menge, d.h. des Gewichts des Ethanols, berechnet. Die Ethanolvorhersage des Modellcompstimmte sehr gut mit der theoretischen Konzentration überein, was darauf hindeutet, dass das Modell die Ethanolkonzentration bei der Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab von Cohn-Fraktion (I+)II+III und Cohn-Fraktion IV genau bestimmen kann (Abbildung 8).

Vorhersagekraft von ModI+II+III

[0198] Das ModelI+II+IIIwurde zur Vorhersage der Ethanolkonzentration in einem Produktionslauf der Plasmafraktionierung der Cohn-Fraktion (I+)II+III verwendet.

[0199] Die theoretische Ethanolkonzentration wurde für jedes aufgezeichnete Spektrum auf der Grundlage der zugegebenen Menge, d.h. des Gewichts des Ethanols, berechnet. Die Ethanolvorhersage des Modells ModelI+II+IIIstimmte sehr gut mit der theoretischen Konzentration überein, was darauf hindeutet, dass das Modell die Ethanolkonzentration bei der Plasmafraktionierung im Produktionsmassstab der Cohn-Fraktion (I+)II+III genau bestimmen kann (Abbildung 10).

Vorhersagekraft von ModIV

[0200] Das Modelliv wurde zur Vorhersage der Ethanolkonzentration in einem Produktionslauf der Plasmafraktionierung von Cohn-Fraktion IV verwendet.

[0201] Das theoretische Ethanol wurde für jedes aufgezeichnete Spektrum auf der Grundlage der hinzugefügten Menge, d.h. des Gewichts des Ethanols, berechnet. Die Ethanolvorhersage des ModellsIVstimmte sehr gut mit der theoretischen Konzentration überein, was darauf hindeutet, dass das Modell die Ethanolkonzentration bei der Plasmafraktionierung von Cohn-Fraktion IV im Produktionsmassstab genau bestimmen kann (Abbildung 12).

Beispiel 7 - At-line-Proteinbestimmung in der Resuspendierung vonAlbuminpräzipitat

[0202] Präzipitat C (PPT C) oder Präzipitat V (PPT V) wurde in einem Doppelmantelgefäss in kleinem Massstab (< 1 I) resuspendiert. Zur Herstellung von NIRS-Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von PPT C oder PPT V wurden Suspensionsproben in Vakuumflaschen entnommen; diese Verdünnungen wurden durch Mischen unterschiedlicher Mengen an Suspensionen, destilliertem Wasser und Filterhilfsmittel hergestellt. Die NIR-Transflexionsspektren dieser Proben wurden in dreifacher Ausführung erfasst und als Kalibrierungssatz für die Erstellung des Modells (ModellAlbresusp) verwendet.

[0203] Für das Modell, das während der Resuspendierung (ModellAlbresusp) als spektrale Vorverarbeitungsmethode verwendet werden soll, lieferte eine Kombination aus erster Ableitung und Vektornormierung die besten Ergebnisse. Abbildung 13 zeigt die NIR-Spektren des Trainingsdatensatzes und Abbildung 14 zeigt, dass das resultierende Modell die Proteinkonzentration während der Resuspendierung von PPT C oder PPT V genau bestimmen kann.

[0204] ModellAlbresuspverwendet Vektornormierung und die erste Ableitung als Vorbehandlungen und weist einen mittleren quadratischen Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) von 0,284 sowie einen PLS-Rang von 5 auf.

Tabelle 3.Eigenschaften und Qualitätsmerkmale von ModellAlbresusp

[0205] ModellAlbresusp ca. 182 9002 - 7497.8 0.284 99.94 5 40.8 45 g/kg (siehe Abbildung 14) 6032.2 - 5592.5

[0206] Um sicherzustellen, dass das Modell zuverlässige Vorhersagen für die Proteinkonzentration macht, wurde es anhand unabhängiger Spektren mit bekanntem entsprechendem Referenzproteinwert getestet. In diesem Fall wurden 21 Testspektren (7 Proben in dreifacher Ausführung) zum Testen des Modells verwendet, wie in Abbildung 15 dargestellt. Die Vorhersage des unabhängigen Testsets ergab einen RMSEP von 0,733 g/kg. Die vom ModellAlbresuspvorhergesagten Werte stimmen gut mit der tatsächlichen Proteinkonzentration überein, die mit dem Dumas-Assay ermittelt wurde. Dies bestätigt, dass ModellAlbresuspdie Proteinkonzentration mit guter Genauigkeit vorhersagen kann.

Beispiel 8-At-line und Inline EtOH-Bestimmung bei der Plasmafraktionierung

[0207] Für diese Machbarkeitsstudie wurden NIR-Transflexionsspektren von drei verschiedenen Probensätzen aufgenommen: 1. .Trainingsset: PPT C (7 Versuchsreihen) oder PPT V (3 Versuchsreihen) wurden in kleinem Massstab (< 1 I) resuspendiert. Nachdem die Resuspendierung abgeschlossen war, wurde schrittweise Ethanol zugegeben. Die NIR-Sonde wurde direkt im Resuspendierungsgefäss (2L-Glasreaktor) installiert, die Spektren wurden nach jedem Schritt der Ethanolzugabe aufgenommen. Ein homogenes Gemisch im Reaktor wurde durch 10-minütiges Rühren zwischen den Ethanolzugaben sichergestellt (350 U/min, Rührwerk mit Überkopfklinge). Die Spektren dieser Proben wurden in dreifacher Ausfertigung erfasst und als Trainingssatz verwendet, um ein Modell für die Vorhersage der Ethanolkonzentration zu erstellen. Die Spektraldatenerfassung wurde bei 0±1 °C durchgeführt. 2. .Testreihe (at-line): Die Prozessproben wurden aus einer Pilotanlage oder dem PAT-Labor entnommen. Die Proben wurden auf 0°C (±1 °C) abgekühlt und für die Spektrenerfassung wie in Tabelle 4 beschrieben vorbereitet (Testreihe at-line). Die At-Line-Spektren dieser Proben wurden in dreifacher Ausführung erfasst. Diese unabhängigen Datensätze wurden später als At-Line-Testreihe zur Bewertung der Modellleistung verwendet. 3. .Testreihe (Inline): Es wurden drei unabhängige Albumin-Resuspendierungsläufe (2x PPT C, 1x PPT V) durchgeführt, bei denen die Nahinfrarot-Sonde (NIR) im Suspensionsgefäss installiert war und die Spektren jede Minute inline erfasst wurden.

[0208] Für alle analysierten Proben wurde der Referenztest zur Bestimmung der tatsächlichen Ethanolkonzentration mittels Gaschromatographie (GC) durchgeführt.

Tabelle 4.Bedingungen der Datenerhebung für diese Durchführbarkeitsstudie.Für jeden Parameter ist angegeben,auf welchen Datensatz diese spezifischeBedingung zutraf.

[0209] Spektrale Auflösung 16 cm<-1> Anzahl der Scans pro Messung 64 Spektraler Wellenzahlbereich 4000-11000 cm<-1> Verstärkung des Vorverstärkers (Hintergrund) A Verstärkung des Vorverstärkers (Sample) B Atmosphärischer Ausgleich AUS Referenzversuch Gaschromatographie Rührzeit (vor dem Eintauchen der Sonde) k.A. 2min k.A. Rührzeit (bei eingetauchter Sonde) k.A. 1min k.A. Rührzeit (zwischen den Messungen) 10min k.A. 1 min (kontinuierliche Messungen) Eintauchtiefe der Sonde k.A. ~3cm über dem Gefässboden k.A.

[0210] Zur Erstellung eines Modells, das zur Vorhersage der Ethanolkonzentration geeignet ist, wurde eine partielle Kleinstquadrat-Regression (PLS) auf ausgewählte Spektralsätze aus den Proben des Modell-Trainingssatzes angewendet. Insgesamt wurden N=34 Proben in den Modell-Trainingssatz aufgenommen.

[0211] Als spektrale Vorverarbeitungsmethode lieferte eine Kombination aus der ersten Ableitung und der Vektornormierung Standard Normal Variate (SNV) die besten Ergebnisse. Darüber hinaus wurden die in Tabelle 5 aufgeführten Spektralbereiche verwendet. Das sich daraus ergebende vorläufige Ethanol-Quantifizierungsmodell, ModellEtOH, wurde dann auf seine Leistungsfähigkeit getestet (siehe Abbildung 17 (B) und Tabelle 6).

Tabelle 5.Detaillierte Kalibrierungsmerkmale von ModellEtOH

[0212] ModellEtOH 1<st>Ableitung + Vektornormierung (SNV) 9000-7992 6112-5392 4656-4336 0.217 7

Tabelle 6. Detaillierte Merkmale der Vorhersagekraft von ModellEtOH

[0213] 0.584 -0.175 0.416 2.28 2.564 0.695

Testreihe (at-line)

[0214] Nach der Erstellung eines vorläufigen Modells wurden 14 einzelne Proben (11x PPT C, 3x PPT V) unter Verwendung des ModellEtOHauf ihren Ethanolgehalt hin quantifiziert. Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen des QC-Referenztests und der Vorhersage der Ethanolkonzentration ist in Abbildung 17 zusammengefasst. Mit einem RMSEP (root mean square error of prediction) von 0,584 %w/w Ethanol in der Suspension liefert das vorläufige Modell eine Vorhersage des Ethanolgehalts.

Testreihe (Inline)

[0215] Um die zeitliche Veränderung der Ethanolkonzentration während der Resuspendierung von PPT C oder PPT V zu verfolgen, wurde ein Inline-NIRS-Szenario im Labormassstab eingerichtet (2x PPT C, 1x PPT V). Während der Resuspendierung des PPT nahm die Inline-NIR-Sonde jede Minute ein Spektrum auf, das dann sofort mit dem ModellEtOHanalysiert wurde. Die resultierenden Daten wurden anschliessend aufgezeichnet (Ethanolkonzentration [%w/w] gegen Zeit [min]) und in Echtzeit auf einem angeschlossenen Computer angezeigt. Auf diese Weise konnte die Auflösung von Ethanol aus dem PPT in Echtzeit verfolgt werden, was auch Rückschlüsse auf den Resuspendierungsstatus und die Kinetik des PPT zuliess.

[0216] Insgesamt drei Resuspendierungsläufe wurden auf diese Weise überwacht und sind in Abbildung 18 dargestellt.

Schlussfolgerung

[0217] Ein NIR-Modell, das in der Lage ist, die Ethanolkonzentration zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Auflösung und Resuspendierung von PPT C und PPT V vorherzusagen, wurde erstellt. Obwohl für die Modellkalibrierung eine relativ kleine Anzahl von Proben verwendet wurde (N=34), konnte eine Vorhersage (RMSEP = 0,584 %w/w Ethanol) im kalibrierten Ethanol-Konzentrationsbereich erreicht werden, wie mit einzelnen Proben at-line (N=14) gezeigt wurde.

[0218] Darüber hinaus wurde eine Echtzeitüberwachung der Ethanolkonzentration während der Auflösung und Resuspendierung des PPT durch Beobachtung von drei Durchläufen mit einer Inline-NIR-Sonde und anschliessender sofortiger Spektralanalyse demonstriert. Dies ermöglicht Echtzeitinformationen über die Ethanolkonzentration im Reaktor zu einem bestimmten Zeitpunkt, was Rückschlüsse auf den Auflösungszustand des PPT und den Verlauf der Resuspendierung zulässt.

[0219] Es versteht sich, dass sich die in dieser Beschreibung offenbarte und definierte Erfindung auf alle alternativen Kombinationen von zwei oder mehr der genannten oder aus dem Text oder den Zeichnungen ersichtlichen Einzelmerkmale im Rahmen der Ansprüche erstreckt. Alle diese unterschiedlichen Kombinationen stellen verschiedene alternative Aspekte der Erfindung dar.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, die während oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C erhalten wird, wobei das Verfahren umfasst: – Bestrahlen einer während oder nach Abschluss der Resuspendierung von Cohn-Fraktion V oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat C gewonnenen Testprobe mit einer Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum, – Messung der Reflexion, Transmission oder Transflexion der Testprobe über einen Wellenlängenbereich im Nahinfrarotspektrum, zur Erzeugung von Testwellenlängenspektren, – Vergleich der Testwellenlängenspektren mit Referenzwellenlängenspektren, die von Referenzproben mit bekannten Konzentrationen des Analyten erhalten wurden, um die Konzentration des Analyten in der Testprobe zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Testwellenlängenspektren einer multivariaten Datenanalyse unterzogen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Referenzwellenlängenspektren ein Referenzdatensatz in Form eines Modells, das unter Verwendung einer multivariaten Analyse von verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren der Referenzproben erzeugt wurde, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die multivariate Analyse ausgewählt ist aus partieller Kleinstquadratregression, PLS-Diskriminanzanalyse, gewöhniiche Kleinstquadratregression, multiple lineare Regression, orthogonal-PLS, Support Vector Machines, allgemeine Diskriminanzanalyse, verallgemeinertes lineares Modell, verallgemeinertes lineares und nichtlineares Modell, lineare Diskriminanzanalyse, Klassifizierungsbäume, Clusteranalyse, neuronale Netze, und Pearson-Korrelation.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Modell ein Modell ist, das unter Verwendung der Regression der partiellen kleinsten Quadrate der verarbeiteten Referenzwellenlängenspektren erzeugt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Anwendung mindestens einer spektralen Vorbehandlung auf die Wellenlängenspektren umfasst.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die spektrale Vorbehandlung eine erste Ableitung, eine Vektornormierung oder eine Kombination aus erster Ableitung und Vektornormierung ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Messmodus Transflexion ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bestrahlung der Testproben mit der Lichtquelle im Nahinfrarotspektrum mit Hilfe einer Sonde erfoigt, die zur Aussendung von Licht mit Wellenlängen im nahen Infrarotbereich ausgebildet ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Analyten um Gesamtprotein oder einen Alkohol, insbesondere Ethanol, handelt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ein Protein ist und die Proteinkonzentration in den Referenzproben unter Verwendung des Dumas-Assays bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Cohn-Fraktion V oder das Kistler/Nitschmann-Präzipitat C aus Blutplasma gewonnen wird, das Frischplasma, kryoarmes Plasma oder kryoreiches Plasma umfasst.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe eine trübe Lösung oder Suspension mit einem nephelometrischen Trübungswert NTU von gleich oder größer als 10 NTU ist, wobei der nephelometrische Trübungswert NTU mit einem Nephelometer bestimmt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Cohn-Fraktion-V oder das Kistler/Nitschmann-Präzipitat C als Paste durch Zugabe eines oder mehrerer Verdünnungsmittel in einem Verdünnungsverhältnis zwischen dem 1- bis 3-fachen des Gewichts der Paste resuspendiert wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Cohn-Fraktion-V oder das Kistler/Nitschmann-Präzipitat C als Paste bei einer Temperatur unter 25°C resuspendiert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Resuspendierungstemperatur <21 °C beträgt.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteinkonzentration in der resuspendierten Cohn-Fraktion-V-Paste oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat-C-Paste im Bereich von 5 % w/w bis 15 % w/w, typischerweise 10% w/w bis 15% w/w, liegt.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Messung von Parametern in-line, at-line, off-line oder on-line durchgeführt wird.